PT837683E - PREPARAÆO E USO DE OLIGOSSACáRIDOS SULFATADOS - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Preparação e uso de oligossacáridos sulfatados"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a oligossacáridos sulfatados, à sua preparação e uso como agentes anti-angiogénicos, anti-metastáticos e/ou anti-inflamatórios.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os sulfatos de heparano pertencem à familia de polissacáridos do glicosaminoglicano. Estão presentes na maior parte dos animais multicelulares e têm uma distribuição omnipresente, sendo expressos na superfície da célula e nas matrizes extracelulares (ECM) da maior parte dos tecidos (1, 2) . Os sulfatos de heparano ocorrem normalmente como proteoglicanos, e tem havido um progresso considerável na sequenciação e clonagem dos polipéptidos nucleares da molécula. Até ao presente, por exemplo, pelo menos oito polipéptidos nucleares de proteoglicano de sulfato de heparano (HSPG) diferentes foram identificados na superfície da célula (3).

Inicialmente, considerava-se que os HSPG desempenhavam largamente um papel estrutural na superfície celular e nas ECM. No entanto, as cadeias de sulfato de heparano apresentam uma diversidade estrutural notável (2, 4) que sugere que podem fornecer importantes informações de sinalização para muitos processos biológicos. Assim, embora as cadeias de sulfato de heparano sejam inicialmente sintetizadas como uma repetição alternada simples de resíduos de glucuronosilo e N-acetilglucosaminilo unidos por ligações β1-4 e al-4, há muitas modificações subsequentes. 0 polissacárido é N-desacetilado e N-sulfatado, e sofre a seguir epimerização em C5 das unidades de glucuronosilo em unidades iduronosilo, e várias 0-sulfatações dos resíduos de urosonilo e glucosaminilo. A variabilidade dessas modificações permite umas trinta sequências dissacarídicas diferentes que, quando arranjadas em ordens diferentes ao longo da cadeia de sulfato de heparano, podem resultar teoricamente num número enorme de estruturas de sulfato de heparano diferentes. A esse respeito, o 2 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ anticoagulante polissacarídico heparina, presente apenas em grânulos de mastócitos, representa uma forma extrema de sulfato de heparano onde a epimerização e a sulfatação foram maximizadas. A maior parte dos sulfatos de heparano contém trechos curtos de resíduos altamente sulfatados unidos por trechos relativamente longos de unidades não sulfatadas. Há agora uma clara evidência de que os sulfatos de heparano desempenham um papel crítico numa ampla gama de processos biológicos (2-4). Em particular, podem agir como ligandos para moléculas de adesão envolvidas em interacções célula-célula (5, 6), participam em interacções célula-ECM (5, 6) e agem como receptores da superfície celular essenciais para factores de crescimento tais como o factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) (7, 8) e o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) (9). Os HSPG também constituem um componente chave das membranas basais, que representam uma crucial barreira à migração das células (10). As barreiras de membranas basais só podem ser rompidas quando as células desenvolvem uma gama de enzimas degradativas (11) que incluem uma endoglicosidase, chamada de heparanase, que cliva as cadeias de sulfato de heparano (12, 13).

Foi mostrado que muitos dos processos biológicos nos quais os sulfatos de heparano participam envolvem o reconhecimento de estruturas únicas de sulfato de heparano, onde a posição dos sulfatos na cadeia polissacarídica é de importância crítica (3) . Por exemplo, foi demonstrado que sequências de sulfato de heparano definidas são reconhecidas por FGF ácido e básico (14-16) e clivadas por heparanases. Com base nessas observações, um objectivo dos inventores foi a síntese de oligossacáridos sulfatados que bloqueiam o reconhecimento de sulfato de heparano por factores de crescimento, e inibem a clivagem de sulfatos de heparano por heparanases. No caso do bloqueio de factores de crescimento, foi considerado que miméticos de baixo peso molecular do sulfato de heparano deveriam ser particularmente eficazes, uma vez que agora se acredita que os sulfatos de heparano da superfície celular medeiam a reticulação de factores de crescimento ligados aos seus receptores (17). Além disso, os oligossacáridos sulfatados deverão ser inibidores de heparanase eficazes ao agirem como substratos não cliváveis dessa enzima. 3 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ

Os oligossacáridos sulfatados com actividade inibidora de factores de crescimento têm uma série de usos clínicos. Os factores de crescimento que se ligam a heparina/sulfato de heparano, tais como bFGF e VEGF, são indutores potentes de angiogénese (18). Nos adultos, a angiogénese é uma ocorrência relativamente rara, excepto durante a cura de ferimentos. No entanto, há uma série de "doenças dependentes de angiogénese" em adultos onde a angiogénese é criticamente importante (18-20) . A mais importante delas é a angiogénese associada ao crescimento de tumores sólidos, retinopatias proliferativas e artrite reumatóide. Os oligossacáridos sulfatados que bloqueiam a acção de factores de crescimento angiogénico chave, tais como bFGF e VEGF, são particularmente úteis no tratamento dessas doenças dependentes de angiogénese.

Similarmente, os oligossacáridos sulfatados que inibem a acção da heparanase têm uma série de aplicações clínicas. A membrana basal subendotelial representa uma crucial barreira física à passagem das células endoteliais, células tumorais e leucócitos através da parede do vaso sanguíneo. A enzima heparanase, combinada com uma gama de enzimas proteolíticas (por exemplo, plasmina, metaloproteinases de matriz), desempenha um papel essencial na degradação da membrana basal ao invadir as células (11-13, 21). Assim, com o impedimento da degradação da membrana basal, os oligossacáridos sulfatados com actividade inibidora de heparanase deverão apresentar actividade antimetastática e anti-inflamatória, e além disso podem inibir os estádios iniciais da angiogénese. O uso de oligossacáridos sulfatados que inibem simultaneamente a acção de factores de crescimento angiogénicos e a enzima de heparanase será preferido em muitas situações clínicas, por exemplo, no tratamento de tumores sólidos altamente metastáticos e de artrite reumatóide. O Pedido Internacional de Patente No. PCT/AU88/00017 anterior (Publicação WO 88/05301) divulga o uso de polissacáridos sulfatados tais como heparina e heparina modificada, fucoidina, sulfato de pentosano, sulfato de dextrano e carragenano lambda, que bloqueiam ou inibem a actividade da heparanase, no tratamento anti-metastático e/ou anti-inflamatório de um paciente animal ou humano. WO 95/09637 refere-se a uma classe de malto-oligossacáridos altamente sulfatados possuindo actividade semelhante a heparina. 4 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ

No trabalho que levou à presente invenção, os inventores prepararam oligossacáridos sulfatados utilizando oligossacáridos de ocorrência natural ou oligossacáridos totalmente sintéticos compreendendo homopolímeros contendo hexose. Foi demonstrado que alguns desses compostos são inibidores potentes de angiogénese humana, metástase tumoral e inflamação. Os dados obtidos são consistentes com os oligossacáridos sulfatados apresentarem os seus efeitos biológicos por inibição da acção do factor de crescimento angiogénico e/ou da função da heparanase, e foram obtidos determinados oligossacáridos sulfatados que são inibidores potentes da angiogénese e da actividade da heparanase.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os oligossacáridos sulfatados de acordo com a presente invenção são baseados em polímeros de unidades monossacarídicas, os quais podem ser ligados por ligações glicosídicas l->3, l->4 e/ou l->6 e que podem consistir em três a oito unidades monossacarídicas. De preferência, os oligossacáridos consistem em três a seis unidades monossacarídicas (ou seja, n varia de 1 a 4), com maior preferência de cinco a seis unidades monossacarídicas (n varia de 3 a 4) . Os polímeros são homopolímeros contendo apenas um tipo de unidade monossacarídica.

As unidades monossacarídicas que são ligadas entre si para formar os oligossacáridos são de preferência hexoses e piranoses, nomeadamente manose ou galactose. As hexoses podem estar na configuração D ou L.

Num aspecto particular da presente invenção, são proporcionados novos oligossacáridos sulfatados, em que o oligossacárido tem a fórmula geral II:

Ry-(Ry)n-Ry (II) na qual: cada grupo Ry é igual, e cada um representa uma unidade monossacarídica, que é manose ou galactose, estando as unidades monossacarídicas adjacentes ligadas por ligações glicosídicas l->3, l->4 e/ou l->6; e n é um número inteiro de 1 a 6. 5 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ

De preferência, nesses oligossacáridos n varia de 1 a 4, e com maior preferência de 3 a 4.

Em geral, os oligossacáridos sulfatados da presente invenção podem ser preparados através da sulfatação dos oligossacáridos por métodos conhecidos 'per se' na especialidade para obter os seus derivados O-sulfatados correspondentes. Os métodos de sulfatação adequados estão exemplificados a seguir. Os oligossacáridos a sulfatar podem ser produtos de ocorrência natural que incluem os oligossacáridos de ocorrência natural como tal, bem como os oligossacáridos preparados por degradação enzimática ou química de polissacáridos de ocorrência natural (por exemplo, fosfato de manopentaose da levedura Pichia holstii). A invenção proporciona assim um processo para a produção de um oligossacárido sulfatado como descrito acima, processo esse que compreende a degradação enzimática ou química de um polissacárido de ocorrência natural.

Tal como descrito acima, foi observado que os oligossacáridos sulfatados que se enquadram no âmbito da presente invenção apresentam actividade inibidora de heparanase e/ou inibidora de factores de crescimento e, por conseguinte, o oligossacárido sulfatado tal como descrito acima pode ser utilizado como agente anti-angiogénico, anti-metastático e/ou anti-inflamatório no tratamento de um paciente animal de sangue quente (incluindo um ser humano). Assim, a presente invenção proporciona pelo menos um oligossacárido sulfatado como descrito acima, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal. A presente invenção estende-se a pelo menos um oligossacárido sulfatado como descrito acima, para utilização num tratamento anti-angiogénico, anti-metastático e/ou anti-inflamatório de um paciente humano ou outro paciente animal de sangue quente que necessite desse tratamento. 0 componente activo deve ser administrado em quantidades terapeuticamente eficazes. Uma quantidade terapeuticamente eficaz significa a quantidade necessária para, pelo menos parcialmente, se obter o efeito desejado, ou para retardar o início, inibir a progressão, ou parar por completo o início ou a progressão da condição particular que está a ser 6 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ tratada. É claro que essas quantidades irão depender da condição particular que está a ser tratada. Essas quantidades dependerão evidentemente da condição a tratar, da gravidade da condição e dos parâmetros do paciente individual incluindo a idade, a condição física, o tamanho, o peso e o tratamento concomitante. Esses factores são bem conhecidos das pessoas competentes na matéria e podem ser abordados com apenas experimentação de rotina. Em geral, é preferível que seja usada uma dose máxima, ou seja, a dose mais elevada que segura de acordo com a opinião médica fundamentada. No entanto, as pessoas competentes na matéria entenderão que pode ser administrada uma dose menor ou uma dose tolerável por motivos médicos, motivos psicológicos ou virtualmente por qualquer outro motivo. A invenção também se estende ao uso na fabricação de um medicamento para o tratamento anti-angiogénico, anti-metastático e/ou anti-inflamatório de um paciente humano ou outro paciente animal de sangue quente, de pelo menos um oligossacárido sulfatado como descrito acima.

Além disso, a presente invenção proporciona também uma composição farmacêutica ou veterinária que compreende pelo menos um oligossacárido sulfatado tal como descrito acima, e um seu transportador ou diluente farmacêutica e veterinariamente aceitáveis. A formulação dessas composições terapêuticas é bem conhecida dos peritos neste campo. Os transportadores e/ou diluentes farmacêutica ou veterinariamente adequados aceitáveis incluem todos e quaisquer solventes convencionais, meios de dispersão, cargas, transportadores sólidos, soluções aquosas, revestimentos, agentes bacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores de absorção, e similares. 0 uso desses meios e agentes para as substâncias farmacêutica e veterinariamente activas é bem conhecido na especialidade, e está descrito, a título de exemplificação, em Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, Mack Publishing Company, Pennsylvania, EUA. Excepto no caso em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente activo, o seu uso nas composições farmacêuticas e veterinárias da presente invenção está contemplado. Ingredientes activos suplementares também podem ser incorporados nas composições. 7 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ É especialmente vantajoso formular as composições na forma de unidades de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A forma de unidades de dosagem, tal como aqui empregue, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos humanos ou animais a tratar; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de ingrediente activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador e/ou diluente farmacêutico ou veterinário requerido. As especificações para as novas formas de unidade de dosagem da invenção são ditadas por, e dependem directamente (a) das características únicas do ingrediente activo e do efeito terapêutico particular a ser obtido, e (b) das limitações inerentes na especialidade da formação de composições com esse ingrediente activo para o tratamento particular.

Os oligossacáridos sulfatados da presente invenção podem ser usados no tratamento de doenças dependentes de angiogénese, incluindo a angiogénese associada com o crescimento de tumores sólidos, retinopatias proliferativas e artrite reumatóide, bem como no tratamento de doenças inflamatórias e condições nas quais a actividade inibidora de heparanase dos oligossacáridos sulfatados seria particularmente útil na inibição da infiltração de leucócitos, incluindo doenças inflamatórias crónicas nas quais a infiltração de leucócitos é um elemento chave, tais como artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes mellitus dependente de insulina, doenças inflamatórias do intestino tais como colite ulcerativa e doença de Chron, rejeição a aloenxerto e asma crónica.

Em todo o presente fascículo, excepto onde o contexto exija o contrário, a palavra "compreender", ou suas variações tais como "compreende", “compreendendo" ou "que compreende", deve ser entendida como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros indicado, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. 8 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Tal como descrito acima de modo amplo, a presente invenção refere-se a oligossacáridos sulfatados e ao seu uso como agentes anti-angiogénicos, anti-metastáticos e/ou anti-inflamatórios.

Alguns oligossacáridos podem ser obtidos a partir de fontes naturais para a sulfatação subsequente; no entanto, um procedimento simples para a síntese de oligossacáridos de comprimento de cadeia e estereoquímica definidos é altamente desejável. É assim aqui proporcionado um método aperfeiçoado para sintetizar e isolar oligómeros de açúcares de hexose a partir de materiais de partida simples com bons rendimentos, onde os monómeros de açúcar desses oligómeros estão ligados com uma ligação l->3, l->4 e/ou 1^6. Esse método para a fabricação de oligómeros de açúcares de hexose contrasta bastante com a maneira pela qual esses oligómeros de açúcar eram fabricados anteriormente, uma vez que são obtidos bons rendimentos, o grau de oligomerização é prontamente controlado, e os produtos derivados desse método são oligómeros lineares homólogos que são isolados e purificados com facilidade empregando técnicas cromatográficas simples.

Muitos exemplos que descrevem os métodos para a preparação de polímeros e oligómeros de açúcar podem ser encontrados na literatura científica e de patentes. Por exemplo, num procedimento normalmente usado, um monómero de açúcar não modificado, tanto sozinho como na presença de um solvente, pode ser aquecido na presença de um catalisador para obter produtos poliméricos ramificados e lineares com várias ligações químicas algumas vezes mal definidas (22, 23). Outro método no qual o açúcar é fundido na presença de resinas de troca catiónica (24) também resulta em polímeros altamente ramificados de elevado peso molecular. Nestes dois exemplos, os polímeros são formados com a perda concomitante de uma molécula de água por cada ligação polimérica formada. Outro exemplo de um método conhecido de polimerização por etapas envolve a utilização da reacção de Koenigs-Knorr onde os açúcares possuindo grupos não hidroxílicos (tais como um átomo de bromo ou de cloro) na posição 1 e grupos protectores (tais como acetilo) em outros grupos hidroxilo do açúcar, são 9 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ levados a reagir na posição 1 com um grupo hidroxilo em outro açúcar (24). Nestes métodos, uma molécula que não de água, por exemplo, de HBr, é perdida durante a formação da ligação polimérica. Este método de preparação de oligossacáridos é tedioso, requer a preparação de materiais de partida complexos e resulta em fracos rendimentos globais (25).

De maneira semelhante, é sabido que um açúcar de hexose que contém um grupo álcool primário no carbono 6 e grupos O-protectores (tais como acetilo) nas posições 2, 3 e 4 e um grupo rejeitado tal como bromo na posição 1, se auto-condensa, em especial na presença de um catalisador tal como óxido de prata, para obter polímeros ligados em 1,6; uma série de gentiodextrinas foi preparada dessa maneira a partir de l-bromo-2,3,4-tri-O-acetil-cx-D-glicose; no entanto, os rendimentos dos oligossacáridos foram baixos devido à formação de 1,6-anidro^-D-glicose derivada da condensação intramolecular; os rendimentos do dímero (14%) e do trímero (22%) não foram bons, e os rendimentos do tetrâmero e do pentâmero foram piores (^5%), e o hexâmero foi isolado com um rendimento de apenas 1% (26).

Publicações mais recentes descrevem as sínteses químicas de polímeros de unidades β-piranosilo ligadas em 1,6 (27) e D-dextrano (28), produzidos através da reacção de polimerização com abertura de anel de derivados de anidro-açúcar. Este método é prejudicado pelo esforço considerável necessário para a preparação do material de partida de anidro-açúcar, e não há nenhuma evidência de que oligossacáridos possam ser prontamente preparados por este método mesmo que as reacções sejam realizadas, por exemplo, a -60°C. Outro método empregou a polimerização em fusão catalisada por ácido de 1,2,3,4-tetra-0-acetil-p-D-glicose para preparar uma mistura de acetatos de oligossacáridos ligados em 1,6' que, por desacetilação e sujeição a exame cromatográfico, revelou conter principalmente mono- e dissacáridos, nomeadamente glicose (15%), levoglucosano (4%) e gentiobiose (16%), enquanto que o rendimento de oligossacárido foi inaceitavelmente baixo, especificamente, gentiotriose (4%) e gentiotetraose (0,6%) (29). Este método foi descrito subsequentemente com mais detalhes (30), e embora o rendimento de produtos polimerizados tenha melhorado ligeiramente, resultou apenas em rendimentos muito fracos dos oligómeros esperados. 10 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ

Assim, parece, a partir da literatura, que embora já existam vários procedimentos para a preparação de uma série de oligossacáridos, até à presente data não foi descrito nenhum método para sintetizar homo-oligossacáridos com um bom rendimento a partir de material de partida de disponibilidade imediata e barato.

No trabalho que levou à presente invenção, os inventores caracterizaram um processo por meio do qual hexopirano-oligossacáridos específicos podem ser sintetizados com bons rendimentos a partir de materiais de partida de disponibilidade imediata e baratos. Este é um processo para a preparação de hexopirano-oligossacáridos que compreende o aquecimento de um derivado acetilo ou de outro éster, de uma hexose, num solvente inerte, sob pressão reduzida e na presença de um ácido de Lewis ou de outro catalisador.

De acordo com este processo, que não faz parte da presente invenção, a oligomerização dos açúcares de hexose derivatizados, incluindo mas não restritos aos derivados 1, 2,3, 4-tetra-O-acetilo de glicose, manose, galactose, altrose, talose, gulose, idose e alose, pode ser realizada de uma maneira controlada para obter oligossacáridos de hexose 0-acetilados. Neste processo, o grau de oligomerização (comprimento da cadeia) pode ser prontamente controlado através da manipulação da temperatura à qual a reacção de oligomerização é realizada e fazendo variar o período durante o qual a reacção é deixada prosseguir. Depois da reacção de oligomerização, a mistura de produtos brutos pode ser submetida a mais acetilação, a fim de acetilar os grupos hidroxilo livres remanescentes dos oligossacáridos. Os oligossacáridos acetilados podem ser então prontamente separados por cromatografia de adsorção. Os grupos acetilo apresentam absorvância de luz ultravioleta, facilitando o uso de espectrofotometria para identificar os oligossacáridos acetilados à medida que estes forem eluídos sequencialmente da coluna. Os grupos protectores de acetilo também podem ser removidos da mistura de oligossacáridos, e os oligossacáridos resultantes separados de acordo com o tamanho por cromatografia de filtração em gel (exclusão por tamanhos).

Nos Exemplos e Exemplos de Referência aqui descritos, os oligossacáridos sulfatados são isolados e usados na forma dos 11 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ seus respectivos sais de sódio. Será entendido que outros sais farmaceuticamente aceitáveis, tais como sais de cálcio ou sais de amina farmaceuticamente aceitáveis, podem ser isolados e usados de maneira correspondente. Por conseguinte, as referências aqui a um "oligossacárido sulfatado" devem ser entendidas como incluindo sais de sódio ou outros sais farmaceuticamente aceitáveis do oligossacárido sulfatado.

Outras caracteristicas da presente invenção estão descritas de modo mais completo no(s) Exemplo(s) a seguir. No entanto, deve ficar entendido que esta descrição detalhada é incluida apenas para fins de exemplificação da presente invenção, e não deve ser entendida de modo algum como uma restrição na descrição ampla da invenção tal como exposto acima.

Os Exemplos 1 e 2 e o Exemplo de Referência 1 exemplificam a preparação de oligossacáridos sintéticos pelo novo processo aqui divulgado, os Exemplos 3 e 4, e o Exemplo de Referência 2 exemplificam processos para a sulfatação de oligossacáridos, e o Exemplo 5 exemplifica o uso de oligossacáridos sulfatados como agentes anti-angiogénicos, anti-metastáticos e/ou anti-inflamatórios. (No Exemplo 1 e no Exemplo de Referência 1, "ND" representa "não determinado").

Nos desenhos anexos: A Figura 1 mostra o efeito de sulfato de malto-hexaose na angiogénese humana in vitro. A figura de cima é uma imagem digital da angiogénese de controlo 14 dias depois do inicio da cultura. A figura de baixo mostra a angiogénese na presença de 20 pg/ml de sulfato de malto-hexaose. A Figura 2 mostra o efeito de concentrações diferentes de sulfato de maltose ( ) , sulfato de maltotetraose (o) e sulfato de maltotetraose () na angiogénese humana in vitro. Os dados obtidos foram obtidos a partir das imagens digitais da resposta angiogénica 14 dias depois do inicio da cultura. Cada valor é a média ± erro padrão (n = 4) . A Figura 3 mostra o efeito de diferentes concentrações (yg/ml) de fosfato de manopentaose sulfatada de Pichia holstii na angiogénese humana in vitro. Os dados foram obtidos a partir das imagens digitais da resposta angiogénica 12 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ 19 dias depois do inicio da cultura. Cada valor é a média ± erro padrão (n = 4). A Figura 4 mostra o efeito de oligossacáridos de maltose sulfatados de comprimentos de cadeia diferentes na metástase do adenocarcinoma mamário de rato 13762 MAT. Os animais de controlo receberam células de 13762 MAT na ausência de oligossacárido. No painel A, os animais tratados receberam 2 mg, i.v., de cada composto no momento da injecção de células tumorais. No painel B, os animais tratados receberam 4 mg, subcutaneamente., de cada composto no momento da injecção de células tumorais. As barras verticais representam os erros padrão das médias. A Figura 5 é uma determinação da capacidade de oligossacáridos de maltose sulfatados de comprimentos de cadeia diferentes inibirem a ligação de sulfatos de heparano da superfície celular em células 3T3 de BALB/c, a aFGF imobilizado. As células 3T3 ligadas foram quantificadas através de coloração com Rosa de Bengala e por medição da absorvância do corante a 540 nm. O grau de sulfatação dos diferentes oligossacáridos de maltose está listado na Tabela 2 . A Figura 6 mostra o efeito do grau de sulfatação de sulfato de malto-hexaose na sua capacidade de inibir a metástase de adenocarcinoma mamário de rato 13 762 MAT. Os números ao longo do eixo dos xx referem-se ao número de grupos sulfato por molécula de malto-hexaose. Os animais de controlo receberam células tumorais na ausência de compostos. Os oligossacáridos foram administrados numa dose de 2 mg/rato, i.v., no momento da injecção de células tumorais. As barras verticais representam os erros padrão das médias. A Figura 7 mostra o efeito de malto-hexaose com números diferentes de grupos sulfato por molécula na angiogénese humana in vitro. Os oligossacáridos foram adicionados a 200 pg/ml, e a análise foi realizada em meio sem soro. Foi observada nesta experiência uma resposta angiogénica semelhante, quer a análise tenha sido realizada num meio contendo soro (2 0 % de FCS) ou sem soro (sem FCS) . A malto-hexaose com 2 0 sulfatos por molécula representa a molécula sulfatada no máximo. Os dados são a média ± erro padrão de quatro determinações. 13 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ A Figura 8 mostra ο efeito de diferentes oligossacáridos sulfatados contendo manose na angiogénese humana in vitro. Os valores entre parênteses representam a percentagem de sulfatação de oligossacáridos. Os oligossacáridos foram adicionados a 200 pg/ml, e a análise foi realizada num meio contendo soro. Os dados são a média ± erro padrão de guatro determinações. A Figura 9 mostra o efeito de oligossacáridos de manose sulfatados de comprimentos de cadeia diferentes na metástase do adenocarcinoma mamário de rato 13762 MAT. Os valores entre parênteses representam a percentagem de sulfatação de oligossacáridos. Os animais de controlo receberam células de 13762 MAT na ausência de oligossacárido. Os animais tratados receberam 2 mg (A) ou 4 mg (B) , subcutan., de cada composto imediatamente depois da injecção i.v. de células tumorais. As barras verticais representam os erros padrão das médias. A Figura 10 mostra o efeito de oligossacáridos de galactose e glicose sulfatados de diferentes comprimentos de cadeia na metástase do adenocarcinoma mamário de rato 13762 MAT. Os valores entre parênteses representam a percentagem de sulfatação de oligossacáridos. Os animais de controlo receberam células de 13762 MAT na ausência de oligossacárido. Os animais tratados receberam 2 mg, subcutan., de cada composto imediatamente depois da injecção i.v. de células tumorais. As barras verticais representam os erros padrão das médias. EXEMPLO 1

Obtiveram-se oligossacáridos de manose da seguinte maneira: 1,2,3,4-tetra-O-acetilmanose (31) (15,0 g, 43 mmol) e cloreto de zinco (1,5 g) foram misturados integralmente em tetrametilenossulfona (7 ml), essa mistura foi aquecida sob pressão reduzida com agitação a cerca de 110°C por 6 horas; nessa altura, a massa reaccional tinha endurecido e tinha cessado a produção de vapor (ácido acético). Durante todo o tempo da reacção, um tubo de cal sodada ficou situado entre o vaso reaccional e a fonte de vácuo. A mistura reaccional foi deixada arrefecer, e uma porção (11,0 g) da mistura de produtos foi dissolvida em piridina seca (20 ml), e a essa solução foi adicionado anidrido acético (2 ml), essa mistura 14 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ foi protegida contra a humidade atmosférica e aquecida a cerca de 50°C com agitação por 2 horas. Depois do arrefecimento, foi adicionado etanol (10 ml), e a mistura foi deixada em repouso por 2 horas. A piridina, o etanol e todo acetato de etilo formado foram evaporados sob pressão reduzida, e o resíduo foi lavado intensamente com água, para remover o cloreto de zinco, a tetrametilenossulfona e a piridina. O resíduo foi dissolvido em diclorometano, lavado com água, e a camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro. Os oligossacáridos derivatizados foram inicialmente separados em duas fracções aplicando a solução de diclorometano numa coluna curta (4 x 40 cm) de gel de sílica 60 (130 g), a qual foi primeiro eluída com clorofórmio e a seguir com acetona. A eluição com clorofórmio resultou numa mistura do monossacárido totalmente acetilado e oligómeros contendo 3 a 5 unidades de manose (Mistura A) . A eluição subsequente com acetona resultou numa mistura de oligómeros totalmente O-acetilados contendo principalmente de 6 até 12 unidades de manose por molécula (Mistura B). A Mistura A (4 g) foi aplicada a uma coluna (3,3 x 135 cm) empacotada com gel de sílica de qualidade para tlc (H) . A coluna foi eluída com acetona/petróleo leve (ponto de ebulição de 60°C-80°C) com um gradiente começando em 1:5 e aumentando a percentagem de acetona até ser atingida uma razão final de 1:1. O caudal era <0,5 ml/min. Recolhendo e agrupando as fracções apropriadas (determinadas por análise tlc em gel de sílica) e removendo o solvente sob pressão reduzida, obtiveram-se os oligossacáridos de manose totalmente O-acetilados la - ld tal como segue (n = número de resíduos de manose; rendimento, rotação molecular (c = 2, CHC13) ) ; la, (3; 0,7 g, 4,2%, [oí] 27d = +ND) ; lb, (4; 4,1 g, 8,4%, [a]27D = + 50); lc, (5; 1,2 g, 7,9%, [a]27D = +47,3); ld, (6; 0,8 g, 5,2%, [oí]27d = +36,0). A Mistura B (7,0 g) foi cromatografada de uma maneira semelhante à Mistura A, mas o gradiente de eluição começou com acetona/petróleo leve (ponto de ebulição de 60°C--80°C) a 4:5, e a percentagem de acetona aumentou até ficar 100%. Dessa maneira, obtiveram-se os oligossacáridos de manose totalmente O-acetilados ld - lj tal como segue: (n = número de resíduos de manose; rendimento, rotação molecular (c = 1,

CHC13) ) ; ld, (6; 1,6 g, 10,4%, [oí]27d = +ND) ; le, (7; 3,2 g, 21,2%, [oí]27d = +50,0); lf, (8; 0,5 g, 3,4%, [a]27D = +47,0); lg, (9; 0,7 g, 4,7%, [oí]27d = +59); lh, (10; 0,9 g, 5,7%, [a]27D 15 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ = +54); li, (11; 0,02 g, 0,1%, [α]270 = +ND) ; 1 j, (12; 0,03 g 0,2%, [α] 27 = +ND). Ο composto la (1,55 g) foi dissolvido em metanol seco (40 ml), e metóxido de sódio metanólico 1 M (8,6 ml) foi adicionado com agitação à temperatura ambiente. O precipitado resultante foi filtrado, lavado integralmente com metanol, e seco. O produto (2a; 0,61 g, 70%, [oí]27d = +12°) foi identificado como manotriose por análise elementar (os valores de CHN foram 0,4% do esperado), espectrometria de massa com electropulverização (M+504) e espectroscopia de RMN. Os oligómeros lb - lj foram tratados de maneira semelhante, para obter os oligossacáridos de manose seguintes (n = número de resíduos de manose; rendimento em % de derivados acetilados, rotação m (4; 75%, [oí]27d = +78°) ; 2c, (5; 98%, [oí] 27d = 84' .Oí 27 [a] 27 a 27 = +98,0°); 2g, = +100°); 2i, = ND) . (9; 99%, (11; 98%, 1-1 0 d) 1 -1 ar (c = 1, H20) ) ; 2b 85%, [ Oí ]2 7d = + 80° ) ; 2d, (6 [0í]27d = 86,3°; I ; 2f , (8; 99% :]27d = + 106°) ; 2h, (10; 99% [Oí] 27d = ND) ; 2 j, (12; 98%

Alternativamente, estes oligossacáridos de manose podem ser isolados através de cromatografia de filtração em gel (exclusão por tamanhos). Assim, uma mistura de oligossacáridos de manose acetilados foi obtida aquecendo uma mistura totalmente agitada de 1,2,3,4-tetra-O-acetilmanose (15,0 g, 43 mmol) e cloreto de zinco (1,5 g) em tetrametilenossulfona (7 ml) sob pressão reduzida a cerca de 110°C por 6 horas tal como descrito acima. A mistura reaccional foi deixada arrefecer, e foi adicionada água (50 ml) , e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente por 5 minutos, e a camada de água foi descartada. Este procedimento de lavagem foi repetido, e a massa foi dissolvida a seguir em clorofórmio, lavada com água e seca sobre sulfato de sódio anidro. Depois da filtração, o clorofórmio foi removido sob pressão reduzida, para obter a mistura de oligossacáridos acetilados em bruto (11,3). Esta mistura foi dissolvida em isopropanol (20 ml) e metanol (60 ml), e então foi adicionado metóxido de sódio 1 M em metanol (8 ml), e a mistura foi deixada em repouso à temperatura ambiente por 1 hora. O precipitado resultante foi filtrado e lavado duas vezes com metanol (30 ml) . Depois da secagem, esta mistura de produtos (6,5 g) foi aplicada ao topo de uma coluna de filtração em gel 16 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ com gel Ρ2 de grau fino (BioRad) (com camisa; 5 x 90 cm) que tinha sido estabilizada sendo eluída por dois dias com água (caudal de 0,5 ml por minuto) a 60°C. A coluna foi eluída com água a um caudal de 0,5 ml por minuto. Os produtos eluídos da coluna foram identificados na forma de picos através de refractometria diferencial, e as fracções foram recolhidas de modo correspondente. Dessa maneira, foram recolhidas as fracções correspondentes às áreas sob 11 picos separados. Cada uma destas fracções foi novamente cromatografada numa coluna de gel P2 idêntica mantida a 60 °C e eluída com água a um caudal de 0,5 ml/min. Assim, a título de exemplo, a fracção identificada como correspondente a manopentaose (0,9 g) na primeira filtração em gel foi novamente cromatografada para obter um pico central principal com um ressalto de cada lado. O produto eluído no pico central foi isolado removendo a água sob pressão reduzida, para obter (0,5 g) de material, o qual novamente cromatografado numa coluna de gel P2 idêntica a 60°C, a um caudal de 0,3 ml/min. Desta maneira obteve-se manopentaose (0,3 g) idêntica a 2c anterior. Obtido: C, 38,4; H, 6,7, C30H52O26· 6H20 requer C, 38,5; H, 6,8%. O valor de azoto foi de 0% obtido e de 0% esperado.

Verificou-se por HPLC que o composto era substancialmente puro. Isto foi determinado num sistema HPLC Dionex configurado como segue.

Coluna: Detector: Caudal: Solventes: Gradiente: Código - CPMA 1 # 1291 (+ protector# 1172) . Uma coluna de Troca Iónica de Amónio Quaternário.

Detector Electroquímico (ED40:IAMP). 1 ml/min.

Solução A: NaOH 0,1 M

Solução B: Acetato 1 M em NaOH 0,1 M

Tempo (min.) % de A % de B Acção 0 95 5 Eluição 20 90 10 Eluição 25 0 100 Eluição/Lavagem 30 0 100 Eluição/Lavagem A espectrometria de massa com electropulverização revelou que este composto tinha uma massa M+ de 828, o peso molecular correcto da manopentaose. De uma maneira semelhante, foram isoladas manotriose, manotetraose, mano-hexaose e mano-heptaose idênticas a 2a, 2b, 2d e 2e acima. 17 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1

Este exemplo mostra o efeito da realização da reacção de polimerização a uma temperatura mais baixa do que no

Exemplo 1. Os oligossacáridos de glicose foram obtidos através da polimerização de 1,2,3,4-tetra-0-acetilglicose da mesma maneira que para os oligossacáridos de manose produzidos pelo método indicado no Exemplo 1 acima, excepto que neste caso a reacção de polimerização foi realizada a 90°C por 8 horas. A mistura reaccional foi tratada como no Exemplo 1, e os produtos foram isolados através de cromatografia em coluna, onde a coluna (7 cm x 155 cm) estava empacotada com gel de silica de qualidade para tlc (H). Empregando métodos de eluição semelhantes àqueles descritos no Exemplo 1, foram obtidos os oligossacáridos de glicose totalmente O-acetilados 3a - 3e como segue: (n = número de resíduos de glicose; rendimento, rotação molecular (c = 2, CHCI3) ) ; 3a, (3; 4,14 g, 24,9%, [a] 27d = 37,5°); 3b, (4; 2,92 g, 18,4%, [a]27D = +44°); 3c, (5; 2,99 g, 19,1%, [a]27D = +37,5°); 3d, (6; 1,37 g, 8,9%, [a]27D = +36°); 3e, (7; 0,18 g, 1,2%, [a]27D = +39°). O composto 3a (1,0 g) foi dissolvido em metanol seco (30 ml), e metóxido de sódio metanólico 1 M (5,5 ml) foi adicionado com agitação à temperatura ambiente. O precipitado resultante foi filtrado, lavado integralmente com metanol, e seco. O produto (4a; ([oí]27d = 68,5°) foi identificado como glicotriose por análise elementar, espectrometria de massa com electropulverização (M+ = 504) e espectroscopia de RMN. Os oligómeros 4b - 4e foram tratados de maneira semelhante, para obter os oligossacáridos de glicose seguintes (n = número de resíduos de glicose; rendimento, %, rotação molecular (c = 2, H20) ) ; 4b, (4; 85%, [oí]27d = +83°); 4c, (5; 90%, [oí]27d =+84°); 4d, (6; 90%, [oí]27d =+86°); 4e, (7; 89%, [oí] 27d = +92,5°) .

Alternativamente, estes oligossacáridos de glicose podem ser isolados através de cromatografia de filtração em gel (exclusão por tamanhos). Assim, foi obtida uma mistura de oligossacáridos de glicose acetilados aquecendo uma mistura totalmente agitada de 1,2,3,4-tetra-O-acetilglicose (15,0 g, 43 inmol) e cloreto de zinco (1,5 g) em tetrametilenossulfona (7 ml) sob pressão reduzida a cerca de 110°C por 6 horas, tal como descrito acima. A massa reaccional foi dissolvida em 18 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ diclorometano, lavada com água e seca sobre sulfato de sódio anidro. O diclorometano foi removido sob pressão reduzida, e o produto foi pesado e dissolvido em isopropanol (20 ml) e metanol (60 ml), e então foi adicionado metóxido de sódio 1 M em metanol (9 ml), e a mistura foi deixada em repouso à temperatura ambiente por 1 hora. O precipitado resultante foi filtrado e lavado duas vezes com metanol (30 ml) . Uma porção (7,6 g) desta mistura foi dissolvida em água (10 ml) e aplicada a uma coluna de cromatografia com camisa de água de 5 x 90 cm empacotada com gel de exclusão por tamanhos P2 de grau fino (BioRad). A coluna tinha sido empacotada, pré-aquecida e eluida a 60°C por dois dias antes de ser usada. Depois da adição da mistura de oligossacáridos de glicose, a coluna foi mantida a 60°C e eluida com água (1 ml/min.). Os produtos eluidos da coluna foram identificados na forma de picos através de refractometria diferencial, e as fracções foram recolhidas de modo correspondente. Dessa maneira, foram recolhidas as fracções correspondentes às áreas sob 10 picos separados. Cada uma destas fracções foi outra vez cromatografada numa coluna de gel P2 idêntica a 60°C e eluida com água a um caudal de 0,5 ml/min. Assim, a título de exemplo, a fracção identificada como correspondente a glicopentaose (0,59 g) foi novamente cromatografada, para obter um pico central principal com um ressalto de cada lado. O produto eluído no pico central foi isolado removendo a água sob pressão reduzida, para obter (0,3 g) de material, o qual foi novamente cromatografado numa coluna de gel P2 idêntica a 60°C idêntica a um caudal de 0,3 ml/min. Dessa maneira, foi obtida glicopentaose (0,2 g) , idêntica a 4c acima. De uma maneira semelhante, foram isoladas glicotriose, glicotetraose, glico-hexaose e glico-heptaose idênticas a 4a, 4b, 4d e 4e acima. EXEMPLO 2

Oligossacáridos e outros açúcares de hexose incluindo a galactose, altrose, talose, gulose, idose e alose, podem ser obtidos seguindo os métodos divulgados no Exemplo 1 e no Exemplo de Referência 1.

Por exemplo, oligossacáridos de galactose foram obtidos da seguinte maneira: 1,2,3,4-tetra-O-acetilgalactose (21,0 g) e cloreto de zinco (2,1 g) foram misturados integralmente em 19 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ tetrametilenossulfona (10 ml), essa mistura foi aquecida sob pressão reduzida com agitação a cerca de 90°C por 17 horas; nessa altura, a massa reaccional tinha endurecido e tinha cessado a produção de vapor (ácido acético). Durante toda a reacção, um tubo de cal sodada ficou situado entre o vaso reaccional e a fonte de vácuo. A mistura reaccional foi deixada arrefecer, a massa reaccional foi dissolvida a seguir em diclorometano, lavada com água e seca sobre sulfato de sódio anidro. O diclorometano foi removido sob pressão reduzida, e o produto foi pesado e dissolvido em isopropanol (30 ml) e metanol (70 ml), e a seguir foi adicionado metóxido de sódio 1 M em metanol (10 ml), e a mistura foi deixada em repouso à temperatura ambiente por 1 hora. O precipitado resultante foi filtrado e lavado duas vezes com metanol (30 ml). Esta mistura foi separada por cromatografia de filtração em gel, tal como descrito para os polímeros de manose e glicose nos Exemplos 1 e 2 acima. Os produtos eluídos da coluna foram identificados na forma de picos através de refractometria diferencial, e as fracções foram recolhidas de modo correspondente. Dessa maneira, foram recolhidas 8 fracções. Sete dessas fracções foram novamente cromatografadas mais duas vezes numa coluna de gel P2 idêntica a 60°C e eluídas com água a um caudal de 0,5 ml/min durante a primeira eluição e 0,3 ml/min na segunda. Dessa maneira, foram obtidos os oligossacáridos de galactose seguintes: galactotriose, 1,03 g, 5,3%; galactotetraose, 1,15 g, 6,0%; galactopentaose, 1,21 g, 6,3%; galacto-hexaose, 4,26 g, 22,1%; galacto-heptaose, 2,11 g, 11%; galacto-octaose, 1,91 g, 9,9%; e galactononaose, 0,08 g, 0,4%. EXEMPLO 3 A uma solução de complexo trióxido de enxofre-piridina (0,8 g) (Aldrich) em DMF recém-destilada (1 ml) a 80°C, foi adicionada em gotas uma solução de manopentaose (2c) (0,1 g) em piridina seca (3 ml), e o todo foi aquecido a 80°C por mais 90 minutos. O sobrenadante foi decantado enquanto ainda quente, e o resíduo pegajoso foi lavado integralmente com metanol (2 ml) três vezes. Depois do metanol residual ser decantado, o produto foi dissolvido em água (5 ml) e neutralizado (até pH ~6) com acetato de bário (cerca de 0,4 g em 2 ml de água) com agitação vigorosa. Depois de centrifugação (3000 x g), o líquido sobrejacente foi decantado 20 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ e retido, e a pelete de sulfato de bário precipitada foi lavada integralmente com água (3 x 10 ml) . O liquido sobrejacente retido e liquido das lavagens foram combinados e colocados numa coluna (1,0 x 14 cm) de resina de troca catiónica DOWEX 50W-X8-400 (forma de H+) . A coluna foi eluida com água, até o eluato ser neutro. O eluato (~50 ml) foi agitado e neutralizado (até pH ~7) com acetato de sódio (0,7 g). A solução foi diluída com acetona (200 ml) e centrifugada (1750 x g) para separar o produto. A pelete foi finamente pulverizada através de trituração sob metanol, e a seguir agitada enquanto ainda sob metanol, e depois filtrada. O sólido foi lavado várias vezes com metanol, para obter o composto puro (sem sais inorgânicos) (0,2 g; 66%). O produto não estava contaminado com iões de bário (por micro-análise e ionização por chama) nem com azoto (micro-análise).

Foi observado que o produto, manopentaose sulfatada, tinha 11 de 17 possíveis posições sulfatadas. Obtido: C, 14,2; H, 3,0; S, 14,1; Na, 7,3. CsoHeoOsgSuNas. 36H20 requer: C, 14,1; H, 5,2; S, 13,8; Na, 7,2%. Os valores de azoto e bário foram de 0% obtido e 0% esperado. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2 A uma mistura de complexo de trióxido de enxofre-piridina (Aldrich Chemical Company) (4 g) em DMF seca (5 ml), foi adicionada piridina seca (10 ml) sob uma atmosfera de azoto seco. Essa mistura foi aquecida até 50°C e agitada rapidamente, enquanto gluco-hexaose (4d) (0,5 g), isolada pelo método descrito no Exemplo de Referência acima, foi adicionada numa só adição. Foi adicionada piridina adicional (5 ml), e a mistura foi então aquecida, com agitação contínua, a 80°C por 90 minutos. A mistura reaccional foi então mantida a 4°C por toda a noite. O líquido foi decantado do vaso reaccional, foi adicionado metanol (3 ml), e a massa semi-sólida foi despedaçada e misturada integralmente com o metanol. Depois de sedimentação, o metanol foi decantado, e este procedimento foi repetido. Foi adicionada água (5 ml) ao sólido remanescente, e a solução resultante foi colocada num tubo de ensaio de 50 ml. O vaso reaccional foi enxaguado com mais água (5 ml), a qual foi combinada com a primeira solução. A solução resultante foi ajustada a um pH de cerca de 7-8 com NaOH a 40%, após o que foi adicionado metanol (40 ml). A solução nublada resultante 21 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ foi centrifugada (3000 χ g) por 25 minutos, e a solução límpida foi decantada do material precipitado. O sólido remanescente foi dissolvido outra vez em água (10 ml), foi adicionado metanol (40 ml), e o tubo foi centrifugado tal como antes. Depois da decantação do solvente sobrejacente límpido, o sólido foi dissolvido em água (10 ml) e eluído através de uma coluna de dessalinação em gel P2 (2,5 cm x 250 cm; gel P2 de grau fino - BioRad), para obter o sal de sódio esperado do derivado sulfatado de 1,6-glico-hexaose. EXEMPLO 4

Embora a síntese de homopolímeros de hexose esteja descrita nos Exemplos 1 e 2 e no Exemplo de Referência 1, normalmente é extremamente difícil sintetizar a maior parte das estruturas oligossacarídicas. Assim, uma abordagem mais simples consiste em sulfatar os oligossacáridos de estrutura definida a partir de fontes naturais. Os oligossacáridos de produtos naturais usados neste exemplo eram de duas classes. A primeira classe continha oligossacáridos que não precisavam de mais degradação e fraccionamento. Os exemplos dessa classe são maltose, rafinose e estaquiose (apenas para referência). A segunda classe consistia em oligossacáridos obtidos a partir de polissacáridos de ocorrência natural que foram parcialmente degradados enzimática ou quimicamente, e fraccionados por tamanhos. Os exemplos desta classe são os oligossacáridos derivados de amilose, condroitina e dextrano (apenas para referência) e o fosfato de manopentaose da levedura Pichla holstii. A maltose, a rafinose e a estaquiose foram adquiridas a Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. A maltotriose, a maltotetraose, a maltopentaose, a malto-hexaose e a malto-heptaose foram obtidas a Seikagaku, Tokyo, Japão, e representam os oligossacáridos purificados a partir de materiais digeridos por amilase limitados do homopolímero de glicose ligado em al-4, amilose. Os tetra-, hexa- e octassacáridos de condroitina foram purificados através de fraccionamento por filtração em gel de um material digerido por hialuronidase de testículo de bovino de condroitina-6-sulfato, tal como descrito anteriormente (32). As ciclo-hexa-hepta- e octa-amiloses foram obtidas da Sigma. Esses oligossacáridos podem ser sulfatados tal como descrito no Exemplo de Referência 2. 22 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ A título de exemplo de referência, o sulfato de malto-hexaose foi preparado da maneira a seguir. A uma solução de complexo trióxido de enxofre-piridina (4,0 g) (Aldrich) em DMF recém-destilada (5 ml) a 80°C, foi adicionada em gotas uma solução de malto-hexaose (0,5 g) em piridina seca (15 ml), e o todo foi aquecido a 80°C por mais 90 minutos. O sobrenadante foi decantado enquanto ainda quente, e o resíduo pegajoso foi lavado integralmente com metanol (10 ml) três vezes. Depois do metanol residual ter sido decantado, o produto foi dissolvido em água (15 ml) e neutralizado (até pH ~6) com acetato de bário (cerca de 2,0 g em 10 ml de água) com agitação vigorosa. Depois de centrifugação (3000 x g) , o liquido sobrejacente foi decantado e retido, e a pelete de sulfato de bário precipitada foi lavada integralmente com água (3 x 10 ml) . O liquido sobrejacente retido e o líquido das lavagens foram combinados e colocados numa coluna (2,5 x 14 cm) de resina de troca catiónica DOWEX 50W-X8-400 (forma de H+) . A coluna foi eluída com água, até o eluato ser neutro. O eluato (-250 ml) foi agitado e neutralizado (até pH -7) com acetato de sódio (3,5 g). A solução foi diluída com acetona (1 L) e centrifugada (1750 x g) para separar o produto. A pelete foi finamente pulverizada através de trituração sob metanol, e a seguir foi agitada enquanto ainda sob metanol, e depois filtrada. O material filtrado foi lavado várias vezes com metanol, para obter o composto puro (sem sais inorgânicos) (0,88 g; 55%). O produto não estava contaminado com iões de bário (determinado através de micro-análise e ionização à chama) nem com azoto (micro-análise) .

Foi observado que este produto tinha 14 de 20 possíveis posições sulfatadas. Obtido: C, 13,9; H, 2,2; S, 14,3; Na, 6,7. C36H71073Si4Na9. 45H2O requer: C, 13,8; H, 5,1; S, 14,3; Na, 6,6%. Os valores de azoto e bário foram 0,32 e 0%, obtidos, respectivamente, e 0% esperado de cada.

Os dados de 1H RMN (300 MHz - Gemini 300; referenciados a acetona, 2,25 ppm a campo baixo relativamente a TMS); para o sulfato de malto-hexaose acima indicaram que 14 de 20 possíveis posições estavam sulfatadas. Isto foi determinado a partir dos desvios químicos dos hidrogénios centrados em torno de 4,15 ppm (integrando para 20 H) versus aqueles centrados em torno de 4,4 ppm (integrando para 16 H) . Pode-se assumir que todos os grupos OH primários, ou seja, aqueles na posição 6, 23 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ serão sulfatados, uma vez que esta é a posição menos estereoquimicamente impedida. Também se pode assumir que nos resíduos de açúcar internos vai ser sulfatada apenas uma outra posição. Cada um dos resíduos de açúcar terminais, em adição ao da posição 6, terá duas outras posições sulfatadas. 0 fosfato de manopentaose foi preparado a partir do exopolissacárido produzido pela levedura diplóide Pichia holstii (estirpe BRRL Y-2448, anteriormente Hansenula holstii). 0 método para o crescimento de P. holstii e o isolamento do fosfato de manopentaose foi baseado no descrito anteriormente (33, 34). Em resumo, o exopolissacárido bruto foi isolado de sobrenadantes de cultura da levedura crescida aerobicamente na forma de um sal de potássio por precipitação com etanol. Foi então usada hidrólise ácida para libertar o fosfato de manopentaose do núcleo de monoéster de fosfomanano (PPME) do exopolissacárido. 0 PPME e o fosfato de manopentaose foram então separados um do outro na forma de sais de bário por precipitação diferencial com etanol e a seguir por filtração em gel. 0 oligossacárido tem a estrutura Ρ-6-Man-a-(1 —► 3 ) Man-α- (1 ->3 ) -Man-a- (1 —* 3 ) -Man-a- (1 —► 2 ) -Man (34) . 0 sulfato do fosfato de manopentaose de levedura (33, 34) isolado do exopolissacárido de levedura foi preparado da maneira seguinte. Uma suspensão de fosfato de manopentaose de levedura (0,09 g) em DMF (2 ml) e piridina (3 ml) foi adicionada a uma solução de complexo trióxido de enxofre-piridina (0,8 g) (Aldrich) em DMF (1 ml) . A mistura foi aquecida a 80°C por 2 horas. O sobrenadante foi decantado enquanto ainda quente, e o resíduo pegajoso foi lavado integralmente com metanol (2 ml) três vezes. Depois do metanol residual ser decantado, o produto foi dissolvido em água (5 ml) e neutralizado (até pH ~6) com acetato de bário (cerca de 0, 7 g em 5 ml de água) com agitação vigorosa. Depois de centrifugação (3000 x g), o líquido sobrejacente foi decantado, e a pelete de sulfato de bário precipitada foi lavada integralmente com água (3 x 10 ml). O líquido sobrejacente e os líquidos de lavagem foram combinados e colocados numa coluna (2,5 x 14 cm) de resina de troca catiónica DOWEX 50W-X8-400 (forma de H+) . A coluna foi eluída com água, até o eluato ser neutro. O eluato (cerca de 50 ml) foi agitado e neutralizado (até um pH 7) com acetato de sódio (cerca de 0,4 g) . A solução foi diluída com acetona (150 ml) 24 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ e centrifugada (1750 χ g) para separar o produto. A pelete foi finamente pulverizada através de trituração sob metanol, e a seguir agitada enquanto ainda sob metanol, e depois filtrada. O sólido foi lavado várias vezes com metanol, para obter o fosfato de manopentaose de levedura sulfatado (0,18 g) . O produto não estava contaminado com iões de bário (determinado através de micro-análise e ionização à chama) nem com azoto (micro-análise).

Foi observado que este produto tinha 10 de 16 possíveis posições sulfatadas. Obtido: C, 15,35; H, 2,7; P, 1,2; S, 13,7; Na, 8,5. C3oH4i059PSioNa9. 25H2O requer: C, 15,3; H, 3,5; P, 1,3; S, 13,6; Na, 8,8%. Os valores de azoto e bário foram 0,16% e 0% obtidos, respectivamente, e 0% esperado para cada um.

Os oligossacáridos de 1,6-a-glicose foram preparados por hidrólise ácida de dextrano (peso molecular médio de 71 000; Sigma Chemical Co.). Assim, o dextrano (5 g) foi dissolvido em água destilada (100 ml), e essa solução foi ajustada a pH 1,8 com ácido clorídrico 1 Μ. A mistura foi mantida em refluxado (100°C) por 48 horas. A mistura foi seca sob pressão reduzida e completada até 100 ml com água destilada, e seca uma segunda vez sob pressão reduzida. Etanol absoluto (100 ml) foi adicionado ao resíduo, e evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi completado até 4 ml com água destilada e aplicado a uma coluna de cromatografia com camisa de água de 5 x 90 cm contendo gel de exclusão por tamanhos P2 de grau fino (BioRad). A coluna tinha sido empacotada, pré-aquecida e eluída a 60°C por dois dias antes de ser usada. Depois da adição da mistura de oligossacáridos de 1,6-a-glicose, a coluna foi mantida a 60°C e eluída com água (1 ml/min.) . Os produtos eluídos da coluna foram identificados na forma de picos através de refractometria diferencial, e as fracções foram recolhidas de modo correspondente. Dessa maneira, foram recolhidas as fracções correspondentes às áreas sob picos separados. Cada uma destas fracções foi novamente cromatografada numa coluna de gel P2 idêntica a 60°C e eluída com água a um caudal de 0,5 ml/min. Assim, a título de exemplo, a fracção identificada como correspondente a 1,6-a-glico-hexaose (0,19 g) foi novamente cromatografada para obter um pico central principal com um ressalto de cada lado. O produto eluído no pico central foi isolado removendo a água 25 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ sob pressão reduzida, para obter (0,16 g) de material, o qual novamente cromatografado numa coluna de gel P2 idêntica a 60°C a um caudal de 0,3 ml/min. Dessa maneira, foi obtida a glico-hexaose (0,14 g) (electropulverização M+ = 990). De maneira semelhante, foram isoladas a 1,6-a-glicotriose, a 1,6-cx-glicotetraose (0,21 g) e a 1,6-a-glicopentaose (0,17 g). EXEMPLO 5

A. MATERIAIS E MÉTODOS

Actividade Anticoagulante de Oligossacáridos Sulfatados A actividade anticoagulante de cada oligossacárido sulfatado foi determinada tal como descrito anteriormente (35), usando os procedimentos do tempo de trombina e do tempo de tromboplastina parcial activada. A actividade de cada preparação foi comparada com um controlo de heparina, e a actividade anticoagulante foi expressa como uma percentagem da actividade da heparina.

Análise de Angiogénese Humana O método de análise usado está descrito no Pedido Internacional de Patente PCT/AU95/00105, cuja divulgação está aqui incorporada a titulo de referência. Vasos sanguíneos, com cerca de 1 a 2 mm de diâmetro e 2 a 5 cm de comprimento, foram excisados da superfície de placentas humanas dentro de seis horas após o nascimento. Os vasos foram colocados em BSS de Hank contendo 2,5 mg/ml de fungizona e cortados em fragmentos de 1 a 2 mm de comprimento usando fórceps de dissecção finos e tesoura de iridectomia. Foram removidos os coágulos residuais dos fragmentos de vasos, e estes foram mergulhados em BSS de Hank antes do uso. A dissecção e o seccionamento dos vasos foram realizados com a ajuda de uma lâmpada ampliadora (Maggylamp, Nwebound, Balmain, NSW, Austrália). Foram obtidas respostas angiogénicas semelhantes de vasos sanguíneos de origem venular e arterial, porém, para cada análise, foram usados fragmentos de vaso de apenas um vaso.

As análises de angiogénese foram feitas em placas de cultura de 24 ou 28 poços (Costar, Cambridge, MA) . No formato de 24 poços, 30 μΐ de trombina bovina (50 unidades NIH/ml em 26 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ

NaCl 0,15 Μ; Sigma Chemical Co., St Louis, MO) foram adicionados a cada poço, seguidas de 1,0 ml/poço de fibrinogénio bovino a 3 mg/ml (Sigma) em Meio 199. A trombina e o fibrinogénio foram misturados rapidamente e um fragmento de vaso foi colocado rapidamente no centro do poço antes da formação de coágulo. Normalmente, a formação de gel de fibrina ocorria em 30 segundos, e o fragmento de vaso foi deixado suspenso no gel. Depois da formação do gel, foram adicionados 1,0 ml/poço de Meio 199 suplementado com soro fetal de bezerro (FCS) a 20%, 0,2 mg de ácido ε-aminocapróico, L-glutamina e antibióticos (gentamicina e fungazona) . No formato de 48 poços, todos os volumes dos reagentes foram usados pela metade. Os vasos foram cultivados a 37°C num ambiente humidificado por 14 a 21 dias, sendo que o meio era trocado duas vezes por semana. A angiogénese foi quantificada através de análise de imagem em computador, usando o software NIH Image, das imagens digitais das culturas obtidas com uma câmara digital Dycam montada num microscópio invertido (Olympus, Tokyo, Japão).

Análise de Heparanase A análise da heparanase é baseada na observação de que a proteína sérica, glicoproteína rica em histidina (HRG), se liga às cadeias de sulfato de heparano e mascara o local de clivagem por heparanase. Com base na verificação de que o sulfato de heparano clivado com heparanase não consegue ligar-se à HRG, foi desenvolvida uma análise de heparanase que envolve a digestão de cadeias de sulfato de heparano marcadas com 3H, com heparanase, a ligação de sulfato de heparano digerido a contas acopladas a HRG, e a medição do marcador 3H não ligado. Com o aumento da digestão do substrato, uma quantidade crescente de marcador 3H não consegue ligar-se às contas de HRG. Assim, este método representa um procedimento simples e rápido para medir a actividade de heparanase em extractos de tecido e para determinar a inibição de heparanase por vários compostos.

Inicialmente, o sulfato de heparano do intestino de bovino (Mr média 32 kDa) foi N-desacetilado parcialmente por aquecimento em hidrato de hidrazina (36) e foi reacetilado com anidrido acético marcado com 3H. HRG de galinha, purificada pelo método de Rylatt et al. (1981) (37), foi acoplada a 27 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ

Sepharose 4Β activada por CNBr (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante. A actividade de heparanase de plaquetas humanas foi determinada por incubação (37°C, 30 min.) de heparanase de plaquetas humanas purificada (que tinha revelado ter a mesma actividade em relação a sulfato de heparano que a actividade de heparanase presente em linhagens celulares de carcinoma humano cultivado altamente metastático HCT 116, adenocarcinoma de rato 13762 MAT e melanoma de ratinho B16) com 60 pmol de sulfato de heparano do intestino de bovino radiomarcado com 3H. A actividade foi determinada pela taxa de produção de fragmentos de sulfato de heparano menores (cerca de 5 kDa) que não estavam ligados depois da passagem da mistura de incubação (100 μΐ) através de mini-colunas de HRG-Sepharose (200 μΐ) de contas empacotadas) que retinham o substrato não clivado e parcialmente clivado maior.

Nas análises de inibição de heparanase, foram adicionadas à enzima diferentes concentrações de inibidor antes da adição do substrato radiomarcado, sendo que o inibidor foi retido na mistura reaccional durante todo o período de incubação.

Análise da Metástase A actividade anti-metastática dos diferentes oligossacáridos sulfatados foi determinada usando o adenocarcinoma mamário de rato altamente metastático 13762 MAT (35). As células tumorais foram mantidas in vitro como descrito anteriormente (35). 334 ratos Fisher fêmeas (10 a 13 semanas de idade) foram injectados i.v. com 2 x 105 células de 13762 MAT em 0,6 ml de meio RPMI 1640 contendo FCS a 10%. No momento da injecção das células tumorais, os animais também foram injectados com 2 mg de oligossacárido sulfatado, sendo sido obtidos resultados semelhantes quer o oligossacárido fosse injectado i.v., i.p. ou subcutaneamente. Os pulmões foram removidos dos ratos 13 dias depois da injecção de células tumorais, colocados numa solução de Bouin por pelo menos 24 horas, e as metástases dos pulmões foram então determinadas num microscópio de dissecção. O número de metástases de pulmão em ratos tratados com oligossacáridos sulfatados foi comparado com aquele observado nos animais de 28 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ controlo, com um mínimo de quatro animais incluídos em cada grupo.

Efeito dos Oligossacáridos Sulfatados na Interacção FGF-Heparina/Sulfato de Heparano

Uma análise de ligação, que está descrita em detalhe noutro lado (38), foi usada para medir a ligação de aFGF e bFGF a heparina, e determinar a capacidade dos diferentes oligossacáridos sulfatados inibirem esta interacção. Em resumo, os FGF foram imobilizados nos poços de placas de PVC de 96 poços, e foi determinada a ligação da heparina radiomarcada aos FGF imobilizados. Nas análises de inibição, diluições em série de oligossacáridos sulfatados foram examinadas quanto à sua capacidade de inibir a interacção FGF-heparina. Os resultados da inibição foram expressos como a concentração de oligossacárido sulfatado necessária para inibir a ligação de heparina aos FGF imobilizados em 20% ou 50%. Heparina não marcada foi incluída como controlo em todas as experiências de inibição de ligação. A interacção FGF-sulfato de heparano foi determinada, tal como indicado anteriormente (39), medindo a ligação de fibroblastos 3T3 de BALB/c a FGF imobilizados em PVC, sendo a ligação das células detectada por coloração com Rosa de Bengala das células aderentes. Os oligossacáridos sulfatados foram examinados quanto à sua capacidade de inibir este processo de adesão celular, que é totalmente dependente das estruturas de sulfato de heparano na superfície das células 3T3 de BALB/c (39) . Os dados foram expressos como a concentração de oligossacárido sulfatado que inibiu a adesão celular em 50% (IC50).

Modelo de Inflamação de Bolsa de Ar A análise é baseada num procedimento relatado anteriormente (40) . Bolsas de ar subcutâneas foram formadas no dorso de ratinhos injectando 5 ml de ar estéril por baixo da pele de uma área barbeada entre as escápulas de um ratinho anestesiado no primeiro dia. No dia 3, a bolsa foi novamente inflada por injecção de 2,5 ml de ar. A inflamação foi induzida no dia 6 injectando directamente na bolsa 1,0 ml de tioglicolato a 56 mg/ml ou 1,0 ml de solução salina como controlo. Cerca de 17-20 horas depois da injecção de 29 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ tioglicolato, os animais foram mortos por deslocamento cervical, e o conteúdo celular das bolsas foi recuperado através da injecção de 2,5 ml de PBS gelado/FCS a 5%. Os oligossacáridos sulfatados foram testados quanto à sua capacidade de inibir a reacção inflamatória sendo injectados subcutaneamente (50 μΐ em PBS) num local separado imediatamente após a administração do tioglicolato. Foi usada prednisolona como droga anti-inflamatória de controlo, sendo injectada subcutaneamente em óleo a 25 mg/kg. O conteúdo celular total de cada bolsa foi determinado usando um Contador Coulter, e as diferentes subpopulações de leucócitos foram determinadas por citometria de fluxo imunofluorescente.

Modelo de Asma de Ratinho

Um modelo de asma de ratinho relatado anteriormente (41) foi usado para testar a capacidade dos oligossacáridos sulfatados inibirem a infiltração de eosinófilos induzida por aeroalergina (ovalbumina, OVA) nos pulmões. Os ratinhos (C57BL/6, 6 a 10 semanas de idade) foram sensibilizados através de injecção i.p. com 50 mg de OVA/ 1 mg de Alhydrogel (CSL Ltd, Parkville, Austrália) em solução salina estéril a 0. 9% nos dias 0 e 12. No dia 24, os ratinhos foram expostos a um aerossol de OVA (10 mg/ml) em solução salina a 0,9% por trinta minutos três vezes (a intervalos de 1 hora), e a seguir expostos a uma provocação semelhante nos dias 26 e 28. O aerossol foi gerado a 6 litros/min, por um nebulizador que produzia um diâmetro médio de partícula de 39 pm, numa câmara fechada de 800 cm3. No dia 29, os ratinhos foram mortos por deslocamento cervical. As traqueias foram canuladas e os lúmenes das vias aéreas foram lavados com 4 x 1 ml de solução salina a 0,9% contendo BSA (0,1% em peso/volume) a 37°C. Cerca de 0,8 ml do fluido instilado foi recuperado por lavagem. O fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) obtido de um animal foi agrupado, e os números de células foram determinados usando um hemocitómetro padrão. As células de BALF também foram centrifugadas e coradas diferencialmente com solução de May-Grunwald-Giemsa, e os eosinófilos foram identificados empregando critérios morfológicos. Os dados foram calculados como o número de eosinófilos/ml de BALF. Os oligossacáridos sulfatados foram administrados aos animais tanto sistemicamente por meio de bombas mini-osmóticas da Alzet 1. p., como através dos pulmões na forma de aerossol. As bombas 30 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ mini-osmóticas foram inseridas no dia 23, 24 horas antes da provocação com OVA, e a droga foi administrada continuamente até os animais serem sacrificados no dia 29. No caso da administração por aerossol, os ratinhos foram expostos a um aerossol de oligossacáridos sulfatados em solução salina a 0,9% por 30 min, três vezes (a intervalos de lh) nos dias 20, 25 e 27.

Modelo de Encefalomielite Auto-imune Experimental (EAE) Células do baço foram preparadas para a transferência adoptiva de EAE tal como descrito anteriormente (43). Em resumo, ratos Lewis foram sensibilizados à proteína básica de mielina, as células de baço imunes foram activadas por ConA in vitro, e 30 x 106 células efectoras de EAE activadas por ConA foram transferidas i.v. para cada recebedor. Bombas mini-osmóticas (Alzet) contendo oligossacáridos sulfatados foram implantadas subcutaneamente no momento da transferência de células e entregavam uma dose de 70 mg/kg/dia por 14 dias. A EAE clínica foi classificada de acordo com o esquema a seguir: 0, assintomático; 1, metade distai da cauda flácida ; 2, totalidade da cauda flácida; 3, ataxia, dificuldade em manter-se de pé; 4, fraqueza nos membros traseiros; e 5, paralisia dos membros traseiros.

Modelo de Doença Inflamatória do Intestino A doença inflamatória do intestino foi induzida em ratinhos através da suplementação da água de beber com 5% (p/v) de sulfato de sódio e dextrano (DSS) fornecido pela TdB Consultancy, Uppsala, Suécia. A solução foi ajustada a pH 8,0 e filtrada através de uma membrana de meio de 0,45 pm. As soluções de DSS foram recolhidas diariamente, refiltradas, e os volumes foram ajustados com material de DSS fresco. Ratinhos BALB/c machos de 6-7 semanas de idade foram rastreados pelo peso corporal, e aqueles entre 20 e 23 g foram agrupados em gaiolas com 5 ratinhos por gaiola.

Os ratinhos foram injectados com fosfato de manopentaose sulfatada (20 mg/kg/dia) ou transportador (água estéril) a intervalos de oito horas, do dia 0 ao dia 10. O volume de injecção foi normalizado para 100 μΐ e injectado subcutaneamente na nuca. 31 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ A taxa de consumo de DSS, o peso corporal e os sintomas foram classificados diariamente para todos os ratinhos. Os sintomas de diarreia e sangramento rectal foram classificados como ligeiro ou intenso e receberam valores numéricos de 1 e 4, respectivamente. A presença de muco também foi observada e incluída como pontuação de diarreia leve. A soma das pontuações de diarreia e sangramento rectal foi então dividida pelo número de animais sobreviventes nesse grupo nesse dia. A pontuação total é a soma das pontuações de diarreia e sangramento rectal.

B. RESULTADOS

Act ividade_Ant i-angiogénica_e_Anti-metas tática_de

Oligossacáridos de Ocorrência Natural Sulfatados

Uma vez sintetizada uma gama de oligossacáridos de ocorrência natural sulfatados, estes foram examinados numa gama de análises biológicas. A Tabela 1 resume os resultados obtidos com as formas sulfatadas de 12 oligossacáridos de ocorrência natural. As actividades biológicas da suramina (um composto que tem uma actividade anti-angiogénica e inibidora de heparanase moderada) (42), e da heparina também estão incluídas na Tabela 1, para comparação.

Inicialmente, foi demonstrado que todos os oligossacáridos sulfatados testados tinham uma actividade anticoagulante insignificante, ou seja, actividade de heparina <2% (Tabela 1). Esta era uma propriedade importante, uma vez que a heparina, um potente composto anti-metastático, tem uma utilidade clínica limitada para esta indicação devido à sua potente actividade anticoagulante.

Três dos oligossacáridos de ocorrência natural sulfatados foram inibidores bastante potentes da angiogénese humana, nomeadamente o fosfato de manopentaose sulfatado (derivado de P. holstii), o sulfato de maltotetraose (apenas referência) e o sulfato de malto-hexaose (apenas referência). 0 fosfato de manopentaose e a malto-hexaose foram os mais potentes destes compostos, com uma concentração inibidora em 50% de 2 pg/ml, enquanto que a maltotetraose resultou em 50% de inibição a 20 pg/ml. Um exemplo da inibição pronunciada da angiogénese induzida por 20 pg/ml de malto-hexaose está representado na Figura 1 (apenas referência). É interessante observar que a 32 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ heparina teve pouca actividade anti-angiogénica. Assim, parece provável gue oligossacáridos sulfatados de comprimento de cadeia relativamente curto sejam necessários para este tipo de actividade. Uma titulação mais completa da inibição da angiogénese pela série da maltose (apenas referência) está representada na Figura 2 e pelo fosfato de manopentaose sulfatado na Figura 3. Pode-se observar gue, com a série da maltose, o sulfato de maltose teve uma pouca actividade inibidora, enquanto que a maltotetraose e o sulfato de malto-hexaose foram inibidores bastante potentes (Figura 2).

Todas as experiências de angiogénese apresentadas na Tabela 1 envolveram a adição de oligossacárido ao meio de cultura no início da análise da angiogénese. No entanto, estudos preliminares (dados não mostrados) indicam que a adição de sulfato de malto-hexaose, depois do início da resposta de angiogénese, também pode inibir o crescimento adicional de vasos, embora a inibição mais eficaz ocorra quando o composto é adicionado no início da cultura.

Os oligossacáridos sulfatados também diferiram de modo marcante na sua actividade inibidora de heparanase, sendo os inibidores mais potentes o fosfato de manopentaose sulfatado e o sulfato de mano-hexaose, e a actividade desses dois compostos assemelhando-se à da heparina (Tabela 1). É interessante notar que estes dois compostos também são compostos anti-angiogénicos eficazes. No entanto, a inibição de angiogénese não foi correlacionada com a actividade inibidora de heparanase de muitos compostos. Por exemplo, as cicloamiloses sulfatadas eram inibidores de heparanase bastante potentes, porém fracos inibidores de angiogénese. A série da maltose (apenas referência) também foi muito informativa também com respeito ao comprimento da cadeia e à inibição de heparanase. A Tabela 3 apresenta a actividade inibidora de heparanase para a série completa da maltose, variando desde o dissacárido (maltose) ao heptassacárido (malto-heptaose). A maltose não era inibidora, a maltotriose era fracamente inibidora, a maltotetraose exibia uma actividade inibidora modesta, enquanto que os penta-, hexa- e heptassacáridos exibiam uma elevada actividade inibidora. Assim, é necessário um pentassacárido sulfatado ou superior para uma inibição óptima da heparanase. 33 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ

Muitos dos açúcares sulfatados também tinham sido testados in vivo quanto à actividade anti-metastática (Tabela 1). Em geral, há uma correlação razoavelmente boa entre a inibição da heparanase e a actividade anti-metastática. Assim, o fosfato de manopentaose sulfatado e o sulfato de malto-hexaose, os dois compostos com a mais elevada actividade inibidora de heparanase, exibem a maior actividade anti-metastática; de facto, não diferem significativamente da heparina na sua capacidade de prevenir a metástase (Tabela 1) . Dois outros compostos (apenas referência), o sulfato de ciclo-octa-amilose e o sulfato de estaquiose, também eram agentes anti-metastáticos razoavelmente eficazes, uma propriedade consistente com a sua modesta actividade inibidora de heparanase. Colectivamente, esses dados sugerem que o fosfato de manopentaose sulfatado e o sulfato de malto-hexaose possuem simultaneamente actividades anti-angiogénica, anti-metastática e inibidora de heparanase consideráveis. A actividade anti-metastática da série da maltose (apenas referência) de oligossacáridos sulfatados está apresentada com mais detalhes na Figura 4. Com o aumento do comprimento de cadeia houve um aumento estável na actividade anti-metastática dos oligossacáridos, sendo os penta-, hexa- e heptassacáridos os mais activos. Quando administrado intravenosamente numa dose de 2 mg/rato, o sulfato de maltose não teve efeito sobre a metástase (Figura 4A) , mas quando dado subcutaneamente a 4 mg/rato foi observada uma inibição significativa da metástase (Figura 4B). Experiências subsequentes revelaram que, independentemente da via de injecção (ou seja, i.v., subcutan. ou i.p.), os oligossacáridos sulfatados exibiam uma actividade anti-metastática comparável (dados não mostrados). De facto, a actividade anti-metastática do sulfato de maltose só foi observada quando foram administradas doses elevadas aos animais. Uma vez que o sulfato de maltose é um inibidor de heparanase muito fraco, esse resultado sugere que a inibição de heparanase pode não ser a única maneira pela qual os oligossacáridos sulfatados inibem a metástase tumoral, em particular quando são usadas doses elevadas dos oligossacáridos.

Cicloamiloses foram sulfatadas e incluídas no estudo como exemplos de referência, uma vez que representam 34 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ oligossacáridos não lineares. É interessante observar que estes compostos só foram modestamente activos (Tabela 1), implicando que os oligossacáridos lineares podem ser necessários para uma actividade óptima. Além disso, os oligossacáridos sulfatados mais activos foram inibidores de angiogénese, da metástase e da heparanase muito mais eficazes do que a suramina (Tabela 1), uma droga actualmente em ensaios clínicos como composto anti-angiogénico (42).

Uma vez que a actividade anti-angiogénica dos compostos nem sempre foi directamente correlacionada com a sua actividade inibidora de heparanase, parecia provável que os oligossacáridos sulfatados pudessem inibir a angiogénese por algum outro mecanismo. Tal como acima mencionado, é altamente provável que alguns oligossacáridos sulfatados possam perturbar a acção de factores de crescimento angiogénico mediante o rompimento das interacções factor de crescimento-sulfato de heparano. As análises anteriores (vide o Pedido Internacional de Patente PCT/AU95/00105) revelaram que a análise de angiogénese humana usada neste Exemplo depende bastante da acção de bFGF endógena, e num grau menor, de aFGF e VEFG. Assim, os vários oligossacáridos sulfatados foram examinados quanto à sua capacidade de agir como competidores da interacção de bFGF, aFGF e VEFG com heparina ou sulfato de heparano.

Foi verificado que, com o aumento do comprimento da cadeia, a série da maltose (apenas referência) de oligossacáridos sulfatados transformou-se em inibidores mais eficazes da interacção de bFGF e aFGF com sulfatos de heparano da superfície celular (Tabela 2), ou seja, a maltose era fracamente inibidora, enquanto que os penta-, hexa- e heptassacáridos eram os mais activos. 0 fosfato de manopentaose sulfatado também exibiu uma considerável actividade inibidora neste sistema (Tabela 2). As curvas de inibição completa para a inibição da interacção aFGF-sulfato de heparano pela série da maltose de oligossacáridos sulfatados estão apresentadas na Figura 5. Estudos adicionais revelaram que o sulfato de malto-hexaose também era um potente inibidor da ligação de heparina radiomarcada a bFGF e aFGF (dados não mostrados). 35 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ

Uma vez que ο sulfato de malto-hexaose foi um dos mais activos compostos anti-angiogénicos e anti-metastáticos, a influência do grau de sulfatação na sua actividade biológica foi examinada com alguns detalhes. Inicialmente, foi observado que, até mesmo quando alguma actividade anti-coagulante foi detectada com a malto-hexaose mais altamente sulfatada, essa actividade ainda era extremamente baixa quando comparada com a heparina (Tabela 2) . No entanto, com o aumento da sulfatação, houve um aumento estável na capacidade da malto-hexaose inibir a actividade de heparanase e a ligação de FGF a sulfato de heparano (Tabela 2). No entanto, a actividade inibidora estagnou nos dois sistemas quando a sulfatação era igual ou maior do que 85%.

Os estudos de inibição de metástase (Figura 6) também demonstraram que com graus crescentes de sulfatação o sulfato de malto-hexaose tornava-se uma droga anti-metastática mais eficaz. Em contraste, houve uma sugestão de que a malto-hexaose muito altamente sulfatada (90% a 100% sulfatada) era um inibidor menos eficaz da angiogénese (Figura 7) . Estes dados sugerem que há diferenças subtis na estrutura do oligossacárido sulfatado óptima necessário para inibir a angiogénese e a metástase. Apesar disto, foi identificada uma série de oligossacáridos sulfatados, derivados de oligossacáridos de ocorrência natural, que exibem simultaneamente potentes actividades anti-metastática e anti-angiogénica. Esses compostos são o fosfato de manopentaose sulfatado de P. holstii e os sulfatos de malto-pentaose, -hexaose e -heptaose (apenas referência).

Actividade_Ant i-angiogénica_e_Anti-metastática_de

Oligossacáridos Sintéticos Sulfatados

Os oligossacáridos sintéticos sulfatados descritos nos Exemplos 1 a 5 também foram testados quanto à sua actividade biológica. A Tabela 3 resume a capacidade dos oligossacáridos sintéticos sulfatados que contêm manose, galactose ou glicose (apenas para referência) inibirem a coagulação, a acção da heparanase e a ligação factor de crescimento-sulfato de heparano. Todos os oligossacáridos sintéticos sulfatados testados exibiram uma actividade anticoagulante insignificante. No entanto, com excepção dos trissacáridos de 36 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ manose e glicose, todos os outros oligossacáridos sulfatados eram inibidores razoavelmente eficazes da actividade de heparanase e da ligação factor de crescimento-sulfato de heparano. De facto, a conclusão geral é de que os oligossacáridos sintéticos sulfatados contendo 4-6 unidades de hexose (ou seja, D-manose, D-galactose ou D-glicose) são altamente activos nessas análises. Uma excepção é o sulfato de galactotriose, que era essencialmente tão activo quanto os outros membros da série da galactose.

Quando testados na análise de angiogénese humana, os oligossacáridos de manose sulfatados foram inibidores, embora os penta- e hexassacáridos fossem mais activos do que o tetrassacárido (Figura 8), assemelhando-se ao fosfato de manopentaose sulfatado na sua eficácia. Similarmente, os tetra-, penta- e hexassacáridos de manose sulfatados eram tão eficazes quanto o fosfato de manopentaose sulfatado como drogas anti-metastáticas (Figura 9). Os oligossacáridos sulfatados contendo galactose e o sulfato de glico-hexaose também inibiram a metástase (Figura 10), embora tendessem a ser ligeiramente menos activos do que os compostos contendo manose.

Actividade Anti-inflamatória de Oligossacáridos Sulfatados

Tal como acima mencionado, uma barreira chave à entrada de leucócitos nos locais inflamatórios é a membrana basal subendotelial. Para atravessarem essa membrana, os leucócitos têm que empregar uma bateria de enzimas degradativas (11). É de relevância particular a endoglicosidade, heparanase, que cliva as cadeias de sulfato do heparano associadas com a membrana basal e é essencial para o extravasamento de leucócitos (12, 13). De facto, tal como nos estudos de inibição da metástase (35), os polissacáridos sulfatados que inibem a actividade da heparanase são potentes inibidores da inflamação (43, 44). Com base nestas observações, seria antecipado pelos peritos na especialidade que os oligossacáridos sulfatados que eram potentes agentes anti-angiogénicos e anti-metastáticos seriam compostos anti-inf lamatórios muito eficazes. A esse respeito, são de importância particular o sulfato de malto-hexaose e o sulfato de manopentaose. Além disso, uma vez que a angiogénese está associada a doenças inflamatórias crónicas tais como artrite 37 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ reumatóide (18), a actividade anti-angiogénica desses compostos teria um valor adicional no tratamento da inflamação.

Foi obtida evidência a favor dessa previsão em vários modelos animais de inflamação. Em primeiro lugar, o sulfato de malto-hexaose, o sulfato de manopentaose e o fosfato de manopentaose sulfatado puderam inibir significativamente a inflamação na bolsa de ar induzida por tioglicolato (Tabela 4). De facto, numa experiência uma só injecção de sulfato de manopentaose foi tão eficaz quanto a prednosolona na inibição da infiltração de leucócitos, que era de natureza predominantemente neutrófila, enquanto que o sulfato de malto-hexaose era um pouco menos eficaz. Foi observada uma inibição da resposta inflamatória ainda maior quando os oligossacáridos sulfatados foram injectados em duas doses iguais com um afastamento de 6 horas.

Em segundo lugar, os oligossacáridos sulfatados foram testados quanto à sua capacidade de inibir um modelo de ratinho de asma crónica. Esse modelo é caracterizado por um influxo massivo de eosinófilos nos pulmões de ratinhos que é induzido pela provocação com aeroalergénios (41). Esta resposta inflamatória é caracteristica da asma crónica em seres humanos. Quando administrados através de bombas mini-osmóticas, o sulfato de malto-hexaose e o sulfato de manopentaose inibiram significativamente a acumulação de eosinófilos nos pulmões de ratinhos (Tabela 5) . 0 sulfato de malto-hexaose também exibiu alguma actividade anti- inflamatória quando administrado na forma de aerossol (solução a 40 mg/ml).

Em terceiro lugar, o sulfato de manopentaose e o fosfato de manopentaose sulfatado inibiram significativamente a EAE num modelo de rato da doença (Tabela 6). De facto, alguns animais tratados com os oligossacáridos sulfatados não desenvolveram sintomas da doença. Estes dados são consistentes com os estudos anteriores revelando que os polissacáridos sulfatados que inibem a actividade da heparanase podem reduzir a gravidade da EAE (43).

Por fim, o fosfato de manopentaose foi examinado quanto à sua capacidade de inibir um modelo de doença inflamatória do 38 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ intestino em ratinhos. Esse modelo, que é induzido pelo sulfato de dextrano na água de beber, induz uma colite que se assemelha à colite ulcerativa e, em menor grau, à doença de Chron. Foi verificado que, a 20 mg/kg/dia, o fosfato de manopentaose sulfatado causou uma atenuação marcante da colite aguda e também impediu a perda de peso corporal causada pela doença (Tabela 7). Os controlos nesta experiência receberam as injecções de oligossacárido sulfatado mas não o sulfato de dextrano na sua água de beber. TABELA 1

INIBIÇÃO DA ANGIOGÉNESE HUMANA, DA ACTIVIDADE DE HEPARANASE E DA METÁSTASE POR FORMAS SULFATADAS DE DIFERENTES OLIGOSSACÁRIDOS DE OCORRÊNCIA NATURAL

Composto Número de unidades sacaridicas Actividade Anticoagu- lante* (%) Concentr. Inibidora a 50% (pg/ml) Metástase (% do controlo)b Angiogénese Heparanase *Heparina Aprox. 60 100 >2000 1 20±3 Fosfato de manopentaose S04c 5 0, 2 2 2 31±3 *Rafinose S04 3 1,6 200 50 48±9 *Estaquiose S04 4 3,2 2000 12 36±4 *Maltose S04 2 0 2000 > 1000 99±9 *Maltotetraose S04 4 co o 20 10 72±9 *Malto-hexaose S04 6 1, 6 2 1,5 24±7 *Ciclo-hexa-amilose S04 6 0,4 200 8 107 + 7 *Ciclo-hepta-amilose S04 7 CO o 200 7 81±14 *Ciclo-octa-amilose S04 8 1,6 200 5 36±6 *Condroitina tetra S04 4 0 2000 >30 ND *Condroitina hexa S04 6 0, 2 2000 45 ND *Condroitina octa S04 8 ND 1000 ND ND *Suraraina - 0,1 50 8 74+8 a Actividade anticoagulante como percentagem da actividade da heparina (100%). b Percentagem do controlo da metástase ± erro padrão da média (n=4) em pulmões de ratos recebendo células de 13762 MAT i.v. e 2 mg/rato de cada oligossacárido no momento da injecção de células tumorais. Os valores sublinhados representam os compostos com o maior efeito anti- metastático.

Fosfato de manopentaose isolado da levedura Pichia holstii. ND Não determinado.

Composto de Referência 39 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ TABELA 2

INIBIÇÃO DA ACTIVIDADE DE HEPARANASE E DA LIGAÇÃO DE FACTORES DE CRESCIMENTO A SULFATOS DE HEPARANO POR FOSFATO DE MANOPENTAOSE SULFATADO E PELA SÉRIE DA MALTOSE DE OLIGOSSACÁRIDOS SULFATADOS

Oligossacárido Sulfatação3 Sulfatação Actividade IC50 (ug/ml) C sulfatado "0 Anticoagulanteb (%) Heparanase bFGF aFGF *Maltose 6/8 75 0,2 >100 >200 134 *Maltotriose 10/11 91 0,8 100 145 58,7 *Maltotetraose 11/14 79 1,6 25 65 31,5 *Maltopentaose 15/17 88 3,2 4 37,5 27 *Malto-hexaose 18/20 90 2 5 31,3 27 *Malto-heptaose 18/23 78 3,9 3 10 27 Fosfato de manopentaosed 10/16 63 0,2 5 25 22 *Malto-hexaose 3/20 15 0 >100 187 >200 *Malto-hexaose 9/20 45 0,8 50 45,6 79 *Malto-hexaose 14/20 70 0,4 20 12,5 12,5 *Malto-hexaose 17/20 85 1,7 6 5,4 10,4 *Malto-hexaose 18/20 90 2 6 5,4 18,8 *Malto-hexaose 20/20 100 3,3 5 5,4 19,7

Composto de referência a Número real de grupos sulfato ligados/número teórico máximo de grupos sulfato que podem ser acoplados a cada molécula. b Actividade anticoagulante como percentagem da actividade da heparina (100%).

Concentração de composto necessária para inibir em 50% a actividade da heparanase de plaquetas humanas, ou a ligação de células 3T3 de ratinho a aFGF/bFGF imobilizado. No caso da análise da heparanase, o valor de IC50 para a heparina foi de 2 pg/ml. d Fosfato de manopentaose isolado da levedura Pichia holstii. ND = Não determinado. 40 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ TABELA 3

INIBIÇÃO DA ACTIVIDADE DE HEPARANASE E DA LIGAÇÃO DE FACTORES DE CRESCIMENTO A SULFATOS DE HEPARANO POR FORMAS SULFATADAS DE DIFERENTES OLIGOSSACÁRIDOS SULFATADOS

Oligossacárido sulfatado Sulfatação3 Sulfatação o. 0 Actividade Anticoagulanteb (%) IC50 (ug/ml)c Heparanase bFGF aFGF Manotriose 7/11 6 4 0,3 25 ND ND Manotetraose 10/14 71 0,4 6 20 5 Manopentaose 12/17 71 0,4 4 15 5 Mano-hexaose 11/20 55 0,8 3 11 5 Galactotriose 6,6/11 60 0,7 4 25 ND Galactotetraose 8,3/14 59 1,0 3,5 9 ND Galacto-hexaose 14,5/17 72.5 0,7 3,5 11 ND *Glucotriose ND ND 0,1 30 47 ND *Gluco-hexaose 13,4/20 67 0,4 3,5 15 ND a Número real de grupos sulfato ligados/número teórico máximo de grupos sulfato que podem ser acoplados a cada molécula. b Actividade anticoagulante como percentagem da actividade da heparina (100%). c Concentração de composto necessária para inibir em 50% a actividade de heparanase de plaquetas humanas, ou a ligação de células 3T3 de ratinho a aFGF/bFGF imobilizado. No caso da análise de heparanase, o valor de IC50 para a heparina foi de 2 pg/ml. ND = Não determinado.

Composto de referência TABELA 4

EFEITO DE OLIGOSSACÁRIDOS SULFATADOS NA INFLAMAÇÃO DE BOLSA DE ARa

Tratamento Dose Infiltrado de leucócitos na bolsa de arb (% do Controlo) Experiência 1 Experiência 2 *Malto-hexaose S04 50mg/kg 76±7 44±12 Manopentaose S04 50mg/kg 57±7 16±2 Fosfato de manopentaose S04 (P. holstii) 50mg/kg ND 51±9 * Prednisolona 25mg/kg 56±14 44±3 a Inflamação na bolsa de ar induzida por injecção de triglicolato e influxo de leucócitos determinado 17 horas mais tarde. Os tratamentos com drogas foram injectados subcutaneamente no mesmo momento que o tioglicolato para a Experiência 1. Na Experiência 2, os oligossacáridos sulfatados foram injectados subcutaneamente a Oh e 7h depois da injecção de tioglicolato. b Dados apresentados como percentagem do controlo do número de leucócitos nos infiltrados da bolsa de ar ± erro padrão da média. Os controlos foram injectados com o tioglicolato mas não receberam tratamento com drogas, apenas uma injecção de solução salina. O infiltrado de leucócitos basais nas bolsas de ar que foram injectadas só com solução salina era de 9±2% daquele observado depois da injecção de tioglicolato. ND = Não determinado.

Composto de referência 41 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ TABELA 5

EFEITO DE OLIGOSSACÁRIDOS SULFATADOS NA ACUMULAÇÃO DE EOSINÓFILOS : INDUZIDA POR OVALBUMINA DE RATINHOSa (OVA) EM PULMÕES Oligossacárido sulfatado Via Dose Eosinófilos/ml de BALF (% de controlo)b *Malto-hexaose Bomba, i.p 50 mg/kg/dia 57±2 *Malto-hexaose Bomba, i.p 115 mg/kg/dia 9 ± 2 *Malto-hexaose Aerossol 10 mg/mh 98 ± 24 *Malto-hexaose Aerossol 40 mg/mlc 63 ± 23 Manopentaose Bomba, i.p 50 mg/kg/dia 63 ± 12 a Ratinhos sensibilizados a OVA e a seguir um influxo de eosinófilos de pulmão induzido pela administração em aerossol de OVA. Oligossacáridos sulfatados administrados i.p. com bombas mini-osmóticas ou através dos pulmões na forma de aerossol b Dados expressos como percentagem do controlo do número de eosinófilos em fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) ± erro padrão, sendo que os controlos são animais que foram provocados com OVA e receberam solução salina através de bombas mini-osmóticas ou através dos pulmões na forma de aerossol. c Concentração de oligossacárido sulfatado na solução de aerossol. * Composto de referência TABELA 6 EFEITO DE OLIGOSSACÁRIDOS SULFATADOS NA ENCEFALOMIELITE AUTO-IMUNE EXPERIMENTAL (EAE) TRANSFERIDA ADOPTIVAMENTEa

Oligossacárido sulfatadob N.Q com EAE/Total Dia médio de inicioc Gravidade da Doença (% do Controlo)d Controlo 6/6 5,5 ± 0,2 100 ± 11 Manopentaose 3/5 5,3 ± 0,3 31,5 ± 15,1 Fosfato de manopentaose (P. holstii) 4/5 5,3 ± 0,3 47,9 ± 16,4 a EAE induzida em ratos Lewis com 30 x 106 células efectoras dê EAE activadas por ConA. b Oligossacáridos sulfatados, administrados subcutaneamente através de bombas mini-osmóticas inseridas no momento da transferência das células, entregues a uma dose de 70 mg/kg/dia. c Dia médio de inicio da EAE em animais que desenvolveram a doença. d A gravidade da doença representa a pontuação clinica cumulativa de animais. 42 ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ TABELA 7 EFEITO DE FOSFATO DE MANOPENTAOSE SULFATADO EM DOENÇA INFLAMATÓRIA DO INTESTINO EM RATINHOSa

Diab Não tratado0 Tratado0 Pontuação Média da Doençad Peso Corporal (g) Pontuação Média da Doençad Peso Corporal (g) 0 0 23,1 0 22,1 1 0 23,2 0 22,1 2 0 23,6 0 22,6 3 0 23,5 0 22,5 4 0 23,3 0 21,9 5 0 23,4 0 21,9 6 0,47 23,3 0,07 22,4 7 1,40 22, 7 0,40 22,4 8 2,47 22,1 0,40 22,3 9 2,87 21, 4 0,67 22,2 10 2,00 20, 7 0,93 22,1 a Doença inflamatória do intestino induzida pela administração de sulfato de dextrano na água de beber. b Dias depois do início da administração de sulfato de dextrano. c Os animais não tratados receberam injecções de transportador três vezes ao dia, enquanto que os animais tratados receberam injecções de fosfato de manopentaose sulfatado três vezes ao dia numa dose de 20 mg/kg/dia. d A pontuação média da doença representa a soma de pontuações de diarreia e sangramento rectal para os animais em cada ponto no tempo.

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Lisboa, 2010-07-02

Claims (11)

1. ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Oligossacárido sulfatado em que o oligossacárido tem a fórmula geral II: Ry (Ry)n Ry (II) em que cada grupo Ry é igual, e cada um representa uma unidade monossacaridica, que é manose ou galactose, estando as unidades monossacaridicas adjacentes ligadas por ligações glicosidicas l->3, 1^4 e/ou l->6; e n é um número inteiro de 1 a 6.
2. 2. Oligossacárido sulfatado, de acordo com a reivindicação 1, em que n é de 1 a 4, de preferência 3 ou 4.
3. 3. Oligossacárido sulfatado, de acordo com a reivindicação 1, em que o oligossacárido é um oligossacárido de ocorrência natural.
4. 4. Oligossacárido sulfatado, de acordo com a reivindicação 1, em que o oligossacárido é preparado por degradação enzimática ou química de um polissacárido de ocorrência natural.
5. 5. Composição farmacêutica ou veterinária que compreende pelo menos um oligossacárido sulfatado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um seu transportador ou diluente farmacêutica e veterinariamente aceitáveis.
6. 6. Pelo menos um oligossacárido sulfatado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, para uso num método de tratamento do corpo humano ou animal.
7. 7. Pelo menos um oligossacárido sulfatado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 para uso em tratamento anti-angiogénico, anti-metastático e/ou anti-inflamatório de um paciente humano ou de outro paciente animal de sangue quente com necessidade desse tratamento.
8. 8. Pelo menos um oligossacárido sulfatado de acordo com a reivindicação 7, em que o tratamento compreende o ΕΡ Ο 837 683/ΡΤ 2/2 tratamento de uma doença dependente de angiogénese, incluindo a angiogénese associada com o crescimento de tumores sólidos, retinopatias proliferativas e artrite reumatóide.
9. 9. Pelo menos um oligossacárido sulfatado de acordo com a reivindicação 7, em que o tratamento compreende o tratamento de doenças e condições inflamatórias nas quais a actividade inibidora de heparanase inibe a infiltração de leucócitos, incluindo doenças inflamatórias crónicas tais como artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes mellitus dependente de insulina, doenças tais como colite ulcerativa e doença inflamatória do intestino de Crohn, rejeição de aloenxertos e asma crónica.
10. 10. Uso no fabrico de um medicamento para o tratamento anti-angiogénico, anti-metastático e/ou anti-inflamatório de um paciente humano ou outro paciente animal de sangue quente, de um oligossacárido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
11. 11. Processo para a produção de um oligossacárido sulfatado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, processo esse que compreende a degradação enzimática ou química de um polissacárido de ocorrência natural. Lisboa, 2010-07-02