CN114716500A

CN114716500A - 山楂酸葡萄糖苷及其合成方法与应用

Info

Publication number: CN114716500A
Application number: CN202210245404.1A
Authority: CN
Inventors: 胡芬; 许可; 张运峰; 蔡海峰; 闫金银; 陈佳新
Original assignee: North China University of Science and Technology
Current assignee: North China University of Science and Technology
Priority date: 2022-03-14
Filing date: 2022-03-14
Publication date: 2022-07-08
Also published as: CN116535455A

Abstract

本申请公开了一种山楂酸葡萄糖苷及其合成方法与应用。该山楂酸酸葡萄糖苷名为山楂酸‑2‑O‑β‑D‑葡萄糖苷具有(式1)所示结构。山楂酸葡萄糖苷相较于山楂酸而言，毒性微弱，可以作为前药，利用特异性作用于癌细胞的抗体和β‑葡萄糖苷酶联合在一起，在肿瘤部位转化为活性细胞毒分子‑山楂酸，特异地杀伤肿瘤细胞，减少对正常细胞的毒副作用。

Description

山楂酸葡萄糖苷及其合成方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及山楂酸葡萄糖苷及其合成方法与应用。

背景技术

山楂酸(C₃₀H₄₈O₄，maslinic acid，MA)是一种五环三萜类化合物，是齐墩果酸衍生物，在植物中分布广泛，主要存在于油橄榄、蛇麻草、薄荷、丁香、山楂、大叶紫薇、鼠尾草、枇杷叶和苹果果皮中，但其含量较低因而十分珍贵。

山楂酸具有多种生物活性。(1)山楂酸具有抗肿瘤的作用，目前肿瘤的治疗方法主要是放疗、化疗及手术治疗。但部分晚期高分化患者对放疗的敏感性较差，而常规化疗药物毒副作用大、易产生耐药性，使患者的身体质量明显下降。有研究发现山楂酸在结肠癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中具有较好的抗肿瘤活性，其机制涉及到抑制癌细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡及抑制血管生成等。(2)山楂酸在降血糖方面也有重要作用，山楂酸天然无毒的，副作用少，可治疗各种糖尿病的并发症，如糖尿病所致的凝血功能障碍、糖尿病心肌病等。(3)此外，山楂酸还有抗艾滋病病毒的作用，细胞感染艾滋病的病毒，在丝氨酸蛋白酶作用下，会被释出扩散到其他细胞，山楂酸则能抑制丝氨酸蛋白酶的活性。

已有研究报道了山楂酸对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的调控作用，但其毒性较大，且不具有选择性。

糖基化Glycosylation)修饰是指在糖基转移酶的作用下，将糖基供体转移到糖基受体上的过程。由此可见进行糖基化的关键是糖基转移酶(GTs)，糖基转移酶是高度分化的超级酶家族，是专门负责催化糖基化反应的酶类，它能够将糖基从活性供体分子上转移到受体分子形成特定糖苷键上。超过55万个糖基转移酶的氨基酸序列被收录在碳水化合物活性酶数据库CAZy(Carbohydrate-Active Enzyme Database)中，共分为107个家族(GT1～GT107)。庞大的糖基转移酶信息为先导化合物的糖基化改造奠定了基础。山楂酸的C-2和C-3是羟基，C-28位是羧基，这些化学基团的存在不仅能增加山楂酸的亲水性和影响山楂酸本身特性，更重要的是提供了可以对山楂酸进行修饰的重要位点。现有文献中，糖基化后的分子毒性较难预测，例如：姜黄素4′-O-β-葡萄糖苷对AGS人胃癌细胞的IC50(7.11±0.17uM)显著低于姜黄素(9.77±0.77uM)，而姜黄素4′，4″-二-O-β-葡萄糖苷对AGS人胃癌细胞的IC50(18.09±0.63uM)则高于姜黄素；南蛇藤醇-29-O-β-葡萄糖苷对斑马鱼的IC50(＞80uM)显著高于南蛇藤醇(1.6uM)。

然而山楂酸的结构刚性较强，导致其水溶性差，降低了其生物活性，影响其药用价值。糖基化修饰作为一种重要的修饰反应在天然先导化合物改性方面发挥着积极作用。糖基化修饰分为化学合成和生物合成，化学合成工艺复杂，转化率低，且副产物多，会造成环境污染，难以应用。而生物合成则具有工艺简单，催化效率高，产物容易分离，对环境污染小等优点。然而目前那些糖基转移酶可以催化山楂酸糖基化修饰并无报道，且目前并没有适合山楂酸糖基化的反应体系，其糖基化较为困难。

发明内容

为解决现有技术的缺陷，降低山楂酸毒性，减小其对于正常细胞的杀伤作用，本发明提供了一种山楂酸葡萄糖苷及其合成方法与应用。该山楂酸葡萄糖苷不具有毒性，可作为一种良好的山楂酸前药。

为此，本发明一方面公开了一种山楂酸葡萄糖苷，名为山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷，具有(式1)所示结构：

本发明另一方面还提供了一种所述山楂酸葡萄糖苷的合成方法，包括以下步骤：

在pH＝7.0-9.0的PBS缓冲溶液中加入0.5μg/ml纯化酶，0.2mM山楂酸和1.2mMUDP-葡萄糖，反应温度为37-50℃，反应2-10小时得到所述山楂酸葡萄糖苷。

当反应当量较小时，反应时间为2h；大当量反应时间为10小时。

作为优选，所述纯化酶包括YjiC蛋白、UGT109A3蛋白、YojK蛋白中的一种；

所述YjiC蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述UGT109A3蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述YojK蛋白的序列如SEQ ID NO.3所示。

作为优选，所述PBS缓冲溶液中还加入10mM的金属离子溶液；所述金属离子任选自Mg²⁺、Na⁺、K⁺、Li⁺、Ca²⁺、Mn²⁺中的一种。

作为优选，所述纯化酶为YjiC蛋白，所述PBS缓冲溶液的pH为8.0，反应温度为45℃，所述金属离子为Mg²⁺。

作为优选，所述纯化酶为UGT109A3蛋白，所述PBS缓冲溶液的pH为7.4，反应温度为40℃，所述金属离子为Mg²⁺。

作为优选，所述纯化酶为YojK蛋白，所述PBS缓冲溶液的pH为8.0，反应温度为40℃，所述金属离子为Mg²⁺。

作为优选，所述纯化酶在BL21菌中表达纯化得到，包括以下步骤：

克隆来自于枯草芽孢杆菌，编码UDP-糖基转移酶的基因，并连接到pET28a质粒构建表达载体，并通过热激的方式进行转化BL21菌中；培养BL21菌，诱导蛋白表达，得到所述纯化酶。

作为优选，所述编码UDP-糖基转移酶为NP_389824.2、NP_389104.1、WP_003220489.1中的一种；

所述NP_389824.2是YojK蛋白的氨基酸序列，编码基因序列号(Gene ID：939457)；

所述NP_389104.1是YjiC蛋白的氨基酸序列，编码基因序列号(Gene ID：939402)；

所述WP_003220489.1是UGT109A3蛋白的氨基酸序列，编码基因序列号(Gene ID：64303099)。

本发明另一方面还提供了一种山楂酸葡萄糖苷在制备山楂酸葡萄糖苷前药中的用途。

实验结果表明山楂酸对正常乳腺上皮细胞的细胞毒性：其在抑制ER⁺(雌激素受体阳性)乳腺癌细胞(MCF-7、T47D)、三阴性乳腺癌细胞(MAD-MB-231、MAD-MB-157)增殖的同时，对正常乳腺细胞(SVCT、MCF-0A)也有显著的细胞毒副作用。由此可见，山楂酸作为抗乳腺癌药物有很强的细胞毒副作用，加上山楂酸水溶性差、生物利用率低的缺点严重影响了山楂酸的生物活性发挥和药物开发。

本发明创造性地在山楂酸上引入糖基，并优化了其多种性质：(1)增加山楂酸的水溶性，亲水性的糖基结合到糖苷配体上形成其糖基衍生物，可以增加天然产物的亲水性利于其活性的发挥；(2)增加山楂酸在体内的吸收，体内细胞膜表面上有多种糖基受体，利于介导带有糖基的化合物跨膜吸收；(3)增加的糖基直接参与山楂酸的反应活性和识别特异性，根据临床上现已使用的天然产物药物，如部分抗生素和抗癌药物的活性都依赖于其糖基侧链；(4)降低山楂酸毒性，使其可作为山楂酸前药，利用特异性作用于癌细胞的抗体和β-葡萄糖苷酶联合在一起，山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷在肿瘤部位转化为活性细胞毒分子(山楂酸)，特异地杀伤肿瘤细胞，减少对正常细胞的毒副作用；(5)此外，该分子采用生物合成法，对环境友好，低能耗，绿色环保，原料转化率高达100％。

附图说明

图1为YjiC、UGT109A3、YojK的氨基酸序列对比。

图2为YojK、YjiC和UGT109A3蛋白SDS-PAGE电泳后，进行考马斯亮蓝染色图；其中，1、4、7为control；2、5、8分别为YojK、YjiC和UGT109A3的蛋白粗提液；3、6、9分别为YojK、YjiC和UGT109A3的蛋白纯化产物。

图3为YjiC、UGT109A3、Yojk催化山楂酸糖基化反应产物的HPLC分析。

图4为纯化的山楂酸糖基化产物HPLC(A)及LC-MS(B)分析。

图5为不同pH值(A)、温度(B)和金属离子(C)对YojK、YjiC和UGT109A3催化山楂酸糖基化活性的影响。

图6为β-葡萄糖苷酶催化山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷的去糖基化。

具体实施方式

以下将通过实施例来详细说明本申请的实施方式，借此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本申请中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均来自市售产品。本申请中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

本申请还存在其它多种可实施的技术方案，在此不做一一列举，本申请权利要求中要求保护的技术方案都是可以实施的。

“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由......组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本申请的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由......组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本申请的范围内。的专利中公开的制备方法获得的。

YjiC蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示；

UGT109A3蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；

YojK蛋白的序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例1：UDP-糖基转移酶YojK、YjiC和UGT109A3表达载体的构建及表达纯化

从枯草芽孢杆菌中克隆编码UDP-糖基转移酶YojK(NP_389824.2)、YjiC(NP_389104.1)和UGT109A3(WP_003220489.1)的基因，并连接到pET28a质粒构建pET28a-YojK、pET28a-YjiC和pET28a-UGT109A3表达载体。

其中，所述NP_389824.2是YojK蛋白的氨基酸序列，编码基因序列号(Gene ID：939457)；

采用热激的方式将任一上述表达载体转化至BL21菌中，转化完成后在新鲜配置的含卡那霉素的LB固体培养基(配方：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、2％琼脂粉)中涂板倒置培养。过夜培养后，挑取单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基(配方：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl)，37℃，160rpm过夜培养，菌液送至公司测序正确。三种糖基转移酶的蛋白质序列如图1。

取含有pET28a-YojK、pET28a-YjiC或pET28a-UGT109A3质粒的菌液过夜培养于新鲜的含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，160rpm培养至OD600(溶液在600nm波长处的吸光值)达到0.6-0.8。加入终浓度为0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，培养条件改变为18℃，160rpm，过夜培养。取诱导后少量菌体在冰浴中用超声波处理15min，制得粗酶液。进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)(图2)分析。YjiC、UGT109A3、YojK分别表达45.6kD，46KD和43.7kD左右的蛋白。如图所示，目标蛋白条带位于35kD和55KD marker之间。

pET28a-YojK、pET28a-YjiC或pET28a-UGT109A3质粒糖基转移酶成功表达后，4℃，8000rpm离心5min收集菌体，弃上清，菌体沉淀用pH＝7.4的10mM PBS缓冲液(配方：8gNaCl，0.2g KCl，1.42g Na₂HPO₄，0.27 KH₂PO₄定容至1L)洗涤两次，并重新悬浮于2ml PBS缓冲液中。菌体在冰浴中用超声波处理15min，制得粗酶液。4℃下12,000g离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。用蛋白纯化仪(美国GE公司，型号AKTA purifier 10)进行蛋白纯化。将得到的上清液，经0.2μm孔径过滤器过滤后待用。上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer(50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH 7.4，500mM NaCl)以5mL/min的流速平衡镍柱。经过上样前处理的样品以1mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱(Ni柱中的氯化镍可以与有his(组蛋白)标签的蛋白结合)上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。平衡上样后Ni柱用10倍柱体积的Binding Buffer以1mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。以梯度的Elution Buffer(1M咪唑)/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱，流速为1mL/min，并监测OD280值(溶液在280nm波长处的吸光值)，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液。用超滤管浓缩和更换纯蛋白的溶剂，冷冻干燥备用。YojK、YjiC、UGT109A3蛋白纯化后进行SDS-PAGE(图2)分析。

实施例2：UDP-糖基转移酶YojK、YjiC和UGT109A3的糖基化反应

(1)快速配置小量酶反应体系(1mL)：10mM PBS(pH＝7.4)，0.5μg YojK、YjiC或UGT109A3纯化酶，0.2mM山楂酸和1.2mM UDP-葡萄糖，37℃，180rpm摇床反应2小时。反应完成后加入2mL乙酸乙酯涡旋10min，8000rpm，离心5min取上清至于新管中，用离心浓缩仪蒸干。蒸干后的样品用0.5mL甲醇溶解，用0.2μm的有机相滤膜过滤上清到液相小瓶中进行HPLC检测。

(2)HPLC分析

山楂酸反应产物经HPLC检测山楂酸及山楂酸糖基化产物的出峰位置、峰的高低和峰的面积。

HPLC条件如下：仪器型号：Agilent 1260，C18色谱柱(250mm×4.6mm，5um)，流动相：甲醇：0.6％乙酸(80：20)；检测波长：210nm；柱温：40℃；流速：1mL/min；进样量：20μL；保留时间：20min。经HPLC(图3)分析检测，其中底物山楂酸出峰时间为10.8min左右，通过与对照组比较，YjiC、UGT109A3和Yojk在保留时间为7.9min有一个特征峰出现，说明有新物质产生。

(3)放大反应、表征及结构鉴定

为了鉴定糖基化山楂酸的结构，将反应放大至200mL反应体系，其中含有10mM PBS缓冲液(pH 7.4)、20μg纯化酶、2mL 20mM山楂酸、30mL 8mM UDP-葡萄糖。在37℃下反应10h后，加入200mL乙酸乙酯以停止反应。通过0.2μm尼龙膜过滤后，将混合物注入制备型LC3000HPLC系统，制备型HPLC的操作条件与HPLC相同(图4A)。收集HPLC中代谢物峰对应的洗脱液，在真空下浓缩，然后冷冻干燥。

通过LC-MS和NMR分析证实糖基化山楂酸的结构。

LC-MS条件如下：仪器型号：Agilent 1260-6120，ESI源正负离子检测，源电压5.5kV，氮气为干燥气，离子源Gas1 50psj，离子源Gas2 50psi，气帘气35，CAD气7，温度500℃，扫描范围m/z100-1000。如图4B所示，负离子模式下，准分子离子峰[M-H]-的m/z为633.1。根据分子量可知分子式为C₃₆H₅₈O₉。与山楂酸的分子式C₃₀H₄₈O₄相比，目标化合物多一组六碳糖单元。

NMR分析：取5mg纯化产物，用氘代二甲基亚砜溶解，进行1H谱和碳谱分析。测试仪器为BRUKER AVIII 400MHz(表1)。

表1山楂酸-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的1H-和13C-NMR光谱(氘代二甲基亚砜，400MHz)

通过HPLC检测和LC-MS分析结果表明糖基转移酶YojK、YjiC和UGT109A3能以UDP-葡萄糖为糖基供体对山楂酸进行糖基化修饰，得到的山楂酸糖基化产物的分子量为633.1。对山楂酸糖基化产物进行NMR 1H谱和碳谱分析表明山楂酸的糖基化产物为山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷。

实施例3：糖基转移酶的酶学特性研究

按照上述制备小量糖基化反应体系(1mL)，在不同pH的缓冲体系(pH＝5.0-10.0)，加入0.5μg YojK、YjiC或UGT109A3纯化酶，0.2mM山楂酸和1.2mM UDP-葡萄糖，在37℃水浴锅反应2h，测定酶活；pH 7.4的缓冲液中加入加入0.5μg YojK、YjiC或UGT109A3纯化酶，0.2mM山楂酸和1.2mM UDP-葡萄糖，将反应液置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃的水浴中反应2h，取样测定酶活。配制含有Mg²⁺、Na⁺、K⁺、Li⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Al³⁺溶液，使最终测定体系中的各金属离子的浓度为10mM，对照组加入EDTA，测定在上述含各种金属离子对的糖基化反应的影像，其中缓冲体系pH 7.4，温度40℃。反应完成后进行HPLC分析。

结果表明YojK在pH 8.0-10.0，YjiC和UGT109A3在pH8.0时，催化山楂酸生成山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷的活性最强(图5A)；YojK和UGT109A3催化山楂酸进行糖基化反应的最适温度为40℃，而YjiC的最佳温度为45℃(图5B)；三种酶均在Mg²⁺存在的情况下反应活性最强，并且在Co²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Al³⁺存在情况下，对山楂酸的糖基化反应具有强烈的抑制作用(图5C)。YjiC在PH 7.4，45℃，且反应体系中含有Mg²⁺的情况下转化效率可达到100％；UGT109A3在PH 7.4，40℃，且反应体系中含有Mg²⁺的情况下，转化效率可达到100％；YojK在PH 8.0，40℃，且反应体系中含有Mg²⁺的情况下，转化效率可达到100％。

实施例4：细胞实验

(1)细胞培养

人类正常乳腺上皮细胞系(MCF-10A)和四种乳腺癌细胞系(MCF-7、T-47D、MDA-MB-231、MDA-MB-157)选用本实验室保存的传代细胞。ER阳性乳腺癌细胞系MCF-7、T-47D培养在含10％胎牛血清和双抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的RPMI-1640(RoswellPark Memorial Institute-1640)培养基中；三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-157培养在含10％胎牛血清和双抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培养基中；MCF-10A使用专用培养基(购买自赛普诺)。并将细胞置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

(2)山楂酸和山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷的细胞毒性实验

将细胞按5×10³个细胞/孔接种到96孔细胞培养板中，次日细胞密度达到60％-70％，使用全培养基配置不同浓度的山楂酸或山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖，对照组加入同等体积的DMSO(二甲基亚砜)，并设置调零孔。24小时后，用全培养基配置0.5mg/ml MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液，弃掉原培养基加入MTT溶液。CO₂培养箱培养4h。培养结束后，去除培养基，加入150μl DMSO，摇床15min。酶标仪测量570nm吸光度。根据吸光度计算半抑制浓度值。

在本研究中，用山楂酸或山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷处理不同的乳腺癌细胞系，然后用MTT法测定细胞活力。MTT分析显示，山楂酸对人乳腺癌细胞系(MCF-7、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-157)和人正常乳腺上皮细胞系(MCF-10A和SVCT)具有剂量依赖性细胞毒性，在24h时，山楂酸的半抑制浓度(IC50)值分别为88.33μM、103.95μM、99.92μM、43.03、77.41μM和64.2μM。对MDA-MB-157的IC50值最低为43.03μM。MCF-7、T47D、MDA-MB-231的IC50值高于人正常乳腺上皮细胞系(MCF-10A和SVCT)，这表明山楂酸对人乳腺正常上皮细胞系具有较高的细胞毒活性。然而，山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷对上述所有细胞系均不起作用(截止350μM)(表2)。

表2山楂酸或山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖处理不同乳腺细胞系IC50

实施例5：β-葡萄糖苷酶的去糖基化

由于山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷对上述所有细胞系均无细胞毒性，因此山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷可以作为山楂酸的前药。β-葡萄糖苷酶是能够水解存在于双糖、低聚糖或共轭糖苷中的β-葡萄糖苷键的酶。因此为检测β-葡萄糖苷酶(黑曲霉)能否使山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷去糖基化，制备2mL反应混合液，包括PH5.0的磷酸盐缓冲液，0.2mM山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷溶液和3U β-葡萄糖苷酶，37℃，180rpm震荡培养2h。培养完成后，加入2mL乙酸乙酯抽提，涡旋10min，8000rpm离心5min，取上清至新的离心管蒸干，再用0.5mL甲醇溶解，经0.2um滤膜过滤至液相小瓶进行HPLC分析。结果表明，加入β-葡萄糖苷酶后生成的山楂酸保留峰出现在10.7min，而山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖出现在7.8min，这表明β-葡萄糖苷酶使山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖水解掉了一个葡萄糖，从而又变成了山楂酸(图6)。因此山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖可以用到抗体导向酶促前药治疗(antibody-directed enzyme-prodrug therapy)，利用特异性作用于癌细胞的抗体作为载体将山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖前药的专一性活化酶β-葡萄糖苷酶选择性地结合于肿瘤部，从而特异性杀伤癌细胞，减少对正常细胞的毒副作用。

本申请说明书中未作详细描述的内容属于本领域技术人员的公知常识。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个......”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 华北理工大学

<120> 山楂酸葡萄糖苷及其合成方法与应用

<141> 2022-03-14

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 392

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

Met Lys Lys Tyr His Ile Ser Met Ile Asn Ile Pro Ala Tyr Gly His

1 5 10 15

Val Asn Pro Thr Leu Ala Leu Val Glu Lys Leu Cys Glu Lys Gly His

20 25 30

Arg Val Thr Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Phe Ala Pro Ala Val Gln Gln

35 40 45

Ala Gly Gly Glu Ala Leu Ile Tyr His Thr Ser Leu Asn Ile Asp Pro

50 55 60

Lys Gln Ile Arg Glu Met Met Glu Lys Asn Asp Ala Pro Leu Ser Leu

65 70 75 80

Leu Lys Glu Ser Leu Ser Ile Leu Pro Gln Leu Glu Glu Leu Tyr Lys

85 90 95

Asp Asp Gln Pro Asp Leu Ile Ile Tyr Asp Phe Val Ala Leu Ala Gly

100 105 110

Lys Leu Phe Ala Glu Lys Leu Asn Val Pro Val Ile Lys Leu Cys Ser

115 120 125

Ser Tyr Ala Gln Asn Glu Ser Phe Gln Leu Gly Asn Glu Asp Met Leu

130 135 140

Lys Lys Ile Arg Glu Ala Glu Ala Glu Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Gln

145 150 155 160

Glu Lys Leu Pro Ala Val Ser Phe Glu Gln Leu Ala Val Pro Glu Ala

165 170 175

Leu Asn Ile Val Phe Met Pro Lys Ser Phe Gln Ile Gln His Glu Thr

180 185 190

Phe Asp Asp Arg Phe Cys Phe Val Gly Pro Ser Leu Gly Glu Arg Lys

195 200 205

Glu Lys Glu Ser Leu Leu Ile Asp Lys Asp Asp Arg Pro Leu Met Leu

210 215 220

Ile Ser Leu Gly Thr Ala Phe Asn Ala Trp Pro Glu Phe Tyr Lys Met

225 230 235 240

Cys Ile Lys Ala Phe Arg Asp Ser Ser Trp Gln Val Ile Met Ser Val

245 250 255

Gly Lys Thr Ile Asp Pro Glu Ser Leu Glu Asp Ile Pro Ala Asn Phe

260 265 270

Thr Ile Arg Gln Ser Val Pro Gln Leu Glu Val Leu Glu Lys Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Ile Ser His Gly Gly Met Asn Ser Thr Met Glu Ala Met Asn

290 295 300

Ala Gly Val Pro Leu Val Val Ile Pro Gln Met Tyr Glu Gln Glu Leu

305 310 315 320

Thr Ala Asn Arg Val Asp Glu Leu Gly Leu Gly Val Tyr Leu Pro Lys

325 330 335

Glu Glu Val Thr Val Ser Ser Leu Gln Glu Ala Val Gln Ala Val Ser

340 345 350

Ser Asp Gln Glu Leu Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Gln Lys Asp Val

355 360 365

Lys Glu Ala Gly Gly Ala Glu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Glu Ala Phe

370 375 380

Met Lys Lys Ser Ala Val Pro Gln

385 390

<210> 2

<211> 392

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 2

Met Lys Lys Tyr His Ile Ser Met Ile Asn Ile Pro Ala Tyr Gly His

1 5 10 15

Val Asn Pro Thr Leu Ala Leu Val Glu Lys Leu Cys Glu Lys Gly His

20 25 30

Arg Val Thr Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Phe Ala Pro Ala Val Gln Gln

35 40 45

Ala Gly Gly Glu Ala Leu Ile Tyr His Thr Ser Leu Asn Ile Asp Pro

50 55 60

Lys Gln Ile Arg Glu Met Met Glu Lys Asn Asp Ala Pro Leu Ser Leu

65 70 75 80

Leu Lys Glu Ser Leu Ser Ile Leu Pro Gln Leu Glu Glu Leu Tyr Lys

85 90 95

Asp Asp Gln Pro Asp Leu Ile Ile Tyr Asp Phe Val Ala Leu Ala Gly

100 105 110

Lys Leu Phe Ala Asp Lys Phe Asn Val Pro Val Ile Lys Leu Cys Ser

115 120 125

Ser Tyr Ala Gln Asn Glu Ser Phe Gln Leu Gly Asn Glu Asp Met Leu

130 135 140

Lys Lys Ile Lys Glu Ala Glu Ala Glu Phe Lys Ala Tyr Leu Glu Lys

145 150 155 160

Glu Gln Leu Pro Ala Ile Ser Phe Glu Gln Leu Ala Val Pro Glu Ala

165 170 175

Leu Asn Ile Val Phe Met Pro Lys Ser Phe Gln Ile Gln His Glu Thr

180 185 190

Phe Asp Asp Arg Phe Cys Phe Val Gly Pro Ser Leu Gly Lys Arg Thr

195 200 205

Glu Gln Glu Ser Leu Glu Met Lys Lys Gly Asp Gln Pro Leu Met Leu

210 215 220

Ile Ser Leu Gly Thr Ala Phe Asn Ala Trp Pro Glu Phe Tyr Lys Met

225 230 235 240

Cys Ile Glu Ala Phe Arg Asn Ser Ser Trp Gln Val Val Met Ser Val

245 250 255

Gly Lys Ser Ile Asp Pro Glu Ser Leu Asp Asp Ile Pro Ala His Phe

260 265 270

Thr Ile Arg Gln Ser Val Pro Gln Leu Glu Val Leu Glu Lys Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Ile Ser His Gly Gly Met Asn Ser Thr Met Glu Ala Met Asn

290 295 300

Ala Gly Val Pro Leu Val Val Ile Pro Gln Met Tyr Glu Gln Glu Leu

305 310 315 320

Thr Ala Lys Arg Val Asp Asp Leu Gly Leu Gly Val Tyr Leu Pro Lys

325 330 335

Glu Glu Val Thr Val Ser Ser Leu Gln Glu Ala Val Gln Ala Val Ser

340 345 350

Gly Asp Gln Glu Leu Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Gln Lys Asp Val

355 360 365

Lys Glu Ala Gly Gly Ala Glu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Glu Ala Phe

370 375 380

Met Lys Arg Ser Ala Val Pro Gln

385 390

<210> 3

<211> 405

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 3

Met Ala Asn Val Leu Met Ile Gly Phe Pro Gly Glu Gly His Ile Asn

1 5 10 15

Pro Ser Ile Gly Val Met Lys Glu Leu Lys Ser Arg Gly Glu Asn Ile

20 25 30

Thr Tyr Tyr Ala Val Lys Glu Tyr Lys Glu Lys Ile Thr Ala Leu Asp

35 40 45

Ile Glu Phe Arg Glu Tyr His Asp Phe Arg Gly Asp Tyr Phe Gly Lys

50 55 60

Asn Ala Thr Gly Asp Glu Glu Arg Asp Phe Thr Glu Met Leu Cys Ala

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ala Cys Lys Asp Ile Ala Thr His Ile Tyr Glu Glu Val

85 90 95

Lys His Glu Ser Tyr Asp Tyr Val Ile Tyr Asp His His Leu Leu Ala

100 105 110

Gly Lys Val Ile Ala Asn Met Leu Lys Leu Pro Arg Phe Ser Leu Cys

115 120 125

Thr Thr Phe Ala Met Asn Glu Glu Phe Ala Lys Glu Met Met Gly Ala

130 135 140

Tyr Met Lys Gly Ser Leu Glu Asp Ser Pro His Tyr Glu Ser Tyr Gln

145 150 155 160

Gln Leu Ala Glu Thr Leu Asn Ala Asp Phe Gln Ala Glu Ile Lys Lys

165 170 175

Pro Phe Asp Val Phe Leu Ala Asp Gly Asp Leu Thr Ile Val Phe Thr

180 185 190

Ser Arg Gly Phe Gln Pro Leu Ala Glu Gln Phe Gly Glu Arg Tyr Val

195 200 205

Phe Val Gly Pro Ser Ile Thr Glu Arg Ala Gly Asn Asn Asp Phe Pro

210 215 220

Phe Asp Gln Ile Asp Asn Glu Asn Val Leu Phe Ile Ser Met Gly Thr

225 230 235 240

Ile Phe Asn Asn Gln Lys Gln Phe Phe Asn Gln Cys Leu Glu Val Cys

245 250 255

Lys Asp Phe Asp Gly Lys Val Val Leu Ser Ile Gly Lys His Ile Lys

260 265 270

Thr Ser Glu Leu Asn Asp Ile Pro Glu Asn Phe Ile Val Arg Pro Tyr

275 280 285

Val Pro Gln Leu Glu Ile Leu Lys Arg Ala Ser Leu Phe Val Thr His

290 295 300

Gly Gly Met Asn Ser Thr Ser Glu Gly Leu Tyr Phe Glu Thr Pro Leu

305 310 315 320

Val Val Ile Pro Met Gly Gly Asp Gln Phe Val Val Ala Asp Gln Val

325 330 335

Glu Lys Val Gly Ala Gly Lys Val Ile Lys Lys Glu Glu Leu Ser Glu

340 345 350

Ser Leu Leu Lys Glu Thr Ile Gln Glu Val Met Asn Asn Arg Ser Tyr

355 360 365

Ala Glu Lys Ala Lys Glu Ile Gly Gln Ser Leu Lys Ala Ala Gly Gly

370 375 380

Ser Lys Lys Ala Ala Asp Ser Ile Leu Glu Ala Val Lys Gln Lys Thr

385 390 395 400

Gln Ser Ala Asn Ala

405

Claims

1.一种山楂酸葡萄糖苷，名为山楂酸-2-O-β-D-葡萄糖苷，具有(式1)所示结构：

2.一种根据权利要求1所述山楂酸葡萄糖苷的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

在pH＝7.0-9.0的PBS缓冲溶液中加入0.5mg/L纯化酶，0.2mmol/L山楂酸和1.2mmol/LUDP-葡萄糖，反应温度为37-50℃，反应2-10小时得到所述山楂酸葡萄糖苷。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述纯化酶包括YjiC蛋白、UGT109A3蛋白、YojK蛋白中的一种；

所述YjiC蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述UGT109A3蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述YojK蛋白的序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述PBS缓冲溶液中还加入10mM的金属离子溶液；所述金属离子任选自Mg²⁺、Na⁺、K⁺、Li⁺、Ca²⁺、Mn²⁺中的一种。

5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述纯化酶为YjiC蛋白，所述PBS缓冲溶液的pH为8.0，反应温度为45℃，所述金属离子为Mg²⁺。

6.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述纯化酶为UGT109A3蛋白，所述PBS缓冲溶液的pH为7.4，反应温度为40℃，所述金属离子为Mg²⁺。

7.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述纯化酶为YojK蛋白，所述PBS缓冲溶液的pH为8.0，反应温度为40℃，所述金属离子为Mg²⁺。

8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述纯化酶在BL21菌中表达纯化得到，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述编码UDP-糖基转移酶为NP_389824.2、NP_389104.1、WP_003220489.1中的一种；

所述NP_389824.2是YojK蛋白的氨基酸序列；

所述NP_389104.1是YjiC蛋白的氨基酸序列；

所述WP_003220489.1是UGT109A3蛋白的氨基酸序列。

10.一种如权利要求1所述山楂酸葡萄糖苷在制备山楂酸葡萄糖苷前药中的用途。