CN1183043A - 硫酸化低聚糖的制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

硫酸化低聚糖及其作为抗血管生成、抗转移和/或抗炎症药剂的用途,其中所说的低聚糖具有结构通式Ⅰ:R1－(Rx)n－R2(Ⅰ)其中R1和R2以及每个Rx代表一个单糖单元,所有的单糖单元可以相同也可以不同,相邻的单糖单元由1→2,1→3,1→4和/或1→6糖苷键连接,n是1—6之间的整数。

Description

硫酸化低聚糖的制备方法和用途
发明领域
本发明涉及硫酸化低聚糖，其制备方法及其作为抗血管生成、抗转移和/或抗炎症药剂的用途。
发明背景
硫酸乙酰肝素属于多糖中的葡糖胺聚糖类。它们存在于大多数多细胞动物中并且分布很普遍，位于细胞的表面和大多数组织的细胞外载体(ECM)中(1，2)。硫酸乙酰肝素通常以蛋白多糖的形式存在，在测序和克隆所说分子的核心肽方面具有相当多的进展。比如，至今已经证实在细胞表面至少有八种不同的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)核心多肽(3)。
起初认为HSPG对于细胞表面和ECM的结构起着十分重要的作用。然而，硫酸乙酰肝素链之间存在着显著的结构差异(2，4)，这说明它们对许多生物过程能提供重要的标志信息。因此，虽然乙酰肝素链硫酸酯起初以简单改变由β1→4和α1→4键连接的葡糖苷醛基和N-乙酰葡糖胺基残基的重复被合成，但存在许多后续修饰。将多糖进行N-脱乙酰化和N-位硫酸化，接着进行葡糖苷醛基单元到艾杜糖醛基单元的C5位的立体异构化，以及尿基和葡糖胺基残基的各种O-硫酸化。这些修饰的可变化性导致了约三十种不同的二糖序列的存在，当二糖序列沿着硫酸乙酰肝素链按不同顺序排列时，理论上可形成很多种硫酸乙酰肝素结构。根据这种观点，仅仅存在于柱状细胞中的抗凝血剂多糖肝素代表硫酸乙酰肝素的一种极端形式，其立体异构化和硫酸化已经达到最大化。大多数硫酸乙酰肝素包含由相对较长骨架的非硫酸化单元连接较短骨架的高度硫酸化残基。
目前已经清楚地证实硫酸乙酰肝素在很大范围的生物过程中起着关键性的作用(2-4)。尤其是它们能作为参与细胞-细胞间相互作用的粘附分子的配体(5，6)，参与细胞-ECM间相互作用(5，6)以及作为诸如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(7，8)和血管内皮生长因子(VEGF)(9)之类的生长因子的必不可少的细胞表面受体。HSPG也是代表细胞迁移的主要屏降的基膜的一种关键组分(10)。只有当细胞解聚为一定范围的可降解的酶(包括一种称为肝素酶的裂解硫酸乙酰肝素链的内糖苷酶)时，基膜屏障才被破坏(11)。
已经知道许多硫酸乙酰肝素参与的生物过程涉及到对独特的硫酸乙酰肝素的结构的识别，其中最重要的是这些硫酸基团在多糖链中的位置(3)。比如，已经证明所限定的硫酸乙酰肝素序列是由酸性的和碱性的FGF(14-16)识别并由肝素酶裂解。基于这些观察，本发明发明人的一个目的是合成能阻止硫酸乙酰肝素被生长因子识别并能抑制硫酸乙酰肝素被肝素酶裂解的硫酸化低聚糖。在阻断生长因子的情况下，曾经认为硫酸乙酰肝素的低分子量模拟物应当特别有效，因为目前认为细胞表面的硫酸乙酰肝素介导生长因子与它们的受体交联(17)。并且，通过充当肝素酶不能裂解的底物，硫酸化低聚糖应当是有效的肝素酶抑制剂。
具有生长因子抑制活性的硫酸化低聚糖有许多的临床用途。结合生长因子(比如bFGF和VEGF)的肝素/硫酸乙酰肝素是血管生成的有效的诱导物(18)。在成年人中血管生成的出现是相当少的，除非是伤病治愈。然而在成年人中存在着大量的“血管生成依赖性疾病”，这些疾病中血管生成至关重要(18-20)。最重要的是与实体肿瘤生长有关的血管生成、增生性视网膜病和类风湿性关节炎。具有阻断诸如bFGF和VEGF之类的关键血管生成生长因子作用的硫酸化低聚糖尤其可用来治疗这些血管生成依赖性疾病。
类似地，抑制肝素酶作用的硫酸化低聚糖具有许多临床用途。内下皮基膜代表内皮细胞，肿瘤细胞和白血球穿过血管壁的主要的生理屏障。肝素酶与一定范围的解蛋白酶(比如血纤维蛋白溶酶，基质金属蛋白酶)组合，通过入侵细胞，在基膜降解过程中起着不可缺少的作用(11-13，21)。因此，通过防止基膜降解，具有肝素抑制活性的硫酸化低聚糖应该具有抗转移和抗炎活性，此外，还可以抑制早期的血管生成。在许多临床场合下，比如高度转移的实体肿瘤和类风湿关节炎的治疗，优选地是使用能同时抑制血管生成生长因子作用和肝素酶的硫酸化低聚糖。
以前的国际专利申请PCT/AU88/00017(公开号WO 88/05301)中公开了在对动物或人类患者进行抗转移或抗炎症治疗中使用诸如肝素和修饰的肝素，岩藻多糖，戊聚糖硫酸，葡聚糖硫酸和角叉胶λ之类的阻断或抑制肝素酶活性的硫酸化的多糖。
在导致本发明的工作中，本发明发明人采用天然存在的低聚糖或全合成的含己糖均聚物的低聚糖制备了硫酸化低聚糖。这些化合物中有些已经被证明是人体血管生成、肿瘤转移和炎症的有效的抑制剂。所获得的数据与硫酸化低聚糖所具有的抑制血管生成生长因子作用和/或肝素酶功能的生物效应相一致，并且制备出了某些对血管生成和肝素酶活性都是强有力的抑制剂的硫酸化低聚糖。
发明概要
本发明一方面提供了硫酸化低聚糖，其中所说的低聚糖具有结构通式I：
                  R1-(Rx)n-R2(I)
其中R1和R2以及每个Rx代表一个单糖单元，所有的单糖单元可以相同也可以不同，相邻的单糖单元由1→2，1→3，1→4和/或1→6糖苷键连接；且n是1-6之间的整数。
本发明中的硫酸化低聚糖基于单糖单元的聚合物，其可以由1→2，1→3，1→4和/或1→6糖苷键连接且可以由3-8个单糖单元组成；优选地，所述低聚糖由3-6个单糖单元(即n为1-4)组成，更优选地由5-6个单糖单元(n为3-4)组成。这些聚合物可以包括只含有一种类型的单糖单元的均聚物或含两种或多种类型的单糖单元的杂聚物。
被连在一起以构成低聚糖的单糖单元优选地是己糖，可以是诸如果糖之类的呋喃糖，或诸如葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔罗糖、半乳糖、艾杜糖或古洛糖之类的吡喃糖。己糖既可以是D-型也可以是L-型构型。
另一方面，本方面提供了具有通式II的新型合成低聚糖：
               Ry-(Ry)n-Ry(II)
其中每一个Ry基团相同且每个代表一个单糖单元，相邻的单糖单元由1→3，1→4和/或1→6糖苷键连接；且n是1-6之间的整数。
在这一特殊方面中，本发明也提供了硫酸化低聚糖，其中所说的低聚糖具有以上的结构通式II。
优选地，在结构式II中的均聚低聚糖中，单糖单元是一种诸如葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔罗糖、半乳糖、艾杜糖或古洛糖之类的己糖。在这些低聚糖中n优选地是1-4，更优选地是3-4。
具有结构通式I和II的低聚糖也包括那些其中所说的单糖单元是衍生化的(尤其单糖单元是单糖的磷酸酯、乙酰化或其它酯衍生物)的化合物。
通常，本发明中的硫酸化低聚糖可通过采用现有技术中已经公开的方法将低聚糖硫酸化制得其相应的O-硫酸衍生物来制备。适宜的硫酸化方法例举如下。待进行硫酸化的低聚糖可以是天然存在的产物，包括诸如棉子糖和水苏糖之类的天然存在的低聚糖，以及由天然存在的多糖通过酶促降解或化学降解而制备的低聚糖(如麦芽四糖，麦芽五糖和麦芽六糖；葡萄三糖，葡萄四糖和葡萄五糖；软骨素四、六和八糖；以及来源于酵母Pichiaholstii的甘露五糖磷酸酯)。
如前所述，属于本发明范围中的硫酸化低聚糖具有肝素酶抑制和/或生长因子抑制活性；并且另一方面，本发明还将以上所描述的硫酸化低聚糖开发为一种在对温血动物(包括人)患者进行治疗的抗血管生成、抗转移和/或抗炎症药剂。
因此，本发明开发一种对需要进行治疗的人或其它温血动物患者进行抗血管生成、抗转移和/或抗炎症治疗的方法，该方法包括向患者施用有效量的至少一种以上所描述的硫酸化低聚糖。
活性组分按治疗有效量来施用。治疗有效量指的是至少部分达到所希望的效果，或推迟将要治疗的特殊病症的开始，抑制它的发展，或同时防止它的开始或发展所需要的施用量。自然，这种施用量取决于将要进行治疗的特殊病症，病症的严重性以及各个患者的参数(包括年龄，身体状况，大小，体重)和同时进行的治疗。这些因素对于本领域普通技术人员来说是已知的，可以不需要进行进一步的解释。通常优选地是施用最大剂量，即符合医学最高安全要求的剂量。然而，本领域普通技术人员将知道，基于药物原因、身体原因或任何其它原因，可施用较低的剂量或可忍受的剂量。
本发明进一步将以上所描述的至少一种硫酸化低聚糖用于人或其它温血动物患者的抗血管生成、抗转移和/或抗炎症治疗药物的制造中。
另外，本发明也提供了一种用于抗血管生成、抗转移和/或抗炎症治疗的药物或兽药组合物，该组合物包含至少一种以上所描述的硫酸化低聚糖以及药理上或兽医学上可接受的载体/和或稀释剂。
这种治疗组合物的配制对于本领域技术人员来说是熟知的。适宜的药学上或兽医学上可接受的载体/和或稀释剂包括任何和所有的普通溶剂、分散介质、填料、固体载体、水溶液、包衣、抗菌和杀真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。在现有技术中将这些介质和试剂用于药物和兽药活性物质是众所周知的，比如在Remingtons药物科学，18版，Mack出版公司，Pensyvania，USA中对其进行过描述。除非是任何普通介质或试剂与活性组分不相容的情况，将它们用于药物和兽药组合物是本发明所期望的。也可以向所述组合物中加入辅助活性组分。
按剂量单位形式来配制组合物是特别有益的，因为这样易于施用且剂量一致。这里所用的剂量单位形式指的是适宜于作为待治疗的人类或动物的单元剂量的物理上的不连续单位；每一单位中含有预定量的估计与所要求的药物或兽药载体和/或稀释剂配合使用可产生所希望的治疗效果的活性组分。本发明中的新的剂量单位形式的规格受制于或取决于(a)活性组分的特性和所要取得的特殊治疗效果，及(b)为了进行特殊治疗而使这种活性组分进行化合的技术中固有的限制。
本发明中的硫酸化低聚糖可用来治疗血管生成依赖性疾病，包括与实体肿瘤生长相关的血管生成，增生性视网膜病和类风温性关节炎，以及用来治疗炎症性疾病和那些其中硫酸化低聚糖的肝素酶抑制活性对抑制白血球渗透特别有用的病症，包括诸如类风湿性关节炎、多部位硬化、胰岛素依赖性糖尿病之类的白血球渗透是关键因素的慢性炎症性疾病；诸如溃疡性结肠炎和Chron病之类的肠道炎症性疾病；异体移植排斥和慢性哮喘病。
除非上下文中另有要求，本说明书中的“含有”一词或变化词“包含”应理解为意指包括所述的整体或整体组，但不排出任何其它的整体或整体组。发明详述
如以上所广泛描述的，本发明涉及硫酸化低聚糖以及其作为抗血管生成、抗转移和/或抗炎症药剂的用途。
一些低聚糖可由天然资源进行进一步硫酸化来获得，然而，更希望的是采用一种合成所限定的链长和立体化学的低聚糖的简单方法。本发明提供了一种从简单起始原料合成和分离己糖低聚物的高收率的改进方法，其中低聚物中的糖单体由1→3，1→4和/或1→6键连接。这种制备己糖低聚物的方法与以前的高收率的制备这种糖低聚物的方法极为不同，其聚合度容易控制并且从这种方法所衍生而来的产品是均一的线形低聚物，很容易用简单的色谱技术分离和提纯。
在科学和专利文献中可发现许多描述制备糖聚合物和低聚物的方法的例子。比如，在一种普遍采用的方法中，可将一种未经改性的糖单体(要么是单独的，要么在溶剂中)在催化剂的存在下加热，以便得到各种各样的有时难以限定的带支链的和线形的聚合产物(22，23)。另一种方法中在阳离子交换树脂的存在下将糖融化也得到高分子量高支链化的聚合物(24)。在这两个例子中，聚合物是伴随形成一个聚合键失去一分子水而形成的。另一个已公开的分步聚合的方法的例子涉及到利用Koenings-Knorr反应，其中使具有1位上的非羟基基团(比如溴或氯原子)和其它糖羟基上的保护基团(比如酰基)的糖在1位与其它糖上的羟基反应(24)。在这些方法中，在聚合键生成期间失去一个非水分子，比如HBr。这种制备低聚糖的方法很使人厌烦，需要制备复杂的起始材料，并且总收率低(25)。
在一种已经公开的类似的方法中，将一种在碳6原子上含一个伯醇基，在2，3和4位上有O-保护基团(比如乙酰基)且1位上有一个象Br一样的离去基团的己糖进行自缩合，尤其在诸如氧化银一样的催化剂的存在下，得到1，6相连的聚合物；采用这种方法由1-Br-2，3，4-三-O-乙酰基-α-D-葡萄糖制备出一系列的龙胆糊精。然而，由于由分子内缩合衍生而来的1，6-无水-β-D-葡萄糖的形成，低聚糖的收率很低；二聚物(14％)和三聚物(22％)的收率不好，四聚物和五聚物的收率很差(≤5％)，并且六聚物仅以1％的收率分离出(26)。
更新的公开物中描述了1，6-键合的β-吡喃基单元(27)和D-葡聚糖(28)的聚合物的化学合成，其通过无水糖衍生物的开环聚合反应来制备。这种方法受需要费很大的努力才能制备出无水糖起始材料的困扰，并且尽管反应在比如-60℃下进行也不能证明用这种方法来制备低聚糖容易。另一种方法用1，2，3，4-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖酸催化熔融聚合来制备1，6-键合的低聚糖乙酸酯的混合物，经脱乙酰基并进行色谱检测，表明基本上含单糖和二糖，即葡萄糖(15％)，左旋葡聚糖(4％)和龙胆二糖(16％)，而低聚糖收率不能接受地低，尤其龙胆三糖(4％)及龙胆四糖(06％)(29)。这种方法被进一步地进行了更详细的描述(30)，虽然聚合物产物的产率得到稍微的改进，但所期望的低聚物的收率仍然低
因此，从文献中很明显地发现，虽然早已经存在几种制备低聚糖的方法，但至今没有一种合成均匀低聚糖方法能取得好的收率并描述过使用廉价的起始材料。
在导致本发明的工作中，发明人发现了一种高收率的采用易于得到的廉价的起始材料来合成特定的六吡喃-低聚糖的方法。本发明一个方面提供了一种制备六吡喃-低聚糖的方法，该方法包括在减压并有路易斯酸或其它催化剂存在的条件下，在一种惰性溶剂中加热一种己糖的乙酰或其它酯类衍生物。
按照这种方法，可以用一种可控制的方法来进行衍生化的己糖(包括但不局限于葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔罗糖、半乳糖、艾杜糖或古洛糖的1，2，3，4-四-O-乙酰基衍生物)的聚合，以便制备O-乙酰化的低聚糖。在这种方法中，通过控制聚合反应的温度和改变反应的时间，很容易控制聚合度(链长)。进行聚合反应后，可将粗产物混合物进行进一步的乙酰化，以便将低聚糖中剩余的游离羟基乙酰化。然后通过吸附色谱很容易将乙酰化的低聚糖分离出来。乙酰化基团有紫外光吸收，当它们从色谱柱中洗脱出来时容易用光谱鉴定乙酰化的低聚糖。也可以将乙酰保护基团从低聚糖混合物中脱除，通过凝胶过滤(筛析)色谱按分子大小分离出低聚糖产物。
在这里所描述的实例中，将硫酸化低聚糖分离并以其相应的钠盐形式使用。应当意识到可以将其它药理上可接受的盐(比如钙盐或药理上可接受的铵盐)分离并以正确的方法来使用。此外，这里提到的“硫酸化低聚糖”应理解为包括例如硫酸化低聚糖的钠盐或其它药理上可接受的盐。
在下面的实施例中将对本发明的其它特点进行全面的描述。然而，应该知道，这种详细的描述其目的只是为了对本发明进行举例说明而决不应该被认为是对以上所提出的本发明的广泛的描述的限制。
实施例1，2和3通过所公开的新方法对合成低聚糖的制备进行了举例说明，实施例4，5和6对低聚糖的硫酸化的方法进行了举例说明，实施例7举例说明了硫酸化低聚糖作为抗血管生成、抗转移和/或抗炎症药剂的用途。实施例1和2中，“ND”表示“没有测定”。
在附图中：
图1表明了硫酸麦芽六糖对体外人体血管生成的影响。上面的图是进行14天培养后对照血管生成的图象。下面的图描述了在20μg/ml硫酸麦芽六糖存在下的血管生成。
图2表明了不同的硫酸麦芽糖(□)，硫酸麦芽四糖(○)和硫酸麦芽六糖
Figure A9619356300121
浓度对体外人体血管生成的影响。数据由经14天培养后血管生成的数据图象获得。各自是平均值±标准偏差(n＝4)。
图3表明了不同浓度(μg/ml)的从Pichia holstii得到的甘露五糖磷酸酯对体外人体血管生成的影响。数据由经19天培养后血管生成的数据图象获得。各自是平均值±标准偏差(n＝4)。
图4表明了不同链长的硫酸化的麦芽糖低聚糖对小鼠乳腺癌13762 MAT转移的影响。对照动物在无低聚糖存在下接受13762MAT细胞。在A组中，当注射肿瘤细胞时将处理动物由静脉注入每种化合物2毫克。在B组中，当注射肿瘤细胞时将处理动物由皮下注入每种化合物4毫克。垂直条代表平均值的标准偏差。
图5是对不同链长的硫酸化麦芽糖低聚糖抑制BALB/c 3T3细胞上的细胞表面硫酸乙酰肝素结合到固定化的aFGF上的能力的评估。结合的3T3细胞通过Rose Bengal染色并测定540nm处的染色体吸收来进行定量。不同的麦芽糖低聚物的硫酸化程度列于表2中。
图6显示硫酸麦芽糖的硫酸化程度对其抑制小鼠乳腺癌13762MAT转移能力的影响。X轴数值是指硫酸基团与麦芽六糖分子的比值。当注射肿瘤细胞时将低聚糖以2毫克/小鼠的剂量静脉注射施用。垂直条代表平均值的标准偏差。
图7显示含不同数量的硫酸基团/分子的麦芽六糖比值对体外人体血管生成的影响。低聚糖按200μg/ml加入，且试验在无血清的介质中进行。不管试验是在含血清(20％FCS)或无血清(无FCS)的介质中进行，在这种试验中都可观察到类似的血管生成响应。具有20硫酸/分子的麦芽六糖代表最大硫酸化的分子。数据为四次测定的平均值±标准偏差。
图8代表含硫酸化低聚糖的不同的甘露糖对体外人体血管生成的影响。括号中的值代表低聚糖硫酸化％。低聚糖按200μg/ml加入，且试验在无血清的介质中进行。数据为四次测定的平均值±标准偏差。
图9代表不同链长的硫酸化的甘露糖低聚糖对小鼠乳腺癌13762MAT转移的影响。括号中的值代表低聚糖的硫酸化％。对照动物在无低聚糖存在下接受13762MAT细胞。静脉注射肿瘤细胞后立即将处理动物由皮下注入每种化合物2毫克(A)或4毫克(B)。垂直条代表平均值的标准偏差。
图10代表不同链长的硫酸化的半乳糖和葡萄糖低聚糖对小鼠乳腺癌13762MAT转移的影响。括号中的值代表低聚糖的硫酸化％。对照动物在无低聚糖存在下接受13762MAT细胞。静脉注射肿瘤细胞后立即将处理动物由皮下注入每种化合物2毫克。垂直条代表平均值的标准偏差。
                     实施例1
采用以下的方法制备甘露糖的低聚糖：将1，2，3，4-四-O-乙酰甘露糖(31)(15.0g，43mmol)和氯化锌(1.5g)于四氢噻吩(7ml)中充分混合，减压搅拌下将这种混合物于110℃加热6小时；此时反应物已经硬化并且停止蒸汽(乙酸)产生。整个反应期间将一碱石灰试管置于反应容器和真空源之间。将反应混合物冷却且将产品混合物的一部分(11.0g)溶于干的吡啶(20ml)中，并将乙酸酐(2ml)加入这种溶液中，将混合物与空气隔绝并在搅拌下于50℃加热2小时。冷却后，加入乙醇(10ml)并将混合物放置2小时。减压下蒸出吡啶、乙醇和形成的乙酸乙酯，然后用水反复冲洗残基以便除去氯化锌、四氢噻吩和吡啶。将残余物溶于二氯甲烷中，用水冲洗，用无水硫酸钠干燥有机层。让二氯甲烷溶液流过一硅胶60(130g)短色谱柱(4×40cm)，先用氯仿然后用丙酮洗脱，将衍生化的低聚糖分成两份。随氯仿洗脱的洗脱液为完全乙酰化的单糖和含3-5个甘露糖单元的低聚糖的混合物(混合物A)。随后随丙酮洗脱的洗脱液为完全O-乙酰化的每分子含6-12个甘露糖单元的低聚糖的混合物(混合物B)。
将混合物A(4g)施用于装有t1c级硅胶(H)的柱色谱子(3.3×135cm)中。将色谱柱用起始比例为1∶5的丙酮/轻汽油(沸点60→80℃)并逐渐增加丙酮的百分数直到最后比例为1∶1的梯度溶液洗脱。流速≤0.5ml/min。通过收集和合并需要的组分(由硅凝胶tlc分析测定)并在减压下脱除溶剂，所制备的全O-乙酰化的甘露糖低聚糖1a-1d如下(n＝甘露糖残基的数量，产率，分子旋光(c＝2，CHCl3))：1a，(3；0.7g，4.2％，[α]27 D＝+ND)；1b，(4；4.1g，8.4％，[α]27 D＝+50)；1c，(5；1.2g，7.9％，[α]27 D＝+47.3)；1d，(6；0.8g，5.2％，[α]27 D＝+36.0)。将混合物B用类似于混合物A的方法进行色谱分离，只是洗脱液梯度开始是4∶5的丙酮/轻汽油(沸点60→80℃)，逐渐增加丙酮的百分数直到100％。在这种方法中，所制备的全O-乙酰化的甘露糖低聚糖1d-1j如下(n＝甘露糖残基的数量，产率，分子旋光(c＝1，CHCl3))：1d，(6；1.6g，10.4％，[α]27 D＝+ND)；1e，(7；3.2g，21.2％，[α]27 D＝+50)；1f，(8；0.5g，3.4％，[α]27 D＝+47.0)；1g，(9；0.7g，4.7％，[α]27 D＝+59)；1h，(10；0.9g，5.7％，[α]27 D＝+54)；1i，(11；0.02g，0.1％，[α]27 D＝+ND)；1j，(12；0.03g，0.2％，[α]27 D＝+ND)。
将化合物1a(1.55g)溶于干乙醇(40ml)中并于室温搅拌下加入1M甲醇钠甲醇盐(8.6ml)。将所得沉淀过滤，用甲醇洗脱并干燥。经元素分析(CHN值为计算值的±0.4％)，电喷雾质谱(M+504)和核磁共振谱鉴定产物(2a，0.61g，70％，[α]27 D＝+72°)为甘露三糖。对低聚物1b-1j进行类似的处理得到以下的甘露糖低聚糖(n＝甘露糖残基的数量，从乙酰化衍生物得到的产率％，分子旋光(c＝1，H2O))：2b，(4；75％，[α]27 D＝+78°)；2c，(5；85％，[α]27 D＝+80°)；2d，(6；98％，[α]27 D＝+84°)；2e，(7；98％，[α]27 D＝+86.3°)；2f，(8；99％，[α]27 D+98°)；2g，(9；99％，[α]27 D＝+106°)；2h，(10；99％，[α]27 D＝+100°)；2i，(11；98％，[α]27 D＝+ND)；2j，(12；98％，[α]27 D＝+ND)。
另外，这些甘露糖低聚糖也可用凝胶过滤(筛析)色谱进行分离。因此，如上所述，通过将充分搅拌的1，2，3，4-四-O-乙酰甘露糖(15.0g，43mmol)和氯化锌(1.5g)在四氢噻吩(7ml)中的混合物减压下于110℃加热6小时。将反应混合物冷却，加入水(50ml)并将反应混合物于室温下搅拌5分钟且去掉水层。反复进行这种洗脱程序，然后将所得物质溶解于氯仿中，用水洗涤并用硫酸钠干燥。过滤后，减压下脱除氯仿得到粗乙酰化低聚糖混合物(11.3g)。将混合物溶于异丙醇(20ml)和丙醇(60ml)中，然后加入1M的甲醇钠甲醇溶液(8ml)，将混合物于室温下放置1小时。将所得的沉淀过滤并用甲醇(30ml)洗涤两次。干燥后，将这种产品混合物(6.5g)从一细粉级P2凝胶(BioRad)凝胶过滤色谱柱(包裹的，5×90cm)的顶部加入，所述色谱柱已经用水在60℃下稳定了两天(流速0.5ml/min)。先用水洗脱色谱柱，流速为0.5ml/min。根据差示折光谱的谱峰来鉴定从色谱柱中洗脱下来的产物，然后收集组分。采用这种方法收集相当于11个分离峰以下的面积的组分。在同一P2凝胶色谱柱上于60℃温度下将这些组分中的每种重新进行色谱分离，并用水以0.5ml/min的速度洗脱。因此，比方说，将第一次从凝胶过滤中洗脱出来的经鉴定符合甘露五糖(0.9g)的组分重新进行色谱分离以便得到一个其每一边有一个肩峰的中心主峰。通过减压下脱除水份分离出中心峰处的洗脱产物，得到0.5g物质，60℃下再将其在同一P2凝胶色谱柱上以0.3ml/min的流速重新进行色谱分离。采用这种方法得到符合以上的2c的甘露五糖。实测值C 38.4；H，6.7，C30H52O26.6H2O计算值C38.5；H 6，8％。实测和计算的N值都是0％。
HPLC鉴定发现该化合物具有很高的纯度。鉴定是在一个具有以下构成的Dionex HPLC系统中进行的：
色谱柱  Code-CPMA1#1291(+guard#1172).一种季铵离子
        交换色谱柱。
检测器  电化学检测器(ED40：IAMP)。
流速    1ml/min。
溶剂    溶液A：0.1M氢氧化钠
溶液B：1M乙酸盐于0.1M氢氧化钠中
梯度  时间(min) ％A    ％B     操作
        0        95     5      洗脱
        20       90     10     洗脱
        25       0      100    洗脱/洗涤
        30       0      100    洗脱/洗涤
电喷雾质谱表明该化合物有一个M+828的质量峰，与甘露五糖的分子量相同。采用类似的方法分离出符合以上2a，2b，2d和2e的甘露四糖，甘露六糖和甘露七糖。
                     实施例2
本实施例说明在比实施例1的反应温度低的温度下进行聚合反应的效果。在这种情况下，除了聚合反应是在90℃下进行8小时外，采用与以上的实施例1中所提供的制备甘露糖低聚糖相同的方法由1，2，3，4-四-O-乙酰葡萄糖的聚合来制备葡萄糖的低聚糖。按实施例1中的方法将反应混合物进行处理，产物由柱色谱分离，其中色谱柱(7cm×155cm)用tlc级硅胶(H)装填。采用与实施例1中所描述的类似的洗脱方法所制得的完全O-乙酰化的葡萄糖低聚糖3a-3e如下(n＝葡萄糖残基的数量，产率，分子旋光(c＝2，CHCl3))：3a，(3；4.14g，24.9％，[α]27 D＝+37.5°)；3b，(4；2.92g，18.4％，[α]27 D＝+44°)；3c，(5；2.99g，19.1％，[α]27 D＝+37.5°)；3d，(6；1.37g，8.9％，[α]27 D＝+36°)；3e，(7；0.18g，1.2％，[α]27 D＝+39°)。
将化合物3a(1.0g)溶于干乙醇(30ml)中并于室温搅拌下加入1M甲醇钠甲醇盐(5.5ml)。将所得沉淀过滤，用甲醇洗涤并干燥。经元素分析，电喷雾质谱(M+504)和核磁共振谱鉴定产物(4a，[α]27 D＝+68.5°)为葡萄三糖。对低聚物4b-4e进行类似的处理得到以下的葡萄糖低聚糖(n＝葡萄糖残基的数量，％产率，分子旋先(c＝2，H2O))：4b，(4；85％，[α]27 D＝+83°)；4c，(5；90％，[α]27 D＝+84°)；4d，(6；90％，[α]27 D＝+86°)；4e，(7；89％，[α]27 D＝+92.5°)。
另外，这些葡萄糖低聚糖可用凝胶过滤(筛析)色谱进行分离。因此，如上所述，通过将充分搅拌的1，2，3，4-四-O-乙酰基葡萄糖(15.0g，43mmol)和氯化锌(1.5g)在四氢噻吩(7ml)中的混合物减压下于110℃加热6小时，制得一种乙酰化的葡萄糖低聚糖混合物。将所得物质溶解于二氯甲烷中，用水洗涤并用硫酸钠干燥。减压下脱除二氯甲烷，将产物称重并溶于异丙醇(20ml)和丙醇(60ml)中，然后加入1M的甲醇钠甲醇溶液(9ml)，将混合物于室温下放置1小时。将所得的沉淀过滤并用甲醇(30ml)洗涤两次。将该混合物的一部分(7.6g)溶于水(10ml)中并施于一5×90cm水夹套的用细粉级P2筛析凝胶(BioRad)装填的凝胶过滤色谱柱中。该色谱柱使用前已经在60℃下装填，预热和运行了两天。随着葡萄糖低聚糖混合物的加入，将色谱柱保持在60℃并用水洗脱色谱柱(流速为1ml/min)。根据差示折光谱的谱峰来鉴定从色谱柱中洗脱下来的产物并收集组分。在这种方法中收集相当于10个分离峰以下的面积的组分。在同一P2凝胶色谱柱上于60℃温度下将这些组分中的每种重新进行色谱分离，并用水以0.5ml/min的流速洗脱。因此，比方说，将经鉴定符合于葡萄五糖(0.59g)的组分重新进行色谱分离以便得到一个其每一边有一个肩峰的中心主峰。通过减压下脱除水份分离出中心峰处的洗脱产物，得到0.3g物质，60℃下再将其在同一P2凝胶色谱柱上以0.3ml/min的流速重新进行色谱分离。采用这种方法得到符合以上4c的葡萄五糖。用类似的方法分离出符合以上4a，4b，4d和4e的葡萄三糖，葡萄四糖葡萄六糖和葡萄七糖。
                     实施例3
其它包括半乳糖、阿卓糖、塔罗糖、古洛糖、艾杜糖和阿洛糖的己糖的低聚糖可采用实施例1和2中所公开的方法来制备。
比如，采用以下的方法来制备半乳糖的低聚糖：将1，2，3，4-四-O-乙酰半乳糖(21.0g)和氯化锌(2.1g)与四氢噻吩(10ml)充分混合，将这种混合物减压搅拌下于90℃加热17小时；此时反应物已经硬化并且停止蒸汽(乙酸)产生。整个反应期间将一碱石灰试管置于反应容器和真空源之间。将反应混合物冷却，然后将反应物溶于二氯甲烷中，用水洗涤并用硫酸钠干燥。减压下脱除二氯甲烷，将产物称重并溶于异丙醇(30ml)和甲醇(70ml)中，然后加入1M的甲醇钠甲醇溶液(10ml)，将混合物于室温下放置1小时。将所得的沉淀过滤并用甲醇(30ml)洗涤两次。采用如以上实施例1和2中所描述的制备甘露糖和葡萄糖的凝胶过滤色谱法将这种混合物进行分离。根据差示折光谱的谱峰来鉴定从色谱柱中洗脱下来的产物并收集组分。用这种方法收集8种组分。在同一P2凝胶色谱柱上于60℃温度下将这些组分中的七种重新进行两次色谱分离，并且在第一次用水以0.5ml/min的流速及第二次以0.3ml/min的流速洗脱。采用这种方法得到以下的半乳糖低聚糖半乳三糖，1.03g，5.3％；半乳四糖，1.15g，6.0％；半乳五糖，1.21g，6.3％；半乳六糖，4.26g，22.1％；半乳七糖，2.11g，11％；半乳八糖，1.91g，9.9％和半乳九糖，0.08g，0.4％。
                     实施例4
80℃下向一种三氧化硫-吡啶络合物(0.8g)(Aldrich)于新蒸馏的DMF(1ml)的溶液中滴加甘露五糖(2c)(0.1g)的干吡啶(3ml)溶液，再在80℃下加热90分钟。趁温将上面的液体倾出，用甲醇洗涤粘稠的残余物三次。倾出残余的甲醇后，剧烈搅拌下将产物溶于水(5ml)中并用乙酸钡中和(至PH约6)(约0.4g于2ml水中)。离心后(3,000xg)，倾出上面的液体并保留，用水(3×10ml)洗涤沉淀的硫酸钡。将保留的上面的液体和洗涤液合并在一起并注入一DOWEX-X8-400交换树脂(H+型)色谱柱(1.0×14cm)中。用水洗涤色谱柱直到洗脱液为中性。将洗脱液(约50ml)搅拌并用乙酸钠(0.7g)中和(至PH约7)。将溶液用丙酮(200ml)稀释并离心(1,750xg)分离出产物。通过在甲醇中挤压将小丸压碎，再在甲醇中搅拌然后过滤。用甲醇洗涤固体数次制得纯(无无机盐)化合物(0.2g；66％)。产物无钡离子(通过显微分析和火焰离子分析)也无氮(显微分析)污染。
发现产物硫酸化的甘露五糖中可能17个位置中有11个以上被硫酸化。实测值：C 14.2；H，3.0；S 14.1；Na 7.3。C30H60O59S11Na8.36H2O计算值：C 14.1；H，5.2；S 13.8；Na 7.2％。实测和计算都无氮和钡。
                     实施例5
于干的氮气氛下向一种三氧化硫-吡啶络合物(Aldrich化学公司)(4g)与干DMF(5ml)的混合物中加入干吡啶(10ml)。将混合物升温至50℃并快速搅拌，将由以上实施例2中所描述的方法分离出来的葡萄六糖(4d)(0.5g)在单个加入步骤中加入。再加入吡啶(5ml)，然后将混合物保持在4℃的温度过夜。将液体从反应容器中倾出，加入甲醇(3ml)并将半固体物质破碎，与甲醇混合。倾出甲醇后，重复操作。向残余的固体中加入水(5ml)并将所得到的溶液放置在一50ml的测试试管中。用水洗涤反应容器，将洗涤液与第一种溶液合并。用40％的氢氧化钠溶液调节所得溶液的PH值7-8，然后加入甲醇(40ml)。将所得的不清亮的溶液离心(3,000xg)25分钟，将清亮的溶液从沉淀中倾出。将残余的固体再次溶于水(10ml)，加入甲醇(40ml)，再如前面一样进行离心。倾出上面的清液后，将固体溶于水(10ml)中并通过一P2凝胶脱盐色谱柱(2.5×250cm；细粉级P2凝胶BioRad)。制得所期望的1，6-葡萄六糖的硫酸化衍生物的钠盐。
                   实施例6
虽然实施例1，2和3中描述了己糖均聚物的合成，然而通常合成大多数低聚糖结构是十分困难的。因此，一种比较简单的途径是从天然资源中硫酸化所限定结构的低聚糖。在本实施例中使用的天然低聚糖产物有两类。第一类中所含的低聚糖不需要进一步的降解和分级分离。这种类型的实例有麦芽糖、棉子糖和水苏糖。第二种类型包括由天然存在的多糖通过部分酶促降解或化学降解以及大小分级分离获得的低聚糖。这种类型的实例有来源于酵母Pichia holstii的直链淀粉、软骨素和葡聚糖衍生的低聚糖以及甘露五糖磷酸酯。
麦芽糖、棉子糖和水苏糖购自St Louis，MO的S西格玛化学公司。麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖购自Seikagau，东京，日本，代表从α1-4连接的葡萄糖均聚物直链淀粉的限制性的淀粉酶消化液中提纯出的低聚糖。如前所述，软骨素四、六和八低聚糖是通过凝胶过滤分级分离由软骨素-6-硫酸的牛睾丸透明质酸酶消化液提纯而得(32)的。环六、七和八-直链淀粉购自西格玛。这些低聚糖可如实施例5中所描述的那样进行硫酸化。
比方说，采用以下的方法来制备硫酸化的麦芽六糖：80℃下向一种三氧化硫-吡啶络合物(4.0g)(Aldrich)的新蒸馏的DMF(5ml)溶液中滴加麦芽六糖(0.5g)的干吡啶(15ml)溶液，再在80℃下加热90分钟。趁温将上面的液体倾出，用甲醇(10ml)洗涤粘稠的残余物三次。倾出残余的甲醇后，剧烈搅拌下将产物溶于水(15ml)中并用乙酸钡(约0.4g于2ml水中)中和(至PH约6)。离心后(3,000xg)，倾出上面的液体并保留，用水(3×10ml)洗涤沉淀的硫酸钡。将保留的上面的液体和洗涤液合并在一起并注入一DOWEX-X8-400交换树脂(H+型)色谱柱(2.5×14cm)中。用水洗脱色谱柱直到洗脱液为中性。搅拌洗脱液(→250ml)并用乙酸钠(3.5g)中和(至PH7)。将溶液用丙酮(1L)稀释并离心(1750xg)分离出产物。通过在甲醇中挤压将小丸压碎，再在甲醇中搅拌，然后过滤。用甲醇洗涤固体数次制得纯(无无机盐)化合物(0.88g；55％)。产物无钡离子(通过显微分析和火焰离子分析)也无氮(显微分析)污染。
发现这一产物中可能20个位置有14个以上被硫酸化。实测值：C13.9；H，2.2；S 14.3；Na 6.7。C36H60O71S73Na14.45H2O计算值：C 13.8；H，5.1；S 14.3；Na 6.6％。实测和计算都无氮和钡。
以上制得的麦芽六糖的1H核磁共振数据(300MHZ-Gemini 300；以比TMS低2.25ppm的丙酮为参比)表明可能20个位置中的14个被硫酸化。该结论是根据化学位移约4.15ppm的H的积分为20H而化学位移约4.4ppm的H的积分为16H得出来的。可以猜测所有主要的羟基，比如在6位的羟基，由于空间位阻最小而被硫酸化。还可猜测在糖结构的内部仅仅一个另外的位置被硫酸化。除了位置6外，糖的端部各有两个被硫酸化其它位置。
采用由二倍体酵母Pichia holstii(菌株NRRL Y-2448以前为Hansenula holstii)制备的外聚糖来制备甘露五糖磷酸酯。P.holstii的生长和甘露五糖磷酸酯的分离基于以前所描述的方法(33，34)。简单地说，通过乙醇沉淀将粗外聚糖从有氧生长的酵母培养上清液中分离出来。然后采用酸解将甘露五糖磷酸酯从磷酸甘露糖单酯核(PPME)中释放出来。然后通过示差乙醇沉淀以及凝胶过滤将PPME和甘露五糖磷酸酯以钡盐分离出来。低聚糖的结构为P-6-Man-α-(1→3)-Man-α-(1→3)-Man-α-(1→3)-Man-α-(1→2)Man(34)。
从酵母的外聚糖分离出来的酵母甘露五糖磷酸酯(33，34)的硫酸通过以下的方法来制备。将一种酵母麦芽五糖磷酸酯(0.09g)于干吡啶(2ml)中的悬浮液中加入三氧化硫-吡啶络合物(0.8g)(Aldrich)的新蒸馏的DMF(1ml)溶液中。将混合物于80℃下加热2小时。趁温将上面的液体倾出，用甲醇(2ml)洗涤粘稠的残余物三次。倾出残余的甲醇后，剧烈搅拌下将产物溶于水(5ml)中并用乙酸钡(约0.7g于5ml水中)中和(至PH6)。离心后(3,000xg)，倾出上清液，用水(3×10ml)洗涤沉淀的硫酸钡。将上清液和洗涤液合并在一起并注入一DOWEX 50W-X8-400交换树脂(H+型)色谱柱(2.5×14cm)中。用水洗脱色谱柱直到洗脱液为中性。搅拌洗脱液(→50ml)并用乙酸钠(0.4g)中和(至PH7)。将溶液用丙酮(150ml)稀释并离心(1,750xg)分离出产物。通过在甲醇中挤压将小丸压碎，再在甲醇中搅拌，然后过滤。用甲醇洗涤固体数次制得硫酸化的酵母麦芽五糖磷酸酯(0.18g)。产物无钡离子(通过显微分析和火焰离子分离)也无氮(显微分析)污染。
发现产物中可能16个位置中的10个以上硫酸化。实测值：C 15.35；H，2.7；P 1.2；S 13.7；Na 8.5。C30H41O59PS10Na9.25H2O计算值：C 15.3；H，3.5；P 1.3；S 13.6；Na 8.8％。氮和钡实测分别为0.16和0％，二者计算值都为％。
1，6-α-葡萄糖低聚物通过葡聚糖(平均分子量71,000；西格玛化学公司)的酸解来制备。因此，将葡聚糖(5g)溶于蒸馏水(100ml)中，并用1M的HCl将该溶液的PH值调至1.8。100℃下回流48小时。将混合物在减压下干燥并用蒸馏水配至100ml，在减压下进行第二次干燥。将无水乙醇(100ml)加入残余物中并在减压下蒸发掉。将残余物用蒸馏水配至4ml，并施用一5×90cm水夹套的用细粉级P2筛析凝胶(BioRad)装填的凝胶过滤色谱柱中。该色谱柱使用前已经在60℃下装填、预热和运行了两天。随着1，6-α-葡萄糖低聚糖混合物的加入，将色谱柱保持在60℃并用水洗脱色谱柱(流速为1ml/min)。根据差示折光谱的谱峰来鉴定从色谱柱中洗脱下来的产物并收集组分。在这种方法中收集相当于分离峰以下面积的组分。在同一P2凝胶色谱柱上于60℃温度下将这些组分中的每种重新进行色谱分离，并用水以0.5ml/min的流速洗脱。因此，比方说，将经鉴定符合1，6-α-葡萄六糖(0.19g)的组分重新进行色谱分离以便得到一个其每一边有一个肩峰的中心主峰。通过减压下脱除水份分离出中心峰处的洗脱产物，得到0.16g物质，60℃下再将其在同一P2凝胶色谱柱上以0.3ml/min的流速重新进行色谱分离。采用这种方法得到葡萄六糖(0.14g)(电喷雾M+＝990)。用类似的方法分离出1，6-α-葡萄三糖、1，6-α-葡萄四糖(0.21g)和1，6-α-葡萄五糖(0.17g)。
                    实施例7A.材料和方法硫酸化低聚糖的抗凝活性
通过以前所描述的方法使用凝血酶时间和活化的部分凝血致活酶时间方法对每种硫酸化低聚糖的抗凝血活性进行评估(35)。将每种制备物的活性与一个肝素对照比较，抗凝血活性用肝素活性的百分数来表示。人体抗血管生成试验
所使用的试验方法在国际专利申请号PCT/AU95/00105中进行了描述，本文一并参考。直径约1-2mm长2-5cm的血管取自分娩时间不超过6小时的人体胎盘表面。将血管放置在一含2.5mg/ml两性酶素的Hanks BSS中且用细解剖镊子和虹膜切除剪将其切成1-2mm长的碎片。使用前将血管碎片去掉残余的凝块并浸泡在Hanks BSS中。借助于放大器灯(Maggylamp，Newbond，Balmain，NSW，Australia)将血管进行解剖和切开。从静脉和动脉源血管获得类似的血管生成响应，但每一个试验只使用一根血管的碎片。
血管生成试验在24或48孔培养平板中进行(Costa，Cambridge，MA)。在24孔培养平板中，往每一孔中加入30μl牛凝固因子II(0.15M的NaCL中50NIH单位/ml；西格玛化学公司，圣路易斯，MO)，接着加入1.0ml在介质199中的浓度为3mg/ml的牛纤维蛋白源酶(西格玛)。将凝固因子II和纤维蛋白源酶迅速混合，并在形成凝块前立即将一块血管碎片放在培养孔的中心。通常30秒内形成纤维蛋白凝胶并且血管碎片悬浮在凝胶中。在形成凝胶后往每个孔中加入1.0ml含20％胎儿腓肠血清(FCS)、0.2mgε-氨基己酸、L-谷氨酰胺和抗菌素(庆大酶素和两性酶素)的介质199。在48孔培养板中，所有试剂的体积减半。将血管在一种潮湿的环境中于37℃的温度下培养14-21天，培养过程中每两周更换一次介质。由一台安装在翻转式显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)上的Dycam数字式照相机获取培养物的数字图象，采用NIH图象软件通过计算机进行图象分析来对血管生成进行定量。肝素酶试验
肝素酶试验基于血清蛋白、富组氨酸糖蛋白(HRG)结合到硫酸乙酰肝素链上并掩蔽肝素酶裂解部位的观察。基于发现被肝素酶裂解的硫酸乙酰肝素不能结合到HGR上，已经开发出一种肝素酶试验法，该试验涉及到用肝素酶消化用3H标记的硫酸乙酰肝素链，将消化的硫酸乙酰肝素结合到HRG偶合的小珠上并测量未结合的3H标记。未结合到HRG颗粒的3H标记的数量随着消化的底物的增加而增加。因此，这种方法代表了一种用不同化合物来测量肝素酶组织浸膏活性和评估肝素酶抑制性的简单而快速的方法。
首先，通过在水合肼中加热将牛肠硫酸乙酰肝素(Mr av 32kDa)部分脱N-乙酰化(36)并用含3H的乙酰酐重新乙酰化。按照制造商的说明将ChickenHRG(采用Rylatt等提出的方法进行提纯(1981)(37))与经CNBr活化的琼脂糖4B(药物)偶合。
通过将纯化的人体血小板肝素酶(其已显示出具有对硫酸乙酰肝素的与存在于高度转移性人体癌HCT116、乳腺癌13762MAT和小鼠黑瘤中的肝素酶活性相同的活性)与60pmol 3H放射性际记的牛肠硫酸乙酰肝素一起温育(37℃，30分钟)来测定人体血小板肝素酶活性。让温育混合物(100μl)通过HRG-琼脂糖小柱(装填200μl颗粒)，该柱中保留比较大的未裂解和部分裂解的基质，根据比较小的(大概5kDa)未被结合的硫酸乙酰肝素碎片的产生速度来测定活性。
在肝素酶抑制试验中，在加入经放射性标记的基质前将不同浓度的抑制剂加入酶中，整个温育期间将抑制剂保留在反应混合物中。转移试验
采用高度转移的大鼠乳腺癌13762MAT来评估不同的硫酸化低聚糖的抗转移活性(35)。如以往所描述的那样，将肿瘤细胞体外保持(35)。由静脉向雌Fisher344大鼠中注入0.6ml含2×10513762MAT细胞的含10％FCS的RPMI介质。在动物注入肿瘤细胞的同时，也注入2mg硫酸化低聚糖，低聚糖由静脉、动脉或皮下注射，可获得类似的结果。将肺从注入肿瘤细胞13天后的大鼠体中取出，放置在Bouin溶液中至少24小时并在解剖显微镜下评估肺转移。将经硫酸化低聚糖处理过的大鼠的肺转移的数量与在对照动物中所观察到的进行比较，每一组中最少包括四只动物。硫酸化低聚糖对FGF-肝素/硫酸乙酰肝素之间的作用的影响
采用一种在其它文献中(38)已经详细描述过的结合试验来测量aFGF和bFGF对肝素的结合并评估不同硫酸化低聚糖对这种作用的抑制能力。简单地说，就是将FGF固定在96孔PVC平板的孔中并评估经放射性标记的肝素对固定的FGF的结合。在抑制试验中对一系列的硫酸化低聚糖稀溶液抑制FGF-肝素之间作用的能力进行检测。采用抑制20％或50％的肝素结合到固定化的FGF上时所需要的硫酸化低聚糖的浓度来代表抑制结果。在所有的抑制结合试验中，用未经标记的肝素作为对照。
如早期报道的那样(39)，通过测定BALB/c 3T3纤维细胞对PVC固定化的FGF的结合，由粘附细胞的Rose Bengal染色所检测到的细胞结合来评估FGF-硫酸乙酰肝素相互作用。检测硫酸化低聚糖抑制这种细胞粘附过程的能力，这种能力总的来说取决于BALB/c 3T3细胞表面的硫酸乙酰肝素的结构(39)。数据用抑制50％(IC50)的细胞粘附所需的硫酸化低聚糖的浓度来表示。气囊炎模式
本试验是基于一种以前报道过的方法(40)。于第一天在一只麻醉的小鼠的肩胛骨之间的一块剃光的区域的皮下注射5ml消毒的空气，从而在小鼠的背上形成皮下气囊。于第三天通过注射2.5ml空气使气囊重新发炎。于第六天通过将1.0ml含56mg的巯基乙酸酯或1.0ml盐水直接注入气囊来引起发炎，以作为对照。大概在注射巯基乙酸酯17→20小时后通过革除颈部将动物杀死并通过注射2.5ml经冰冷却的PBS/5％FCS重新获得囊的细胞含量。施用巯基乙酸酯后，在一个独立的部位立即通过皮下注射(50μl在PBS中)来测试硫酸化低聚糖抑制发炎反应的能力。将氢化泼泥松作为对照抗炎症药从皮下注入25mg/kg。用Coulter Counter测定每个囊的细胞含量并用免疫荧光流动细胞仪来评估白血球(亚群)。小鼠哮喘模式
一种以前报道过的小鼠哮喘模式(41)被用来测试硫酸化低聚糖抑制由嗜酸性细胞浸入肺内所诱发的气源性致敏原(卵清蛋白，OVA)的能力。通过在开始和第12天腹内注射含50mg Alhydrogel(CSL，Ltd，Parkville，Austrlia)的0.9％的消毒盐水使小鼠(C57BL/6，6→10周)致敏。在第24天，让老鼠在一种OVA(10mg/ml)的0.9％盐水中的烟雾剂中暴露30分钟三次(每次隔1小时)，然后在第26天和第28天进行类似的激发暴露。烟雾剂由喷雾器以6升/分钟的速度产生，其在一个800cm3的封闭孔中产生平均直径39μm的颗粒。在第29天将小鼠通过解剖离位而杀死。在导管中插入插管并在37℃温度下用4×1ml含BSA(0.1％wt/vol)的0.9％的盐水洗涤导管腔。每次洗涤大概回收0.8ml滴注液。将从一个动物中所获得的支气管肺泡的灌洗液(BALF)装好并用标准的血细胞测定仪测定细胞数目。也将BALF细胞进行细胞离心并用May-Grunwald-Giemsa溶液进行微染色，采用形态学标准方法鉴别。数据以嗜酸性细胞/mlBALF数量来计算。硫酸化低聚糖要么通过系统地在腹内插入Alzet微型浸透泵要么通过肺部以烟雾剂的形式对动物施用。微型浸透泵在进行OVA激发前的第23，24天插入且连续地注入药物直到动物在第29天死亡。在注入烟雾剂的情况中，在第23，25和27天将小鼠于含硫酸化低聚糖的0.9％盐水烟雾剂中暴露30分钟三次(每次隔1小时)。试验性自体免预脑脊髓炎(EAE)模式
如以前所描述的那样(43)制备脾细胞用来进行EAE的转移。简单地说，就是使Lewis大鼠对髓磷脂碱性蛋白敏感，在试管中用ConA体外活化免疫脾细胞并将30×106个ConA活化的EAE效应细胞静脉转移至各接受者。在细胞转移时将含硫酸化低聚糖的微型浸透泵(Alzet)插入皮下并以70mg/kg/天的剂量输注14天。根据下面的规格将临床的EAE分级：0，无症状；1，尾部末端柔软；2，总个尾部柔软；3，运动失调，扶直困难；4，后肢虚弱；以及5，后肢瘫痪。炎性肠道疾病模式
通过将在饮用水中补充TdB Consultancy，Uppsala，Sweden所提供的5％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发小鼠炎性肠道疾病。将这种溶液的PH值调到8.0并用0.45μ的介质膜过滤。每天收集DSS溶液，重新过滤并用新鲜DSS原料调节体积。根据体重对6-7周的雄性BALB/c小鼠进行筛选并将20-23gm之间的小鼠分组按5只/笼装入笼中。
从开始到第10天将小鼠注射硫酸化的甘露五糖磷酸酯(20mg/kg/天)或消毒水，每8小时注射一次。注射体积标准化为100μl，并且在颈项处通过皮下注入。
每天对所有小鼠进行DSS消耗速度，体重和症状的评分。腹泻和直肠出血症状每次用轻微或严重来评估，且依次给出1和4之间的数值。也注意到有粘液出现并认为是一种轻微的腹泻。然后将那天那一组中腹泻和直肠出血评分的和除以存活的动物个数。总的评分是腹泻和直肠出血评分的和。B.结果硫酸化的天然存在的低聚糖的抗血管生成和抗转移活性
一旦合成一定范围的硫酸化的天然存在的低聚糖，就在一定的生物试验范围内对其进行检验。表1总结了由12种硫酸化的天然存在的低聚糖所获得的结果。作为比较，表1中也包括了苏拉明(一种具有适当的抗血管生成和肝素酶抑制活性的化合物)(42)和肝素的生物活性。
首先可以看到所有被测试的硫酸化低聚糖的抗凝血活性都可忽略，都低于肝素活性均2％(表1)。这是一种重要的性质，因为肝素(一种有效的抗转移化合物)由于其强有力的抗凝血活性而限制了它的临床使用。
有三种硫酸化的天然存在的低聚糖是十分有效的人体血管生成抑制剂，它们是硫酸化的甘露五糖磷酸酯(由P.holstii衍生而来)，硫酸麦芽四糖和硫酸麦芽六糖。甘露五糖磷酸酯和麦芽六糖是这些化合物中最有效的，其50％抑制浓度为2μl/ml，而麦芽四糖的50％抑制浓度为20μl/ml。图1中描述了一个显著的由20μl/ml麦芽六糖所导致的血管生成抑制的例子。有趣的是注意到肝素几乎没有抗血管生成活性。因此，明显地是很可能相对短链长的硫酸化低聚糖对这类活性是所需的。图2和图3中分别描述了由麦芽糖系列和硫酸化的甘露糖磷酸酯所引起的血管生成抑制的一个更完全的滴定结果。可以看到，对于麦芽糖系列，硫酸麦芽糖具有很小的抑制活性，而麦芽四糖和麦芽六糖是非常有效的抑制剂(图2)。
表1中所提供的所有血管生成试验都是在血管生成试验的开始时往温育介质中加入低聚糖。然而，初步研究(没有给出数据)表明，在血管生成响应开始后加入硫酸麦芽六糖也能进一步抑制血管自然发展，虽然大多数有效的抑制是发生在当温育开始时加入化合物的情况。
各种硫酸化低聚糖的肝素酶抑制活性也存在显著的差别，最有效的抑制剂是硫酸化的甘露五糖磷酸酯和硫酸麦芽六糖，这两种化合物的活性与肝素类似(表1)。有趣的是，这两种化合物也是有效的抗血管生成化合物。然而血管生成抑制与许多化合物的肝素酶抑制活性没有关系。比如，硫酸化的环直链淀粉是十分有效的肝素酶抑制剂，但却是不好的血管生成抑制剂。麦芽糖系列的链长和肝素酶抑制也是非常重要的资料。表3提供了从二糖(麦芽糖)到七糖(麦芽七糖)整个麦芽糖系列的肝素酶抑制活性。麦芽糖没有活性，麦芽三糖抑制活性很弱，麦芽四糖具有适当的抑制活性，而麦芽五，六和七糖具有很高的抑制活性。因此，优化的肝素酶抑制需要硫酸化的五糖或更高的糖。
对许多硫酸化的糖也进行了抗转移活性的测试(表1)。通常，在肝素酶抑制和抗转移活性之间存在一个很好的关系。因此，硫酸化的甘露五糖磷酸酯和硫酸麦芽六糖这两种肝素酶抑制活性最高的化合物具有最大的抗转移活性，事实上，它们防止转移的能力与肝素并没有显著的不同(表1)。两种其它化合物，硫酸环辛直链淀粉和硫酸水苏糖也具有十分有效的抗转移性，这与它们一定的肝素酶抑制活性是一致的。这些数据集中起来表明硫酸化的甘露五糖磷酸酯和麦芽六糖磷酸酯同时拥有相当强的抗血管生成、抗转移和肝素酶抑制活性。
图4中更详细地提供了硫酸化低聚糖中麦芽糖系列的抗转移活性。随着链长的增加低聚糖的抗转移活性稳定地增强，五、六和七糖的活性最高。当以2mg/大鼠的剂量静脉施用时，硫酸麦芽糖对转移没有作用(图4A)，但当按4mg/大鼠皮下施用时，可观察到显著的转移抑制(图4B)。随后的实验表明，不管注射的方式如何(比如静脉，皮下或腹膜内)，硫酸化低聚糖都显示出可比较的抗转移活性(没有给出数据)。事实上，只有当对动物高剂量施用时才能观察到硫酸麦芽糖的抗转移活性。既然硫酸麦芽糖是一种很差的肝素酶抑制剂，这表明肝素酶抑制不可能是硫酸化低聚糖抑制肿瘤转移的唯一途径，特别是当以高剂量施用时。
环直链淀粉被硫酸化且包括在本研究中，因为它们代表非线形低聚糖。有趣的是注意到这些化合物只有适当的活性(表1)，表明对于优化的活性来说需要线形低聚糖。而且，活性最高的硫酸化低聚糖是比苏拉明(一种目前作为一种抗血管生成化合物而正在进行临床试验的药物)(表1)有效得多的血管生成、转移和肝素酶活性的抑制剂。
既然这些化合物的抗血管生成活性并不总是直接与其肝素酶抑制活性有关，有可能硫酸化低聚糖可通过一些其它的机理来抑制血管生成。如上所述，很有可能一些硫酸化低聚糖能通过破坏生长因子-硫酸乙酰肝素之间的相互作用来干扰血管生成生长因子的作用。以前的分析(见国际专利申请号PCT/AU95/00105)表明本实例中使用的人体血管生成试验主要取决于内源性bFGF，而很少取决于aFGF和VEGF的作用。因此，对不同的硫酸化低聚糖作为bFGF，aFGF和VEGF与肝素或硫酸乙酰肝素相互作用的竞争者的能力进行了检测。
发现，随着链长的增大，硫酸化低聚糖中的麦芽糖系列成为bFGF，aFGF和VEGF与细胞表面硫酸乙酰肝素相互作用的更有效的抑制剂(表2)，比如，麦芽糖的抑制性很弱，而五、六和七糖的活性最高。硫酸化的甘露五糖磷酸酯在这种系统中也显示出很高的抑制活性(表2)。其它的研究表明硫酸麦芽六糖也是一种有效的对放射标记的肝素结合到bFGF和aFGF上的抑制剂(没有给出数据)。
既然硫酸麦芽六糖是一种活性最高的抗血管生成和抗转移化合物，详细地检测了硫酸化程度对其生物活性的影响。首先注意到，尽管检测到大多数高硫酸化的麦芽六糖有一些抗凝血活性，但与肝素相比，这种活性是十分低的(表2)。然而，随着硫酸化程度的增加，麦芽六糖抑制肝素酶活性和FGF结合至硫酸乙酰肝素上的能力稳定增长(表2)。然而，当硫酸化达85％或更高时抑制活性趋于平稳。
转移抑制研究也表明(图6)随着硫酸化的程度增加，硫酸麦芽六糖变成更有效的抗转移药物。相反，非常高的硫酸化的麦芽六糖(90-100％硫酸化)却是一种不十分有效的血管生成抑制剂(图7)。这些数据表明对抑制血管生成和转移所需的优化的硫酸化低聚糖中存在细微的差别。不管怎样，已经证明几种由天然存在的低聚糖衍生而来的硫酸化低聚糖同时显示出有效的抗转移和抗血管生成活性。这些化合物是来源于P.holstii的硫酸化的甘露五糖磷酸酯和硫酸麦芽五糖、六糖和七糖的。硫酸化的合成低聚糖的抗血管生成和抗转移活性
也对实施例1-5中所描述的硫酸化的合成低聚糖的生物活性进行了测试。表3总结了含甘露糖、半乳糖或葡萄糖的硫酸化的合成低聚糖抑制凝血，肝素酶作用和生长因子-硫酸乙酰肝素结合的能力。所有被测试的硫酸化低聚糖都显示可忽略的抗凝血活性。然而，除了甘露糖和葡萄糖的三糖外，所有其它的硫酸化低聚糖都是肝素酶活性和生长因子-硫酸乙酰肝素结合的很有效的抑制剂。事实上，总的结论是在这些试验中含4-6个己糖单元(比如D-甘露糖、D-半乳糖或D-葡萄糖)的硫酸化的合成低聚糖都具有很高的活性。一种例外是半乳三糖，其具有与半乳糖系列中其它的成员一样的活性。
当在人体血管生成试验中测试时，硫酸化的甘露糖低聚物是抑制性的，虽然五和六糖比四糖的活性高(图8)，其效力类似于硫酸化的甘露五糖磷酸酯。类似地，作为抗转移药物，硫酸化的甘露四，五和六糖与硫酸化的甘露五糖磷酸酯一样有效(图9)。含半乳糖的硫酸化低聚糖和葡萄六糖硫酸也抑制转移(图10)，虽然它们倾向于比含甘露糖的化合物的活性稍微低一些。硫酸化低聚糖的抗炎症活性
如前所述，阻止白血球进入炎症位点的关键屏障物是内皮下膜基膜。为了通过这层膜，白血球必须应用一套降解酶(11)。特别相关的是内糖苷酶，肝素酶，其将与硫酸乙酰肝素链缔和的基膜裂解并且对于白血球外浸是必不可少的(12，13)。事实上，如转移研究一样(35)，抑制肝素酶活性的硫酸化的多糖对于炎症也是有效的抑制剂(43，44)。基于这些观察，这也是熟悉本技术领域的人所期望的，有效的抗血管生成和抗转移剂将是有效的抗炎症化合物。其中特别重要的是硫酸麦芽六糖和甘露五糖硫酸。并且，既然血管生成是伴随诸如风湿性关节炎(18)之类的慢性炎症疾病而引起的，因此这些化合物的抗血管生成活性在炎症的治疗中将是很有价值的。
在几个动物的炎症模式中获得了支持这种预言的证据。首先，硫酸麦芽六糖、甘露五糖硫酸和硫酸化的甘露五糖磷酸酯可显著地抑制由巯基乙酸酯所诱发的气囊炎(表4)。事实上，在一个实验中简单地注射甘露五糖硫酸在抑制白血球浸透中与泼泥松一样有效，其主要是天然的中性白细胞，而硫酸麦芽六糖的效力稍差一些。当在6小时外注射两等剂量的硫酸化低聚糖时，甚至观察到比较大的炎症抑制。
其次，对硫酸化低聚糖进行了抑制小鼠慢性哮喘病模式的能力。这种模式的特征在于是由气源性致敏原激发所引起的大量的嗜酸性细胞移入老鼠的肺内(41)。这种炎症的响应在人体中的特征是慢性哮喘病。当通过微型浸透泵部施用硫酸麦芽六糖和甘露五糖硫酸时，显著抑制了嗜酸性细胞在老鼠肺部的积累(表5)。当硫酸麦芽六糖以一种烟雾剂(40mg/ml溶液)的形式施用时，也具有一定的抗炎症活性。
第三，甘露五糖硫酸和硫酸化的甘露五糖硫酸在一个老鼠疾病模式中都显著地抑制EAE(表6)。事实上，一些经硫酸化低聚糖处理过的动物不出现病症。这些数据与早期研究中所表明的抑制肝素酶活性的硫酸化的多糖能减轻EAE的严重性的结果是一致的(43)。
最后，检测了甘露五糖磷酸酯抑制小鼠肠道炎症疾病模式的能力。这种模式(其被饮用水中的葡聚糖硫酸诱发)引起一种类似于溃疡性结肠炎的结肠炎和轻微的Chron病。发现20mg/kg/天的硫酸化的甘露五糖磷酸酯引起了剧烈结肠炎的显著减弱，也阻止了由这种病产生的体重损失(表7)。这个实验中的对照接受了硫酸化低聚糖注射但不是在饮用水中加入葡聚糖硫酸。
                        表1
           不同天然存在的低聚糖的硫酸化形式
        对人体血管生成、肝素酶活性和转移性的抑制作用化合物                 糖单元数  抗凝血活性a 50％抑制浓度(μl/ml)  转移性
                                (％)      血管生成     肝素酶  (％对照)b肝素酶                    大约60     100         ＞2000     1        20±3硫酸化的甘露五糖磷酸酯c   5         0.2         2          2        31±3硫酸化的棉子糖             3         1.6         200        50       48±9硫酸化的水苏糖             4         3.2         2000       12       36±4硫酸化的麦芽糖             2         0           2000     ＞1000     99±9硫酸化的麦芽四糖           4         0.8         20         10       72±9硫酸化的麦芽六糖           6         1.6         2          1.5      24±7硫酸化的环六直链淀粉       6         0.4         200        8        107±7硫酸化的环七直链淀粉       7         0.8         200        7        81±14硫酸化的环八直链淀粉       8         1.6         200        5        36±6硫酸化的软骨素四糖         4         0           2000     ＞30       ND硫酸化的软骨素六糖         6         0.2         2000       45       ND硫酸化的软骨素八糖         8         ND          1000       ND       ND苏拉明    -    0.1    50    8    74±8a抗凝血活性以肝素活性为100％b大鼠肺(其由静脉注射接受13762MAT细胞且在细胞注射的同时接受2mg/大鼠的低聚糖)的百分对照转移性±平均值的标准偏差(n＝4)。下划线值表示具有最大的抗转移作用的化合物。c从酵母Pichia holstii分离的甘露五糖磷酸酯。ND没有测定。
                             表2
            硫酸化低聚糖中的硫酸化的甘露五糖磷酸酯和
     麦芽糖系列对肝素酶活性和生长因子结合到硫酸乙酰肝素上的抑制作用硫酸化低聚糖  硫酸化a ％硫酸化  抗凝血活性(％)b       IC50(μl/ml)c
                                             肝素酶    bFGF     aFGF麦芽糖           6/8      75          0.2       ＞100       ＞200    134麦芽三糖         10/11    91          0.8         100       145      58.7麦芽四糖         11/14    79          1.6         25        65       31.5麦芽五糖         15/17    88          3.2         4         37.5     27麦芽六糖         18/20    90          2           5         31.3     27麦芽七糖         18/23    78          3.9         3         10       27甘露五糖磷酸酯d 10/16    63          0.2         5         25       22麦芽六糖         3/20     15          0         ＞100       187    ＞200麦芽六糖         9/20     45          0.8         50        45.6     79麦芽六糖         14/20    70          0.4         20        12.5     12.5麦芽六糖         17/20    85          0.7         6         5.4      10.4麦芽六糖         18/20    90          2           6         5.4      18.8麦芽六糖         20/20    100         33          5         5.4      19.7a实际连接的硫酸基团数目/理论上每个分子可连接的硫酸基团的最大数目b抗凝血活性以肝素活性为100％c抑制50％人体血小板肝素酶活性或小鼠3T3细胞结合至固定化的aFGF/bFGF上所需的化合物的浓度。在肝素酶试验中，IC50对肝素是2μg/ml。d从酵母Pichia holstii分离的甘露五糖磷酸酯。ND没有测定。
                          表3
            不同合成硫酸化低聚糖的硫酸化形式
       对肝素酶活性、生长因子结合到硫酸乙酰肝素上的抑制作用硫酸化低聚糖  硫酸化a ％硫酸化  抗凝血活性(％)b        IC50(μl/ml)c
                                             肝素酶      bFGF      aFGF甘露三糖       7/11       64       0.3            25           ND        5甘露四糖       10/14      71       0.4            6            20        5甘露五糖       12/17      71       0.4            4            15        5甘露六糖       11/20      55       0.8            3            11        ND半乳三糖       6.6/11     60       0.7            4            25        ND半乳四糖       8.3/14     59       1.0            3.5          9         ND半乳六糖       14.5/17    72.5     0.7            3.5          11        ND葡萄三糖       ND         ND       0.1            30           47        ND葡萄六糖       13.4/20    67       0.4            3.5          15        NDa实际连接的硫酸基团数目/理论上每个分子可连接的硫酸基团的最大数目b抗凝血活性以肝素活性为100％c抑制50％人体血小板肝素酶活性或小鼠3T3细胞结合到固定化的aFGF/bFGF上所需的化合物的浓度。在肝素酶试验中，IC50对肝素是2gμ/l。d从酵母Pichia holstii分离的甘露五糖磷酸酯。ND没有测定。
                                  表4
                    硫酸化低聚糖对气囊炎的作用a
   处理                剂量    白血球浸入气囊(％时照)b
                                 实验1     实验2硫酸化的麦芽六糖          50mg/kg    76±7     44±12硫酸化的甘露五糖          50mg/kg    57±7     16±2硫酸化的甘露五糖磷酸酯    50mg/kg    ND        51±9(P.holstii)泼泥松                    25mg/kg    56±14    44±3a气囊炎由巯基乙酸酯所诱发且在白血球浸入17小时后评估。对实验1，药物与巯基乙酸酯同时由皮下注射。在实验2中，硫酸化低聚糖在巯基乙酸酯注射0小时和7小时后由皮下注射。b数据以气囊中浸入的百分对照白血球数±平均值的标准偏差给出。对照注射巯基乙酸酯但不接受药物处理，只注射盐水。在只注射盐水的气囊中的背景白血球浸入是跟着注射巯基乙酸酯所观察的9±2％。ND没有测定。
                    表5
          硫酸化低聚糖对由嗜酸性细胞
   在小鼠肺部积累所诱发的卵清蛋白(OVA)的作用a硫酸化低聚糖    准则       剂量    嗜酸性细胞/ml
                               BALF(％对照)b麦芽六糖    泵，腹膜注射  50mg/kg/天    5742麦芽六糖    泵，腹膜注射  115mg/kg/天   9±7麦芽六糖    烟雾剂        10mg/mlc     98±24麦芽六糖    烟雾剂        40mg/mlc     63±23甘露五糖    泵，腹膜注射  50mg/kg/天    63±12a使老鼠对OVA敏感，然后通过施用OVA烟雾剂引起肺部浸入嗜酸性细胞。硫酸化低聚糖要么由微型浸透泵腹内注入要么以烟雾剂通过肺部。b数据以支气管肺泡灌洗液(BALF)中对照嗜酸性细胞数目百分数±标准偏差表示，对照是经OVA激发且以烟雾剂形式要么通过微型浸透泵要么通过肺部接受盐水的动物。c烟雾剂溶液中硫酸化低聚糖的浓度。
                       表6
           硫酸化低聚糖对过继转移的
        实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)的作用a硫酸化低聚糖  EVA/总计  平均开始天数  疾病严重性(％对照)d对照            6/6      5.5±0.2      100±11甘露五糖        3/5      5.3±0.3      31.5±15.1甘露五糖磷酸酯  4/5      5.3±0.3      47.9±16.4(P.holstii)a EAE通过用30×106个ConA活化的EAE效应细胞在Lewis大鼠中诱发。b硫酸化低聚糖在细胞转移时由微型浸透泵插入皮下来施用，接受的剂量为70mg/kg/天。c在发生疾病的动物中EAE开始的平均天数。d疾病严重性代表动物的累积临床评分。
                         表7
     硫酸化的甘露五糖磷酸酯对小鼠肠道炎性疾病的作用a天数b        未经处理的                  经处理的
  平均疾病评分d 体重(gm)d 平均疾病评分d 体重(gm)d0       0             23.1          0          22.11       0             23.2          0          22.12       0             23.6          0          22.63       0             23.5          0          22.54       0             23.3          0          21.95       0             23.4          0          21.96       0.47          23.3          0.07       22.47       1.40          22.7          0.40       22.48       2.47          22.1          0.40       22.39       2.87          21.4          0.67       22.210      2.00          20.7          0.93       22.1a通过在饮用水中施用葡聚糖硫酸所诱发的肠道炎疾病。b开始施用葡聚糖磷酸酯后的天数。c未经处理的动物每天接受三次盐水注射而经处理的动物每天以20mg/kg/天接受三次硫酸化的甘露五糖磷酸酯注射。d平均疾病评分代表动物在每个时间点腹泻和直肠出血的评分的和。
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Claims (24)

1.一种硫酸化低聚糖，该低聚糖具有结构通式I：
               R1-(Rx)n-R2(I)其中R1和R2以及每个Rx代表一个单糖单元，所有的单糖单元可以相同也可以不同，相邻的单糖单元由1→2，1→3，1→4和/或1→6糖苷键连接；且n是1-6之间的整数。
2.按照权利要求1的硫酸化低聚糖，其中n是1→4，优选地是3或4。
3.按照权利要求1或2的硫酸化低聚糖，其中所说的单糖单元是选自由果糖、葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔罗糖、半乳糖、艾杜糖和古洛糖组成的组的己糖。
4.按照权利要求1的硫酸化低聚糖，该低聚糖具有结构通式II：
              Ry-(Ry)n-Ry(II)其中每一个Ry基团相同且每个代表一个单糖单元，相邻的单糖单元由1→3，1→4和/或1→6糖苷键连接；且n是1-6之间的整数。
5.按照权利要求4的硫酸化低聚糖，其中n是1-4，优选地是3或4。
6.按照权利要求4或5的硫酸化低聚糖，其中Ry代表一个单糖单元，该单糖单元是选自由葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔罗糖、半乳糖、艾杜糖和古洛糖组成的组的己糖。
7.按照权利要求6的硫酸化低聚糖，其中Ry代表葡萄糖，甘露糖或半乳糖。
8.按照按照权利要求1的硫酸化低聚糖，其中所说的低聚糖是天然存在的低聚糖。
9.按照权利要求8的硫酸化低聚糖，其中所说的低聚糖选自棉子糖和水苏糖。
10.按照权利要求1的硫酸化低聚糖，其中所说的低聚糖是通过天然存在的多糖的酶促降解或化学降解制备的。
11.按照权利要求10的硫酸化低聚糖，其中所说的低聚糖是一种由直链淀粉，软骨素或葡聚糖衍生的低聚糖。
12.按照权利要求11的硫酸化低聚糖，其中所说的低聚糖选自麦芽四糖、麦芽五糖和麦芽六糖；葡萄三糖、葡萄四糖和葡萄五糖；以及软骨素四、六和八糖。
13.按照权利要求10的硫酸化低聚糖，其中所说的低聚糖是来源于酵母Pichia holstii的甘露五糖磷酸酯。
14.一种用于对需要抗血管生成、抗转移和/或抗炎症治疗的人或其它温血动物患者进行这种治疗的方法，该方法包括对患者施用有效量的至少一种按照权利要求1-13之任一的硫酸化低聚糖。
15.按照权利要求1-13之任一的硫酸化低聚糖在温血动物(包括人)患者的治疗中作为抗血管生成、抗转移和/或抗炎症药剂的用途。
16.按照权利要求14或15的方法或用途，其中所说的治疗包括血管生成依赖性疾病的治疗，所述疾病包括与实体肿瘤生长有关的血管生成、增生性视网膜病和类风湿性关节炎。
17.按照权利要求14或15的方法或用途，其中所说的治疗包括治疗其中肝素酶抑制活性抑制白血球渗透的炎症性疾病和病态，包括诸如类风湿性关节炎、多部位硬化、胰岛素依赖性糖尿病之类的慢性炎症性疾病；诸如溃疡性结肠炎和克罗恩氏炎症性肠道疾病之类的疾病；同种异体移植排斥和慢性哮喘病。
18.一种用于抗血管生成、抗转移和/或抗炎症治疗的药物或兽药组合物，该组合物包含至少一种按照权利要求1-13之任一的硫酸化低聚糖以及药学上和兽医学上可接受的载体或稀释剂。
19.按照权利要求1-13之任一的至少一种硫酸化低聚糖在制造用于人或其它温血动物患者的抗血管生成、抗转移和/或抗炎症治疗之药物上的用途。
20.一种低聚糖，该低聚糖具有结构通式II：
             Ry-(Ry)n-Ry  (II)其中每一个Ry基团相同且每一个代表一个单糖单元，相邻的单糖单元由1→3，1→4和/或1→6糖苷键连接；且n是1-6之间的整数。
21.按照权利要求20的低聚糖，其中n是1-4，优选地是3或4。
22.按照权利要求20或21的低聚糖，其中Ry代表一个单糖单元，该单糖单元是选自由葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔罗糖、半乳糖、艾杜糖和古洛糖组成的组的己糖。
23.按照权利要求22的低聚糖，其中Ry代表葡萄糖、甘露糖或半乳糖。
24.按照权利要求20的低聚糖，其中Ry是一个全部O-乙酰化的单糖，或Ry是一个全部由不是乙酰基的酰基部分O-酯化的单糖。
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