CN110882263B - 礁膜寡二糖在制备抗乳腺癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例提供礁膜寡二糖与礁膜寡二糖衍生物在抗乳腺癌中的应用,将所述礁膜寡二糖或者所述礁膜寡二糖衍生物用以治疗乳腺癌。具体的,将所述礁膜寡二糖或者所述礁膜寡二糖衍生物应用于抗乳腺癌的药物,或者将所述礁膜寡二糖或者所述礁膜寡二糖衍生物应用于抗乳腺癌的功能食品。本发明实施例通过靶向抑制PTP1B的酶活力,并抑制乳腺癌细胞的生长,用以治疗乳腺癌。
Description
技术领域
本发明属于生物技术药物技术领域,具体涉及礁膜寡二糖与礁膜寡二糖衍生物在抗乳腺癌中的应用,尤其涉及将礁膜寡二糖应用于靶向PTP1B 抗乳腺癌药物和功能食品、以及将礁膜寡二糖衍生物应用于靶向PTP1B 抗乳腺癌药物和功能食品。
背景技术
近年来,各种恶性肿瘤频发,一直以来,恶性肿瘤都是医学界的难点,其中,以乳腺癌、乳腺癌、肺癌等较多。因此,医学界也是一直致力于各种恶性肿瘤的攻克。
以乳腺癌为例,蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phospatase,PTP)又叫做蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型1(tyrosine-protein phosphatase non-reeeptor type l)。PTP1B是PTP家族第一个被分离纯化出来的酶,能负向调节胰岛素信号通路和瘦素信号通路。随着对PTP1B研究的深入,人们发现PTP1B与肿瘤也密切相关,PTP1B蛋白在人类乳腺癌组织中高表达,其阳性表达率明显高于正常乳腺组织;根据研究结果,我们认为 PTP1B的高表达是乳腺癌中致癌信号转导增强的重要肿瘤标记物,是乳腺癌的不良预后因素,因此靶向PTP1B抗乳腺癌研究是开发抗肿瘤药物的重要方向之一。小分子天然产物是PTP1B抑制剂的重要来源。目前发现的的天然抑制剂主要包括:酚类化合物、黄酮类化合物、香豆素类和木酚素类化合物、萜类化合物等,因此,从天然产物中寻找新型PTP1B抑制剂来治疗结乳腺癌癌是近期研究的热点。
不同来源的海藻酸盐及其衍生物有多种生物和药用作用,如神经保护作用、抗炎作用、免疫刺激作用、抗癌作用和抗氧化作用等。海藻酸盐也因其稳定性、生物降解性和低毒性而广泛应用于食品、制药、化妆品和纺织业。目前文献报道最多的是褐藻多糖及寡糖领域的研究,对于绿藻,因其结果更为复杂,研究主要集中于多糖的结构解析和活性探索,其寡糖的研究鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供礁膜寡二糖在抗乳腺癌中的应用,可以降低 PTP1B的酶活力,并抑制乳腺癌细胞的生长,用以治疗乳腺癌。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明的一方面提供礁膜寡二糖在抗乳腺癌中的应用,将所述礁膜寡二糖用以治疗乳腺癌。
本发明的又一方面提供礁膜寡二糖衍生物在抗乳腺癌中的应用,将所述礁膜寡二糖衍生物用以治疗乳腺癌。
作为本发明的进一步方案,将所述礁膜寡二糖或者所述礁膜寡二糖衍生物应用于抗乳腺癌的药物,或者将所述礁膜寡二糖或者所述礁膜寡二糖衍生物应用于抗乳腺癌的功能食品。
具体的,将所述礁膜寡二糖应用于抗乳腺癌的药物或者抗乳腺癌的功能食品,和/或,将所述礁膜寡二糖衍生物应用于抗乳腺癌的药物或者抗乳腺癌的功能食品。
作为本发明的进一步方案,所述礁膜寡二糖衍生物包括:以包含礁膜寡二糖为母核的硫酸化衍生物、以包含礁膜寡二糖为母核的磷酸化衍生物,以及以包含礁膜寡二糖为母核的乙酰化衍生物。
作为本发明的进一步方案,所述礁膜寡二糖能降低PTP1B的酶活力,并抑制乳腺癌细胞的生长,用以治疗乳腺癌。
作为本发明的进一步方案,所述礁膜寡二糖的分子骨架为葡萄糖醛酸 (GIA)通过β-1,3糖苷键与鼠李糖(Rha)键连接形成,所述礁膜寡二糖的分子量为340.28Da。
作为本发明的进一步方案,所述礁膜寡二糖分子结构通式如下:
作为本发明的进一步方案,所述礁膜寡二糖的制备采用绿藻为原料,经化学降解、分离纯化制备而得。
作为本发明的进一步方案,所述礁膜寡二糖的制备方法具体包括如下步骤:
将绿藻溶于水,得到绿藻水溶液;
往绿藻水溶液中添加稀硫酸,加热,并搅拌,使所述绿藻进行化学降解,得到降解液;
将所述降解液置于透析袋中透析,并过夜,得到透析液;
将所述透析液浓缩,再经过超滤膜,得到寡糖;
将所述寡糖经浓缩、分离纯化,得到洗脱液;
检测所述洗脱液的糖含量,并绘制洗脱曲线,收集峰尖部分,冻干,得到所述礁膜寡二糖。
作为本发明的进一步方案,所述洗脱液采用苯酚-硫酸法检测其糖含量。
作为本发明的进一步方案,所述浓缩步骤采用旋转仪进行浓缩;
所述超滤膜采用1000Da的超滤膜。
本发明的有益效果在于:
1、本发明提供礁膜寡二糖与礁膜寡二糖衍生物在抗乳腺癌中的应用,将礁膜寡二糖或者礁膜寡二糖衍生物用以治疗乳腺癌。
具体的,将礁膜寡二糖或者礁膜寡二糖衍生物应用于抗乳腺癌的药物,或者将礁膜寡二糖或者礁膜寡二糖衍生物应用于抗乳腺癌的功能食品,通过靶向可以降低PTP1B的酶活力,并抑制乳腺癌细胞的生长,用以治疗乳腺癌。
2、本发明实施例采用PTP1B体外分子模型和乳腺癌细胞模型 MDA-MB-231,探索礁膜寡二糖在制备靶向PTP1B抗乳腺癌药物和功能食品中的应用。
结果证明:礁膜寡二糖可显著抑制PTP1B的酶活力,在细胞水平上也观察到礁膜寡二糖可明显的抑制乳腺癌细胞的生长;可通过靶向抑制 PTP1B而显著抑制乳腺癌细胞的生长。
3、本发明实施例原料来源采用绿藻,具体可以采用绿藻礁膜藻粉;其原料来源于海洋天然礁膜多糖,具有资源丰富、易于产业化,安全有效等诸多优点,经发明人实验发现,可开发成抗乳腺癌药品及保健品,因此具有较好的市场应用前途。
3、本发明实施例提供礁膜寡二糖在制备靶向PTP1B抗乳腺癌药物和功能食品中的应用,其技术方案为临床提供了乳腺癌病人以及亚健康等人群服用的药品或功能食品。
附图说明
图1是本发明实施例中礁膜寡二糖的二级质谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
本发明的一实施例提供礁膜寡二糖的应用,应用于治疗乳腺癌。
具体的,将礁膜寡二糖应用于抗乳腺癌的药物,或者将礁膜寡二糖应用于抗乳腺癌的功能食品。具体应用方式为:将礁膜寡二糖直接作为药物或者功能食品进行食用。
具体的用法用量为:每天1-3次,以礁膜寡二糖用量计,每次30-500 毫克。
礁膜寡二糖可以通过靶向降低PTP1B的酶活力,并抑制乳腺癌细胞的生长,用以治疗乳腺癌。
具体的,经体外实验证明,本实施例中,礁膜寡二糖可以显著降低蛋白酶PTP1B的酶活力,且对乳腺癌细胞MDA-MB-231具有明显的抑制生长作用,可通过靶向抑制PTP1B达到有效治疗乳腺癌的作用。
本发明另一实施例提供礁膜寡二糖衍生物的应用,应用于治疗乳腺癌。
具体的,将礁膜寡二糖衍生物应用于抗乳腺癌的药物,或者将礁膜寡二糖衍生物应用于抗乳腺癌的功能食品。具体应用方式为:将礁膜寡二糖衍生物直接作为药物或者功能食品进行食用。
具体的用法用量为:每天1-3次,以礁膜寡二糖用量计,每次30-500 毫克。
进一步的,礁膜寡二糖衍生物包括:以包含礁膜寡二糖为母核的硫酸化衍生物、以包含礁膜寡二糖为母核的磷酸化衍生物,以及以包含礁膜寡二糖为母核的乙酰化衍生物。
在礁膜寡二糖衍生物的应用中,产生治疗乳腺癌效果的机理与礁膜寡二糖相同,都是礁膜寡二糖在起作用,在此不再赘述。具体的,也是通过礁膜寡二糖显著降低蛋白酶PTP1B的酶活力,且对乳腺癌细胞MDA-MB-231 具有明显的抑制生长作用,可通过靶向抑制PTP1B达到有效治疗乳腺癌的作用。
本发明还一实施例提供礁膜寡二糖的制备方法,具体包括如下步骤 S1-S6:
S1、将绿藻溶于水,得到5-15wt%的绿藻水溶液;
在本实施例中,该绿藻采用为绿藻礁膜藻粉,将绿藻礁膜藻粉溶于水后,配置成5-15wt%的绿藻礁膜藻水溶液。
S2、往绿藻水溶液中添加1.0wt%的稀硫酸,加热至50-85℃,并搅拌,使绿藻进行化学降解6-8小时,得到降解液;
在本实施例中,在步骤S1中得到的绿藻礁膜藻水溶液中添加1.0wt%的稀硫酸,加热至50-85℃,并搅拌,使绿藻礁膜藻进行化学降解6-8小时,得到降解液。
S3、将步骤S2中得到的降解液置于透析袋中透析,并过夜,得到透析液;
S4、将步骤S3中得到的透析液采用旋转仪进行浓缩,得到一次浓缩液,将得到的一次浓缩液经过1000Da的超滤膜,得到小于1000Da的寡糖;
S5、将步骤S4中得到的寡糖采用旋转仪进行浓缩,得到二次浓缩液,将该二次浓缩液经过Bio-Gel P4色谱柱分离纯化,得到洗脱液;
S6、采用苯酚-硫酸法检测步骤S5中得到的洗脱液的糖含量,并绘制洗脱曲线,收集洗脱曲线中峰尖部分对应的洗脱液,将收集的该洗脱液进行冻干,得到所述礁膜寡二糖。
需要说明的是,本发明实施例中,礁膜寡二糖的分子骨架为葡萄糖醛酸(GIA)通过β-1,3糖苷键与鼠李糖(Rha)键连接形成,所述礁膜寡二糖的分子量为340.28Da。并且,礁膜寡二糖分子结构通式如下:
以下为具体实施例。
实施例1
本发明的实施例1提供礁膜寡二糖的制备方法,具体包括如下步骤 S1-S6:
S1、将绿藻礁膜藻粉溶于水后,配置成7wt%的绿藻礁膜藻水溶液。
S2、在步骤S1中得到的绿藻礁膜藻水溶液中添加1.0wt%的稀硫酸,加热至60℃,并搅拌,使绿藻礁膜藻进行化学降解6小时,得到降解液。
S3、将步骤S2中得到的降解液置于透析袋中透析,并过夜,得到透析液;
S4、将步骤S3中得到的透析液采用旋转仪进行浓缩,得到一次浓缩液,将得到的一次浓缩液经过1000Da的超滤膜,得到小于1000Da的寡糖;
S5、将步骤S4中得到的寡糖采用旋转仪进行浓缩,得到二次浓缩液,将该二次浓缩液经过Bio-Gel P4色谱柱分离纯化,得到洗脱液;
S6、采用苯酚-硫酸法检测步骤S5中得到的洗脱液的糖含量,并绘制洗脱曲线,收集洗脱曲线中峰尖部分对应的洗脱液,将收集的该洗脱液进行冻干,得到所述礁膜寡二糖。
实施例2
本发明的实施例2提供礁膜寡二糖的制备方法,具体包括如下步骤 S1-S6:
S1、将绿藻礁膜藻粉溶于水后,配置成12wt%的绿藻礁膜藻水溶液。
S2、在步骤S1中得到的绿藻礁膜藻水溶液中添加1.0wt%的稀硫酸,加热至80℃,并搅拌,使绿藻礁膜藻进行化学降解8小时,得到降解液。
S3、将步骤S2中得到的降解液置于透析袋中透析,并过夜,得到透析液;
S4、将步骤S3中得到的透析液采用旋转仪进行浓缩,得到一次浓缩液,将得到的一次浓缩液经过1000Da的超滤膜,得到小于1000Da的寡糖;
S5、将步骤S4中得到的寡糖采用旋转仪进行浓缩,得到二次浓缩液,将该二次浓缩液经过Bio-Gel P4色谱柱分离纯化,得到洗脱液;
S6、采用苯酚-硫酸法检测步骤S5中得到的洗脱液的糖含量,并绘制洗脱曲线,收集洗脱曲线中峰尖部分对应的洗脱液,将收集的该洗脱液进行冻干,得到所述礁膜寡二糖。
实施例3
本发明的实施例3提供礁膜寡二糖的制备方法,具体包括如下步骤 S1-S6:
S1、将绿藻礁膜藻粉溶于水后,配置成10wt%的绿藻礁膜藻水溶液。
S2、在步骤S1中得到的绿藻礁膜藻水溶液中添加1.0wt%的稀硫酸,加热至85℃,并搅拌,使绿藻礁膜藻进行化学降解7小时,得到降解液。
S3、将步骤S2中得到的降解液置于透析袋中透析,并过夜,得到透析液;
S4、将步骤S3中得到的透析液采用旋转仪进行浓缩,得到一次浓缩液,将得到的一次浓缩液经过1000Da的超滤膜,得到小于1000Da的寡糖;
S5、将步骤S4中得到的寡糖采用旋转仪进行浓缩,得到二次浓缩液,将该二次浓缩液经过Bio-Gel P4色谱柱分离纯化,得到洗脱液;
S6、采用苯酚-硫酸法检测步骤S5中得到的洗脱液的糖含量,并绘制洗脱曲线,收集洗脱曲线中峰尖部分对应的洗脱液,将收集的该洗脱液进行冻干,得到所述礁膜寡二糖。
以下针对实施例3所制得的产物进行分析:
采用负离子模式的电喷雾质谱法对其寡糖进行分析。取少量实施例3 中寡糖组分,以乙腈∶水=1∶1(V/V)溶液溶解,以氮气为载气,流速为 250L/h。在二级质谱中,需要锥孔电压80eV,氩气作为碰撞气体。同时,保持碰撞能量保持在20-50eV交换时,得到最佳序列信息。流动相为乙腈∶水=1∶1(V/V)且离子源和溶剂挥发峰温度分别为80℃和150℃。
图1为葡萄糖醛酸鼠李二糖m/z 339的二级质谱图,参见图1可知,葡萄糖醛酸位于非还原端。m/z 339的结构为β-D-GlcA-(1→3)-α -L-Rhap,此二糖分子骨架为葡萄糖醛酸(GIA)通过β-1,3糖苷键与鼠李糖(Rha)键连接形成。
以下分析礁膜寡二糖对蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制活性的影响
本次分析采用实施例3所制备的礁膜寡二糖。具体分析过程如下:
(1)将实施例3得到的礁膜寡二糖用蒸馏水溶解配制成10mg/mL 的储备溶液,取3μL储备溶液加入到缓冲体系(50mM柠檬酸盐,pH 6.0,2mMpNPP(4-硝基苯基磷酸二钠盐),蛋白酪氨酸磷酸酶1B0.05U)中,形成测活体系;
(2)待测化合物(礁膜寡二糖)在测活体系中的终浓度为10-200μ g/mL,阴性对照:蒸馏水,阳性对照:熊果酸,37℃黑暗条件下,孵育15 min,加入50μL 2mol/L的NaOH溶液终止反应,于波长405nm处测定吸光度值,每次浓度梯度设置3个平行,保证数据的准确性,按如下公式计算化合物PTP1B酶活力抑制率。其中:A为吸光度。
抑制率=(阴性对照组A值-实验组A值)/阴性对照组A×100%,结果见表1。
表1蛋白质酪氨酸磷酸酶1B抑制率(%)
在浓度为12.5μM时,阳性对照品熊果酸,对PTP1B的抑制率为 91.6%。
实验结果表明:礁膜寡二糖在50-200μg/mL对蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B表现出显著的抑制作用,具有开发成为PTP1B抑制剂的应用前景,用于胰乳腺癌的预防及治疗。
以下分析礁膜寡二糖对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞存活率的影响
本次分析采用实施例3所制备的礁膜寡二糖。具体分析过程如下:
(1)细胞培养:将MDA-MB-231细胞接种于MEM完全培养液中(含有100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS(胎牛血清)),置于37℃、 5%CO2培养箱中培养。
(2)将每孔8000个细胞种植于96孔板中,放入恒温细胞培养箱孵育12h后,加入不同浓度的礁膜寡二糖放入恒温细胞培养箱继续孵育48h。孵育结束后更换无血清培养基,每孔加入20μL(5mg/ml)MTT(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)溶液,培养箱继续孵育4h。结束后,除去液体,每孔加入150μLDMSO(二甲基亚砜)溶液,混匀放入 37℃培养箱孵育20min。最后,采用酶标仪A540nm处测量吸光值。每次取三个平行样,实验重复三次。
计算公式:细胞存活率(Cell viability)=实验组吸光值/对照组吸光值
实验结果如表2所示,礁膜寡二糖的给药浓度为200μmol/L-600μ mol/L时,细胞存活率与对照组存在显著性差异,礁膜寡二糖可对乳腺癌细胞具有很好的抑制生长的作用,并呈现明显的剂量依赖效应。
表2礁膜寡二糖对MDA-MB-231细胞存活率影响实验结果
注:n=9,x±SD,与模型组相比,*P<0.05,**P<0.001
经上述实验证明,礁膜寡二糖可对乳腺癌细胞具有很好的抑制生长的作用,并呈现明显的剂量依赖效应。
并且,礁膜寡二糖不但可以抑制乳腺癌细胞的生长,还能够显著抑制细胞内的PTP1B酶的酶活力,可通过靶向抑制PTP1B达到有效治疗乳腺癌的作用。
需要说明的是,在整个申请文件中,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,由于文字表达的有限性,而客观上存在无限的试试方式,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进、润饰或变化,也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合;这些改进润饰、变化或组合,或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的,均应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述礁膜寡二糖的制备方法具体包括如下步骤:
将绿藻溶于水,得到绿藻水溶液;
往绿藻水溶液中添加稀硫酸,加热,并搅拌,使所述绿藻进行化学降解,得到降解液;
将所述降解液置于透析袋中透析,并过夜,得到透析液;
将所述透析液浓缩,再经过超滤膜,得到寡糖;
将所述寡糖经浓缩、分离纯化,得到洗脱液;
检测所述洗脱液的糖含量,并绘制洗脱曲线,收集峰尖部分,冻干,得到所述礁膜寡二糖。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述洗脱液采用苯酚-硫酸法检测其糖含量。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述浓缩步骤采用旋转仪进行浓缩;所述超滤膜采用1000Da的超滤膜。
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《部分海藻多糖的抗肿瘤作用研究和临床应用》;寿佩勤;《现代实用医学》;20040731;第16卷(第7期);全文 * |
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