CN1254496C - 制备分枝型聚乙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的制备分枝型聚乙二醇的方法，步骤如下：先分别制备赖氨酸乙酯盐酸盐和羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇，将其均匀混配后，再依次加入TEA，DCC，NHS，反应得到的产物脱保护后，再经过凝胶过滤分离，即可得到分枝型聚乙二醇，分枝型聚乙二醇应用广泛，即可修饰蛋白质等大分子，也可修饰小分子药物及表面；本发明的方法简单，易操作，而且只需保护赖氨酸的羧基，不需要活化的氨基和羧基；反应在室温进行，不需控制pH值；所用原料和试剂价格便宜；产率高达65%左右。
Description
技术领域
本发明属于生物医学和蛋白质化学领域，特别涉及一种制备分枝型聚乙二醇的方法。
背景技术
随着生物技术的快速发展，越来越多具有生物活性的多肽，蛋白质，酶被人们用于临床治疗。然而这些生物大分子在直接应用于人体时存在着一些缺陷。这些缺陷包括：1.快速排除，2.生物降解，3.引起免疫反应等等。因此，蛋白质特别是药用蛋白质的化学修饰至今仍然是一个热门的研究领域。许多天然及合成的分子正在被用做化学修饰。聚乙二醇这种合成的分子由于其生物相容性，对人体无毒，具有能够降低被修饰物的抗原性等优点被广泛用于蛋白质，多肽，酶甚至一些小分子药物的修饰。
聚乙二醇(PEG)是一种水溶性的聚合物。当与蛋白质(还有多肽，酶及其他生物活性分子)共价结合时，聚乙二醇能够弥补这些蛋白质分子本身的不足，扩大其潜在的应用。与未修饰的蛋白质对照物相比，PEG-蛋白质结合物的这种改良了的药理学性质激发了人们开发这种结合物作为制剂的热情。例如，PEG-腺苷脱氨酶已获得FDA的批准；PEG修饰的细胞因子已被制成，并且PEG修饰的GM-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)显示了两种不相关联的生物学性质。在研究中人们发现，PEG对生物活性物质的修饰效果与所使用的PEG分子的分子量及特定的修饰度相关。一般说来，所用的PEG的分子量越大，修饰度越高，PEG-蛋白质结合物的抗原性越小，排除时间越长，但同时结合物的生物活性会降低。这种生物活性的降低主要是由于过度修饰造成的。为了解决这个问题，人们合成了分枝型PEG分子。用分枝型PEG修饰蛋白质，与直链PEG分子相比，在修饰度相同的情况下，连接的PEG分子量则会成倍增加。这种增加相对于直链PEG来说，具有两个优点：1.扩大结合物分子大小，延长体内排除时间，2.分枝型PEG能够更有效地阻遏水解酶类和抗体与蛋白质-PEG结合物的接触，避免被水解和引起免疫反应。因此，在拥有相同的修饰度的情况下，分枝型PEG的修饰效果要比直链PEG好得多。
分枝型PEG的合成由于起始物的不同有几种不同的合成途径：
1.起始物为mPEG-OH，其合成路线为：
缺陷在于所用试剂昂贵，合成步骤多；
2.起始物为mPEG-CHO，其合成路线为：
缺陷在于产率很低，产物难分离：
3.起始物为mPEG-COOH，其合成路线为
缺陷在于虽然产率较高，但反应条件较难控制；
上述合成方法的上述缺陷造成分枝型聚乙二醇的产品价格昂贵，在很大程度上限制了分枝型聚乙二醇在研究和实践中的应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述制备分枝型聚乙二醇的方法存在的诸多缺陷，而提供一种新的制备分枝型聚乙二醇的方法。
分枝型聚乙二醇具有单个可活化官能团，在结构上是两个PEG-COOH分子对于赖氨酸分子的二取代产物，其分子为：
本发明的技术方案如下：
本发明提供的制备分枝型聚乙二醇的方法，其工艺步骤如下：
1、制备赖氨酸乙酯盐酸盐
将赖氨酸溶于无水乙醇，在搅拌条件下通入干燥的氯化氢气体至饱和，加热回流使赖氨酸溶解，将此溶液放置过夜；然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢；最后用无水乙醚，进行赖氨酸乙酯盐酸盐的结晶；再经过滤，洗涤，干燥得到赖氨酸乙酯盐酸盐淡黄色晶体；
2、制备羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇
将mPEG溶于干燥的二氯甲烷中，加入活化的二氧化锰，均匀混合后，室温下搅拌过夜；过滤除去催化剂，通过减压蒸去溶剂得到中间氧化产物；
将得到的中间氧化产物溶于体积比为3％过氧化氢水溶液，反应24小时后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.02M HCl洗脱，得到羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇；
3、制备分枝型聚乙二醇
1)将步骤1所得的赖氨酸乙酯盐酸盐与步骤2所得的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇以1∶2-4的摩尔比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入过量的三乙胺，二环己基碳二亚胺，氮—羟基琥珀酰亚胺，室温下反应24小时后，过滤除去所生成的二环己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状产物；将得到的白色粉末状产物溶于1N NaOH，加入氯化钠，反应1-2小时后，用盐酸将溶液调至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取至少3次，将萃取所得的有机相合并，并用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏浓缩，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状的物质。
2)将上述所得产物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50层析柱进行以水为洗脱液的洗脱分离，每管10毫升收集组分；将相对于分枝型聚乙二醇的组分合并，浓缩，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇结晶，得到纯化的分枝型聚乙二醇；
所述的赖氨酸为L-赖氨酸；所述的mPEG为相对分子质量是750-10000之间的单甲氧基聚乙二醇。
本发明的方法制备的分枝型聚乙二醇可用于修饰蛋白质等生物大分子，也可修饰小分子药物及其他表面。
本发明具有以下特点：
1、发明基于多肽合成中接肽原理，只需保护赖氨酸的羧基，不需要活化的氨基和羧基；
2、反应在室温进行，不需控制pH值；
3、所用原料和试剂价格便宜；
4、反应在有机相中进行；
5、产率高，可达65％。
附图说明
附图1为本发明制备方法的步骤1所得产物赖氨酸酯盐酸盐的薄板层析图谱；样品1为赖氨酸酯盐酸盐，样品2为赖氨酸；层析条件：固定相为硅胶G60；展开剂为正丁醇/甲醇(7/3)；显色剂为茚三酮；
附图2为本发明制备方法的步骤1所得产物赖氨酸酯盐酸盐的红外谱图；其特征吸收为1740.94cm-1(酯羰基的吸收)；3422.24(-N-H的吸收)；
附图3为本发明制备方法的步骤2所得产物的红外谱图；其特征吸收为1745.50cm-1(酸羰基的吸收)；
附图4为本发明制备方法的步骤3所得产物的MALDI-TOF谱图；
附图5为本发明制备方法的步骤3所得产物的GPC谱图；
附图6为本发明制备方法的目的产物的1H NMR谱图；
具体实施方式
实施例1，用本发明的方法制备一种分枝型聚乙二醇，其步骤为：
1、制备赖氨酸乙酯盐酸盐
将L赖氨酸溶于无水乙醇，在搅拌条件下通入干燥的氯化氢气体至饱和，加热回流使L-赖氨酸溶解，将此溶液放置过夜；然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢；最后用无水乙醚，进行赖氨酸乙酯盐酸盐的结晶；再经过滤，洗涤，干燥得到赖氨酸乙酯盐酸盐淡黄色晶体；
2、制备分子量为5000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇
将mPEG5000溶于干燥的二氯甲烷中，加入活化的二氧化锰，均匀混合后，室温下搅拌过夜；过滤除去催化剂，通过减压蒸去溶剂得到中间氧化产物；
将得到的中间氧化产物溶于体积比为3％过氧化氢水溶液，反应24小时后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.02M HCl洗脱，得到分子量为5000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇；
3、制备纯化的分枝型聚乙二醇
1)将步骤1所得的赖氨酸乙酯盐酸盐与步骤2所得的分子量为5000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇以1∶2的摩尔比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入过量的三乙胺，二环己基碳二亚胺，氮-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应24小时后，过滤除去所生成的二环己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状产物；将得到的白色粉末状产物溶于1N NaOH，加入氯化钠，反应1-2小时后，用盐酸将溶液调至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取3次，将萃取所得的有机相合并，并用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏浓缩，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状的物质；
MALDI-TOF(图3)谱图表明：此产物是分子量为5000的羧甲基化的单甲氯聚乙二醇和分子量为10000的羧甲基化的单甲氯聚乙二醇的混合物；GPC谱图表明：分枝型PEG的产率为61％；
2)将上述所得产物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50层析柱进行以水为洗脱液的洗脱分离，每管10毫升收集组分；将相对于分枝型聚乙二醇的组分合并，浓缩，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇结晶，得到纯化的目的产物分枝型聚乙二醇。
目的产物的结构可通过MALDI-TOF(图3)谱图和1H NMR(图6)证实。
实施例2，用本发明的方法制备一种分枝型聚乙二醇，其步骤为：
1、制备赖氨酸乙酯盐酸盐
将L赖氨酸溶于无水乙醇(1∶8的摩尔比)，在搅拌条件下通入干燥的氯化氢气体至饱和，加热回流使L-赖氨酸溶解，将此溶液放置过夜；然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢；最后用无水乙醚，进行赖氨酸乙酯盐酸盐的结晶；再经过滤，洗涤，干燥得到赖氨酸乙酯盐酸盐淡黄色晶体；
2、制备分子量为2000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇
将25克的mPEG2000溶于干燥的二氯甲烷中，加入20克活化的二氧化锰，均匀混合后，室温下搅拌过夜；过滤除去催化剂，通过减压蒸去溶剂得到中间氧化产物；
将得到的中间氧化产物溶于体积比为3％过氧化氢水溶液，反应24小时后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.02M HCl洗脱，得到分子量为2000的羧甲基化的单甲氯聚乙二醇；
3、制备纯化的分枝型聚乙二醇
1)将步骤1所得的赖氨酸乙酯盐酸盐与步骤2所得的分子量为2000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇以1∶4的摩尔比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入过量的三乙胺，二环己基碳二亚胺，氮-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应24小时后，过滤除去所生成的二环己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状产物9.5克；将得到的白色粉末状产物溶于1N NaOH，加入氯化钠，反应1-2小时后，用盐酸将溶液调至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取5次，将萃取所得的有机相合并，并用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏浓缩至50毫升后，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状的物质9.0克；
MALDI-TOF(图3)谱图表明：此产物是分子量为2000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇和分子量为4000的羧甲基化的单甲氯聚乙二醇的混合物；GPC谱图表明：分枝型PEG的产率为61％；
2)将上述所得产物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50层析柱进行以水为洗脱液的洗脱分离，每管10毫升收集组分；将相对于分枝型聚乙二醇的组分合并，浓缩，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇结晶，得到纯化的目的产物分枝型聚乙二醇。
目的产物的结构可通过MALDI-TOF(图3)谱图和1H NMR(图6)证实。
实施例3，用本发明的方法制备一种分枝型聚乙二醇，其步骤为：
1、制备赖氨酸乙酯盐酸盐
将L赖氨酸溶于无水乙醇，在搅拌条件下通入干燥的氯化氢气体至饱和，加热回流使L-赖氨酸溶解，将此溶液放置过夜；然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢；最后用无水乙醚，进行赖氨酸乙酯盐酸盐的结晶；再经过滤，洗涤，干燥得到赖氨酸乙酯盐酸盐淡黄色晶体；
2、制备分子量为750的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇
将mPEG750溶于干燥的二氯甲烷中，加入活化的二氧化锰，均匀混合后，室温下搅拌过夜；过滤除去催化剂，通过减压蒸去溶剂得到中间氧化产物；
将得到的中间氧化产物溶于体积比为3％过氧化氢水溶液，反应24小时后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.02M HCl洗脱，得到分子量为750的羧甲基化的单甲氯聚乙二醇；
3、制备纯化的分枝型聚乙二醇
1)将步骤1所得的赖氨酸乙酯盐酸盐与步骤2所得的分子量为5000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇以1∶2的摩尔比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入过量的三乙胺，二环己基碳二亚胺，氮-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应24小时后，过滤除去所生成的二环己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状产物；将得到的白色粉术状产物溶于1N NaOH，加入氯化钠，反应1-2小时后，用盐酸将溶液调至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取3次，将萃取所得的有机相合并，并用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏浓缩，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状的物质；
MALDI-TOF(图3)谱图表明：此产物是分子量为750的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇和分子量为15000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇的混合物；GPC谱图表明：分枝型PEG的产率为61％；
2)将上述所得产物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50层析柱进行以水为洗脱液的洗脱分离，每管10毫升收集组分；将相对于分枝型聚乙二醇的组分合并，浓缩，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇结晶，得到纯化的目的产物分枝型聚乙二醇。
目的产物的结构可通过MALDI-TOF(图3)谱图和1H NMR(图6)证实。
实施例4，用本发明的方法制备一种分枝型聚乙二醇，其步骤为：
1、制备赖氨酸乙酯盐酸盐
将L赖氨酸溶于无水乙醇，在搅拌条件下通入干燥的氯化氢气体至饱和，加热回流使L-赖氨酸溶解，将此溶液放置过夜；然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢；最后用无水乙醚，进行赖氨酸乙酯盐酸盐的结晶；再经过滤，洗涤，干燥得到赖氨酸乙酯盐酸盐淡黄色晶体；
2、制备分子量为10000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇
将mPEG10000溶于干燥的二氯甲烷中，加入活化的二氧化锰，均匀混合后，室温下搅拌过夜；过滤除去催化剂，通过减压蒸去溶剂得到中间氧化产物；
将得到的中间氧化产物溶于体积比为3％过氧化氢水溶液，反应24小时后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.02M HCl洗脱，得到分子量为10000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇；
3、制备纯化的分枝型聚乙二醇
1)将步骤1所得的赖氨酸乙酯盐酸盐与步骤2所得的分子量为10000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇以1∶2的摩尔比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入过量的三乙胺，二环己基碳二亚胺，氮-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应24小时后，过滤除去所生成的二环己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状产物；将得到的白色粉末状产物溶于1N NaOH，加入氯化钠，反应1-2小时后，用盐酸将溶液调至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取4次，将萃取所得的有机相合并，并用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏浓缩，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状的物质；
MALDI-TOF(图3)谱图表明：此产物是分子量为10000的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇和分子量为20000的分支型聚乙二醇的混合物；GPC谱图表明：分枝型PEG的产率为61％；
2)将上述所得产物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50层析柱进行以水为洗脱液的洗脱分离，每管10毫升收集组分；将相对于分枝型聚乙二醇的组分合并，浓缩，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇结晶，得到纯化的目的产物分枝型聚乙二醇。
目的产物的结构可通过MALDI-TOF(图3)谱图和1H NMR(图6)证实。
Claims (3)
1、一种制备分枝型聚乙二醇的方法，其工艺步骤如下：
1)制备赖氨酸乙酯盐酸盐
将赖氨酸溶于无水乙醇，在搅拌条件下通入干燥的氯化氢气体至饱和，加热回流使赖氨酸溶解，将此溶液放置过夜；然后减压蒸馏除去过量的乙醇和氯化氢；最后用无水乙醚，进行赖氨酸乙酯盐酸盐的结晶；再经过滤，洗涤，干燥得到赖氨酸乙酯盐酸盐淡黄色晶体；
2)制备羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇
将mPEG溶于干燥的二氯甲烷中，加入活化的二氧化锰，均匀混合后，室温下搅拌过夜；过滤除去催化剂，通过减压蒸去溶剂得到中间氧化产物；
将得到的中间氧化产物溶于体积比为3％过氧化氢水溶液，反应24小时后，通过Bio-Rad AG1*2树脂柱，除去中性物质，再用0.02M HCl洗脱，得到羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇；
3)制备纯化的分枝型聚乙二醇
(1)将步骤1)所得的赖氨酸乙酯盐酸盐与步骤2所得的羧甲基化的单甲氧基聚乙二醇以1∶2-4的摩尔比溶于干燥二氯甲烷中，然后加入过量的三乙胺，二环己基碳二亚胺，氮-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应24小时后，过滤除去所生成的二环己基脲；然后加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状产物；将得到的白色粉末状产物溶于1N NaOH，加入氯化钠，反应1-2小时后，用盐酸将溶液调至pH＝3；然后用二氯甲烷萃取至少3次，将萃取所得的有机相合并，并用无水硫酸镁干燥，减压蒸馏浓缩，加入冷乙醚沉淀，得到白色粉末状的物质；
(2)将上述所得产物，每0.2克溶于1毫升水，分批用BiogelP100(100-200mesh)5*50层析柱进行以水为洗脱液的洗脱分离，每管10毫升收集组分；将相对于分枝型聚乙二醇的组分合并，浓缩，然后用二氯甲烷抽提，乙醚沉淀，最后用乙醇结晶，得到纯化的分枝型聚乙二醇。
2、按权利要求1所述的制备分枝型聚乙二醇的方法，其特征在于，所述的氨基酸为L-赖氨酸。
3、按权利要求1所述的制备分枝型聚乙二醇的方法，其特征在于，所述的mPEG为相对分子质量是750-10000之间的聚合物。
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