CN111904968A - 硫酸半乳四糖及其衍生物在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了硫酸半乳四糖及其衍生物在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用。将所述硫酸半乳四糖或者所述硫酸半乳四糖衍生物应用于抗上皮细胞黏附的药物,或者将所述硫酸半乳四糖或者所述硫酸半乳四糖衍生物应用于抗上皮细胞黏附的功能食品。所述硫酸半乳四糖能靶向结合斑激酶(FAK);有效抑制上皮细胞的黏附能力。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种硫酸半乳四糖及其衍生物在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用。
背景技术
黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一种细胞内的非受体酪氨酸激酶,在转染的V-Src鸡胚成纤维细胞中被首次发现[1]。FAK在多数组织中都有较高的表达,其蛋白序列在很多物种(鼠、蟾蜍、人等)中具有较高的同源性。FAK在细胞内是多条信号传导通路的交汇处,参与肿瘤形成、增殖、转移和凋亡、心血管疾病等多个生物过程。本文对近年来FAK的主要信号转导通路、生物学效应及其作为抗肿瘤靶点等研究进展进行综述。FAK的相对分子质量为125kDa,其结构可以分为4个部分:氨基端的FERM(4.1-ezrin-radixinmoesin)区域、中间的激酶催化区域、羧基端的黏着斑目标(focal-adhesiontargeting,FAT)区域以及多个起连接作用的富含脯氨酸区域(proline-richregions,PRRs)。FAK有7个酪氨酸磷酸化位点,分别是位于FERM区域的Y194、位于FERM和激酶区域之间的Y397、位于激酶区域的Y576和Y577、位于PRR3区域的Y861以及位于FAT区域的Y925和Y1007,其中Y397具有自磷酸化作用,对FAK的活性和生物学功能的实现起着重要的作用。
FAK通过多条信号通路促进肿瘤细胞的生存和生长,其中包括激酶依赖和非激酶依赖途径,涉及肿瘤细胞的凋亡、耐药和细胞周期等生理过程。在多种肿瘤细胞中,FAK的表达量和活性增加,能够促进细胞抗凋亡作用。其中,FAK通过非激酶依赖途径,在细胞核内发挥脚手架蛋白功能与P53和MDM2相互作用,促进P53泛素化失活,抑制其转录功能,从而促进细胞抗凋亡。FAK经激酶依赖途径发挥抗凋亡作用,多数通过PI3K-AKT信号通路[15]。如由蛋白酪氨酸激酶6(protein tyrosine kinase 6,PTK6)介导的FAKY861磷酸化激活,能够引起由AKT介导的抗凋亡作用[16]。同时,FAK活化可以激活细胞内的生存信号,从而促进肿瘤生长。
肿瘤细胞侵袭是肿瘤形成的重要过程,是肿瘤细胞入侵周围微环境的过程,有助于肿瘤转移至正常组织形成新病灶。肿瘤细胞侵袭需要有以下几个过程:黏着斑和细胞骨架力学的改变;基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)表达量或者活性的改变以及上皮细胞间质转化(epithelial-to-mesenchymaltransition,EMT)。FAK通过多个信号通路参与黏着斑的形成和翻转过程。FAK在新生黏着斑处募集活化,与RHOARHGEF28连接。研究表明,FAK-ARHGEF28复合物在原位结肠癌小鼠中,促进肿瘤细胞的局部侵袭[17]。FAK-ARHGEF28二聚体和FAK活性增强,促进桩蛋白(paxillin)酪氨酸磷酸化过程。桩蛋白是黏着斑位点上肌动蛋白-膜附着的细胞骨架蛋白,参与黏着斑的成熟[18]。FAK还会将整合素活化调节蛋白(talin)募集至新生黏着斑[19]。同时,FAK-talin连接参与黏着斑的翻转过程。研究表明,干扰FAK-tailin连接的基因突变,会抑制tailin剪切,从而抑制有效的黏着斑翻转[19]。
FAK与肿瘤的增殖、生存、转移和凋亡之间存在密切关系,在多种类型的肿瘤细胞(如卵巢癌、肺癌、肝癌等)中发现FAK上调现象,FAK逐渐成为一个临床抗肿瘤靶点。最初的尝试是通过下调FAK在肿瘤细胞中的表达以达到抑制肿瘤的目的。通过转染羧基端失活的FAK(FAK-CD)沉默FAK,减少细胞黏着和增殖,在活体实验中实现了抑制乳腺癌细胞生长的作用[27]。通过转染含有FAK-silenced RNA(FAK-siRNA)的质粒,在活体内抑制了癌症。同时抑制FAK和FAK下游信号分子(如SRC)的表达,能够使得抗肿瘤效应增强。
FAK在肿瘤细胞内扮演十分重要的角色,是多条信号传导通路的交汇点,是目前受到广泛关注的抗肿瘤靶点之一。近年来的研究发现,FAK可经多种因素激活,包括整合素、G蛋白偶联受体等,同时FAK经激酶依赖和非激酶依赖2种途径调控细胞内P53、PI3K-AKT-mTOR等信号通路,参与肿瘤细胞的生存、增殖、转移等生物过程。基于FAK在肿瘤细胞中的重要功能,目前有多种FAK抑制剂作为抗肿瘤药物,处于临床前研究或临床试验阶段。对FAK功能的研究及其抑制剂的研发,将为临床治疗肿瘤带来新的思路和化疗策略。本发明聚焦硫酸半乳四糖与FAK的靶向结合以及抗上皮细胞黏附的功能,可将硫酸半乳四糖开发为新型FAK抑制剂的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明的目的在于提供了硫酸半乳四糖及其衍生物在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明的一方面提供硫酸半乳四糖在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用。
本发明的另一方面提供硫酸半乳四糖衍生物在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用。
优选的,将所述硫酸半乳四糖或者所述硫酸半乳四糖衍生物应用于抗上皮细胞黏附的药物,或者将所述硫酸半乳四糖或者所述硫酸半乳四糖衍生物应用于抗上皮细胞黏附的功能食品。
优选的,所述硫酸半乳四糖能靶向结合斑激酶(FAK);有效抑制上皮细胞的黏附能力。
优选的,硫酸半乳四糖是以海洋松藻为原料,通过乙醇脱脂、用热水提取后,然后用不同百分比的乙醇分级沉淀,得到沉淀组分,取沉淀组分质量的80%,进一步采用化学降解、超滤和凝胶柱分离纯化,得到所述硫酸半乳四糖;
优选的,所述硫酸半乳四糖分子结构式如下:
优选的,所述硫酸半乳四糖衍生物包括:以包含半乳四糖为母核的硫酸化衍生物、以包含半乳四糖为母核的磷酸化衍生物,以及以包含半乳四糖为母核的乙酰化衍生物。
优选的,所述硫酸半乳四糖的用量为25-355mg/kg。
优选的,所述半乳四糖的制备方法包括如下步骤:
1)、将采集的松藻晒干、研磨成粉,脱脂后在恒温水浴下搅拌;
2)、浓缩后采用不同百分比的乙醇分级沉淀,收集沉淀冻干,得到醇沉冻干粉末,备用;
3)、取醇沉冻干粉末的80%,采用稀盐酸进行恒温降解,得到降解溶液;
4)、将步骤3)得到的溶液进行浓缩、醇沉,取上清液经旋转仪浓缩后,再通过凝胶色谱柱进行脱盐处理;
5)、然后采用Bio-Gel P6色谱柱分离纯化;
6)、收集峰尖部分,冻干即得硫酸半乳四糖。
本发明的有益效果在于:
1、本发明提供硫酸半乳四糖及其衍生物在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用。
2、本发明实施例提供了硫酸半乳四糖在制备靶向FAK抗上皮细胞黏附药物中的应用,并提供了硫酸半乳四糖衍生物在制备靶向FAK抗上皮细胞黏附药物中的应用。
3、本发明硫酸半乳四糖与FAK的亲和力极强,相互作用结合口袋位于FAK的硫酸半乳四糖可紧凑的与FAK的Loop区域结合,亲和力为-5.3kcal/mol。实验表明硫酸半乳四糖能显著抑制口腔鳞状癌细胞的黏附能力。
4、本发明实施例原料来源于松藻,具有资源丰富、制备工艺简单、得率高、容易产业化,以及产品具有水溶性好、稳定性高等优点,在口腔鳞状癌的防治方面具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例中硫酸半乳四糖的二级质谱图。
图2是硫酸半乳四糖与靶点蛋白的FAK的分子对接图谱
图3是硫酸半乳四糖与靶点蛋白的FAK相互作用的活性口袋分析。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
本发明的一实施例提供硫酸半乳四糖在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用。需要说明的是,硫酸半乳四糖属于硫酸半乳糖一大类。
具体的,将硫酸半乳四糖应用于抗上皮细胞黏附的药物,或者应用于抗上皮细胞黏附的功能食品。
具体应用方式为:将所述硫酸半乳四糖直接作为药物或者功能食品进行食用。
具体的用法用量为:每天(2)次,以硫酸半乳四糖的用量计,每次(12.5-177.5)mg。所述硫酸半乳四糖的用量为25-355mg/kg。
本发明的另一实施例提供硫酸半乳四糖衍生物在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用。
具体的,将硫酸半乳四糖衍生物应用于抗上皮细胞黏附的药物,或者应用于抗上皮细胞黏附的功能食品。
具体应用方式为:将所述硫酸半乳四糖衍生物直接作为药物或者功能食品进行食用。
具体的用法用量为:每天(2)次,以硫酸半乳四糖的用量计,每次(12.5-177.5)mg。所述硫酸半乳四糖的用量为25-355mg/kg。
本发明实施例中,所述硫酸半乳四糖衍生物包括:以包含半乳四糖为母核的硫酸化衍生物、以包含半乳四糖为母核的磷酸化衍生物,以及以包含半乳四糖为母核的乙酰化衍生物。
本发明实施例中,所述硫酸半乳四糖能靶向结合斑激酶(FAK);有效抑制上皮细胞的黏附能力。
本发明实施例中,硫酸半乳四糖是以海洋松藻为原料,通过乙醇脱脂、用热水提取后,然后用不同百分比的乙醇分级沉淀,得到沉淀组分,取沉淀组分质量的80%,进一步采用化学降解、超滤和凝胶柱分离纯化,得到所述硫酸半乳四糖;
具体的,包括如下步骤:
1)、将采集的松藻晒干、研磨成粉,经70%乙醇脱脂,然后在恒温50℃水浴下搅拌4-10小时提取,将提取液进行浓缩;
2)、浓缩后依次采用70%乙醇、80%乙醇分级沉淀,收集沉淀冻干,得到醇沉冻干粉末,备用;
3)、取醇沉冻干粉末的80%,采用稀盐酸进行恒温降解,得到降解溶液;
4)、将步骤3)得到的溶液进行浓缩、醇沉,取上清液经旋转仪浓缩后,再通过凝胶色谱柱进行脱盐处理;
5)、然后采用Bio-Gel P6色谱柱分离纯化;
6)、收集峰尖部分,冻干即得硫酸半乳四糖。
所述硫酸半乳四糖分子量为746.1kD;所述硫酸半乳四糖分子结构式如下:
以下为具体实施例。
实施例1
实施例1:硫酸半乳四糖提取制备及分析
将松藻晒干、研磨成粉,脱脂后恒温50摄氏度水浴下搅拌10小时;浓缩后70%和80%乙醇分级沉淀;收集沉淀冻干;采用0.05-0.1mol/L稀盐酸58摄氏度将粉末进行恒温降解,58摄氏度,3小时;将溶液进行浓缩、醇沉,取上清液经旋转仪浓缩后,再通过凝胶色谱柱进行脱盐处理;然后采用Bio-Gel P6色谱柱分离纯化;收集峰尖部分,冻干即得硫酸半乳四糖。
所制得的硫酸半乳四糖结构式如下:
取样品加入0.05M的NaBH4与冰箱4C中反应过夜,以1∶1乙酸水调PH为7.0。采用AG50W-X8对反应后的寡糖样品进行蒸馏水洗脱,然后浓缩冻干。在质谱分析过程中,以氮气为吹干气体和喷雾气体,流速为250L/h,以乙腈∶水=1∶1(V/V)为流动相进行质朴分析。在二级质谱中,需要锥孔电压80eV,氩气作为碰撞气体,流速为15L/h。同时,保持碰撞能量保持在20-50eV交换时,得到最佳序列信息。离子源和溶剂挥发峰温度分别为80℃和150℃。
硫酸半乳四糖的二级质谱如图1所示。在[M-H]-745.1(m/z)中,(m/z 241),(m/z403),(m/z 421),(m/z 565),(m/z 583)是环间断裂分子,由此可以推断硫酸半乳四糖的连接顺序;(m/z 331),(m/z 493),(m/z 523),(m/z 625),(m/z655),(m/z 685)为环内断裂产生的离子碎片。依据这些特征碎片离子推断此四糖为还原端带有硫酸基团的直链四糖,结构为β-D-Galp-(4SO4)-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp--(1→3)-β-D-Galp。
实验测试1:硫酸半乳四糖与FAK蛋白激酶的紧密相互结合作用分析
采用实施例1所制备的硫酸半乳四糖进行测试。具体步骤为:
我们采用分子对接软件Autodock vina 1.1.2研究了硫酸半乳四糖与FAK蛋白激酶的相互作用方式。首先使用ChemDraw Professional 15.1软件画出小分子硫酸半乳四糖的分子结构,然后用Chem3D 15.1软件转化为三维结构,MMFF94力场进行能量优化。FAK蛋白激酶用AutodockTools 1.5.6添加极性氢,并转化为PDBQT分子对接格式。确定GK的活性口袋坐标为:center_x=-27.408,center_y=-0.201,center_z=16.359;size_x=20,size_y=38,size_z=42。为了增加计算的准确度,我们将参数exhaustiveness设置为10。最终选取打分值最高的构象用PyMoL 1.7.6和DS客户端进行作图和结果分析。
由分析结果可知,硫酸半乳四糖可紧凑的与FAK的Loop区域结合,亲和力为-5.3kcal/mol。硫酸半乳四糖位于由ASN551、GLN432、SER568、GLU430、MET499、GLY563、VAL436、ALA452、ASP564、ARG550、LEU553组成的疏水腔袋中,形成强烈的疏水相互作用。而且硫酸半乳四糖可与FAK的活性腔袋中氨基酸GLN432、ARG550、GLU506形成4个稳定的氢键,因而,我们可以推知:这种特殊的结合模式,可使硫酸半乳四糖与FAK形成稳定的复合物,有利于硫酸半乳四糖作用的发挥。
实验测试2:硫酸半乳四糖人口腔鳞癌的生长抑制作用
采用实施例1所制备的硫酸半乳四糖进行测试。
液氮内保存的人口腔鳞癌SCC-15细胞取出后进行复苏,接种于DMEM培养基。在37℃、5%CO2恒温的培养箱中培养细胞。24h后细胞呈贴壁生长即复苏成功,每隔1d冲洗换液1次,2d后,用胰蛋白酶消化并制成细胞悬液用于实验。
将对数生长期的SCC-15制成细胞悬液,接种于96孔的孔板中,每孔200μl,含5000个SCC-15细胞,设置5个复孔,将其放置在CO2为5%,温度为37℃恒温箱中孵育,观察到细胞将96孔平底板的孔底部铺满时,加入不同的药物浓度(DMEM培养液配制)100μl,空白对照组为添加等量不含药液的DMEM培养液,培养时间为24h及48h。检测前每孔加入MTT 20μl(5mg/ml),继续置于培养箱中培养4h,离心后弃去培养液,用PBS洗3次,再加入含MTT培养液,终止培养后吸去培养液,加入150μl二甲基亚砜,低速震荡10min,在酶标仪上读取570nm波长下每孔的吸光度值,按细胞生长抑制率(inhibitory rate,IR)的计算公式算出IR的数值:IR=(1-药物组A值/对照组A值)×100%。
表1半硫酸半乳四糖对人口腔鳞癌SCC-15细胞的生长抑制作用
组别(μmol/L) | 细胞生长抑制率(%) |
对照组 | 0 |
5.0 | 7.1±0.08 |
10 | 12.7±0.11 |
20 | 18.68±1.16* |
40 | 21.41±1.21<sup>**</sup> |
80 | 31.02±1.16<sup>**</sup> |
150 | 41.55±3.82<sup>**</sup> |
300 | 48.72±4.10<sup>**</sup> |
600 | 48.21±4.11<sup>**</sup> |
注:n=8,x±SD,与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01
结果显示,硫酸半乳四糖从20mg/ml的剂量开始,可显著抑制人口腔鳞癌SCC-15细胞的生长,当剂量加大到300mg/ml时,其抑制人口腔鳞癌SCC-15细胞生长率高达48.72%。
需要说明的是,在整个申请文件中,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,由于文字表达的有限性,而客观上存在无限的试试方式,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进、润饰或变化,也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合;这些改进润饰、变化或组合,或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的,均应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.硫酸半乳四糖在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用。
2.硫酸半乳四糖衍生物在制备抗上皮细胞黏附药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,将所述硫酸半乳四糖或者所述硫酸半乳四糖衍生物应用于抗上皮细胞黏附的药物,或者将所述硫酸半乳四糖或者所述硫酸半乳四糖衍生物应用于抗上皮细胞黏附的功能食品。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述硫酸半乳四糖能靶向结合斑激酶;有效抑制上皮细胞的黏附能力。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,硫酸半乳四糖是以海洋松藻为原料,通过乙醇脱脂、用热水提取后,然后用不同百分比的乙醇分级沉淀,得到沉淀组分,取沉淀组分质量的80%,进一步采用化学降解、超滤和凝胶柱分离纯化,得到所述硫酸半乳四糖。
7.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述硫酸半乳四糖衍生物包括:以包含半乳四糖为母核的硫酸化衍生物、以包含半乳四糖为母核的磷酸化衍生物,以及以包含半乳四糖为母核的乙酰化衍生物。
8.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述硫酸半乳四糖的用量为25-355mg/kg。
9.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述半乳四糖的制备方法包括如下步骤:
1)、将采集的松藻晒干、研磨成粉,脱脂后在恒温水浴下搅拌;
2)、浓缩后采用不同百分比的乙醇分级沉淀,收集沉淀冻干,得到醇沉冻干粉末,备用;
3)、取醇沉冻干粉末的80%,采用稀盐酸进行恒温降解,得到降解溶液;
4)、将步骤3)得到的溶液进行浓缩、醇沉,取上清液经旋转仪浓缩后,再通过凝胶色谱柱进行脱盐处理;
5)、然后采用Bio-GelP6色谱柱分离纯化;
6)、收集峰尖部分,冻干即得硫酸半乳四糖。
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