CN114767841B - 复合纳米疫苗及其制备方法、组合疫苗及其制备方法 - Google Patents
复合纳米疫苗及其制备方法、组合疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114767841B CN114767841B CN202210387647.9A CN202210387647A CN114767841B CN 114767841 B CN114767841 B CN 114767841B CN 202210387647 A CN202210387647 A CN 202210387647A CN 114767841 B CN114767841 B CN 114767841B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- drug
- resistant mutant
- vaccine
- cells
- antigen polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 138
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 105
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 38
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 211
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 210
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 138
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 131
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 131
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 129
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 129
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 129
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims abstract description 90
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 143
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 26
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000002177 L01XE27 - Ibrutinib Substances 0.000 claims description 8
- 229960001507 ibrutinib Drugs 0.000 claims description 8
- XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N ibrutinib Chemical compound C1=2C(N)=NC=NC=2N([C@H]2CN(CCC2)C(=O)C=C)N=C1C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- GZOSMCIZMLWJML-VJLLXTKPSA-N abiraterone Chemical compound C([C@H]1[C@H]2[C@@H]([C@]3(CC[C@H](O)CC3=CC2)C)CC[C@@]11C)C=C1C1=CC=CN=C1 GZOSMCIZMLWJML-VJLLXTKPSA-N 0.000 claims description 7
- 229960000853 abiraterone Drugs 0.000 claims description 7
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 7
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 claims description 5
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims description 5
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 claims description 4
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 claims description 4
- 229960001686 afatinib Drugs 0.000 claims description 4
- ULXXDDBFHOBEHA-CWDCEQMOSA-N afatinib Chemical compound N1=CN=C2C=C(O[C@@H]3COCC3)C(NC(=O)/C=C/CN(C)C)=CC2=C1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 ULXXDDBFHOBEHA-CWDCEQMOSA-N 0.000 claims description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 claims description 4
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 claims description 4
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N (2R,4S)-ketoconazole Chemical compound C1CN(C(=O)C)CCN1C(C=C1)=CC=C1OC[C@@H]1O[C@@](CN2C=NC=C2)(C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)OC1 XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N 0.000 claims description 3
- 229960001602 ceritinib Drugs 0.000 claims description 3
- VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N ceritinib Chemical compound CC=1C=C(NC=2N=C(NC=3C(=CC=CC=3)S(=O)(=O)C(C)C)C(Cl)=CN=2)C(OC(C)C)=CC=1C1CCNCC1 VERWOWGGCGHDQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WXCXUHSOUPDCQV-UHFFFAOYSA-N enzalutamide Chemical compound C1=C(F)C(C(=O)NC)=CC=C1N1C(C)(C)C(=O)N(C=2C=C(C(C#N)=CC=2)C(F)(F)F)C1=S WXCXUHSOUPDCQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004671 enzalutamide Drugs 0.000 claims description 3
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002074 flutamide Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004125 ketoconazole Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003862 vemurafenib Drugs 0.000 claims description 3
- GPXBXXGIAQBQNI-UHFFFAOYSA-N vemurafenib Chemical compound CCCS(=O)(=O)NC1=CC=C(F)C(C(=O)C=2C3=CC(=CN=C3NC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)=C1F GPXBXXGIAQBQNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GLYMPHUVMRFTFV-QLFBSQMISA-N 6-amino-5-[(1r)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl)ethoxy]-n-[4-[(3r,5s)-3,5-dimethylpiperazine-1-carbonyl]phenyl]pyridazine-3-carboxamide Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NN=1)N)=CC=1C(=O)NC(C=C1)=CC=C1C(=O)N1C[C@H](C)N[C@H](C)C1 GLYMPHUVMRFTFV-QLFBSQMISA-N 0.000 claims description 2
- 239000002146 L01XE16 - Crizotinib Substances 0.000 claims description 2
- 229960005061 crizotinib Drugs 0.000 claims description 2
- KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N crizotinib Chemical compound O([C@H](C)C=1C(=C(F)C=CC=1Cl)Cl)C(C(=NC=1)N)=CC=1C(=C1)C=NN1C1CCNCC1 KTEIFNKAUNYNJU-GFCCVEGCSA-N 0.000 claims description 2
- 229950004126 ensartinib Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 60
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 53
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 46
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 12
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 abstract description 10
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 132
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 56
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 54
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 35
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 24
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 22
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 21
- 102200048955 rs121434569 Human genes 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 8
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 8
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 229940061278 prodium Drugs 0.000 description 7
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N Everolimus Chemical compound C1C[C@@H](OCCO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N 0.000 description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 6
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 6
- 229960005167 everolimus Drugs 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 102200137006 rs137852578 Human genes 0.000 description 6
- 230000008410 smoothened signaling pathway Effects 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 5
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 102200018200 rs121908585 Human genes 0.000 description 5
- 102220004453 rs387906517 Human genes 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 4
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 4
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 4
- 102100023085 Serine/threonine-protein kinase mTOR Human genes 0.000 description 4
- 102100032800 Spermine oxidase Human genes 0.000 description 4
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 4
- 102100029823 Tyrosine-protein kinase BTK Human genes 0.000 description 4
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 4
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 4
- 229940030495 antiandrogen sex hormone and modulator of the genital system Drugs 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N phenanthrene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 102220197960 rs1057519783 Human genes 0.000 description 4
- 102220197928 rs121913452 Human genes 0.000 description 4
- 102200039431 rs121913488 Human genes 0.000 description 4
- 102200137007 rs137852580 Human genes 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 101000854862 Homo sapiens Vacuolar protein sorting-associated protein 35 Proteins 0.000 description 3
- 102100020822 Vacuolar protein sorting-associated protein 35 Human genes 0.000 description 3
- -1 bei Futi Chemical compound 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 3
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 3
- 102220197958 rs1057519781 Human genes 0.000 description 3
- 102220197961 rs1057519784 Human genes 0.000 description 3
- 102220197986 rs1057519805 Human genes 0.000 description 3
- 102200162764 rs1057519825 Human genes 0.000 description 3
- 102200124924 rs11554290 Human genes 0.000 description 3
- 102220197925 rs121913451 Human genes 0.000 description 3
- 102220197929 rs121913454 Human genes 0.000 description 3
- 102220004452 rs387906516 Human genes 0.000 description 3
- YFGHCGITMMYXAQ-UHFFFAOYSA-N 2-[(diphenylmethyl)sulfinyl]acetamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(S(=O)CC(=O)N)C1=CC=CC=C1 YFGHCGITMMYXAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N BAY-43-9006 Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=CC(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N Dasatinib Chemical compound C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1Cl ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 2
- 239000002147 L01XE04 - Sunitinib Substances 0.000 description 2
- 239000005511 L01XE05 - Sorafenib Substances 0.000 description 2
- 239000002067 L01XE06 - Dasatinib Substances 0.000 description 2
- 239000005536 L01XE08 - Nilotinib Substances 0.000 description 2
- 239000002145 L01XE14 - Bosutinib Substances 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229960003736 bosutinib Drugs 0.000 description 2
- UBPYILGKFZZVDX-UHFFFAOYSA-N bosutinib Chemical compound C1=C(Cl)C(OC)=CC(NC=2C3=CC(OC)=C(OCCCN4CCN(C)CC4)C=C3N=CC=2C#N)=C1Cl UBPYILGKFZZVDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960002448 dasatinib Drugs 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000004317 gizzard Anatomy 0.000 description 2
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 2
- 229950007440 icotinib Drugs 0.000 description 2
- QQLKULDARVNMAL-UHFFFAOYSA-N icotinib Chemical compound C#CC1=CC=CC(NC=2C3=CC=4OCCOCCOCCOC=4C=C3N=CN=2)=C1 QQLKULDARVNMAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 2
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229960001165 modafinil Drugs 0.000 description 2
- 229960001346 nilotinib Drugs 0.000 description 2
- HHZIURLSWUIHRB-UHFFFAOYSA-N nilotinib Chemical compound C1=NC(C)=CN1C1=CC(NC(=O)C=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)=CC(C(F)(F)F)=C1 HHZIURLSWUIHRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VQWNELVFHZRFIB-UHFFFAOYSA-N odn 1826 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C(O1)CC(O)C1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(N=C(N)C=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(N=C(N)C=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(N=C(N)C=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC1CC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OC1COP(O)(=O)OC(C(O1)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(O)=O)CC1N1C=C(C)C(=O)NC1=O VQWNELVFHZRFIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002987 phenanthrenes Chemical class 0.000 description 2
- LOUPRKONTZGTKE-LHHVKLHASA-N quinidine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@H]2[C@@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-LHHVKLHASA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 102220197946 rs1057519772 Human genes 0.000 description 2
- 102200124919 rs121913237 Human genes 0.000 description 2
- 102220197927 rs121913450 Human genes 0.000 description 2
- 102220197917 rs121913456 Human genes 0.000 description 2
- 102220197920 rs121913458 Human genes 0.000 description 2
- 102220197922 rs121913460 Human genes 0.000 description 2
- 102220197808 rs121913523 Human genes 0.000 description 2
- 102200103757 rs17710891 Human genes 0.000 description 2
- 102200003103 rs281864719 Human genes 0.000 description 2
- 102220011140 rs397516792 Human genes 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229960003787 sorafenib Drugs 0.000 description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 2
- 229960001796 sunitinib Drugs 0.000 description 2
- WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N sunitinib Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC(F)=CC=C3NC\2=O)=C1C WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 2
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N Atorvastatin Natural products C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 206010048723 Multiple-drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960005370 atorvastatin Drugs 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N cinchonine Natural products C1C(C(C2)C=C)CCN2C1C(O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229960002465 dabrafenib Drugs 0.000 description 1
- BFSMGDJOXZAERB-UHFFFAOYSA-N dabrafenib Chemical compound S1C(C(C)(C)C)=NC(C=2C(=C(NS(=O)(=O)C=3C(=CC=CC=3F)F)C=CC=2)F)=C1C1=CC=NC(N)=N1 BFSMGDJOXZAERB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011242 molecular targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 229960001404 quinidine Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102220331758 rs1057519698 Human genes 0.000 description 1
- 102200018173 rs1057519700 Human genes 0.000 description 1
- 102220197813 rs1057519710 Human genes 0.000 description 1
- 102200076782 rs1057519713 Human genes 0.000 description 1
- 102220197841 rs1057519729 Human genes 0.000 description 1
- 102220197844 rs1057519732 Human genes 0.000 description 1
- 102220197937 rs1057519764 Human genes 0.000 description 1
- 102220197993 rs1057519808 Human genes 0.000 description 1
- 102220197997 rs1057519812 Human genes 0.000 description 1
- 102220198081 rs1057519864 Human genes 0.000 description 1
- 102200030380 rs121908596 Human genes 0.000 description 1
- 102220050982 rs121913250 Human genes 0.000 description 1
- 102220014433 rs121913418 Human genes 0.000 description 1
- 102200039430 rs121913488 Human genes 0.000 description 1
- 102200076883 rs121913506 Human genes 0.000 description 1
- 102220004836 rs121913512 Human genes 0.000 description 1
- 102220197900 rs121913516 Human genes 0.000 description 1
- 102220004852 rs121913671 Human genes 0.000 description 1
- 102220196649 rs121913671 Human genes 0.000 description 1
- 102200076877 rs121913682 Human genes 0.000 description 1
- 102220196546 rs121913682 Human genes 0.000 description 1
- 102200103778 rs121918347 Human genes 0.000 description 1
- 102200003102 rs863225281 Human genes 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
- A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种延缓肿瘤耐药性产生的肿瘤疫苗，属于肿瘤疫苗技术领域。一种复合纳米疫苗，包括改性耐药突变抗原多肽、鱼精蛋白以及佐剂；所述改性耐药突变抗原多肽是通过酸性氨基酸片段修饰耐药突变抗原多肽而获得的；所述耐药突变抗原多肽选自针对会导致肿瘤细胞对七类肿瘤靶向药物中的任一种药物产生耐药性的任一种基因突变而通过人工设计和/或多肽疫苗设计软件设计得到的相对应的耐药突变抗原多肽。本发明通过激活抗原特异性T细胞，促使T细胞杀伤带有耐药突变抗原的肿瘤细胞，从而避免或延缓肿瘤对肿瘤靶向药物产生耐药性，显著延长肿瘤靶向药物的有效作用时间。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤疫苗领域，尤其涉及一种延缓肿瘤耐药性产生的肿瘤疫苗。
背景技术
随着分子生物学技术的发展，近年来关于肿瘤分子靶向治疗的研究进展飞速，很多肿瘤分子靶向药物已帮助肿瘤病人延长了生存时间，临床获益显著。然而，由于特定的靶向药物通常只是针对癌细胞的某一个蛋白、某一个分子起作用，因此只能抑制肿瘤生长的一条通路。随着该类药物的使用时间延长，多数患者出现耐药。其中，约50-60％的患者是由于发生了基因突变导致耐药。目前的应对方式是针对应用肿瘤分子靶向药物的肿瘤患者进行常见的对应突变基因检测，一旦基因检测结果为阳性，即采用另一种靶向药物进行治疗。例如EGFR突变患者服用靶向药后出现基因突变导致耐药，大多数为T790M突变，此时患者可以使用第三代靶向药物如奥斯替尼。但是，患者在接受EGFR-TKI治疗后的8-14个月会往往会出现继发耐药，又需要寻找新的可用药物进行对应治疗。因此，如何解决肿瘤分子靶向药物治疗的耐药问题成为研究的热点及难点。
目前，肿瘤免疫治疗正在逐步革新肿瘤治疗的传统范式。其中，基于肿瘤抗原——包括肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原，尤其是新生抗原的肿瘤疫苗被认为是训练免疫细胞特异性地识别并杀伤肿瘤细胞的最有前景的技术之一。如果将带有会导致肿瘤细胞耐药性的基因突变所产生的抗原的肿瘤疫苗注入患者体内，可以特异性地激活T细胞免疫应答，使患者自身免疫系统第一时间有效识别、杀灭这一类带有耐药突变的肿瘤细胞，从而延缓肿瘤耐药性的产生时间，延长患者生存期。常见的肿瘤疫苗形式包括多肽疫苗、核酸疫苗(RNA和DNA疫苗)、病毒类载体疫苗、以及不同形式的高端制剂疫苗。
纳米制剂递送技术一方面可以保护多肽或核酸，减缓其在体内外被降解的速率，以此提升纳米疫苗的稳定性；另一方面纳米制剂被认为具有一定程度的佐剂效应，即在特定尺寸范围的纳米制剂更易激起免疫响应，更易于被抗原呈递细胞(Antigen-presentingCells，缩写APC)例如树突细胞(Dendritic Cell,缩写DC)摄取，从而使纳米制剂携带的抗原能够更有效地被DC细胞呈递给T细胞，从而激活T细胞，使T细胞能够特异性地杀伤带有此抗原的细胞，即提升了疫苗的免疫原性和疗效。目前常见的纳米制剂递送系统包括脂质体纳米颗粒，高分子纳米颗粒，无机纳米颗粒以及复合纳米颗粒等。
因此，亟需开发一种能够显著延缓肿瘤分子靶向药的耐药性产生的肿瘤疫苗。
发明内容
本发明提供了一种能够显著延缓肿瘤分子靶向药的耐药性产生的肿瘤疫苗。该肿瘤疫苗不仅能够有效提高负载抗原多肽的体内外稳定性且具有良好的佐剂效应，有效提升疫苗免疫原性和效力；而且还能够特异性地杀伤带有会导致肿瘤细胞耐药性的基因突变所产生的抗原(简称：耐药突变抗原)的肿瘤细胞，实现延缓肿瘤靶向药的耐药性产生的效果。
为实现上述目的，本发明实施例的第一方面提供一种复合纳米疫苗，所述的复合纳米疫苗包含改性耐药突变抗原多肽、鱼精蛋白以及佐剂；
所述耐药突变抗原多肽选自针对会导致肿瘤细胞对七类肿瘤靶向药物中的任一种药物产生耐药性的任一种基因突变而通过人工设计和/或多肽疫苗设计软件设计得到的相对应的耐药突变抗原多肽；七类肿瘤靶向药物的耐药突变分别为:第一类针对靶向药物维莫德吉、索立德吉的耐药突变，第二类针对靶向药物依鲁替尼、奥布替尼、度恩西布的耐药突变，第三类针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚、阿帕他胺、达罗他胺的耐药突变，第四类针对靶向药物达拉菲尼、派姆单抗、威罗菲尼、司美替尼的耐药突变，第五类针对靶向药物阿雷替尼、色瑞替尼、克唑替尼、恩沙替尼、布格替尼的耐药突变，第六类针对靶向药物阿法替尼、博舒替尼、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、奧洛替尼、贝福替尼、埃克替尼、奈拉替尼、伏美替尼、达可替尼、阿美替尼、泽布替尼、伊马替尼、尼洛替尼、奥斯替尼、索拉菲尼、舒尼替尼、酪氨酸激酶抑制剂类药物、特瓦替尼、奎扎替尼、吉瑞替尼、伏罗尼布、阿伐替尼、瑞派替尼的耐药突变，第七类针对靶向药物依维莫司、雷帕霉素、、西罗莫司、莫达美替尼、曲美替尼、多纳非尼、C-MET抑制剂赛沃替尼的耐药突变。
七类肿瘤靶向药物分类法是参照专利CN109887553B、CN112687353A、CN112687325A、CN112687352A、CN112675297A、CN112687354A、CN112767998A的方法把肿瘤靶向药物聚类分为七类：第一类针对SMO突变产生耐药的Hedgehog信号通路拮抗剂如维莫德吉等，第二类针对BTK突变产生耐药的如依鲁替尼等，第三类针对AR耐药突变的一些抗雄激素类药物如阿比特龙等，第四类针对BRAF耐药突变的一些菲尼类药物，第五类针对ALK、MET等融合基因的一些酪氨酸激酶抑制剂，第六类针对EGFR通路的激酶抑制剂，第七类针对PI3K/AKT/mTOR通路的依维莫司等激酶抑制剂。可按照上述专利方法筛选得到肿瘤靶向药物对应的常见耐药突变，并通过人工设计或者多肽疫苗设计软件设计得到相对应的耐药突变抗原多肽序列。
所述维莫德吉的耐药突变为：SMO-A459V，SMO-C469Y，SMO-D473G，SMO-D473H，SMO-D473Y，SMO-F460L，SMO-G497W，SMO-H231R，SMO-Q477E，SMO-T241M，SMO-V321A，SMO-V321M，SMO-W281L，SMO-W535L，SMO-W535R；
索立德吉的耐药突变为：SMO-D473H；
依鲁替尼的耐药突变为：BTK-C481F，BTK-C481R，BTK-C481S，BTK-C481Y，BTK-T316A；
奥布替尼的耐药突变为：BTK-C481F，BTK-C481R，BTK-C481S，BTK-C481Y；
度恩西布的耐药突变为：BTK-C481S；
阿比特龙的耐药突变为：AR-T878A，AR-T878S；
恩扎鲁胺的耐药突变为：AR-F877L，AR-T878A；
氟他胺的耐药突变为：AR-T878A，AR-T878S，AR-V716M；
酮康唑的耐药突变为：AR-T878A；
阿帕他胺的耐药突变为：AR-T878A，AR-T878S，AR-V716M；
达罗他胺的耐药突变为：AR-T878A，AR-T878S，AR-V716M；
达拉菲尼的耐药突变为：MAP2K1-P124S，MAP2K2-Q60P，NRAS-G12D，NRAS-Q61R；
派姆单抗的耐药突变为：NRAS-Q61R；
威罗菲尼的耐药突变为：MAP2K1-G128V，MAP2K1-P124L，MAP2K1-Q56P，NRAS-Q61R；
司美替尼的耐药突变为：MAP2K1-P124L；
阿雷替尼的耐药突变为：ALK-G1202R；
色瑞替尼的耐药突变为：ALK-D1203N，ALK-F1174V，ALK-G1123S，ALK-G1202R，ALK-G1269A，ALK-L1196M；
克唑替尼的耐药突变为：ALK-F1174L，ALK-F1174V，ALK-G1202R，ALK-G1269A，ALK-I1171T，ALK-L1196M，MET-D1246H，MET-D1246N；
恩沙替尼的耐药突变为：ALK-G1269A，ALK-G1202R，ALK-E1210K；布格替尼的耐药突变为：EGFR-T790M，ALK-L1196M；
阿法替尼的耐药突变为：EGFR-T790M；
博舒替尼的耐药突变为：ABL1-F359V，ABL1-V299L；
达沙替尼的耐药突变为：ABL1-E255K，ABL1-E255K，ABL1-F317L，ABL1-F359V，ABL1-T315A，ABL1-T315I，ABL1-V299L；
厄洛替尼的耐药突变为：EGFR-T790M；
吉非替尼的耐药突变为：EGFR-D761Y，EGFR-T790M；
奧洛替尼的耐药突变为：EGFR-C797S；
贝福替尼的耐药突变为：EGFR-T790M；
埃克替尼的耐药突变为：EGFR-T790M；
奈拉替尼的耐药突变:EGFR-T790M；
伏美替尼的耐药突变：EGFR-T790M,EGFR-C797S；
达可替尼的耐药突变：EGFR-T790M；
阿美替尼的耐药突变：EGFR-T790M,EGFR-C797S；
泽布替尼的耐药突变为：EGFR-T474I、EGFR-T474M、EGFR-C481S；
伊马替尼的耐药突变为：ABL1-A397P，ABL1-A399T，ABL1-A433T，ABL1-E255K，ABL1-E255V，ABL1-E275K，ABL1-E279A，ABL1-E279K，ABL1-E279Y，ABL1-E279Z，ABL1-E282G，ABL1-E292V，ABL1-E352D，ABL1-E352G，ABL1-E355A，ABL1-E355G，ABL1-E450A，ABL1-E450G，ABL1-E450K，ABL1-E453A，ABL1-E453G，ABL1-E453K，ABL1-E453L，ABL1-F311L，ABL1-F317L，ABL1-F359A，ABL1-F359V，ABL1-F382L，ABL1-F486S，ABL1-G398R，ABL1-H396P，ABL1-H396R，ABL1-I418V，ABL1-K294>RGG，ABL1-K378R，ABL1-K419E，ABL1-L298V，ABL1-L384M，ABL1-L387F，ABL1-L387M，ABL1-M244V，ABL1-M388L，ABL1-N374Y，ABL1-P480L，ABL1-Q252E，ABL1-Q252H，ABL1-Q252K，ABL1-Q252R，ABL1-R328M，ABL1-S417Y，ABL1-T277A，ABL1-T315I，ABL1-T315N，ABL1-V289F，ABL1-V299L，ABL1-V379I，ABL1-Y253F，ABL1-Y320C，KIT-A829P，KIT-D816A，KIT-D816E，KIT-D816H，KIT-D820G，KIT-D820V，KIT-D820Y，KIT-K642E，KIT-S709F，KIT-S821F，KIT-T670E，KIT-T670I，KIT-V654A，PDGFRA-D842V；
尼洛替尼的耐药突变为：ABL1-E255K，ABL1-E255V，ABL1-H396R，ABL1-T315I，ABL1-T315V，KIT-N655T；
奥斯替尼的耐药突变为：EGFR-C797S，EGFR-G796D，EGFR-G796R，EGFR-G796S，EGFR-L792H，KIT-T790M；
索拉菲尼的耐药突变为：FLT3-D835H，FLT3-D835Y；
舒尼替尼的耐药突变为：FLT3-D835Y，PDGFRA-D842V；
酪氨酸激酶抑制剂类药物的耐药突变为：ABL1-A399T，ABL1-D325G，ABL1-E255K，ABL1-E255V，ABL1-E279K，ABL1-E282K，ABL1-E355G，ABL1-E453K，ABL1-F311L，ABL1-F317L，ABL1-F359V，ABL1-H396P，ABL1-H396R，ABL1-L298V，ABL1-L384M，ABL1-L387F，ABL1-L387M，ABL1-M244V，ABL1-M388L，ABL1-P310S，ABL1-Q252H，ABL1-Q252M，ABL1-T315A，ABL1-T315I，ABL1-T495R，ABL1-V289A，ABL1-V299L，ABL1-V338F，ABL1-V379I，ABL1-Y253F，EGFR-T790M；
特瓦替尼的耐药突变为：EGFR-T790M；
奎扎替尼的耐药突变为：FLT3-D835Y，FLT3-D842V，FLT3-D835Y；
吉瑞替尼的耐药突变为：FLT3-N701K、FLT3-F691L、NRAS-G12S、NRAS-G12D；
伏罗尼布的耐药突变为：PDGFRA-D842V；
阿伐替尼的耐药突变为：PDGFRA-D842V/PDGFRA-V658A、PDGFRA-N659K、PDGFRA-Y676C、PDGFRA-G680R；
瑞派替尼的耐药突变为：KIT-V654A、PDGFRA-D842V；
依维莫司的耐药突变为：MTOR-F2108L；
雷帕霉素的耐药突变为：MTOR-F2108L；
西罗莫司的耐药突变为：MTOR-F2108L
莫达美替尼的耐药突变为：MAP2K1-F129L；
曲美替尼的的耐药突变为：MAP2K1-F129L；
多纳非尼的耐药突变为:MAP2K1-F129L；
C-MET抑制剂赛沃替尼的耐药突变为：MET-D1246V。
所述改性耐药突变抗原是通过酸性氨基酸片段(Aa-Tag)修饰耐药突变抗原多肽而获得的。
进一步，所述改性耐药突变抗原多肽是指酸性氨基酸修饰于所需抗原多肽的N端和/或C端形成的。
进一步，所述佐剂为带负电荷的核酸类佐剂。
进一步，所述复合纳米疫苗中改性耐药突变抗原多肽和鱼精蛋白的质量比为1:1至10∶1；优选的，质量比为5:1至10∶1。
进一步，所述复合纳米疫苗中改性耐药突变抗原多肽和佐剂的质量比为1:1至20∶1；优选的，质量比为5:1至10∶1。
为实现上述目的，本发明实施例的第二方面提供一种复合纳米疫苗的制备方法，该制备方法包括：通过酸性氨基酸片段修饰，使具有目标耐药突变(Neo)的改性耐药突变抗原多肽整体带有负电荷，改性抗原多肽命名为Aa-Neo；将Aa-Neo多肽、鱼精蛋白以及核酸类佐剂分子分别完全溶于水溶液中，得到一定浓度的Aa-Neo溶液、鱼精蛋白溶液和佐剂溶液。首先将Aa-Neo溶液和佐剂溶液均匀混合得到均匀的初始混合物溶液，之后，加入阳离子鱼精蛋白溶液，混合均匀得到具有稳定颗粒尺寸的复合纳米疫苗。
本发明的第三方面提供了一种组合疫苗，包含多种不同耐药突变抗原的复合纳米疫苗。可先制备多种不同的含有单一耐药突变抗原的复合纳米疫苗，再将这几种不同的复合纳米疫苗合，得到组合疫苗，即“制备后混合”法；或者在制备单一纳米颗粒时使其同时负载多条不同的耐药突变抗原，得到一种包含多种不同耐药突变抗原的组合疫苗，即“制备时混合”法。
本发明的有益之处在于：
1、本发明通过利用酸性氨基酸片段修饰耐药突变抗原多肽，从而使得具有不同理化性质的耐药突变抗原多肽均能够通过本法制备得到复合纳米疫苗；且通过“制备后混合”法或“制备时混合”法可制备得到组合疫苗，由此可见，本发明的方法具有普适性。
2、本发明的复合纳米疫苗制备方法操作简单、快捷。制备得到的纳米疫苗具有20-200nm的均匀颗粒尺寸，具有优良的颗粒分散性。
3、本发明的复合纳米疫苗和组合疫苗不仅能够有效提高负载的耐药突变抗原多肽的体内外稳定性且具有良好的佐剂效应、能有效提升疫苗免疫原性和效力；而且还能激活抗原特异性T细胞，从而促使特异性T细胞杀伤带有会导致肿瘤细胞耐药性的基因突变所产生的抗原的肿瘤细胞，从而避免或延缓肿瘤对靶向药产生耐药性，显著延长肿瘤靶向药物的有效作用时间。通过激活抗原特异性T细胞，促使T细胞杀伤带有耐药突变抗原的肿瘤细胞，从而避免或延缓肿瘤对肿瘤靶向药物产生耐药性，显著延长肿瘤靶向药物的有效作用时间。
附图说明
图1是多肽设计及纳米疫苗颗粒设计与制备机理示意图。
图2是实施例1～实施例5的粒径分析图。
图3是实施例1的冷冻电镜结果图。
图4是实施例4的冷冻电镜结果图。
图5是实施例6-10的粒径分布表格图。
图6是实施例6的冷冻电镜结果图。
图7是实施例11-12的粒径分布图。
图8是实施例11的冷冻电镜结果图。
图9是实施例12的冷冻电镜结果图。
图10是实验例13的免疫原性验证的ELISpot结果图；
图11是实验例14的第一类靶向药物的复合纳米疫苗的体外肿瘤细胞杀伤实验结果图；
图12是实验例15的第二类靶向药物的复合纳米疫苗的体外肿瘤细胞杀伤实验结果图；
图13是实验例16的第三类靶向药物的复合纳米疫苗的体外肿瘤细胞杀伤实验结果图；
图14是实验例17的第四类靶向药物的复合纳米疫苗的体外肿瘤细胞杀伤实验结果图；
图15是实验例18的第五类靶向药物的复合纳米疫苗的体外肿瘤细胞杀伤实验结果图；
图16是实验例19的第六类靶向药物的复合纳米疫苗的体外肿瘤细胞杀伤实验结果图；
图17是实验例20的第七类靶向药物的复合纳米疫苗的体外肿瘤细胞杀伤实验结果图
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售产品。
CpG ODN ODN 1826是由金斯瑞生物科技股份有限公司定制的，CpG ODN ODN 1826的序列TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(5’→3’)。
硫酸鱼精蛋白来源于阿拉丁试剂(上海)有限公司。
水来源于自制注射用水。
根据如下专利CN109887553B、CN112687353A、CN112687325A、CN112687352A、CN112675297A、CN112687354A、CN112767998A描述的方法查找肿瘤靶向药物耐药突变的数据；截取耐药突变多肽序列及预测MHC分子亲和力及免疫原性：对于点突变截取覆盖突变位点上下游16个氨基酸的多肽序列，对于移码突变截取向前延伸16个长度的氨基酸、向后延伸直到终止密码子的多肽序列作为耐药突变位点的突变型多肽，同时截取相应位置对应的野生型多肽序列，用至少一个数据库作为来源统计高频HLA分型及频率，将统计出的HLA合并去重之后作为用于预测的候选HLA分型，使用多款软件分析这些突变位点对应的多肽与HLA分子结合亲和力，综合多款软件将亲和力分为三类：强亲和力-SB、弱亲和力-WB和无亲和力，并与相对野生型多肽比较确定其亲和力变化，A类变化为由无亲和力变为有强亲和力，B类变化为由无亲和力变为弱亲和力，C类变化为由弱亲和力变为强亲和力，D类变化为无变化，内部排序认为A类优于B类优于C类优于D类，使用免疫原性预测工具预测其免疫原性，保留突变型多肽亲和力强、亲和力变化大并且免疫原性强的表位；靶向药物与耐药位点相互关系及药物聚类：对耐药位点亲和力打分：综合考虑位点有亲和力的表位个数及各表位亲和力变化大小，对A、B、C、D四类不同亲和力变化给予相对应的权重，根据每个表位对应的HLA频率大小给予权重，将位点的各表位累加求和
AC：亲和力变化大小，A、B、C、D四类不同亲和力变化给予不同的权重；Fhla：对应的HLA频率；n：位点的各表位个数；综合分析靶向药物和耐药位点间相互关系结合靶向药物作用机制可对常见肿瘤分子靶向药物聚类从而将其分为7类：第一类针对SMO突变产生耐药的Hedgehog信号通路拮抗剂如维莫德吉等，第二类针对BTK突变产生耐药的如依鲁替尼等，第三类针对AR耐药突变的一些抗雄激素类药物如阿比特龙等，第四类针对BRAF耐药突变的一些菲尼类药物，第五类针对ALK、MET等融合基因的一些酪氨酸激酶抑制剂，第六类针对EGFR通路的激酶抑制剂，第七类针对PI3K/AKT/mTOR通路的如依维莫司等激酶抑制剂。根据这些靶向药物进行治疗后导致耐药性产生的常见基因突变位点可通过常用网站https://www.cancergenomeinterpreter.org/biomarkers进行查找确认，或通过查找公开文献专利如CN109887553B、CN112687353A、CN112687325A、CN112687352A、CN112675297A、CN112687354A、CN112767998A等获得。根据这些突变基因位点可进一步设计对应的疫苗多肽序列。可选用的具体方法包括公开文献专利CN109887553B、CN112687353A、CN112687325A、CN112687352A、CN112675297A、CN112687354A、CN112767998A所述的方法，但不局限于此种方法。
可按照上述专利方法筛选得到52种肿瘤靶向药物对应的147个常见耐药突变，并设计(通过人工设计或者多肽疫苗设计软件)得到相对应的耐药突变抗原多肽序列。如表1所示：
表1、七类肿瘤靶向药物的常见基因突变及耐药突变抗原多肽序列
/>
/>
/>
改性耐药突变抗原是通过酸性氨基酸片段(Aa-Tag)修饰耐药突变抗原多肽而获得的。该具体实施例中采用的改性抗原序列公式为：DEDEDKK-耐药突变抗原多肽序列-KKDEDED。选取部分改性耐药突变抗原多肽用于复合肿瘤纳米疫苗的制备与表征，如下所示：
DEDEDKK-VKTPQHVKITDFGRAKLLGAEEKEYHAEG-KKDEDED(简写P1，SEQ NO1)；
DEDEDKK-ICLTSTVQLIMQLMPFGCLLD-KKDEDED(简写P2，SEQ NO2)；
DEDEDKK-LITQLMPFGSLLDYVREHKD-KKDEDED(简写P3，SEQ NO3)；
DEDEDKK-PIARELHQFAFDLLIKSHM-KKDEDED(简写P4，SEQ NO4)；
DEDEDKK-RFILLELMAGRDLKSFLRETR-KKDEDED(简写P5，SEQ NO5)；
DEDEDKK-TQAWDLYYHVLRRISKQLPQ-KKDEDED(简写P6，SEQ NO6)；
实施例1
一种复合纳米疫苗是由P1多肽，CpG ODN佐剂，以及硫酸鱼精蛋白复合而成的复合纳米疫苗，其中多肽设计及纳米疫苗颗粒设计与制备机理如图1所示。
一种复合纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)母液配制：使用移液枪将0.9ml缓冲液加入到封装有1mg P1多肽的样品瓶中，超声辅助溶解得到浓度为1.11mg/ml的P1多肽水溶液。使用移液枪将1ml PBS缓冲液加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解得到1mg/ml的CpG水溶液。使用微量分析天平在2ml规格的样品瓶中，称取0.5mg硫酸鱼精蛋白，使用移液枪将2ml水加入到上述样品瓶中，得到0.25mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液。
(2)混合制备：取900μl P1多肽溶液加入1.5ml规格的离心管中，然后向离心管中加入100μl CpG溶液，并混合均匀，得到P1/CpG混合溶液。之后取出上述P1/CpG混合溶液100μl再加入400μl 2％甘露醇溶液以及40μl硫酸鱼精蛋白溶液，混合均匀后得到复合纳米疫苗，之后将复合纳米疫苗分离纯化之后冻干保存。
实施例2至实施例5
一种复合纳米疫苗的组成及其制备方法同实施例1，不同的是鱼精蛋白的用量以及CpG的用量不同，具体见表2。
表2：实施例1-5的复合纳米疫苗中硫酸鱼精蛋白的含量
实施例6至实施例10
一种复合纳米疫苗的组成及其制备方法同实施例1，唯一不同的是所用的耐药突变抗原多肽序列不同，具体见表3。
表3：实施例6至实施例10的复合纳米疫苗的组成
| 组别 | 多肽编号 | 佐剂 | 鱼精蛋白 |
| 实施例1 | P1 | CpG ODN | 硫酸鱼精蛋白 |
| 实施例6 | P2 | CpG ODN | 硫酸鱼精蛋白 |
| 实施例7 | P3 | CpG ODN | 硫酸鱼精蛋白 |
| 实施例8 | P4 | CpG ODN | 硫酸鱼精蛋白 |
| 实施例9 | P5 | CpG ODN | 硫酸鱼精蛋白 |
| 实施例10 | P6 | CpG ODN | 硫酸鱼精蛋白 |
实施例11
一种组合疫苗是由P1多肽，P2多肽，CpG ODN佐剂，以及硫酸鱼精蛋白通过“制备时混合”法制备的复合纳米疫苗。
一种组合疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)母液配制：使用移液枪将0.9ml缓冲液加入到封装有1mg P1多肽的样品瓶中，超声辅助溶解得到浓度为1.11mg/ml的P1多肽水溶液。使用移液枪将0.9ml缓冲液加入到封装有1mg P2多肽的样品瓶中，超声辅助溶解得到浓度为1.11mg/ml的P2多肽水溶液。使用移液枪将1ml PBS缓冲液加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解得到1mg/ml的CpG水溶液。使用微量分析天平在2ml规格的样品瓶中，称取0.5mg硫酸鱼精蛋白，使用移液枪将2ml水加入到上述样品瓶中，得到0.25mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液。
(2)混合制备：取900μl P1多肽溶液加入1.5ml规格的离心管中，然后向离心管中加入100μl CpG溶液，并混合均匀，得到P1/CpG混合溶液。取900μl P2多肽溶液加入1.5ml规格的离心管中，然后向离心管中加入100μl CpG溶液，并混合均匀，得到P2/CpG混合溶液。分别取50μl P1/CpG混合溶液以及50μl P2/CpG混合溶液混合均匀，得到100μl P1/P2/CpG混合溶液。再加入400μl 2％甘露醇溶液以及40μl硫酸鱼精蛋白溶液，混合均匀后得到i-P1/P2组合疫苗，之后将纳米疫苗分离纯化之后冻干保存。
实施例12
一种组合疫苗是由P1多肽，P2多肽，CpG ODN佐剂，以及硫酸鱼精蛋白通过“制备后混合”法制备的复合纳米疫苗。
一种组合疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)母液配制：使用移液枪将0.9ml PBS缓冲液加入到封装有1mg P1多肽的样品瓶中，超声辅助溶解得到浓度为1.11mg/ml的P1多肽水溶液。使用移液枪将0.9ml PBS缓冲液加入到封装有1mg P2多肽的样品瓶中，超声辅助溶解得到浓度为1.11mg/ml的P2多肽水溶液。使用移液枪将1ml PBS缓冲液加入到封装有1mg CpG的样品瓶中，超声辅助溶解得到1mg/ml的CpG水溶液。使用微量分析天平在2ml规格的样品瓶中，称取0.5mg硫酸鱼精蛋白，使用移液枪将2ml水加入到上述样品瓶中，得到0.25mg/ml的硫酸鱼精蛋白水溶液。
(2)混合制备：取900μl P1多肽溶液加入1.5ml规格的离心管中，然后向离心管中加入100μl CpG溶液，并混合均匀，得到P1/CpG混合溶液。取100μl P1/CpG混合溶液再加入400μl 2％甘露醇溶液以及40μl硫酸鱼精蛋白溶液，混合均匀后得到P1复合纳米疫苗，之后将复合纳米疫苗分离纯化之后冻干保存。取900μl P2多肽溶液加入1.5ml规格的离心管中，然后向离心管中加入100μl CpG溶液，并混合均匀，得到P2/CpG混合溶液。取100μl P2/CpG混合溶液再加入400μl 2％甘露醇溶液以及40μl硫酸鱼精蛋白溶液，混合均匀后得到P2复合纳米疫苗，之后将复合纳米疫苗分离纯化之后冻干保存。将上述P1复合纳米疫苗与P2复合纳米疫苗等比例混合得到p-P1/P2组合疫苗。
技术效果验证：
实验设备：粒径分析数据由马尔文动态光散射仪(DLS)测得；冷冻样品由FEIVitrobot冷冻样品制备仪制备，冷冻电镜照片由Talos F200C 200kV冷冻电镜拍摄；实验材料为指定实施例的样品。
粒径分析实验过程：用规格为10mm×10mm×40mm的石英比色皿做样品皿，用DLS测试实施例样品溶液的粒径大小及分布，连续测试2次，间隔30s，最终取两次测试的平均值做最终数据。
冷冻电镜实验过程：将3μl实施例样品溶液滴加在TEM铜网上，使用冷冻样品制备仪blot2次，每次blot时间为5秒，之后在乙烷介质中玻璃化，温度为-180℃。将玻璃化之后的样品保存至液氮中(77K)，之后用Talos F200C 200kV冷冻电镜进行样品形貌的拍摄。
实验一：调控多肽/CpG/鱼精蛋白比例实现纳米颗粒稳定分散
将实施例1-5样品进行粒径分析实验，结果如图2所示。通过冷冻电镜实验对实施例1以及实施例4样品进行冷冻电镜实验，结果如图3及图4所示。
实验结果：通过调控多肽/CpG佐剂比例不仅可以实现复合纳米疫苗的组分精确调控，同时也可以实现纳米颗粒的均匀制备。如图2所示，精确调控多肽/CpG投料比例为10/1(实施例1)，7.5/1(实施例2)，6.25/1(实施例3)，5/1(实施例4)，2.5/1(实施例5)，通过调控多肽/鱼精蛋白的比例(11.5/1～2.5/1)可以20～200nm尺寸的复合纳米颗粒制备。通过冷冻电镜表征技术，我们对实施例1及实施例4样品进行了形貌表征，如图3及图4所示，含有P1耐药突变的复合纳米疫苗具有近似球形的形貌特征，颗粒尺寸约为120nm及90nm。
上述实验表明通过合理调控多肽/佐剂/鱼精蛋白结构砌块的比例不仅可以精确调控复合纳米疫苗中三元组分的相对比例，而且可以实现纳米疫苗的均匀制备，制备得到的复合纳米颗粒具有均匀的20～200nm的颗粒尺寸以及近似球形的颗粒形貌。
实验二：制备方法普适性的验证
将实施例6-10样品进行粒径分析实验，结果如图5所示。实施例6样品进行冷冻电镜拍摄，结果如图6所示。
实验结果：通过在抗原多肽两端添加酸性氨基酸修饰片段(Aa-Tag)，在不改变原有抗原多肽序列的前提下，巧妙的实现了Aa-Neo与阳离子结构砌块的有效复合。基于该思想原则，抗原序列部分不具有唯一性，因此理论上对于多种耐药突变抗原多肽序列具有较好的普适性。为了验证我们的想法，我们选用了6种具有代表性的耐药突变相关的以及耐药敏感度相关的抗原作为待负载抗原，通过本专利方法提出的纳米肿瘤疫苗的制备方法对上述样品进行了普适性评估。如图5所示，经粒径分析实验可知，实施例1以及6-10形成的复合纳米疫苗具有60-190nm颗粒尺寸。以含有EGFR-T790M耐药突变的实施例6为例，如图6所示，其颗粒尺寸约为190nm，形貌为近似球形颗粒。
上述实验表明，本专利提出的制备含耐药突变抗原的多肽纳米疫苗技术具有较好的普适性，对于多种导致耐药性产生的基因突变靶点具有潜在的应用价值。
实验三：组合疫苗的概念验证
将实施例11-12的样品进行粒径分析实验，结果如图7所示；将实施例11-12的样品进行冷冻电镜实验，结果如图8和图9所示。
实验结果：在实际的应用场景中，患者长期使用肿瘤分子靶向药物往往会产生多种耐药相关的基因突变位点。从实际应用出发，本专利方法进一步对组合疫苗的概念进行了验证。制备组合疫苗，根据多种抗原多肽混合的时间点不同，我们将其分为了两类：“制备时混合”以及“制备后混合”。如实施例11展示，“制备时混合”方法是将不同多肽先混和，之后通过鱼精蛋白阳离子结构砌块添加形成纳米颗粒。如实施例12展示，“制备后混合”方法是将含单一抗原的复合纳米颗粒在制备完成之后进行物理混合。如图7所示，i-P1/P2组合疫苗(实施例11)以及p-P1/P2组合疫苗均可成功制备，组合疫苗的粒径约为80～150nm。同时通过冷冻电镜，对组合疫苗进行了形貌表征，结果显示实施例11的样品以及实施例12的样品均具有近似球形颗粒的形貌，并且尺寸约为100～200nm。
上述实验表明，运用本专利方法可以制备得到含有多种导致耐药性产生的基因突变靶点抗原多肽的组合疫苗。这种从需求出发的设计考量最大程度贴合了应用需求。
实验四：免疫原性验证
实施例13
实验多肽：P2-P5改性耐药突变抗原多肽及对应的耐药突变抗原多肽均由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成，多肽纯度均大于90％，内毒素含量低于0.5EU/mg。按照上述方法制备P2-P5对应的复合纳米疫苗。
为了检测多肽的免疫反应，实施IFN-γ酶联免疫吸附(ELISpot)测定法。详细的实验过程如下：选用8周龄人源化小鼠B-NSG(CD34+)45只，随机分为15组，每组3只。适应一周后，分为多肽组1(P1对应的耐药突变抗原多肽)、多肽组2(P2对应的耐药突变抗原多肽)……多肽组5(P5对应的耐药突变抗原多肽)、多肽混合组(混合P1-P5对应的耐药突变抗原多肽)和纳米疫苗组1(P1复合纳米疫苗)、纳米疫苗组2(P2复合纳米疫苗)……纳米疫苗组5(P5复合纳米疫苗)、纳米疫苗组合组1(P1-P5复合纳米疫苗“制备后混合”)、纳米疫苗组合组2(P1-P5复合纳米疫苗“制备时混合”)，共13组；阴性对照组编号14；CpG佐剂对照组编号15。多肽组均采用CpG为佐剂(10μg/只)，多肽50μg每只给药。使用PBS作为阴性对照组，CpG佐剂组每只给药0.2μg。纳米疫苗组分散于PBS，每只小鼠给药纳米疫苗50μg，于尾根部注射，总剂量0.1mL/只，1周一次，共三周，第三次免疫后7天，取小鼠外周血，制备小鼠单个核细胞(简称：PBMC)悬液，用于ELISpot检测。
ELISpot检测结果中，IFN-γ呈阳性结果的多肽，即判定为阳性候选多肽。实验按组别分别进行单肽ELISpot试验，即将小鼠PBMC稀释成浓度为1-2×106/mL，铺24孔板，每孔1mL，按上述相同编号分组1-15，PHA阳性对照组编号16(PHA组PBMC来源于阴性对照组)，每个处理重复3次(即3个复孔)，分别加入对应的多肽(P2-P5)(10μg/mL)，预孵育72h后离心分离细胞，调整细胞浓度为2×106/mL，上IFN-γELISpot板，按照IFN-γELISpot试剂盒的说明书方法进行显色，运用CTL-ImmunoSpotS5系列酶联斑点分析仪读取产生的斑点数。IFN-γ阳性结果表明有抗原特异性T细胞产生，视为多肽能引起机体的免疫反应，斑点数的多少反映其免疫的强弱。
结论：各实验组产生的斑点数见图10，与阴性对照组、CpG佐剂组及对应多肽组相比，复合纳米疫苗组能够产生更强烈的免疫应答(p<0.05)。与多肽混合组和复合纳米疫苗组相比，复合纳米疫苗组合组1和组合组2均能够在人源化小鼠体内产生更强烈的免疫应答(p<0.01)，且复合纳米疫苗组合组1和组合组2之间无显著性差异。证明复合纳米疫苗均具有良好的佐剂效应。
实验五：复合纳米疫苗特异性杀伤带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的验证实验
为了验证复合纳米疫苗特异性地杀伤带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的能力，需要构建一套含本发明中特定耐药突变的稳转细胞系。通过专利CN109887553B、CN112687353A、CN112687325A、CN112687352A、CN112675297A、CN112687354A、CN112767998A提供的具体方法步骤分别构建得到针对前述七个聚类的肿瘤靶向药物的特定耐药突变(如表1所示)的稳转细胞系，分别标记如下：
第一类：针对SMO突变产生耐药的Hedgehog信号通路拮抗剂如维莫德吉等的耐药突变，用smo15-pcDNA3.1(+)质粒和smow7-pcDNA3.1(+)质粒构建的稳转细胞系，分别命名为smo15-ASG(含有smo15-pcDNA3.1(+))和smow7-AGS(含有smow7-pcDNA3.1(+))；
第二类：针对BTK突变产生耐药的如依鲁替尼等的耐药突变，用BTK5-pcDNA3.1(+)质粒和BTKw2-pcDNA3.1(+)质粒构建的稳转细胞系，分别命名BTK5(含有BTK5-pcDNA3.1(+))和BTKw2(含有BTKw2-pcDNA3.1(+))；
第三类：针对AR耐药突变的一些抗雄激素类药物如阿比特龙等的耐药突变，用AR4-pcDNA3.1(+)质粒和ARw2-pcDNA3.1(+)质粒构建的稳转细胞系，分别命名AR4(含有AR4-pcDNA3.1(+))和ARw2(含有ARw2-pcDNA3.1(+))；
第四类：针对BRAF耐药突变的一些菲尼类药物的耐药突变，用ME7-pcDNA3.1(+)质粒和MEw5-pcDNA3.1(+)质粒构建的稳转细胞系分别命名ME7(ME7-pcDNA3.1(+))和MEw5(含有MEw5-pcDNA3.1(+))；
第五类：针对ALK、MET等融合基因的一些酪氨酸激酶抑制剂的耐药突变，用ALK10-pcDNA3.1(+)质粒和ALKw5-pcDNA3.1(+)质粒构建的稳转细胞系，分别命名ALK10(ALK10-pcDNA3.1(+))和ALKw5(含有ALKw5-pcDNA3.1(+))；
第六类：针对EGFR通路的激酶抑制剂的耐药突变，用mut46-hygro(+)质粒和wid8-hygro(+)质粒构建的细胞系分别命名mut46(mut46-hygro(+))和wid8(含有wid8-hygro(+))。将mut46(mut46-hygro(+))重新活化，按转染流程将mut46-zeo(+)导入上述细胞系，用400μg/mL zeo进行筛选，命名为mut92(mut46-hygro(+)，mut46-zeo(+))；
第七类：针对PI3K/AKT/mTOR通路的依维莫司等激酶抑制剂的耐药突变，用MEM3-pcDNA3.1(+)质粒和MEMw3-pcDNA3.1(+)质粒构建的稳转细胞系，分别命名MEM3(含有MEM3-pcDNA3.1(+))和MEMw3(含有MEMw3-pcDNA3.1(+))。
以下实施例14-20分别展示本发明的复合纳米疫苗对七个聚类的肿瘤靶向药物对应的带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的特异性杀伤能力。
当构建得到的突变型稳转细胞系能够表达对应聚类的靶向药物所有的耐药突变抗原时(如表1所示)，从表1展示的该聚类药物的所有耐药突变抗原序列中可任意选择一个用于制备本发明的复合纳米疫苗，用于特异性地杀伤带有该耐药突变抗原的肿瘤细胞，即包括上述突变型稳转细胞系。为了进一步提高实际临床应用中的疗效，可选择该种肿瘤靶向药物(如阿法替尼、吉非替尼、奧洛替尼等)在治疗病人过程中产生的最高比例的耐药突变或突变组合作为靶点，设计对应的耐药突变抗原序列。如选择多于1条耐药突变抗原序列用于制备组合疫苗(可采用“制备后混合”或“制备时混合”方法)，这种多靶点联合设计可以进一步提高组合疫苗对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的特异性杀伤效果，从而延缓肿瘤耐药性的产生，显著延长靶向药物有效作用时间。
实施例14-20中复合纳米疫苗包含的改性耐药突变抗原多肽序列所采用的改性抗原序列公式为：DEDEDKK-耐药突变抗原多肽序列-KKDEDED。
表4、实施例14-20对应的复合纳米疫苗包含的耐药突变抗原多肽序列及采用的制备方法
实施例14
第一类靶向药物的复合纳米疫苗的体外对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤实验
实验目的：验证复合纳米疫苗在体外对具有SMO突变产生耐药的Hedgehog信号通路拮抗剂维莫德吉(Vismodegib)的特定突变位点的肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记smo15-ASG(含有smo15-pcDNA3.1(+))和smow7-AGS(含有smow7-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组(包含第一类靶向药物所有特定突变位点)和对照组用的靶细胞(包含第一类靶向药物所有特定突变位点所对应的野生型序列)。(2)杀伤实验(此部分实验方法可见专利号202111656464.4)：将与肿瘤细胞系HLA基因型部分匹配的健康志愿者，采集分离PBMC。将PBMC及T细胞分离培养，将PBMC培养成的DC细胞的过程中，于培养第3天加入25μg/mL对应的供试品(加入抗原肽S1作为裸多肽组；复合纳米疫苗为纳米疫苗组；鱼精蛋白组为功能对照组；不加抗原组作为阴性对照)后再加入细胞因子刺激诱导其为成熟DC(mDC)，并将mDC与初始T细胞按照1:30进行共刺激培养，取成熟DC与初始T细胞共刺激后的细胞作为效应细胞，培养一周后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将smo15-ASG(含有smo15-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将smow7-AGS(含有smow7-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图11所示，纳米疫苗组诱导的效应T细胞对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤效率在50％-90％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明复合纳米疫苗组对靶细胞起到了杀伤作用。复合纳米疫苗组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达85％以上。图11标识：**表示p<0.01，***表示p<0.001。
实施例15
第二类靶向药物的复合纳米疫苗的体外对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤实验
实验目的：验证复合纳米疫苗在体外对具有BTK突变产生耐药的依鲁替尼Ibrutinib的特定突变位点的肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记BTK5(含有BTK5-pcDNA3.1(+))和BTKw2(含有BTKw2-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组(包含第二类靶向药物所有特定突变位点)和对照组用的靶细胞(包含第二类靶向药物所有特定突变位点所对应的野生型序列)。(2)杀伤实验：将与肿瘤细胞系HLA基因型部分匹配的健康志愿者，采集分离单个核细胞(PBMC)。将PBMC及T细胞分离培养，将PBMC培养成的DC细胞的过程中，于培养第3天加入25μg/mL对应的供试品(加入抗原肽S2作为裸多肽组；复合纳米疫苗为纳米疫苗组；鱼精蛋白组为功能对照组；不加抗原组作为阴性对照)后再加入细胞因子刺激诱导其为成熟DC(mDC)，并将mDC与初始T细胞按照1:30进行共刺激培养，取成熟DC与初始T细胞共刺激后的细胞，培养一周后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将BTK5(含有BTK5-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将BTKw2(含有BTKw2-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图12所示，纳米疫苗组诱导的效应T细胞对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤效率在50％-90％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明复合纳米疫苗组对靶细胞起到了杀伤作用。复合纳米疫苗组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达85％以上。图12标识：**表示p<0.01，***表示p<0.001。
实施例16
第三类靶向药物的复合纳米疫苗的体外对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤实验
实验目的：验证复合纳米疫苗在体外对具有AR耐药突变的一些抗雄激素类药物如阿比特龙等的特定突变位点的肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记AR4(含有AR4-pcDNA3.1(+))和ARw2(含有ARw2-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组(包含第三类靶向药物所有特定突变位点)和对照组用的靶细胞(包含第三类靶向药物所有特定突变位点所对应的野生型序列)。(2)杀伤实验：将与肿瘤细胞系HLA基因型部分匹配的健康志愿者，采集分离单个核细胞(PBMC)。将PBMC及T细胞分离培养，将PBMC培养成的DC细胞的过程中，于培养第3天加入25μg/mL对应的供试品(加入抗原肽S3作为裸多肽组；复合纳米疫苗为纳米疫苗组；鱼精蛋白组为功能对照组；不加抗原组作为阴性对照)后再加入细胞因子刺激诱导其为成熟DC(mDC)，并将mDC与初始T细胞按照1:30进行共刺激培养，取成熟DC与初始T细胞共刺激后的细胞，培养一周后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将AR4(含有AR4-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将ARw2(含有ARw2-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔(可删除)。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图13所示，纳米疫苗组诱导的效应T细胞对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤效率在60％-95％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明复合纳米疫苗组对靶细胞起到了杀伤作用。复合纳米疫苗组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达90％以上。图13标识：**表示p<0.01，***表示p<0.001。
实施例17
第四类靶向药物的复合纳米疫苗体外对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤实验
实验目的：验证复合纳米疫苗在体外对具有BRAF耐药突变的一些菲尼类药物的特定突变位点的肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记ME7(ME7-pcDNA3.1(+))和MEw5(含有MEw5-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组(包含第四类靶向药物所有特定突变位点)和对照组用的靶细胞(包含第四类靶向药物所有特定突变位点所对应的野生型序列)。(2)杀伤实验：将与肿瘤细胞系HLA基因型部分匹配的健康志愿者，采集分离单个核细胞(PBMC)。将PBMC及T细胞分离培养，将PBMC培养成的DC细胞的过程中，于培养第3天加入25μg/mL对应的供试品(加入抗原肽S4作为裸多肽组；复合纳米疫苗为纳米疫苗组；鱼精蛋白组为功能对照组；不加抗原组作为阴性对照)后再加入细胞因子刺激诱导其为成熟DC(mDC)，并将mDC与初始T细胞按照1:30进行共刺激培养，取成熟DC与初始T细胞共刺激后的细胞，培养一周后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将ME7(ME7-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将MEw5(含有MEw5-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔(可删除)。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图14所示，纳米疫苗组诱导的效应T细胞对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤效率在60％-95％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明复合纳米疫苗组对靶细胞起到了杀伤作用。复合纳米疫苗组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达90％以上。图14标识：**表示p<0.01，***表示p<0.001。
实施例18
第五类靶向药物的复合纳米疫苗体外对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤实验；
实验目的：验证复合纳米疫苗在体外对具有ALK、MET等融合基因的一些酪氨酸激酶抑制剂的特定突变位点的肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：
(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记ALK10(ALK10-pcDNA3.1(+))和ALKw5(含有
ALKw5-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组(包含第五类靶向药物所有特定突变位点)和对照组用的靶细胞(包含第五类靶向药物所有特定突变位点所对应的野生型序列)。(2)杀伤实验：将与肿瘤细胞系HLA基因型部分匹配的健康志愿者，采集分离单个核细胞(PBMC)。将PBMC及T细胞分离培养，将PBMC培养成的DC细胞的过程中，于培养第3天加入25μg/mL对应的供试品(加入抗原肽S5作为裸多肽组；复合纳米疫苗为纳米疫苗组；鱼精蛋白组为功能对照组；不加抗原组作为阴性对照)后再加入细胞因子刺激诱导其为成熟DC(mDC)，并将mDC与初始T细胞按照1:30进行共刺激培养，取成熟DC与初始T细胞共刺激后的细胞,培养一周后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将ALK10(ALK10-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将ALKw5(含有ALKw5-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔(可删除)。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/mL，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图15所示，纳米疫苗组诱导的效应T细胞对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤效率在60％-95％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明复合纳米疫苗组对靶细胞起到了杀伤作用。复合纳米疫苗组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达90％以上。图15标识：**表示p<0.01，***表示p<0.001。
实施例19
第六类靶向药物的复合纳米疫苗体外对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤实验；
实验目的：验证复合纳米疫苗在体外对具有EGFR通路的激酶抑制剂的特定突变位点的肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记mut92(mut46-hygro(+)，mut46-zeo(+))和wid8(含有wid8-hygro(+))靶细胞，分别作为实验组(包含第六类靶向药物所有特定突变位点)和对照组用的靶细胞(包含第六类靶向药物所有特定突变位点所对应的野生型序列)。(2)杀伤实验：将与肿瘤细胞系HLA基因型部分匹配的健康志愿者，采集分离单个核细胞(PBMC)。将PBMC及T细胞分离培养，将PBMC培养成的DC细胞的过程中，于培养第3天加入25μg/mL对应的供试品(加入抗原肽S6作为裸多肽组；复合纳米疫苗为纳米疫苗组；鱼精蛋白组为功能对照组；不加抗原组作为阴性对照)后再加入细胞因子刺激诱导其为成熟DC(mDC)，并将mDC与初始T细胞按照1:30进行共刺激培养，取成熟DC与初始T细胞共刺激后的细胞,培养一周后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将mut92(mut46-hygro(+)，mut46-zeo(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将wid8(含有wid8-hygro(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图16所示，纳米疫苗组诱导的效应T细胞对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤效率在60％-95％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明复合纳米疫苗组对靶细胞起到了杀伤作用。复合纳米疫苗组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达92％以上。图16标识：**表示p<0.01，***表示p<0.001。
实施例20
第七类靶向药物的复合纳米疫苗体外对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤实验；
实验目的：验证复合纳米疫苗在体外对具有PI3K/AKT/mTOR通路的依维莫司等激酶抑制剂的特定突变位点的肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记MEM3(含有MEM3-pcDNA3.1(+))和MEMw3(含有MEMw3-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组(包含第七类靶向药物所有特定突变位点)和对照组用的靶细胞(包含第七类靶向药物所有特定突变位点所对应的野生型序列)。(2)杀伤实验：将与肿瘤细胞系HLA基因型部分匹配的健康志愿者，采集分离单个核细胞(PBMC)。将PBMC及T细胞分离培养，将PBMC培养成的DC细胞的过程中，于培养第3天加入25μg/mL对应的供试品(加入抗原肽S7作为裸多肽组；复合纳米疫苗为纳米疫苗组；鱼精蛋白组为功能对照组；不加抗原组作为阴性对照)后再加入细胞因子刺激诱导其为成熟DC(mDC)，并将mDC与初始T细胞按照1:30进行共刺激培养，取成熟DC与初始T细胞共刺激后的细胞,培养一周后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将MEM3(含有MEM3-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将MEMw3(含有MEMw3-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图17所示，纳米疫苗组诱导的效应T细胞对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的杀伤效率在50％-90％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明复合纳米疫苗组对靶细胞起到了杀伤作用。复合纳米疫苗组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达80％以上。图17标识：**表示p<0.01，***表示p<0.001。
将肿瘤靶向药物根据其机制和耐药突变聚类分析归为7大类。根据以上7个实施例，可知本发明提供的针对7类肿瘤靶向药物、包含改性耐药突变抗原多肽的复合纳米疫苗可以覆盖常见的肿瘤靶向药物，可以高效地特异性杀伤带有耐药突变抗原的肿瘤细胞、有效降低肿瘤耐药性发生概率、延缓耐药性产生、延长肿瘤靶向药物有效作用时间，从而增加患者的疾病响应率，具有广谱性，可降低医疗成本。采用多靶点联合的设计可以有效增加组合疫苗对带有耐药突变抗原的肿瘤细胞的特异性杀伤效果，进一步延缓肿瘤耐药性产生、延长靶向药物有效作用时间。
在本说明书的描述中，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种复合纳米疫苗，其特征在于：包括改性耐药突变抗原多肽、鱼精蛋白以及佐剂CpGODN；所述改性耐药突变抗原多肽是通过酸性氨基酸片段修饰耐药突变抗原多肽的N端和C端而获得的，改性耐药突变抗原多肽序列所采用的改性抗原序列公式为：DEDEDKK-耐药突变抗原多肽序列-KKDEDED；所述耐药突变抗原多肽序列选自如下之一：突变位点SMO_A459V对应的耐药突变抗原多肽序列MLRLGIFGFLVFGFVLITFSC，突变位点BTK_C481F对应的耐药突变抗原多肽序列FIITEYMANGFLLNYLREMRHK，突变位点AR_T878A对应的耐药突变抗原多肽序列PIARELHQFAFDLLIKSHM，突变位点NRAS_Q61R对应的耐药突变抗原多肽序列CLLDILDTAGREEYSAMRDQYKK，突变位点ALK_G1202R对应的耐药突变抗原多肽序列RFILLELMAGRDLKSFLRETR，突变位点EGFR_T790M对应的耐药突变抗原多肽序列ICLTSTVQLIMQLMPFGCLLD，或突变位点MTOR_F2108L对应的耐药突变抗原多肽序列TQAWDLYYHVLRRISKQLPQ。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述SMO_A459V是针对维莫德吉的耐药突变，BTK-C481F是针对依鲁替尼、奥布替尼的耐药突变，AR_T878A是针对阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑、阿帕他胺、达罗他胺的耐药突变，NRAS_Q61R是针对达拉菲尼、派姆单抗、威罗菲尼的耐药突变，ALK_G1202R是针对阿雷替尼、色瑞替尼、克唑替尼、恩沙替尼的耐药突变，EGFR_T790M是针对布格替尼、阿法替尼、厄洛替尼、吉非替尼、贝福替尼、埃克替尼、奈拉替尼、伏美替尼、达可替尼、阿美替尼、酪氨酸激酶抑制剂类药物、特瓦替尼的耐药突变，MTOR_F2108L是针对依维莫司、雷帕霉素、西罗莫司的耐药突变。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述复合纳米疫苗中改性耐药突变抗原多肽和鱼精蛋白的质量比为1:1至10∶1。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述复合纳米疫苗中改性耐药突变抗原多肽和鱼精蛋白的质量比为5:1至10∶1。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述复合纳米疫苗中改性耐药突变抗原多肽和佐剂的质量比为1:1至20∶1。
6.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述复合纳米疫苗中改性耐药突变抗原多肽和佐剂的质量比为5:1至10∶1。
7.一种权利要求1所述疫苗的制备方法，包括如下步骤：通过酸性氨基酸片段修饰，使具有目标耐药突变的改性耐药突变抗原多肽整体带有负电荷，改性耐药突变抗原多肽命名为Aa-Neo；将Aa-Neo、鱼精蛋白以及核酸类佐剂分子分别完全溶于水溶液中，得到一定浓度的Aa-Neo溶液、鱼精蛋白溶液和佐剂溶液；首先将Aa-Neo溶液和佐剂溶液均匀混合得到均匀的初始混合物溶液，再加入阳离子鱼精蛋白溶液，混合均匀得到具有稳定颗粒尺寸的复合纳米疫苗。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210387647.9A CN114767841B (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 复合纳米疫苗及其制备方法、组合疫苗及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210387647.9A CN114767841B (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 复合纳米疫苗及其制备方法、组合疫苗及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114767841A CN114767841A (zh) | 2022-07-22 |
| CN114767841B true CN114767841B (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=82429751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210387647.9A Active CN114767841B (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 复合纳米疫苗及其制备方法、组合疫苗及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114767841B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1405150A (zh) * | 2001-09-17 | 2003-03-26 | 中国科学院过程工程研究所 | 蛋白质修饰剂及其制备方法和用途 |
| CN102481360A (zh) * | 2009-06-25 | 2012-05-30 | 生物领先公司 | 包含聚γ谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物 |
| EP2809354A1 (en) * | 2012-01-31 | 2014-12-10 | Curevac GmbH | Negatively charged nucleic acid comprising complexes for immunostimulation |
| CN109887553A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-06-14 | 杭州纽安津生物科技有限公司 | 针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗及其设计方法 |
| CN109998998A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-07-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种纳米疫苗及其制备方法 |
| CN112516297A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-03-19 | 潍坊医学院 | 一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗的制备方法及其应用 |
-
2022
- 2022-04-13 CN CN202210387647.9A patent/CN114767841B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1405150A (zh) * | 2001-09-17 | 2003-03-26 | 中国科学院过程工程研究所 | 蛋白质修饰剂及其制备方法和用途 |
| CN102481360A (zh) * | 2009-06-25 | 2012-05-30 | 生物领先公司 | 包含聚γ谷氨酸-壳聚糖纳米颗粒的佐剂组合物 |
| EP2809354A1 (en) * | 2012-01-31 | 2014-12-10 | Curevac GmbH | Negatively charged nucleic acid comprising complexes for immunostimulation |
| CN109887553A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-06-14 | 杭州纽安津生物科技有限公司 | 针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗及其设计方法 |
| CN109998998A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-07-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种纳米疫苗及其制备方法 |
| CN112516297A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-03-19 | 潍坊医学院 | 一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗的制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 鱼精蛋白增强抗原诱导早期体液免疫反应的研究;倪敬轩等;《中国预防兽医学报》;第40卷(第4期);342-346 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114767841A (zh) | 2022-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jang et al. | ExoSTING, an extracellular vesicle loaded with STING agonists, promotes tumor immune surveillance | |
| AU2013211871B2 (en) | Biomarkers and combination therapies using oncolytic virus and immunomodulation | |
| Zhang et al. | STING agonist-loaded, CD47/PD-L1-targeting nanoparticles potentiate antitumor immunity and radiotherapy for glioblastoma | |
| KR20170100660A (ko) | 신규 인공 핵산 분자 | |
| Feola et al. | A novel immunopeptidomic-based pipeline for the generation of personalized oncolytic cancer vaccines | |
| CN109887553B (zh) | 针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗及其设计方法 | |
| WO2021239471A1 (en) | Cancer treatment strategies using arenavirus vectors | |
| CN104853764B (zh) | 用于预防和治疗癌症的msi-特异性移码肽(fsp) | |
| CN113943374B (zh) | 一种白介素15及其受体的多肽复合物 | |
| WO2020180713A1 (en) | Design, manufacture, and use of personalized cancer vaccines | |
| CN114767841B (zh) | 复合纳米疫苗及其制备方法、组合疫苗及其制备方法 | |
| CN112899233B (zh) | 一种急性淋巴细胞性白血病小鼠模型的构建方法 | |
| CN115998851A (zh) | 一种个体化mRNA组合物、载体、mRNA疫苗及其应用 | |
| Chen et al. | Comprehensive mutanome analysis of Lewis lung cancer reveals immunogenic neoantigens for therapeutic vaccines | |
| Johanns et al. | Integrating multisector molecular characterization into personalized peptide vaccine design for patients with newly diagnosed glioblastoma | |
| CN115808528B (zh) | 溶瘤单纯疱疹病毒vp5蛋白与人白细胞抗原e的互作方法及应用 | |
| CN115785204B (zh) | 肺癌特异性分子靶标08及其用途 | |
| US20230054656A1 (en) | Diagnostic and prognostic utility of exosomes in immunotherapy | |
| Rastogi et al. | B cells require licensing by dendritic cells to serve as primary antigen-presenting cells for plasmid DNA | |
| WO2024086799A2 (en) | Lipid nanoparticles and methods of using the same for treating cell proliferative diseases and disorders | |
| Ding et al. | A preliminary study on the activation and antigen presentation of hepatitis B virus core protein virus-like particle-pulsed bone marrow-derived dendritic cells | |
| CN110072876A (zh) | 多肽及其应用 | |
| Alsaiari et al. | Zeolitic imidazolate frameworks activate endosomal Toll-like receptors and potentiate immunogenicity of SARS-CoV-2 spike protein trimer | |
| Shekarian et al. | IMMU-40. IMMUNE PROFILING OF MATCHED PRIMARY AND RECURRENT GLIOBLASTOMA TUMORS IDENTIFIED CD64 AS A NEGATIVE PREDICTOR FOR SURVIVAL | |
| WO2022226535A1 (en) | Vaccine for sars-cov-2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |