CN109266708A - 一种槲皮素糖苷的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种槲皮素糖苷的制备方法，属于酶催化技术领域。本发明通过槲皮素与糖基供体在溶液中，在序列如SEQ ID NO.1所示的糖基转移酶作为催化剂的作用下发生糖基化反应得到槲皮素糖苷。本发明的糖基转移酶催化槲皮素糖基化底物和产物的专一性都较强，生成的产物为单一产物，这为后续的分离纯化提供了有利的条件。所得到的槲皮素糖苷，水溶性高，并且保留了天然槲皮素的生物活性，克服了天然槲皮素水溶性低，在人体内吸收率低，治疗效果不明显等缺点。

Description

一种槲皮素糖苷的制备方法

技术领域

本发明涉及一种槲皮素糖苷的制备方法，属于酶催化技术领域。

背景技术

槲皮素是人类植物性食物和药物成分中最常见、分布最广泛的黄酮之一，为黄酮醇类化合物，普遍存在于茶叶、洋葱、生菜、卷心菜、西兰花、豆类、苹果、桃子、荞麦等几乎所有的植物性食物中，也是许多中草药如银杏叶、桑寄生等的有效成分，是多酚物质中重要的抗氧化剂之一，具有抗病毒、抗菌、抗炎等作用，并通过诱导变异细胞凋亡、抑制DNA合成和肿瘤细胞生长，下调和修饰细胞信号转导通路等，产生积极的抗癌作用。各种流行病学调查结果也支持槲皮素及其糖苷衍生物的摄入量与健康保护效应之间的关系，这种保护作用包括预防各种疾病，如心血管疾病、骨质疏松症、肺部疾患、某些癌症以及抗衰老等。

槲皮素分子具有高度亲脂性，几乎不溶于水，可溶于冰醋酸、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶、丙酮等溶剂，不溶于乙醚、苯、氯仿、石油醚等。而槲皮素糖苷衍生物的糖基基团则可以增加槲皮素衍生物的亲水性。这种由亲脂性向亲水性的改变，可使槲皮素更容易输送到植物各部分的胞质中，利于储存并增加稳定性，具有重要的生物学意义。

由于化学方法缺乏区域和立体化学选择性，传统的化学法糖基化修饰技术一直是困扰化学家的难题。酶催化具有自己独特的特点，酶催化剂反应条件温和，具有很高的区域选择性和立体选择性，并且反应大多数可在水中进行。随着制药工业对手性化合物的需求日益增长，和人类环保意识的增加酶催化工艺作为一种绿色的手性技术已成为目前化学制药领域中研究和应用的热点之一。Ko等以来源于蜡状芽孢杆菌的糖基转移酶(BcGT-1)对槲皮素进行糖基化反应，糖基化位置在槲皮素3位及7位羟基，该转化体系以UDP-葡萄糖为糖基供体，槲皮素(30mg·L-1)为糖基受体，分别得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-7-O-葡萄糖苷。Lim等以来源于拟南芥的尿苷二磷酸葡萄糖糖基转移酶(UGT)对槲皮素进行糖基化反应，该转化反应以UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基化位置分别在槲皮素的3、7、3'和4'位羟基，得到6种不同的糖基化产物。现有的可用来催化槲皮素糖基化的糖基转移酶种类相对较少，并且产物专一性较弱，一般得到的产物为多个不同位点催化产物，给后续的分离纯化带来了很多困难，不利用工业生产应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明采用葡萄柚中的糖基转移酶作为催化剂，催化槲皮素进行糖基化。

本发明的第一个目的是提供一种槲皮素糖苷的制备方法，包括如下步骤：

槲皮素与糖基供体在溶液中在催化剂的作用下发生糖基化反应得到槲皮素糖苷，其中所述催化剂为糖基转移酶，序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述的糖基转移酶来源于葡萄柚。

在本发明的一种实施方式中，所述的糖基供体为UDP-葡糖糖、UDP-N乙酰-D葡萄糖中的一种或两种。

在本发明的一种实施方式中，所述溶液为pH为5～9的缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述槲皮素的浓度为0.01～10％(w/v)。

在本发明的一种实施方式中，所述糖基供体的浓度为0.01～10％(w/v)。

在本发明的一种实施方式中，糖基转移酶的添加量为不低于0.01mg/L。

在本发明的一种实施方式中，糖基化反应温度为20～40℃。

在本发明的一种实施方式中，糖基化反应时间为12～36h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

(1)将槲皮素与糖基供体加入到pH为5～9的缓冲溶液中，混匀；

(2)在步骤(1)得到的溶液中加入核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的糖基转移酶；

(3)控制反应温度为20～40℃，反应12～36h得到槲皮素糖苷。

本发明的第二个目的是提供上述方法制备得到的槲皮素糖苷。

本发明的第三个目的是提供所述的槲皮素糖苷在食品、药品、保健品中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明的糖基转移酶催化槲皮素糖基化底物和产物的专一性都较强，生成的产物为单一产物，这为后续的分离纯化提供了有利的条件。所得到的槲皮素糖苷，水溶性高，并且保留了天然槲皮素的生物活性，克服了天然槲皮素水溶性低，在人体内吸收率低，治疗效果不明显等缺点。

附图说明

图1为UDP-葡萄糖的液相图谱；

图2为UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖的液相图谱；

图3为UDP-甘露糖的液相图谱；

图4为UDP-葡萄糖与槲皮素反应液的液相图谱；

图5为UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖与槲皮素反应液的液相图谱；

图6为UDP-甘露糖与槲皮素反应液的液相图谱；

图7为UDP-葡萄糖与槲皮素反应液的质谱图；

图8为UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖与槲皮素反应液的质谱图；

图9为柚皮苷分别与UDP-葡萄糖(A)、UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖(B)反应液的液相图谱；

图10为柚皮素分别与UDP-葡萄糖(A)、UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖(B)反应液的液相图谱；

图11为BTGT-1催化槲皮素与UDP-葡萄糖反应液的液相图谱；

图12为Ecol-1催化槲皮素与UDP-葡萄糖反应液的液相图谱；

图13为Ecol-2催化槲皮素与UDP-葡萄糖反应液的液相图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：UDP-葡萄糖/N乙酰-D-氨基葡萄糖/UDP-甘露糖的制备

分别将21.6mg葡萄糖、N乙酰-D-氨基葡萄糖和UDP-甘露糖，加入到1.5ml离心管中，分别加入30.5mgATP、250ul pH8.0的1M Tris-HCl缓冲液和5ul 1M氯化镁，550ul去离子水，混合后，加入200ul 3.9g/L NAHK酶，在其适合温度30℃下反应过夜。

分别将21mg UTP加入到上述反应液中，加入0.42ul DTT和2.8ul 1M氯化镁，混合后，加入200ul 9.7g/L Glmu酶和20ul 1.5g/LPPA酶，在其适合温度30℃下反应大于5h。将反应液用0.22uM孔径的微孔膜过滤后，进行高效液相色谱分析，即可分别检测到UDP-葡萄糖、N乙酰-D-氨基葡萄糖和UDP-甘露糖(如图1、2、3所示)。

实施例2：槲皮素糖苷的制备

分别将4ml 20mM槲皮素和2ml 10mM UDP-葡萄糖、UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖和UDP-甘露糖加入到50ml锥形瓶中离心管中，再加入5ml 50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液和2.5ml 50mM氯化镁，8.5ml去离子水，混合后，加入15ml0.15g/L葡萄柚中的糖基转移酶(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，在其最适催化温度35℃下反应16h；将反应液用0.22uM孔径的微孔膜过滤后，进行高效液相色谱分析，结果如图4、5、6所示，图4和图5显示UDP-葡萄糖和UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖已经反应完全，并且都只检测到了单一的槲皮素糖苷产物，说明葡萄柚中的糖基转移酶催化生成的产物为单一产物。但图6显示UDP-甘露糖没有进行反应，没有新物质生成。

对UDP-葡萄糖和UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖作为底物生成的槲皮素糖苷产物做进一步的质谱分析，结果如图7和8所示，检测反应液用的是负离子源，如图7所示，槲皮素的分子质量为302，葡萄糖分子质量为180，当葡萄糖分子结合到槲皮素时会脱去一分子水，故而产物的分子质量为464。所以根据负离子源时会产生失去氢峰，分子质量减少1，所以质谱图中显示的是463，证明反应生成的产物为槲皮素-葡萄糖苷，并且只有单个位点进行糖基化，没有多位点同时进行糖基化反应。同样的方法，如图8所示UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖的分子质量为221，与槲皮素结合后脱去一分子水后质量为505，质谱检测采用的是负离子源，所以显示的质量为504。证明反应生成了槲皮素-N乙酰-D-氨基葡萄糖苷。进一步验证了葡萄柚中的糖基转移酶催化槲皮素糖基化生成的产物为单一产物。

制备过程中还发现，槲皮素是不溶于水的，反应体系中采用DMSO溶解槲皮素，在反应过程中会出现槲皮素析出的问题，但是沉淀中没有产物，全部溶于水溶液的上清中。

实施例3：槲皮素糖苷的制备

将1ml 20mM槲皮素和0.5ml 10mM UDP-葡萄糖/UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖加入到50ml锥形瓶中，再加入5ml 50mM pH9.0的Tris-HCl缓冲液和2.5ml50mM氯化镁，8.5ml去离子水，混合后，加入15ml 0.15g/L葡萄柚中的糖基转移酶，在其最适催化温度30℃下反应16h；将反应液用0.22uM孔径的微孔膜过滤后，进行高效液相色谱分析，可检测到槲皮素糖苷生成。

实施例4：槲皮素糖苷的制备

将8ml 20mM槲皮素和4ml 10mM UDP-葡萄糖/UDP-N乙酰-D-氨基葡萄糖加入到50ml锥形瓶中，再加入5ml 50mM pH7.0的Tris-HCl缓冲液和2.5ml50mM氯化镁，8.5ml去离子水，混合后，加入15ml 0.15g/L葡萄柚中的糖基转移酶，在其最适催化温度25℃下反应16h；将反应液用0.22uM孔径的微孔膜过滤后，进行高效液相色谱分析，可检测到槲皮素糖苷生成。

对比例1：

采用与实施例2相同的方法，分别采用柚皮素、柚皮苷替代槲皮素进行反应。将反应液用0.22uM孔径的微孔膜过滤后，进行高效液相色谱分析，结果如图9、10所示，图9为柚皮苷分别与UDP-葡萄糖(A)、UDP--D-氨基葡萄糖(B)发生反应，出现在4-5min的吸收峰为柚皮苷，并没有新的产物生成；图10为柚皮素分别与UDP-葡萄糖(A)、UDP--D-氨基葡萄糖(B)发生反应，出现在10-11min的吸收峰为柚皮素，并没有新的产物生成。发现葡萄柚中的糖基转移酶只能够催化槲皮素进行糖基化反应，对槲皮素具有较高的专一性。

对比例2：

采用与实施例2相同的方法，分别采用蜡样芽孢杆菌中的糖基转移酶BTGT-1、大肠杆菌中的两种糖基转移酶Ecol-1、Ecol-2替代葡萄柚中的糖基转移酶进行反应。将反应液用0.22uM孔径的微孔膜过滤后，进行高效液相色谱分析，结果如图11、12、13所示，图11为BTGT-1与槲皮素反应，此反应以UDP-葡萄糖作为底物，其中9min左右的吸收峰为槲皮素，2min左右为杂质峰，并没有出现新的吸收峰。图12、13分别为槲皮素与Ecol-1、Ecol-2发生反应，以UDP-葡萄糖为底物，其中9min左右的吸收峰为槲皮素，2min左右为杂质峰，并没有出现新的吸收峰。发现另外的三种酶并不能催化槲皮素进行糖基化反应。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种槲皮素糖苷的制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2088

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ctggttccgc gtggatccat ggctcaaacg cagtctcagc cccgacctca catagctgtg 720

ctgaatttcc ccttctcaac acacgcctcg tccgttcttt caatcatcaa acgcctcgcc 780

gtctcggcac caactgcact gttcacattc ttcagcactc cgcaatccaa caaggccctt 840

ttctccactg gccaacagcg tcatcttccc agcaatgtaa agccttacga cgtatccgat 900

ggagtcccgg aaggccacgt gttctccggg aagcgtcagg aagatatcga gctgttcatg 960

aatgctgctg atgccaactt caggaaagca gttgaggcag cagtggccga aactggcagg 1020

cccttgactt gtttggtaac agatgctttc atttggtttg ctgcagagat ggctcgagaa 1080

tggaataatg tcccttgggt tccatgctgg cccgctggcc ccaactctct ctctgctcat 1140

ctttacactg acattatcag ggacaaaata ggcacccaaa gtcaaaatca agatcaacaa 1200

cttattcact tcattccagg aatgaataag atacgcgtcg ccgacttgcc tgaaggagtt 1260

gtttccggag acttggattc agtcttttct gttatgctgc atcaaatggg acgtcagcta 1320

cccaaggcag ctgctgtttt catcaacagt tttgaagagt tagaccctga gttgacaaat 1380

catctcaaga ctaaattcaa caacaagttt ctcagtgttg gccctttcaa gctactacta 1440

gcatctgatc agcaaccgtc gtccgcaact gatttggatg atgaatatgg ttgcctggcg 1500

tggctggaca agcagaagaa gaaacctgct tcagtggcgt atgtcagctt tggtacagtg 1560

gcaacaccat ctccaaacga aattgtggca atagcagagg ccttggaagc aaataaagtg 1620

ccatttattt ggtcactgag acataggtcg caggcaaatc tgccaaatgg gttcctggaa 1680

aggacaagat cagatggaat tgtggtggat tgggcccccc aggtcaatgt tttagcacat 1740

gaagcagttg gggtctttgt aacacattgt ggttggggct caatccttga aagcatagct 1800

gcaggtgtgc cgatgatcgg gaggccattc tttggggatc agcggattaa tggaagaatg 1860

atggaacaag tatggggggt tggtgtcgct gtagatggtg gagggatttg cacaaaggaa 1920

ggtttactca gcagcttgga tctaattttg tgccaagaga aaggaatcaa aataagggag 1980

aaggttacaa agctgaagca actgtgccag aatgcaattg gtcccggtgg aagttccatg 2040

caaaatcttg atgcattggt agacatgata tcaagatctt attaagaa 2088

Claims (10)

1.一种槲皮素糖苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

槲皮素与糖基供体在溶液中在催化剂的作用下发生糖基化反应得到槲皮素糖苷，其中所述催化剂为糖基转移酶，序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的糖基供体为UDP-葡糖糖、UDP-N乙酰-D葡萄糖中的一种或两种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液为pH为5～9的缓冲溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述槲皮素的浓度为0.01～10％(w/v)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖基供体的浓度为0.01～10％(w/v)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，糖基转移酶的添加量为不低于0.01mg/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，糖基化反应温度为20～40℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，糖基化反应时间为12～36h。

9.一种权利要求1～8任一项所述的方法制备得到的槲皮素糖苷。

10.权利要求9所述的槲皮素糖苷在食品、药品、保健品中的应用。