PL184357B1 - Siarczanowany oligosacharyd i zawierająca go kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Abstract

1. Siarczanowy oligosacharyd o wzorze (I): R1 -(Rx)n-R2 w którym R 1 i R2 oraz wszystkie Rx oznaczaja heksozowa jednostke monosacharydowa i wszystkie one m oga byc takie same lub rózne, przy czym sasiednie jednostki monosacharydo we sa polaczone wiazaniami glikozydowymi 1 — 2,1 — 3,1 — 4 i/lub 1 — 6, a n oznacza liczbe calkowita od 1 do 6, pod warunkiem, ze oligosacharyd ten nie jest zwiazkiem zawierajacym 1 — 4 zwiazane reszty glukozowe ani zwiazkiem zawierajacym 1 — 2 zwiazane reszty fruktozowe. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest siarczanowany oligosacharyd oraz zawierająca go kompozycja farmaceutyczna lub weterynaryjna przeznaczona do leczenia antyangiogenetycznego, przeciwprzerzutowego i przeciwzapalnego.

Siarczany heparanu należą do rodziny polisacharydów zwanych glikozoaminoglikanami. Występują one u większości zwierząt wielokomórkowych, rozmieszczone są wszechstronnie, a do ekspresji ich dochodzi na powierzchni komórki i w pozakomórkowych macierzach (ECM) większości tkanek (1,2). Siarczany heparanu występująna ogół jako proteoglikany. Zanotowano znaczący postęp jeśli chodzi o sekwencjonowanie i klonowanie polipeptydów rdzenia cząsteczki. Jak dotychczas, na przykład, na powierzchni komórki zidentyfikowano co najmniej osiem różnych polipeptydów rdzenia proteoglikanu siarczanu heparanu (HSPG) (3).

Początkowo sądzono, że HSPG odgrywają przeważnie rolę strukturalną na powierzchni komórki i w pozakomórkowych macierzach (ECM). Jednakże łańcuchy siarczanu heparanu wykazują znaczną rozmaitość strukturalną (2,4), co sugeruje, że mogą one dostarczać ważną informację sygnałową dla licznych procesów biologicznych. Toteż, aczkolwiek łańcuchy siarczanu heparanu początkowo syntetyzowano jako proste, występujące przemiennie reszty glukuronozylowe i N-acetyloglukozaminylowe, połączone ze sobą wiązaniami β1-4 i α l-4, to jednak istnieje wiele dalszych modyfikacji. Polisacharyd zostaje N-deacylowany i N-siarczanowany, po czym ulega C5-epimeryzacji jednostek glukuronozylowych do jednostek iduronozylowych oraz rozmaitym sposobom O-siarczanowania reszt uronozylowych i glukozaminylowych. Taka zmienność tych modyfikacji umożliwia powstanie około trzydziestu różnych sekwencji disacharydowych i w przypadku rozmieszczenia się ich w rozmaitym porządku wzdłuż łańcucha siarczanu heparanu może, teoretycznie, dojść do utworzenia się olbrzymiej ilości różnych struktur siarczanu heparanu. Z tego punktu widzenia heparyna, będąca polisacharydem przeciwkrzepliwym, obecna jedynie w ziamistościach komórek tucznych, przedstawia sobą ekstremalną postać siarczanu heparanu, w przypadku której doszło do zmaksymalizowania procesów epimeryzacji i siarczanowania. Większość siarczanów heparanu zawiera krótkie odcinki wysokozsiarczanowanych reszt, złączonych ze sobą poprzez względnie długie odcinki jednostek niezsiarczanowanych.

Istnieje obecnie oczywisty dowód na to, że siarczany heparanu odgrywajądecydującąrolę w wielu różnych procesach biologicznych (2-4). W szczególności mogą one być czynne jako ligandy dla cząsteczek adhezji zaangażowanych w interakcjach komórka-komórka (5, 6), mogą brać udział w interakcjach komórka-ECM (5, 6) i mogą oddziaływać jako niezbędne receptory powierzchni komórki dla czynników wzrostu, takich jak zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) (7, 8) i naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF) (9). HSPG są także kluczowymi komponentami błon podstawnych stanowiących główną barierę dla migracji komórek (10). Bariery w postaci błon podstawnych można przerwać jedynie wtedy, gdy komórki dostarczą szeregu enzymów degradacyjnych (11), łącznie z endoglikozydazą, nazywaną heparanazą, która rozszczepia łańcuchy siarczanu heparanu (12, 13).

Wykazano, że w wielu procesach biologicznych, w których biorą udział siarczany heparanu, zachodzi rozpoznawanie unikalnych struktur siarczanu heparanu, przy czym decydujący wpływ na przebieg tych procesów ma pozycja siarczanów w łańcuchu polisacharydowym (3). I tak, na przykład, zademonstrowano, że określone sekwencje siarczanu heparanu są rozpoznawane przez kwaśne i zasadowe FGF (14-16) i rozszczepiane przez heparanazy. W oparciu o te obserwacje, celem twórców niniejszego wynalazku stało się zsyntetyzowanie siarczanowanych oligosacha4

184 357 rydów blokujących rozpoznawanie siarczanu heparanu przez czynniki wzrostowe i hamujących rozszczepiania siarczanów heparanu przez heparanazy. Jeśli chodzi o blokowanie czynników wzrostowych, wzięto pod uwagę to że szczególnie skuteczne mogą być związki o małej masie cząsteczkowej imitujące siarczan heparanu, ponieważ obecnie sądzi się, że siarczany heparanu powierzchni komórki pośredniczą przy sieciowaniu czynników wzrostowych związanych z ich receptorami (17). Ponadto siarczanowane oligosacharydy powinny być skutecznymi inhibitorami heparanazy, a to w wyniku ich działaniajako nierozszczepialnych substratów tego enzymu.

Siarczanowane oligosacharydy o aktywności polegającej na hamowaniu działania czynnika wzrostowego znaj dują szereg zastosowań klinicznych. Czynniki wzrostowe wiążące siarczan heparyny/heparanu, takie jak bFGF i VEGF, są silnymi induktorami angiogenezy- (18). U osób dorosłych angiogeneza jest przypadkiem zdarzającym się stosunkowo rzadko, jedynie podczas leczenia ran. Jednakże istnieje u osób dorosłych pewna liczba „chorób angiogenezozależnych, w przypadku których rola angiogenezy jest decydująca (18-20). Najważniejsze są te przypadki, w których powstawanie nowych naczyń jest stowarzyszone z rozwojem guzów litych, retinopatiami rozrostowymi i zapaleniem stawów reumatoidalnym. W leczeniu tych zależnych od powstawania nowych naczyń chorób będą szczególnie użyteczne siarczanowane oligosacharydy, które blokują działanie kluczowych angiogenetycznych czynników wzrostowych, takich jak bFGF i VEGF.

Podobnie, szereg zastosowań klinicznych znajdują siarczanowane oligosacharydy, które hamują działanie heparanazy. Podśródbłonkowa błona podstawna stanowi główną fizyczną barierę dla przechodzenia komórek śródbłonka, komórek nowotworowych i leukocytów przez ścianę naczyń krwionośnych. Enzym heparanaza, w kombinacji z szeregiem enzymów proteolitycznych (takich jak, na przykład, plazmina, metalopropteinazy macierzowe) odgrywa zasadniczą rolę w degradacji błony podstawnej w wyniku zaatakowania komórek (11-13, 21). Toteż dzięki zapobieganiu degradacji błony podstawnej, siarczanowane oligosacharydy o aktywności inhibitorów heparanazy powinny przejawiać aktywność przeciwprzerzutową i przeciwzapalną. Oprócz tego, mogą one hamować postęp wczesnych stadiów angiogenezy. Zastosowanie siarczanowanych oligosacharydów, które jednocześnie hamują działanie angiogenetycznego czynnika wzrostowego i działanie heparanazy, może okazać się korzystne w licznych sytuacjach klinicznych, takich jak, na przykład, leczenie wysokoprzerzutowych guzów litych i rumatoidalnego zapalenia stawów.

We wcześniejszym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/AU88/00017 (Międzynarodowa Publikacja WO 88/05301) ujawniono zastosowanie siarczanowanych polisacharydów, takich jak heparyna i heparyna modyfikowana, fukoidyna, siarczan pentozanu, siarczan dekstranu i karagenina X, które blokują lub hamują aktywność heparanazy, w leczeniu przeciw przerzutowym i/lub przeciwzapalnym chorego człowieka lub zwierzęcia.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki US 5 034 520 (Lormeau i wsp.) ujawniono oligosacharydy otrzymywane z heparyny. Takie oligosacharydy zawierają zatem raczej reszty glukozoaminowe czy też reszty kwasu glukuronowego/kwasu iduronowego, które to reszty stanowią części składowe heparyny, niż heksozy per se.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki US 5 447 919 (Hosang i wsp.) i w jego ekwiwalentach ujawniono sposób otrzymywania siarczanowanej rafinozy i siarczanowanej stachiozy, które uważa się za nadające się do stosowania w leczeniu zaburzeń miażdżycowych i do zapobiegania nawrotom zwężenia po interwencji chirurgicznej. Jednakże w dokumencie tym nie ma żadnego ujawnienia na temat zastosowania siarczanowanych oligosacharydów do hamowania angiogenezy, przerzutów nowotworu lub zmian zapalnych..

Europejski opis patentowy nr EP 0338092 A1 na rzecz Chgai Seiyaku KK ujawnia zastosowanie oligosacharydów zawierających jedynie 1 — 4 związane reszty glukozowe jako środek przeciw wirusowi HIV. Dokument ten również nie ma żadnego powiązania z zastosowaniem siarczanowanych oligosacharydów do hamowania angiogenezy, przerzutów nowotworu lub zmian zapalnych.

184 357

Z kolei międzynarodowa publikacja WO 95/09637 na rzecz Glycomed Inc. dotyczy oligosacharydów zawierającychjako rdzeń siarczanowaną maltozę, do której mogą być przyłączone pozostałe reszty glukozowe. A zatem ujawnione w tym dokumencie oligosacharydy zawierają jedynie 1——4 związane reszty glukozowe. W publikacji tej nie ma żadnej sugestii na temat tego, że inne siarczanowane oligosacharydy mogłyby być stosowane do inhibitowania angiogenezy.

W toku prac badawczych prowadzących do niniejszego wynalazku, twórcy wynalazku wytworzyli siarczanowane oligosacharydy przy wykorzystaniu albo oligosacharydów występujących w przyrodzie albo oligosacharydów wytworzonych całkowicie na drodze syntezy, obejmujących homopolimery utworzone z heksozy. Wykazano, że niektóre z tych związków są silnymi inhibitorami angiogenezy, przerzutów nowotworów i stanów zapalnych u człowieka. Uzyskane dane są zgodne z wynikami otrzymanymi dla siarczanowanych oligosacharydów dających efekty biologiczne polegające na hamowaniu działania angiogenetycznego czynnika wzrostowego i/lub działania heparanazy. Otrzymano także pewne siarczanowane oligosacharydy, które są silnymi inhibitorami zarówno angiogenezy, jak i działania heparanazy.

Według wynalazku siarczanowany oligosacharyd posiada wzór (I):

R l-(R-x)ii-R-2 w którym R, i R₂ oraz wszystkie R_x oznaczają heksozową jednostkę monosacharydową i wszystkie one mogą być takie same lub różne, przy czym sąsiedniejednostki monosacharydowe są połączone wiązaniami glikozydowymi 1—2, 1—3, 1—4 i/lub l—> 6, a n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, pod warunkiem, że oligosacharyd ten nie jest związkiem zawierającym 1 — 4 związane reszty glukozowe ani związkiem zawierającym 1 — 2 związane reszty fruktozowe. Korzystnie n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 4, korzystniej 3 lub 4. Oligosacharyd ten korzystnie zawiera heksozowe jednostki monosacharydowe wybrane z grupy obejmującej mannozę, altrozę, allozę, talozę, galaktozę, idozę i gulozę.

Korzystnie stanowi go oligosacharyd o wzorze (II):

R_v-(Rv)_n-Ry w którym wszystkie grupy o symbolu R_y są takie same i wszystkie one oznaczają heksozowe jednostki monosacharydowe, przy czym sąsiednie jednostki monosacharydowe sąpołączone wiązaniami glikozydowymi 1—3,1 — 4 i/lub 1 — 6, a n oznacza liczbę całkowitaod 1 do 6, pod warunkiem, że oligosacharyd ten nie jest związkiem zawierającym 1 — 4 związane reszty glukozowe. Korzystnie n oznacza liczbę całkowitąod 1 do 4, korzystniej 3 lub 4. Oligosacharyd ten korzystnie zawiera heksozowe jednostki monosacharydowe wybrane z grupy obejmującej mannozę, altrozę, allozę, talozę, glaktozę, idozę i gulozę; korzystniej jako heksozowe jednostki monosacharydowe zawiera mannozę lub galaktozę.

Oligosacharyd według wynalazku stanowi oligosacharyd otrzymywany na drodze enzymatycznej lub chemicznej degradacji polisacharydu występującego w przyrodzie. Korzystnie stanowi go oligosacharyd pochodzący od chondroityny lub egzopolisacharyd wytwarzany przez diploidalne drożdże Pichia holstii. Korzystnie stanowi go oligosacharyd wybrany z grupy obejmującej tetra-, heksa- i oktasacharydy pochodzące od chondroityny. Korzystnie stanowi go fosforan mannopentaozy pochodzący z drożdży Pichia holstii.

Według wynalazku kompozycja farmaceutyczna lub weterynaryjna przeznaczona do leczenia antyangiogenetycznego, przeciwprzerzutowego i przeciwzapalnego zawierająca substancję czynną oraz farmaceutycznie lub weterynaryjnie dozwolony nośnik lub rozcieńczalnik charakteryzuje się tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden siarczanowany oligosacharyd o wzorze (I):

Rl-(Rx)nR2

184 357 w którym R1 i R₂ oraz wszystkie R_x oznaczająheksozowąjednostkę i wszystkie one mogą być takie same lub różne, przy czym sąsiednie jednostki monosacharydowe są połączone wiązaniami glikozydowymi 1 — 2,1 — 3,1 — 4 i/lub 1 ->6, a n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, pod warunkiem, że oligosacharyd ten nie jest związkiem zawierającym 1 —> 4 związane reszty glukozowe ani związkiem zawierającym 1 — 2 związane reszty fruktozowe.

Siarczanowane oligosacharydy o wzorze (I) oparte są na polimerach złożonych z jednostek monosacharydowych, które mogą być związane ze sobą wiązaniami glikozydowymi 1 — 2,1 — 3, 1 —4 i/lub 1 — 6 i które mogą zawierać od 3 do 8 jednostek monosacharydowych. Korzystnie, oligosacharydy złożone są z 3 do 6 jednostek monosacharydowych (a zatem n oznacza 1 do 4), korzystniej z 5 do 6 jednostek monosacharydowych (n oznacza 3 do 4). Polimery mogą obejmować homopolimery złożone z jednostek monosacharydowych jednego tylko typu, albo heteropolimery zawierające jednostki monosacharydowe dwóch lub więcej niż dwóch typów.

Heksozowymi jednostkami monosacharydowymi połączonymi ze sobą z utworzeniem oligosacharydów mogą to być albo furanozy, takie jak fruktoza, albo piranozy, takie jak glukoza, mannoza, altroza, alloza, taloza, galaktoza, idoza lub guloza. Heksozy mogą występować zarówno w konfiguracji D jak i w konfiguracji L.

W szczególnym wykonaniu oligosacharyd ma wzór (II).

W homopolimerycznych oligosacharydach o wzorze (II) jednostkiimonosachaip^y^kr^wikorzystnie jest heksoza, takajak glukoza, mannoza, altroza, alloza, taloza, galaktoza, idoza i guloza. Także korzystnie, w przypadku tych oligosacharydów n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 4, korzystniej od 3 do 4.

Oligosacharydy o wzorach ogólnych I i II obejmują także związki, w których jednostka monosacharydowa przeprowadzona jest w pochodną, a zwłaszcza, gdy jednostki te stanowią fosforanowe, acetylowe lub inne estrowe pochodne monosacharydów.

Ogólnie, siarczanowane oligosacharydy według wynalazku można wytwarzać za pomocą poddania oligosacharydów siarczanowaniu sposobem znanym w tej dziedzinie techniki, z otrzymaniem odpowiednich pochodnych O-zsiarczanowanych. Odpowiednie sposoby dokonywania siarczanowania przedstawiono przykładowo poniżej. Oligosacharydami poddawanymi siarczanowaniu mogąbyć produkty występujące w przyrodzie, włączając w to zarówno oligosacharydy występujące w przyrodzie jako takie (na przykład rafmoza i stachioza), jak i oligosacharydy otrzymane na drodze enzymatycznej lub chemicznej degradacji polisacharydów występujących w przyrodzie (na przykład maltotetraoza, maltopentaoza i maltoheksaoza; glukotrioza, glukotetraoza i glukopentaoza; chondroitynotetra-, heksa i oktasacharydy oraz fosforan mannopentaozy z drożdży Pichia holstii).

Jak już opisano powyżej, wykazano, że siarczanowane oligosacharydy objęte zakresem niniejszego wynalazku wykazują aktywność inhibitora heparanazy i/lub inhibitora czynnika wzrostu i zgodnie z tym takie siarczanowane oligosacharydy znajdują zastosowanie, jak powyżej opisano, jako środek antyangiogenetyczny, środek przeciwprzerzutowy i/lub środek przeciwzapalny w leczeniu chorych ludzi i zwierząt ciepłokrwistych.

Tak więc, wynalazek niniejszy można stosować w sposobie terapeutycznego postępowania antyangiogenetycznego, przeciwprzerzutowego i/lub przeciwzapalnego u ludzi i zwierząt ciepłokrwistych potrzebujących takiego leczenia, polegającego na podawaniu choremu osobnikowi co najmniej jednego siarczanowanego oligosacharydu powyżej opisanego, w ilości skutecznej.

Składnik aktywny podawany jest w ilości terapeutycznie skutecznej. Określenie „ilość terapeutycznie skuteczna” oznacza taką ilość, którajest potrzebna do uzyskania, co najmniej częściowo, pożądanego skutku, albo do opóźnienia zapoczątkowania lub zahamowania postępu, albo do całkowitego wstrzymania zapoczątkowania lub postępu konkretnego stanu chorobowego poddawanego leczeniu. Oczywiście, ilość ta zależeć będzie od rodzaju danego stanu poddawanego leczeniu, ciężkości tego stanu i parametrów poszczególnego pacjenta, włączając w to jego wiek, stan fizyczny, wielkość, masę ciała i sposoby kuracji przeprowadzanej równolegle. Czynniki te są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie wiedzy i można je uwzględnić bez żadnego, poza rutynowym, eksperymentowania. Korzystne jest, na ogół, stosowanie dawki maksy184 357

Ί malnej, a więc najwyższej dawki bezpiecznej z medycznego punktu widzenia. Jednakże, jak to będzie zrozumiałe dla fachowców w tej dziedzinie wiedzy, z przyczyn medycznych, psychologicznych, lub z jakichkolwiek innych potencjalnych przyczyn, można podawać dawki mniejsze lub tolerowane.

Następnie, wynalazek niniejszy dotyczy także kompozycji farmaceutycznej lub weterynaryjnej przeznaczonej do terapeutycznego postępowania antyangiogenetycznego, przeciwprzerzutowego i/lub przeciwzapalnego, obejmującej co najmniej jeden siarczanowany oligosacharyd powyżej opisany, łącznie z farmaceutycznie lub weterynaryjnie dozwolonym jego nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.

Formułowanie tego rodzaju kompozycji terapeutycznych jest dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie techniki. Do odpowiednich, farmaceutycznie lub weterynaryjnie dozwolonych nośników i/lub rozcieńczalników', należą jakiekolwiek, wszelkie zwyczajne rozpuszczalniki, podłoża rozpraszające, wypełniacze, nośniki stałe, roztwory wodne, powłoki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające wchłanianie itp. Sposoby użycia tego rodzaju podłoży i środków dla substancji aktywnych farmaceutycznie i weterynaryjnie, są dobrze znane w tej dziedzinie techniki i opisane są, na przykład w Remington s Pharmaceutical Sciences, wyd. 18, MachPublishing Company, Pennsylwania, USA. Przewiduje się wykorzystanie wszystkich innych wspomnianych podłoży i środków w kompozycjach farmaceutycznych i weterynaryjnych według niniejszego wynalazku, z wyjątkiem tylko tych typowych podłoży lub środków, które nie są zgodne z substancją aktywną. W skład kompozycji można włączyć także uzupełniające składniki aktywne.

Szczególnie korzystne jest, dla ułatwienia podawania i dla ujednolicenia dawkowania, formułowanie kompozycji w jednostkowe postacie dawkowania. Stosowane w niniejszym opisie określenie „jednostkowa postać dawkowania” odnosi się do fizycznie oddzielnych jednostek nadających się jako jednostkowe dawki do podawania ludziom lub zwierzętom poddawanym leczeniu, przy czym każda taka jednostka zawiera przewidzianą ilość składnika aktywnego, obliczoną tak, aby zapewniała spowodowanie uzyskania pożądanego efektu terapeutycznego, łącznie z wymaganym farmaceutycznym lub weterynaryjnym nośnikiem i/lub rozcieńczalnikiem. Wymagania techniczne dla nowych jednostkowych postaci dawkowania według wynalazku są podyktowane i bezpośrednio zależne od: (a) unikalnych właściwości składnika czynnego oraz konkretnego efektu terapeutycznego, który ma się osiągnąć oraz (b) ograniczeń tkwiących w samej sztuce formułowania tego składnika aktywnego w postać przeznaczoną dla konkretnego sposobu leczenia..

Siarczanowane oligosacharydy według niniejszego wynalazku można stosować do leczenia chorób angiogenezozależnych, w tym angiogenezy stowarzyszonej z rozwojem guzów litych, retinopatii rozrostowych i reumatoidalnego zapalenia stawów, jak również do leczenia tych chorób i stanów chorobowych połączonych ze stanem zapalnym, w przypadku których wykazywana przez siarczanowane oligosacharydy aktywność inhibitorów heparanazy będzie szczególnie przydatna, jeśli chodzi o hamowanie naciekania leukocytów. Należą do nich przewlekłe choroby połączone ze stanem zapalnym, w których nacieczenie leukocytów jest kluczowym elementem, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane, cukrzyca insulinozależna, choroby zapalne jelit, takie jak wrzodziejące zapalenie okrężnicy i choroba Chron'a, odrzucenie alloprzeszczepu i astma przewlekła.

W całym tekście niniejszego opisu, jeżeli tylko kontekst nie wymaga innego zrozumienia, słowo „obejmują” lub jego odmiany, takie jak „obejmuje” lub „obejmujący”, należy rozumieć w ten sposób, że implikująone włączenie określonej całości lub grupy całości, ale nie wyłączenie jakiejkolwiek innej całości lub grupy całości.

Szczegółowy opis wynalazku

Jak to ogólnie powyżej opisano, wynalazek niniejszy dotyczy siarczanowanych oligosacharydów i ich zastosowania jako środków antyangiogenetycznych, przeciwprzerzutowych i/lub przeciwzapalnych.

184 357

Niektóre oligosacharydy można otrzymywać ze źródeł naturalnych w celu późniejszego poddania ich siarczanowaniu, tym niemniej jednak wysoce pożądany jest prosty sposób syntezy oligosacharydów o określonej długości łańcucha i stereochemii. Wynalazek niniejszy dotyczy polepszonego sposobu syntezy i wyodrębniania oligomerów utworzonych z cukrów typu heksozy, z wykorzystaniem prostych związków wyjściowych i z dobrą wydajnością, przy czym cukrowe monomery tych oligomerów połączone są wiązaniem 1—3, 1 — 4 i/lub 1 — 6. Taki sposób wytwarzania oligomerów utworzonych z cukrów typu heksozy ostro kontrastuje ze sposobem poprzednio stosowanym do wytwarzania oligomerów cukrowych, pod tym względem, że uzyskuje się tu dobrą wydajność, stopień oligomeryzacji można łatwo kontrolować, a produkty wytworzone tym sposobem są homologicznymi oligomerami liniowymi, które dają się łatwo wyodrębniać i oczyszczać z zastosowaniem prostych metod chromatograficznych.

W literaturze naukowej lub patentowej można znaleźć liczne przykłady opisujące sposoby wytwarzania polimerów i oligomerów cukrowych. I tak, na przykład, zgodnie ze zwykle stosowanym sposobem postępowania, nie zmodyfikowany monomer cukrowy, albo sam, albo w obecności rozpuszczalnika, można ogrzewać w obecności katalizatora, w wyniku czego otrzymuje się rozgałęzione lub liniowe produkty polimeryczne o rozmaitych i niekiedy źle zdefiniowanych wiązaniach chemicznych (22, 23) Innym sposobem, w którym cukier poddaje się topieniu w obecności żywic kationitowych (24), również otrzymuje się wielkocząsteczkowe i bardzo rozgałęzione polimery o dużej masie cząsteczkowej. W tych dwóch przykładach polimery powstają z jednoczesną utratąjednej cząsteczki wody na każde utworzone wiązanie polimeryczne. Innym przykładem jest znana metoda polimeryzacji stopniowej, wykorzystująca reakcję Koenigsa-Knorra, w przypadku której cukry z podstawnikami, które nie stanowią grup hydroksylowych (takimi jak atom bromu lub chloru) w pozycji 1 oraz z grupami zabezpieczającymi (takimi jak grupa acetylowa) inne grupy hydroksylowe cukru, doprowadza się do reakcji w pozycji 1 z grupąhydroksylową innego cukru (24). W sposobach tych, w trakcie tworzenia się wiązania polimeru dochodzi do utraty cząsteczki innej niż woda, na przykład HBr. Ten sposób wytwarzania oligosacharydów jest żmudny, wymaga utworzenia złożonych związków wyjściowych i pozwala na uzyskanie jedynie słabej wydajności ogólnej (25).

Podobnie, jest rzeczą znaną, że cukier typu heksozy zawierający ugrupowanie alkoholu pierwszorzędowego przy węglu 6, grupę zabezpieczającą O (takąjak grupa acetylowa) w pozycjach 2,3 i 4 oraz grupę opuszczającą, takąjak brom, w pozycji 1, ulegać będzie samokondensacji, zwłaszcza w obecności katalizatora, takiego jak tlenek srebrowy, z utworzeniem polimerów o wiązaniach 1, 6. Sposobem tym wytworzono cały szereg gencjodekstryn, przy użyciu jako związku wyjściowego 1-bromo-2,3,4-tri-O-acetylo-a-D-glukozy. Jednakże, uzyskiwane wydajności oligosacharydów były małe, co wynikało z tworzenia się 1,6-anhydro-|3-D-ghikozy, powstającej na drodze kondensacji wewnątrzcząsteczkowej. Wydajności dimeru (14%) i trimeru (22%) nie były dobre, a wydajności tetrameru i pentameru jeszcze gorsze (> 5%). Heksamer wyodrębniany był z wydajnością wynoszącą jedynie 1% (26).

W nowszych publikacjach opisano chemiczne syntezy polimerów złożonych z jednostek β-piranozylowych o wiązaniach 1,6 (27) i D-dekstranu (28), polegające na reakcji polimeryzacji z otwarciem pierścienia, z udziałem pochodnych anhydrocukrowych. W sposobie tym przeszkodę stanowi konieczność poczynienia znacznych wysiłków, niezbędnych do wytworzenia związku wyjściowego, anhydrocukru, przy czym me ma dowodu na to, że oligosacharydy można łatwo otrzymać tą metodą, nawet wtedy, gdy reakcję prowadzi się w temperaturze, na przykład -60°C. W innej metodzie wykorzystuje się katalizowaną kwasem polimeryzację w stopie przeprowadzanąz udziałem 1,2,3,4-tetra-O-acetylo-|3-D-glukozy, w wyniku której otrzymuje się mieszaninę octanów oligosacharydów o wiązaniach 1, 6'. Mieszaninę tę, po odacetylowaniu, poddano badaniu metodą chromatograficzną i wykazano, że zawiera ona głównie mono- i disacharydy, a mianowicie glukozę (15%), lewoglukozan (4%) i gencjobiozę (16%), podczas gdy wydajność oligosacharydu była niedopuszczalnie niska. Bardziej szczegółowo: dla gencjotriozy wynosiła ona 4%, a dla gencjotetraozy 0,6% (29). Sposób ten opisano później bardziej szczegółowo (30);

184 357 aczkolwiek wydajność produktów spolimeryzowanych została nieco polepszona, to jednak uzyskano jedynie bardzo niskie wydajności oczekiwanych oligomerów.

Tak więc, z przeglądu literatury okazuje się, że chociaż istnieją obecnie różne metody wytwarzania szeregu oligosacharydów, to jednak, jak dotychczas, nie opisano żadnego sposobu syntezowania homooligosacharydów z dobrą wydajnością, przy użyciu łatwo dostępnych i tanich związków wyjściowych.

W toku prac badawczych prowadzących do niniejszego wynalazku, twórcy wynalazku odkryli sposób umożliwiający syntezę konkretnych heksopiranooligosacharydów', z dobrą wydajnością i z wykorzystaniem, jako związków wyjściowych, łatwo dostępnych i tanich surowców. Zgodnie z tą swoją cechą znamienną, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania heksopiranooligosacharydów, obejmującego ogrzewanie acetylowej lub innej estrowej pochodnej heksozy w środowisku rozpuszczalnika obojętnego, pod zmniejszonym ciśnieniem i w obecności kwasu Lewisa lub innego katalizatora.

Zgodnie z tym sposobem, oligomeryzacji cukrów typu heksozy, przeprowadzonych w pochodne, włączając w to (ale bez ograniczania się tylko do nich) 1,23.4-tetra-O-acetylowe pochodne glukozy, mannozy, galaktozy, altrozy, talozy, gulozy, idozy i allozy, można przeprowadzić w sposób kontrolowany z wytworzeniem O-acetylowanych utworzonych z heksozy oligosacharydów. W sposobie tym, stopień oligomeryzacji (długość łańcucha) można w łatwy sposób regulować manipulując temperaturą, w której przebiega reakcja oligomeryzacji i zmieniając czas zachodzenia tej reakcji. Po zakończeniu reakcji oligomeryzacji, utworzoną tak surową mieszaninę można poddać dalszemu acetylowaniu w celu zacetylowania pozostałych wolnych grup hydroksylowych obecnych w oligosacharydach. Następnie, zacetylowane oligosacharydy można łatwo wyodrębnić z wykorzystaniem chromatografii adsorpcyjnej’. Grupy acetylowe wykazują absorbancję promieniowania nadfioletowego, co ułatwia zastosowanie spektrofotometrii dla identyfikowania zacetylowanych oligosacharydów w trakcie ich kolejnego eluowania z kolumny. Acetylowe grupy zabezpieczające można także łatwo usunąć z mieszaniny oligosacharydów i otrzymane oligosacharydy rozdzielić na podstawie ich wielkości metodą chromatografii żelowej (wykluczającej w zależności od rozmiarów i/lub kształtu cząsteczki).

W przykładach przedstawionych w niniejszym opisie siarczanowane oligosacharydy wyodrębnia się i stosuje w postaci ich odpowiednich soli sodowych. Rozumie się, że w odpowiadający temu sposób można także wyodrębniać i stosować inne farmaceutycznie dozwolone sole, takie jak sól wapniowa lub farmaceutycznie dozwolone sole z aminami. Zgodnie z tym, przytaczane w niniejszym opisie odniesienia do „siarczanowanych oligosacharydów” należy rozumieć jako obejmujące także sole sodowe lub inne farmaceutycznie dozwolone sole siarczanowanych oligosacharydów.

Dalsze cechy znamienne niniejszego wynalazku są w pełniejszy sposób opisane w następującym przykładzie (następujących przykładach). Jednakże, należy rozumieć, że to szczegółowe omówienie zostało włączone do niniejszego opisu jedynie w celu przykładowego przedstawienia niniejszego wynalazku i nie należy uważać go za ograniczające w jakikolwiek sposób zakres wynalazku, opisanego powyżej w sposób ogólny.

Przykłady 1,2 i 3 demonstrują wytwarzanie syntetycznych oligosacharydów w nowy sposób ujawniony w niniejszym opisie. Przykłady 4, 5 i 6 demonstrują sposoby siarczanowania oligosacharydów', a przykład 7 demonstruje zastosowanie siarczanowanych oligosacharydów jako środków antyangiogenetycznych, przeciwprzerzutowych i przeciwzapalnych. (W przykładach 1 i 2 skrót „ND” oznacza „nie oznaczono”).

W załączonych rysunkach:

Figura 1 przedstawia wpływ siarczanu maltoheksaozy na angiogenezę u człowieka in vitro. Rysunek górny jest cyfrowym obrazem kontrolnej angiogenezy po upływie 14 dni od rozpoczęcia hodowli. Rysunek dolny przedstawia angiogenezę w obecności 20 pg/ml siarczanu maltoheksaozy.

Figura 2 przedstawia wpływ różnych stężeń siarczanu maltozy (□), siarczanu maltotetraozy ( = ) i siarczanu maltoheksaozy ( □ ) na angiogenezę u człowieka in vitro. Dane otrzymane

184 357 z cyfrowych obrazów angiogenetycznej odpowiedzi po upływie 14 dni od rozpoczęcia hodowli. Każda wartość to średnia ± błąd standardowy (n = 4).

Figura 3 przedstawia wpływ różnych stężeń (pg/ml) fosforanu siarczanowanej mannopentaozy z Pichia holstii na angiogenezę u człowieka in vitro. Dane otrzymane z cyfrowych obrazów angiogenetycznej odpowiedzi po upływie 19 dni od rozpoczęcia hodowli. Każda wartość to średnia ± błąd standardowy (n = 4).

Figura 4 pokazuję wpływ siarczanowanych oligosacharydów utworzonych z maltozy, o rozmaitej długości łańcucha, na tworzenie przerzutów przez szczurzy rak gruczołu sutkowego 13762 MAT. Zwierzęta kontrolne otrzymywały komórki 13762 MAT w nieobecności oligosacharydu. W tabeli A zwierzęta traktowane badanymi związkami otrzymywały dożylnie (i.v.) po 2 mg każdego ze związków w czasie wstrzykiwania komórek nowotworowych. W tabeli B zwierzęta traktowane badanymi związkami otrzymywały podskórnie (s.c.) po 4 mg każdego ze związków w czasie wstrzykiwania komórek nowotworowych. Pionowe odcinki oznaczają standardowe błędy średnich.

Figura 5 stanowi oszacowanie zdolności siarczanowanych oligosacharydów utworzonych z maltozy o rozmaitej długości łańcucha do hamowania wiązania obecnych na powierzchni komórek BALB/c 3T3 siarczanów heparanu z unieruchomionym aFGF. Związane komórki kwantyfikowano za pomocą barwienia przy użyciu różu bengalskiego i mierzono absorbancję barwnika przy 540 nm. Stopień zsiarczanowania różnych oligosacharydów utworzonych z maltozy wyszczególniono w tabeli 2.

Figura 6 pokazuje wpływ zsiarczanowania siarczanu maltoheksaozy na jego zdolność hamowania tworzenia przerzutów przez szczurzy rak gruczołu sutkowego 13762 MAT. Liczby znajdujące się wzdłuż osi x odnoszą się do ilości grup siarczanowych w jednej cząsteczce maltoheksaozy-. Zwierzęta kontrolne otrzymywały komórki nowotworowe w nieobecności badanych związków. Oligosacharydy podawano i.v. w dawce wynoszącej 2 mg/szczura, w czasie wstrzykiwania komórek nowotworowych. Odcinki pionowe oznaczają standardowe błędy średnich.

Figura 7 pokazuje wpływ maltoheksaozy z różnymi ilościami grup siarczanowych w cząsteczce na in vitro angiogenezę u człowieka. Oligosacharydy podawano w dawce wynoszącej 200 pg/ml, a badanie przeprowadzono w podłożu nie zawierającym surowicy. W eksperymencie tym zaobserwowano podobną odpowiedź angiogenetyczną, niezależnie od tego, czy badanie przeprowadzono w podłożu z zawartością surowicy (20% FCS) czy w podłożu bez surowicy (bez FCS). Maksymalnie zsiarczanowanącząsteczkąjest cząsteczka maltoheksaozy zawierającej 20 grup siarczanowych/cząsteczkę. Dane: średnie ± błąd standardowy z czterech oznaczeń.

Figura 8 pokazuje wpływ różnych siarczanowanych oligosacharydów utworzonych z mannozy na in vitro angiogenezę u człowieka. Wartości w nawiasach oznaczają % zsiarczanowania oligosacharydów. Oligosacharydy podawano w dawce wynoszącej 200 pg/ml, a badanie przeprowadzono w podłożu zawierającym surowicę. Dane: średnie ± błąd standardowy z czterech oznaczeń.

Figura 9 pokazuje wpływ siarczanowanych oligosacharydów utworzonych z mannozy 0 różnej długości łańcucha na tworzenie przerzutów przez szczurzy rak gruczołu sutkowego 13762 MAT. Wartości w nawiasach oznaczają % zsiarczanowania oligosacharydów. Zwierzęta kontrolne otrzymywały komórki 13762 MAT w nieobecności oligosacharydu. Zwierzęta traktowane badanymi związkami otrzymywały s.c. albo po 2 mg (A), albo po 4 mg (B) każdego ze związków bezpośrednio po i.v. wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Odcinki pionowe oznaczają błędy standardowe średnich.

Figura 10 pokazuje wpływ siarczanowanych oligonukleotydów utworzonych z galaktozy i glukozy o rozmaitej długości łańcucha na tworzenie przerzutów przez szczurzy rak gruczołu sutkowego 13762 MAT. Wartości w nawiasach oznaczają % zsiarczanowania oligosacharydów. Zwierzęta kontrolne otrzymywały komórki 13762 MAT w nieobecności oligosacharydu. Zwierzęta traktowane badanymi związkami otrzymywały po 2 mg każdego ze związków bezpośrednio po i.v. wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Odcinki pionowe oznaczają błędy standardowe średnich.

-84 357

Przykład 1

Oligosacharydy utworzone z mannozy otrzymano w sposób następujący. 15,0 g (43 mmola) 1,2,3,4uetraX)-acetylomannozy (31) i 1,5 g chlorku cynkowego dokładnie zmieszano ze sobąw 7 ml sulfonu tetrametylenowego, po czym utworzoną mieszaninę ogrzewano pod zmniej szonym ciśnieniem, przy mieszaniu, w temperaturze około 110° C, w ciągu 6 godzin. W tym czasie mieszanina reakcyjna stwardniała z utworzeniem masy, przy czym ustało wywiązywanie się oparów (kwasu octowego). W ciągu zachodzenia reakcji, pomiędzy naczyniem reakcyjnym a źródłem podciśnienia usytuowana była rurka z wapnem sodowanym. Następnie mieszaninę reakcyjnąpozostawiono do ostygnięcia i część (11,0 g) utworzonej mieszaniny rozpuszczono w 20 ml suchej pirydyny, po czym do otrzymanego tak roztworu wprowadzono 2 ml bezwodnika octowego. Mieszaninę zabezpieczono przed dostępem wilgoci z atmosfery i ogrzewano w temperaturze około 50° C, przy mieszaniu, w ciągu 2 godzin. Po schłodzeniu, dodano 10 ml etanolu i mieszaninę pozostawiono na okres 2 godzin. Pirydynę, etanol i całą obecną ilość utworzonego octanu etylu odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość przemyto wyczerpująco wodą w celu usunięcia chlorku cynkowego, sulfonu tetrametylenowego i pirydyny. Pozostałość rozpuszczono w dichlorometanie, przemyto wodą i warstwę organiczną osuszono bezwodnym siarczanem sodowym. Przeprowadzone w pochodne oligosacharydy rozdzielono początkowo na dwie frakcje za pomocą naniesienia roztworu w dichlorometanie na krótkąkolumnę (4 x 40 cm) zawierającą 130 g żelu krzemionkowego 60, którą wpierw wyeluowano chloroformem, a następnie acetonem. W wyniku elucji przy użyciu chloroformu otrzymano mieszaninę całkowicie zacetylowanego monosacharydu i oligomerów zawierających od 3 do 5 jednostek mannozy (mieszanina A). W wyniku następującej potem elucji przy użyciu acetonu otrzymano mieszaninę całkowicie O-zacetylowanych oligomerów zawierających głównie od 6 do 12 jednostek mannozy w jednej cząsteczce (mieszanina B).

Na kolumnę (3,3 x 135 cm) upakowaną żelem krzemionkowym do chromatografii cienkowarstwowej (tle) (H) wprowadzono 4 g mieszaniny A. Kolumnę eluowano układem aceton/benzyna lekka (temperatura wrzenia 60-80°C) w gradiencie zaczynającym się od 1:5, z wzrastającąprocentowązawartością acetonu, aż do osiągnięcia końcowego stosunku 1:1. Szybkość przepływu wynosiła > 0,5 ml/min. Za pomocą odebrania i połączenia ze sobą właściwych frakcji (po przeprowadzeniu analizy metodą tle na żelu krzemionkowym) oraz usunięcia rozpuszczalnika pod zmniej szonym ciśnieniem otrzymano całkowicie O-zacetylowane oligosacharydy zawierające mannozę, la-ld, jak następuje [n = liczba reszt mannozy; wydajność; skręcalność molekularna (c = 2, CHCl₃)]:

1a:3;	0,7 g,	4,2%,	[a]27D = +ND;
lb:4,	4,1 g,	8,4%;	50;
lc:5;	1,2 g,	7,9%;	[0^7 = +47^
ld:6;	0,8 g,	5,2%;	[a]27o = +36,0.

7,0 g mieszaniny B poddano chromatografii w sposób podobny do chromatografii mieszaniny A, z tą różnicą, że gradient elucji zaczynał się od stosunku aceton/benzyna lekka (temperatura wrzenia 60-80°C) wynoszącego 4:5, a procentowa zawartość acetonu wzrastała do 100%. W ten sposób otrzymano całkowicie O-zacetylowane oligosacharydy zawierające mannozę. 1d- lj, jak następuje [n = liczba reszt mannozy; wydajność; skręcalność molekularna (c= 1,CHCl₃)]:

1d:6;	1,6 g,	0,4%;	[a]V+ND;
1e:7;	3,2 g,	21,2%;	[0^ ==+50,0;
1f:8;	0,5 g,	3,4%;	[a]27D = +47,0;
1g:9;	0,7 g,	4,7%;	[a]27D = +59;
1h:10;	0,9 g,	5,7%;	[α]227 = +54;
1i:11;	0,02 g,	0,1%;	[aj^+ND;
1j:12;	0,03 g,	0,2%,	[a]^ = +nd.

W 40 ml suchego metanolu rozpuszczono 1,55 g związku 1a, po czym dodano, przy mieszaniu, w temperaturze pokojowej, 8,6 ml IM metanolowego roztworu metanolanu sodowego. Utworzony wytrącony osad odsączono, przemyto dokładnie metanolem i wysuszono. Otrzyma12

184 357 ny produkt (2a; 0,61; 70%; [<a]²⁷D = +12°) zidentyfikowano za pomocą analizy elementarnej (wartości CHN wynosiły ± 0,4 % wartości oczekiwanych), spektrometrii mas (typu „electrospray”) (M+= 504) i spektroskopii NMR jako mannotriozę. Oligomery 1b-lj poddano podobnej obróbce, w wyniku .czego otrzymano następujące oligosacharydy utworzone z mannozy [n = liczba reszt mannozy; wydajność % w przeliczeniu na pochodne acetylowane; skręcalność molekularna (c = 1, H₂0) ]:

2b:4;	75 %;	[a]2?D==+78°;
2c:5;	85 %;	[oPD = +80°;
2d:6;	98 %,	[α]2 ?0 = +106
2e:7;	98 %;	[α]2?0 86,3·;
2f::8;	99 %;	[a]2?D = +98,0°;
2g:9;	99 %;	[α]270 ==+106°;
2h: 10;	99 %;	[α]2 ?ο ==+100°;
2i: 11;	98 %,	[α]270 ND;
2j:12;	98 %;	[a]27D = ND.

Alternatywnie, te złożone z jednostek mannozy oligosacharydy można wyodrębnić za pomocą chromatografii żelowej (wykluczającej w zależności od rozmiarów i/lub kształtu cząsteczki). I tak, mieszaninę zacetylowanych oligosacharydów utworzonych z mannozy otrzymano za pomocą ogrzewania dokładnie mieszanej mieszaniny 15,0 g (43 mmoli) 1,2,3,4-tetra-O-acetylomannozy i 1,5 g chlorku cynkowego w 7 ml sulfonu tetrametylenowego, pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze około H0°C, w ciągu 6 godzin, jak to powyżej opisano. Następnie mieszaninę pozostawiono do ochłodzenia się, po czym dodano 50 ml wody i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 5 minut i warstwę wodną odrzucono. Tę operację przemywania powtórzono i całą masę rozpuszczono następnie w chloroformie. Utworzony roztwór przemyto wodą i osuszono bezwodnym siarczanem sodowym. Po przesączeniu, chloroform usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano 11,3 g surowej mieszaniny zawierającej acetylowany oligosacharyd. Mieszaninę tę rozpuszczono w 20 ml izopropanolu i 60 ml metanolu, po czym dodano 8 ml 1M roztworu metanolanu sodowego w metanolu i mieszaninę odstawiono na godzinę w temperaturze pokojowej. Utworzony wytrącony osad odsączono i przemyto 2 razy po 30 ml metanolu. Po wysuszeniu, 6,5 g tak otrzymanej mieszaniny wprowadzono na wierzchołek opłaszczonej kolumny do chromatografii żelowej (5 x 90 cm) z żelem „P2 fine grade” (Bio Rad), ustabilizowanej za pomocą dwudniowego przepuszczania wody z szybkością przepływu wynoszącą 0,5 ml/min, w temperaturze 60°C. Kolumnę eluowano wodą, przy szybkości przepływu wynoszącej 0,5 ml/min. Produkty eluowane z kolumny identyfikowano jako piki metodą refraktometrii różnicowej i stosownie do tego gromadzono frakcje. W ten sposób zebrano frakcje odpowiadające powierzchniom pod 11 poszczególnymi pikami. Każdą z tych frakcji ponownie poddano chromatografii na takiej samej kolumnie żelu P2, przy utrzymywaniu temperatury 60°C i eluowaniu wodą przy szybkości przepływu wynoszącej 0,5 ml/min. I tak, na przykład, 0,9 g frakcji zidentyfikowanej jako odpowiadającą mannopentaozie z pierwszego przebiegu chromatografii żelowej ponownie poddano chromatografii, w wyniku czego otrzymano jeden główny pik środkowy z jednym przegięciem po każdej stronie. Produkt eluujący się jako pik środkowy wyodrębniono za pomocą usunięcia wody pod zmniejszonym ciśnieniem i w wyniku tego otrzymano 0,5 g produktu, który znów poddano chromatografii na takiej samej kolumnie z żelem P2, w temperaturze 60°C, przy szybkości przepływu wynoszącej 0,3 ml/min. W ten sposób otrzymano 0,3 g mannopentaozy identycznej z powyższym związkiem 2c.

Analiza elementarna dla C₃₀H₅2O₂₆ 6 H₂O:

Obliczono C 38,5%, H 6,8%;

Znaleziono: C 38,4%, H 6,7 %.

Dla azotu oczekiwana wartość wynosiła 0%, znaleziono: 0%.

184 357

Z wykorzystaniem metody chromatografii cieczowej wysokosprawnej (HPLC) stwierdzono, że związek ten był zasadniczo czysty. Oznaczenia dokonano z zastosowaniem układu Dionex HPLC, z następującą charakterystyką procesową:

Kolumna	Code-CPMAl #1291 (+ guard # 1172) A Quaternary Ammonium Ion Exchange Column
Detektor	Detektor elektrochemiczny (ED40 • IAMP).
Szybkość przepływu	1 ml/min
Rozpuszczalniki.	Roztwór A:	0,1 MNaOH
Roztwór B:	1 M octan w 0,1 M NaOH
Gradient:	Czas (min)	%A	%B	Czynność
0	95	5	elucja
20	95	10	elucja
25	0	100	elucj a/przemywan i e
30	0	100	elucj a/przemywanie

Badanie metodą spektrometrii mas (typu „electospray”) wykazało, że wartość M + tego związku wynosiła 828, a więc dokładnie tyle, ile masa cząsteczkowa mannopentaozy. W podobny sposób wyodrębniono mannotriozę, mannotetraozę, mannoheksaozę i mannoheptaozę, identyczne z powyższymi związkami 2a, 2b, 2d i 2e.

Przykład 2

Przykład ten pokazuje skutek przeprowadzenia reakcji polimeryzacji w temperaturze niższej od temperatury przyjętej w przykładzie 1. Oligosacharydy złożone z jednostek glukozy otrzymano na drodze polimeryzacji 1,2,3,4-tetra-O-acetyloglukozy w taki sam sposób, jaki zastosowano w przypadku oligosacharydów utworzonych z mannozy, wytworzonych sposobem przedstawionym w powyższym przykładzie 1, z tą różnicą, że w omawianym przypadku reakcję polimeryzacji przeprowadzono w temperaturze 90°C i w ciągu 8 godzin.

Mieszaninę reakcyjnąpoddano obróbce w taki sam sposób, jak w przykładzie 1, a produkty reakcji wyodrębniono metodą chromatografii kolumnowej z zastosowaniem kolumny 7 x 155 cm upakowanej żelem krzemionkowym do tle (H). Z wykorzystaniem sposobów elucji podobnych do sposobów opisanych w przykładzie 1, otrzymano następujące całkowicie O-zacetylowane oligosacharydy 3a-3e [n = liczba reszt glukozy; wydajność; skręcalność molowa (c = 2, CHC1₃)].

3a:3;	4,14 g,	24,9%;	[α] 27d = +37,5°;
3b:4;	2,92 g,	18,4%,	[α] 27d = +44°;
3c:5;	2,99 g,	19,1%,	[«Pd = +37,5°;
3d:6;	1,37 g,	8,9%;	[o]27o = +36°;
3e:7;	0,18 g,	1,2%;	[α] 27d = +39°.

W 30 ml suchego metanolu rozpuszczono 1,0 g związku 3a, po czym dodano, przy mieszaniu, w temperaturze pokojowej, 5,5 ml 1M metanolowego roztworu metanolanu sodowego. Utworzony wytrącony osad odsączono, przemyto dokładnie metanolem i wysuszono. Produkt (związek 4a; [ot]²⁷D = 68,5°) zidentyfikowano za pomocą analizy elementarnej, spektrometrii mas (typu „elektrospray”) (M+ = 504) i spektroskopii NMR jako glukotriozę. Oligomery 4b-4e poddano podobnej obróbce, w wyniku czego otrzymano następujące oligosacharydy utworzone z glukozy [n = liczna reszt glukozy; % wydajność; skręcalność molekularna (c = 2, H2O)]:

4b:4;	85%;	[<a]27D = +83 °;
4c:5;	90%;	[a]27D = +84°;
4d:6;	90%;	«'d +86°;
4e:7;	89%;	[a]27D = +92,5°

184 357

Alternatywnie, te złożone z jednostek glukozy oligosacharydy można wyodrębnić metodą chromatografii żelowej (wykluczającej w zależności od rozmiarów i/lub kształtu cząsteczki). I tak, mieszaninę zacetylowanych oligosacharydów utworzonych z glukozy otrzymano za pomocą ogrzewania dokładnie mieszanej mieszaniny 15,0 g (43 mmole) 1,2,3,4-tetra-O-acetyloglukozy i 1,5 g chlorku cynku w 7 ml sulfonu tetrametylenowego, pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze około 110°C, w ciągu 6 godzin, jak to powyżej opisano. Masę stanowiącą mieszaninę reakcyjną rozpuszczono w dichlorometanie, po czym utworzony roztwór przemyto wodą i osuszono bezwodnym siarczanem sodowym. Dichlorometan usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym pozostałość odważono i rozpuszczono w 20 ml izopropanolu i 60 ml metanolu, a następnie dodano 9 ml 1M roztworu metanolanu sodowego w metanolu i otrzymaną tak mieszaninę odstawiono na godzinę w temperaturze pokojowej. Utworzony wytrącony osad odsączono i przemyto 2 razy po 30 ml metanolu. W 10 ml wody rozpuszczono 7,6 g tej mieszaniny i wprowadzono na wierzchołek opłaszczonej kolumny do chromatografii (5 x 90 cm) z żelem „fine grade P2 size exclusion” (Bio Rad). Kolumnę załadowano, wstępnie ogrzano i uruchomiono (dla ustabilizowania) w temperaturze 60°C na dwa dni przed użyciem. Po wprowadzeniu mieszaniny oligosacharydów utworzonych z glukozy kolumnę utrzymywano w temperaturze 60°C i poddano elucji przy użyciu wody i przy szybkości przepływu wynoszącej 1 ml/min. Eluowane z kolumny produkty identyfikowano jako piki metodą refraktometrii różnicowej i stosownie do tego gromadzono frakcje. W ten sposób zebrano frakcje odpowiadające powierzchniom pod 10 poszczególnymi pikami. Każdąz tych frakcji ponownie poddano chromatografii na takiej samej kolumnie P2, w temperaturze 60°C i eluowano wodą, przy szybkości przepływu wynoszącej 0,5 ml/min. I tak, na przykład, 0,59 g frakcji zidentyfikowanej jako odpowiadającąglukopentaozie ponownie poddano chromatografii, w wyniku czego otrzymano główny pik środkowy z jednym przegięciem po każdej stronie. Produkt eluujący się jako pik środkowy wyodrębniono za pomocą usunięcia wody pod zmniejszonym ciśnieniem, i w wyniku tego otrzymano 0,3 g produktu, który znów poddano chromatografii na takiej samej kolumnie z żelem P2, w temperaturze 60°C, przy szybkości przepływu wynoszącej 0,3 ml/min. W ten sposób otrzymano 0,2 g glukopentaozy identycznej z powyższym związkiem 4c. W podobny sposób wyodrębniono glukotriozę, glukotetraozę, glukoheksaozę i glukoheptaozę, identyczne z powyższymi związkami 4a, 4b, 4d i 4e.

Przykład 3

Sposobami ujawnionymi w przykładach 1 i 2 można wytworzyć oligosacharydy utworzone z innych cukrów typu heksozy, włącznie z galaktozą, altrozą, talozą, gulozą, idoząi allozą.

I tak, na przykład, oligosacharydy utworzone z galaktozy otrzymano w sposób następujący. W 10 ml sulfonu tetrametylenowego starannie zmieszano ze sobą21,0 g 1,2,3,4-O-acetylogalaktozy i 2,1 g chlorku cynkowego i utworzoną mieszaninę ogrzewano pod zmniejszonym ciśnieniem, przy mieszaniu, w temperaturze około 90°C, w ciągu 17 godzin. W tym czasie mieszanina reakcyjna stwardniała z utworzeniem masy, przy czym ustało wywiązywanie się oparów (kwasu octowego). W trakcie zachodzenia reakcji, pomiędzy naczyniem reakcyjnym a źródłem podciśnienia usytuowana była rurka z wapnem sodowanym. Mieszaninę reakcyjnąpozostawiono do ostygnięcia, po czym powstałą w wyniku reakcji masę rozpuszczono w dichlorometanie i utworzony tak roztwór przemyło wodą, a następnie osuszono bezwodnym siarczanem sodowym. Dichlorometan usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość odważono, a następnie rozpuszczono w 30 ml izopropanolu i 70 ml metanolu. Następnie dodano 10 ml 1M roztworu metanolanu sodowego w metanolu i otrzymaną mieszaninę odstawiono na godzinę w temperaturze pokojowej. Utworzony wytrącony osad odsączono i przemyto 2 razy po 30 ml metanolu. Następnie mieszaninę rozdzielono metodą chromatografii żelowej tak, jak to opisano odnośnie do polimerów utworzonych z mannozy i glukozy w powyższych przykładach 1 i 2. Produkty eluowane z kolumny identyfikowano jako piki metodą refraktometrii różnicowej i stosownie do tego gromadzono frakcje. W ten sposób zebrano 8 frakcji. Siedem z tych frakcji poddano dwukrotnie chromatografii na takich samych kolumnach z żelem P2, w temperaturze 60°C, przy użyciu do elucji wody i przy szybkości przepływu wynoszącej 0,5 ml/min podczas pierwszego przebiegu i 0,3 ml/min podczas drugiego przebiegu. W ten sposób otrzymano następujące oligosacharydy utworzone

-84 357 z galaktozy: 1,03 g (5,3%) galaktotriozy, 1,15 g (6,0%) galaktotetraozy, 1,21 g (6,3%) glaktopentaozy, 4,26 g (22,1%) galaktoheksaozy, 2,11 g (11%) galaktoheptaozy, 1,91 g (9,9%) galaktooktaozy i 0,08 g (0,4%) galaktononaozy.

Przykład 4

Do roztworu 0,8 g kompleksu trójtlenek siarki-pirydyna (Aldrich) w 1 ml świeżo przedestylowanego DMF wkroplono, w temperaturze 80°C, roztwór 0,1 g mannopentaozy (związek 2c) w 3 ml suchej pirydyny, po czym całość ogrzewano w temperaturze 80°C w ciągu dalszych 90 minut. Następnie supernatant zdekantowano jeszcze na ciepło i kleistą pozostałość przemyto dokładnie 3 razy po 2 ml metanolu. Po zdekantowahiu pozostałego metanolu, tak otrzymany produkt rozpuszczono w 5 ml wody i zobojętniono, przy energicznym mieszaniu, do pH ~6 przy użyciu około 0,4 g octanu barowego w 2 ml wody. Po odwirowaniu przy 3000 x g, supernatant zdekantowano i zachowano, a wytrącony osad siarczanu barowego przemyto dokładnie 3 razy po 10 ml wody. Zachowany jak wyżej supernatant i przemywki połączono ze sobą i wprowadzono na kolumnę (1,0 x 14 cm) z żywicą kationitową DOWEX 50w-X8-400 (forma H+). Kolumnę eluowano wodą, aż do osiągnięcia przez eluat odczynu obojętnego. Około 50 ml eluatu mieszano i zobojętniono do pH ~7 przy użyciu 0,7 g octanu sodowego. Otrzymany tak roztwór rozcieńczono 200 ml acetonu i wirowano przy 1750 x g w celu wydzielenia produktu. Osad rozkruszono w środowisku metanolu, w wyniku czego otrzymano subtelnie rozdrobniony proszek, a następnie mieszano, ciągle w środowisku metanolu, po czym odsączono. Osad przemyto kilka razy metanolem, w wyniku czego otrzymano 0,2 g (66%) czystego (nie zawierającego soli nieorganicznych) związku. Wytworzony tak związek nie był zanieczyszczony ani jonami baru (co stwierdzono metodą mikroanalizy oraz metodą jonizacji płomieniowej), ani azotem (co stwierdzono metodą mikroanalizy).

Stwierdzono, że wytworzony związek, a mianowicie siarczanowana mannopentaoza, zawierał, na 17 możliwych, 11 pozycji zsiarczanowanych.

Analiza elementarna dla C₃₀H₆₀O5₉S1 [Na₈ 36 I1₂0:

Obliczono: C 14,1, H 5,2, S 13,8, Na 7,2%;

Znaleziono: C 14,2, H 3,0, S 14,1, Na 7,3 %.

Przewidywane wartości dla azotu i baru wynosiły, dla każdego, 0%; znaleziono, odpowiednio: 0% i 0%.

Przykład 5

Do mieszaniny 4 g kompleksu trójtlenek siarki-pirydyna (Aidrich Chemical Company) w 5 ml suchego DMF wprowadzono, w atmosferze azotu, 10 ml suchej pirydyny. Utworzoną tak mieszaninę ogrzano do temperatury 50°C i przy szybkim mieszaniu dodano w jednej porcji 0,5 g glukoheksaozy (związek 4d) wyodrębnionej sposobem opisanym w powyższym przykładzie 2. Następnie, dodano jeszcze 5 ml pirydyny, po czym mieszaninę ogrzewano przy ciągłym mieszaniu, w temperaturze 80°C, w ciągu 90 minut. Następnie, mieszaninę reakcyjną przetrzymano w temperaturze 4°C przez noc. Ciecz zdekantowano z naczynia reakcyjnego i dodano 3 ml metanolu, po czym półstałą masę rozdrobniono i dokładnie wymieszano w metanolu. Po osadzeniu się cząstek, metanol zdekantowano i postępowanie to powtórzono. Do pozostałej substancji stałej dodano 5 ml wody i utworzony roztwór umieszczono w 50 ml probówce. Naczynie reakcyjne przemyto dodatkowo 5 ml wody i przemywki dołączono do pierwszego roztworu. Następnie, otrzymany roztwór doprowadzono do pH około 7-8 przy użyciu 40% NaOH, po czym dodano 40 ml metanolu. Powstały mętny roztwór wirowano przy 3000 x g w ciągu 25 minut, po czym klarowny roztwór zdekantowano znad osadu. Pozostałą substancję staląponownie rozpuszczono w 10 ml wody i dodano 40 ml metanolu i probówkę z zawartością poddano wirowaniu jak wyżej. Po zdekantowaniu przezroczystego supematantu, substancję stałą rozpuszczono w 10 ml wody i przepuszczono przez kolumnę odsalaj ącąP2 (2,5 x 250 cm), z żelem „fine grade P2” (BioRad), w wyniku czego otrzymano oczekiwaną sól sodową siarczanowanej pochodnej 1,6-glukoheksozy.

Przykład 6

Aczkolwiek syntezę homopolimerów utworzonych z heksozy opisano w przykładach 1, 2 i 3, to jednak nadzwyczaj trudną rzeczą jest zsyntetyzowanie większości struktur oligosachary16

184 357 dowych. Toteż, najprostszym podejściem do tego zagadnienia jest zsiarczanowanie oligosacharydów o określonej strukturze pochodzących ze źródeł naturalnych. Oligosacharydy stanowiące produkty występujące w przyrodzie, stosowane w niniejszym przykładzie, należały do dwu klas związków. Pierwsza klasa obejmowała Oligosacharydy nie wymagające dokonywania dalszej degradacji i frakcjonowania. Przykładami związków należących do tej klasy są maltoza, rafinoza i stachioza. Drogą klasę związków stanowiły Oligosacharydy uzyskiwane z występujących w przyrodzie polisacharydów, poddane częściowej degradacji enzymatycznej lub chemicznej, albo frakcjonowaniu pod względem wielkości cząsteczki. Przykładami związków należących do tej klasy są Oligosacharydy wywodzące się z amylozy, chondroityny i dekstranu, oraz fosforan mannopentaozy z drożdży Pichia holstii.

Maltozę, rafinozę i stachiozę dostarczyła spółka Sigma Chemical Co., St Louis, MO. Maltotriozę, maltotetraozę, maltopentaozę, maltoheksaozę i maltoheptaozę otrzymano z firmy Selkagaku, Tokio, Japonia; sąto Oligosacharydy wyodrębnione z produktu częściowego (dokonanego z udziałem amylazy) strawienia amylozy, a więc homopolimeru glukozy o wiązaniach al -4. Chondroitynowe tetra-, heksa- i oktasacharydy rozfrakcjonowano metodą chromatografii żelowej, której poddano produkt trawienia (dokonanego z udziałem bydlęcej hialuronidazy jądrowej) 6-siarczanu chondroityny, sposobem poprzednio opisanym (32). Cykloheksa-, hepta- i oktaamylozy otrzymano ze spółki Sigma. Te oligosacharydy można siarczanować sposobem opisanym w przykładzie 5.

I tak, na przyklpd, siarczan maltoheksaozy wyhvorzono w sposób pastępujący. Do roztworu 4,0 g kompleksu trójtlenek siarki-pirydyna (Aldrich) w 5 ml świeżo przedestylowanego DMF wkoplono, w temperaturze 80°C, roztwór 0,5 g maltoheksaozy w 15 ml suchej pirydyny, po czym całość ogrzewano w temperaturze 80°C dalej w ciągu 90 minut. SupernataMl zdekantowauo jeszcze na ciepło i kleistą pozostałość przemyto dokładnie 3 razy po 10 ml metanolu. Po zdekaotowamu pozostałego metanolu, tak otrzymany produkt rozpuszczono w 15 ml wody i utworzony tak roztwór zobojętniono, przy energicznym mieszaniu, do pH ~6 przy użyciu około 2,0 g octanu barowego w 10 ml wody. Po odwirowaniu przy 3000 x g, supematant zdekanCowpoo i zachowano, a osad wytrąconego siarczanu barowego przemyto dokładnie 3 razy po 10 ml wody. Zachowanyjak wyżej supernata^ i przemywki połączono ze sobą i wprowadzono pp kolumnę (2,5 x Mcm) z żywicą katlopitowo DOWEX 50W-X8-400 (forma H+). Kolumnę eluowano wodą, aż do osiągnięcia przez eluat odczynu obojętnego. Około 250 ml eluatu, przy mieszaniu, zobojętniono do pH -7 przy użyciu 3,5 g octanu sodowego. Roztwór rozcieńczono 1 litrem acetonu i odwirowano przy 1750 x g w celu wydzielenia produktu. Osad rozkruszorio w środowisku metanolu, w wyniku czego otrzymano subtelnie rozdrobniony proszek, po czym mieszano, ciągle w środowisku metanolu, a następnie odsączono. Przesącz przemyto kilka razy metanolem, w wyniku czego otrzymano 0,88 g (55%) czystego (nie zawierającego soli nieorganicznych) związku. Wytworzony tak związek nie był zanieczyszczony ani jonami barn) co stwierdzono metodą mikroanalizy oraz metodojopizacjl płomieniowej), ani azotem (co stwierdzono metodąmikroanalizy).

Stwierdzono, że produkt zawierał, na 20 możliwych, 14 pozycji zsiprczppowapych.

Analiza elementarna dla ^C36^H71^O73^S14-^Np9 ^{45 H}2O^;

Obliczono: C 13,8, H5,1, S 14,3, Na6,6;

Znaleziono: C 13,9, H 2,2 , S 14,3, Na 6,7.

Przewidywane wartości dla azotu i baru wynosiły, dla każdego, 0%; znaleziono, odpowiednio: 0,32% i 0%.

Dane 'H NMR (300 MHz-Gemini 300; dla roztworu acetonowego 2,25 ppm poniżej sygnału natężenia pola TMS) odnoszące się do powyższego siarczanu mpltoheksaozy wykazały, że na 20 możliwych, 14 pozycji było zslarczppowapych. Oznaczono to na podstawie przesunięć chemicznych wodorów skupionych wokół 4,15 pm (z całkowaniem dla 20 H) w funkcji wodorów skupionych wokół 4,4 ppm (z całkowaniem dla 16 H). Można więc założyć, że wszystkie pierwszorzędowe grupy OH, to znaczy grupy OH w pozycji 6, ąązsiarczapowrpe, ponieważ pozycja ta w najmniejszym stopniu ulega zawadzie przestrzennej. Następnie, zakłada się, że spośród wewnętrznych reszt cukrowych tylko jedna, w innej pozycji jest ząlarczapawapa. W przypadku wszy184 457 stkich krańcowych reszt cukrowych, oprócz jednej znajdującej się w pozycji 6, dwie inne pozycje będą zsiarczanowane.

Fosforan mannopentaozy otrzymano z egzopolisacharydu wytwarzanego przez diploidalne drożdże Pichia holstii (szczep NRRL Y-2448, poprzednio Hansenula holstii). Sposób prowadzenia hodowli P. holstii i wyodrębniania fosforanu mannopentaozy oparto na metodzie wcześniej opisanej (33, 34). Mówiąc krótko, surowy egzopolisacharyd wyodrębniono z supematantu hodowli drożdży prowadzonej w warunkach aerobowych, w postaci soli potasowej, za pomocą wytrącenia etanolem. Następnie zastosowano hydrolizę kwasową w celu uwolnienia fosforanu mannopentaozy z rdzenia estru fosfomannanu (PPME) egzopolisacharydu, po czym PPME i fosforan mannopentaozy rozdzielono jako sole barowe o odmiennej strącalności metodą różnicującego wytrącania etanolem, z następującą potem chromatografią żelową. Otrzymany oligosacharyd miał następującą budowę:

P-6-Man-a-(1—> 3)-Man-a-(1 —> 3)-Man-a-(1 -> 3)-Man-a-(1 —> 3)-Man (34).

Siarczan drożdżowego fosforanu mannopentaozy (33,34), wyodrębniony z egzopolischarydu otrzymanego z drożdży, wytworzono w sposób następujący. Zawiesinę 0,09 g drożdżowego fosforanu mannopentaozy w 2 ml DMF i 3 ml pirydyny wprowadzono do roztworu 0,8 g kompleksu trójtlenek siarki-pirydyna (Aldrich) w 1 ml DMF. Następnie, utworzoną tak mieszaninę ogrzewano w temperaturze 80°C w ciągu 2 godzin. Supernatant zdekantowano jeszcze na ciepło i kleistą pozostałość przemyto dokładnie 3 razy po 2 ml metanolu. Po zdekantowaniu pozostałego metanolu, tak otrzymany produkt rozpuszczono w 5 ml wody i zobojętniono, przy energicznym mieszaniu, do pH 6 przy użyciu około 0,7 g octanu barowego w 5 ml wody. Po odwirowaniu przy 3000 x g, supernatant zdekantowano, a wytrącony osad siarczanu barowego przemyto dokładnie 3 razy po 10 ml wody. Supernatant i przemywki połączono ze sobą i wprowadzono na kolumnę (2,5 x 14 cm) z żywicąkationitową DOWEX 50W-X8-400 (forma H⁺O). Kolumnę eluowano wodą, aż do osiągnięcia przez eluat odczynu obojętnego. Około 50 ml eluatu mieszano i zobojętniono (do pH 7) przy użyciu około 0,4 g octanu sodowego. Utworzony tak roztwór rozcieńczono 150 ml acetonu i odwirowano przy 1750 x g w celu wydzielenia produktu. Osad rozkruszono w środowisku metanolu, w wyniku czego otrzymano subtelnie rozdrobniony proszek, po czym mieszano, ciągle w środowisku metanolu, a następnie odsączono. Osad przemyto kilka razy metanolem, w wyniku czego otrzymano 0,18 g zsiarczanowanego drożdżowego fosforanu mannopentaozy. Wytworzony tak związek nie był zanieczyszczony ani jonami baru (co stwierdzono metodą mikroanalizy i metodą jonizacji płomieniowej) ani azotem (co stwierdzono metodą mikroanalizy).

Stwierdzono, że wytworzony związek zawierał, na 16 możliwych, 10 pozycji zsiarczanowanych.

Analiza elementarna dla C30H41O^PSuNią 25 H₂0;

Obliczono: C 15,3, H 3,5, P 1,3, S 13,6, Na 8,8 %;

Znaleziono: C 15,35, H 2,7, P 1,2, S 13,7, Na 8,5 %.

Przewidywane wartości dla azotu i baru wynosiły, dla każdego, 0%; znaleziono, odpowiednio: 0,16% i 0%.

Oligosacharydy utworzone z glukozy z wiązaniami 1,6-α wytworzono za pomocąpoddania hydrolizie kwasowej dekstranu (średnia masa cząsteczkowa 71000, Sigma Chemical Co.). I tak 5 g dekstranu rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej i powstały roztwór doprowadzono do pH 1,8 przy użyciu IM kwasu solnego. Otrzymaną w ten sposób mieszaninę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 100°C w ciągu 48 godzin. Następnie mieszaninę wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym doprowadzono do objętości 100 ml przy użyciu wody destylowanej, a potem powtórnie wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Do pozostałości dodano 100 ml etanolu absolutnego i alkohol odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość doprowadzono do objętości 4 ml przy użyciu wody destylowanej i wprowadzono na opłaszczonąkolumnę chromatograficzną ,5 x 90 cm) z żelem „fine grade P2 size exclusion” (BioRad). Kolumnę załadowano, ogrzano wstępnie i uruchomiono (dla ustabilizowania) w temperaturze 60°C na dwa dni przed użyciem. Po wprowadzeniu mieszaniny oligosacharydów utworzonych z glukozy z wiązaniami 1,6-α, kolumnę utrzymywano w temperaturze 60°C i eluowano wodą, przy

184 357 szybkości przepływu wynoszącej 1 ml/min. Produkty eluowane z kolumny identyfikowano jako piki metodąrefraktometrii różnicowej i stosownie do tego gromadzono frakcje. W ten sposób zebrano frakcje odpowiadające powierzchniom pod poszczególnymi pikami. Każdą z tych frakcji ponownie poddano chromatografii na takiej samej kolumnie z żelem P2, w temperaturze 60°C i eluowano wodą., przy szybkości przepływu wynoszącej 0,5 ml/min. I tak, przykładowo, 0,19 g frakcji zidentyfikowanej jako 1,6-a-glukoheksaoza ponownie poddano chromatografii, w wyniku czego otrzymano główny pik środkowy z jednym przegięciem po każdej stronie. Produkt eluujący się jako pik środkowy wyodrębniono za pomocą usunięcia wody pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano 0,16 g produktu, który znów poddano chromatografii na takiej samej kolumnie z żelem P2, w temperaturze 60°C, przy szybkości przepływa wynoszącej 0,3 ml/min. W ten sposób otrzymano 0,14 g glukoheksaozy (M+ = 990, elektrorozpylanie). W podobny sposób wyodrębniono 1,6-a-glukotriozę, 0,21 g 1,6-a-glukotetraozy i 0,17 g 1,6-a-glukopentaozy.

Przykład 7

A. Materiały i metody

Aktywność przeciwkrzepliwa siarczanowanych oligosacharydów

Aktywność przeciwkrzepliwa każdego z siarczanowanych oligosacharydów oceniano sposobem poprzednio opisanym (35), przy zastosowaniu zarówno czasu trombinowego jak i czasu kaolinowo-kefalinowego. Aktywność każdego z preparatów porównywano z aktywnością kontroli heparynowej wyrażając to jako procent aktywności heparyny.

Test angiogenezy u człowieka

Metoda przyjęta w tym teście została opisana w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/AU95/00105, którego ujawnienie jest włączone do niniejszego opisu jako odnośnik. Z powierzchni łożysk ludzkich, w ciągu 6 godzin po porodzie, wycięto naczynia krwionośne, o średnicy około 1 -2 mm o długości 2-5 cm. Naczynia te umieszczono w roztworze Hanksa BBS zawierającym 2,5 mg/ml amfoterycyny B (Fungizone) i pocięto na odcinki o długości 1 -2 mm przy użyciu pincety anatomicznej i nożyczek do irydektomii. Fragment naczyń pozbawiono resztek skrzepów i przed użyciem namoczono je w roztworze Hanksa BSS. Wypreparowania naczyń i ich posegmentowania dokonano posiłkując się lampą powiększającą (Maggylamp, Newbound, Balmain, NSW, Australia). Podobne odpowiedzi angiogenetyczne otrzymano w przypadku badania naczyń krwionośnych tak pochodzenia żylnego, jak i tętniczego, ale do danego badania użyto odcinków naczyń pochodzących z jednego tylko naczynia.

Testy angiogenezy przeprowadzano na 24- lub 48-dołkowych płytkach do hodowli (Costar, Cambridge, MA). W przypadku płytek 24-dołkowych, do każdego dołka wprowadzono 30 pl trombiny bydlęcej (50jednostekNIH/m1w0,15 MNaCl; Sigma Chemical Co., StLouis, MO), a potem 1,0 ml/dołek 3 mg/ml fibrynogenu bydlęcego (Sigma) w podłożu Medium 199. Trobinę szybko zmieszano z fibrynogenem i w środku dołka szybko umieszczono jeden odcinek naczynia, zanim jeszcze doszło do utworzenia się skrzepu.

Zwykle, tworzenie się żelu fibryny następowało w ciągu 30 sekund i odcinek naczynia pozostawiano w zawieszeniu w żelu. Po utworzeniu się żelu, dodano 1,0 m/dołek Medium 199 uzupełnionego 20% płodową surowicą cielęcą (FCS), 0,2 mg kwasu ε -aminoheksanowego, L-glutaminą i antybiotykami (gentamycynąi amfoterycynąB). W przypadku płytek 48-dołkowych, wszystkich odczynników użyto w połowie objętości. Naczynia inkubowano w temperaturze 37°C w otoczeniu nawilgacanym w ciągu 14-21 dni, przy wymianie podłoża dwa razy na tydzień. Angiogenezę kwantyfikowano analizą obrazów komputerowych, z wykorzystaniem oprogramowania NIH Image lub obrazów cyfrowych hodowli otrzymanych przy użyciu kamery cyfrowej Dycam zamontowanej na mikroskopie odwróconym (Olympus, Tokio, Japonia).

Test heparanazowy

Test heparanazowy oparty jest na obserwacji, że białko surowicy, glikoproteina o wysokiej zawartości histydyny (HRG) wiąże się z łańcuchami siarczanu heparanu i maskuje miejsce rozszczepiania heparanazy. W oparciu o odkrycie, że rozszczepiony heparanazą siarczan heparanu nie wiąże się z HRG, opracowano test heparanazowy, obejmujący trawienie znakowanych ³H

184 357 łańcuchów siarczanu heparanu heparanazą, wiązanie strawionego siarczanu heparanu z kuleczkami sprzężonymi z HRG i mierzeniu nie związanego znacznika ³H. Wraz ze podwyższaniem się stopnia strawienia substratu, powiększała się ilość znacznika 3h, który nie wiązał się z kulkami HRG. Tak więc, sposób ten stanowi prostą i szybką metodę przeprowadzania pomiaru aktywności heparanazy w ekstraktach z tkanek i dokonywania oceny hamowania aktywności heparanazy przez rozmaite związki.

Na początku, bydlęcy jelitowy siarczan heparanu (średnia pozorna masa cząsteczkowa 32 kDa) był częściowo od-N-acetylowany za pomocą ogrzewania w środowisku hydratu hydrazyny (36), a potem ponownie acetylowany przy użyciu znakowanego 3H bezwodnika octowego. Drobiową HRG oczyszczoną metodą podaną przez Rylatta i in. (1981) (37), sprzężono z aktywowaną CNBr Sepaharose 4B (Pharmacia), zgodnie z instrukcjami wytwórcy.

Aktywność ludzkiej płytkowej heparanazy oznaczono sposobem obejmującym inkubację (w temperaturze 37°C, w ciągu 30 minut) oczyszczonej ludzkiej płytkowej heparanazy (co do której stwierdzono, że posiada taką samą aktywność w stosunku do siarczanu heparanu, jaką zaobserwowano w przypadku hodowli linii komórkowych wysokoprzerzutowego ludzkiego raka HCT 116, szczurzego gruczolakoraka 13762 MAT i mysiego czerniaka B16) z 60 pmolami znakowanego promieniotwórczo 3h bydlęcego jelitowego siarczanu heparanu. Aktywność oznaczano przez szybkość wytwarzania mniejszych (w przybliżeniu 5 kDa) fragmentów siarczanu heparanu, nie związanych po przepuszczeniu około 100 pl mieszaniny inkubacyjnej przez minikolumny HRG-Sepharose (200 pl załadowanych kuleczek), które zatrzymywały większy, nie rozszczepiony lub częściowo rozszczepiony substrat.

Test przerzutów

Aktywność przeciwprzerzutową różnych siarczanowanych oligosacharydów oceniano z zastosowaniem szczurzego wysokoprzerzutowego raka gruczołu sutkowego 13762 MAT (35). Komórki nowotworowe utrzymywano in vitro w sposób uprzednio opisany (35). Samicom szczurów Fisher 344 (w wieku 10-13 tygodni) wstrzyknięto dożylnie (i.v.) 2 x 10⁵ komórek 13762 w 0,6 ml podłoża RPMI1640 zawierającego 10% FCS. Równocześnie ze wstrzyknięciem zawiesiny komórek nowotworu, zwierzętom wstrzyknięto także po 2 mg siarczanowanego oligosacharydu. Podobne wyniki otrzymano przy wstrzykiwaniu oligoscharydu tak i.v., jak i dootrzewnowo (i.p.) lub podskórnie (s.c.). Po upływie 13 dni od dokonania wstrzyknięcia komórek nowotworu, od szczurów pobrano płuca i. umieszczono je w roztworze Bouina na co najmniej 24 godziny, po czym dokonywano oceny przerzutów do płuc pod lupą do oglądania preparatów. Liczbę przerzutów do płuc u szczurów potraktowanych siarczanowanym oligosacharydem porównano z liczbą przerzutów zaobserwowanych u zwierząt kontrolnych, przy czym w skład każdej grupy były włączone co najmniej cztery zwierzęta.

Wpływ siarczanowanych oligosacharydów na interakcję FgF-heparyna/siarczan heparyny

Test wiązania, który opisany jest szczegółowo gdzie indziej (38), zastosowano do mierzenia wiązania aFGF i bFGF z heparyną i dokonywania oceny zdolności rozmaitych siarczanowanych oligosacharydów do hamowania omawianej interakcji. Mówiąc krótko, FGF immobilizowano w dołkach 96-dolkowych płytek PCW i dokonywano oceny wiązania promieniotwórcze znakowanej heparyny z immobolizowanymi FGF. W testach hamowania, seryjne rozcieńczenia siarczanowanych oligosacharydów poddano sprawdzaniu pod względem ich zdolności do hamowania interakcji FGF-heparyna. Wyniki badań nad hamowaniem wyrażono jako stężenie siarczanowanego oligosacharydu potrzebne do zahamowania wiązania heparyny z immobilizowanymi FGF o 20 % lub o 50 %. Jako kontrolę, we wszystkich eksperymentach nad hamowaniem wiązania włączono nieznakowaną heparynę.

Interakcję FGF-heparan oceniano, jak o tym doniesiono wcześniej (29), przez pomiar wiązania fibroblastów BALB/c 3T3 z FGF immobilizowanych na PCW, przy czym detekcji wiązania komórek dokonywano za pomocą barwienia różem bengalskim przylegających komórek. Siarczanowane oligosacharydy poddano badaniu pod względem ich zdolności do hamowania tego procesu adhezji komórek, który całkowicie zależy od struktur heparanu siarczanu na

184 357 powierzchni komórek BALB/c 3T3 (39). Dane wyrażono jako stężenie siarczanowanego oligosacharydu, które powodowało zahamowanie adhezji komórek o 50% (IC50).

Model zapalenia torebki powietrznej

Test ten oparty jest na metodzie uprzednio opisanej (40). Podskórne torebki powietrzne utworzono na grzbietach myszy za pomocą wstrzyknięcia 5 ml jałowego powietrza pod powierzchnię wygolonej skóry między łopatkami znieczulonej myszy w dniu 1. W dniu 3 torebkę ponownie nadmuchano za pomocą wstrzyknięcia 2,5 ml powietrza. Stan zapalny wywołano w dniu 6 za pomocą wstrzyknięcia, bezpośrednio do torebki, 1,0 ml 56 mg/ml tioglikolanu lub 1,0 ml wodnego roztworu chlorku sodowego jako kontroli. Po upływie około 17-20 godzin od wstrzyknięcia tioglikolanu, zwierzęta uśmiercono za pomocą przemieszczenia kręgów szyjnych i zawartość komórkową każdej torebki odzyskano za pomocą wstrzyknięcia 2,5 ml lodowato zimnego PBS/5% FCS. Siarczanowane oligosacharydy przebadano pod względem ich zdolności do hamowania reakcji zapalnej, przy ich podskórnym wstrzyknięciu (50 pl PBS) w oddzielne miejsce, następującym bezpośrednio po podaniu tioglikolanu. Jako kontrolnego leku przeciwzapalnego użyto prednizolonu, przy jego podskórnym wstrzyknięciu, w oleju, w dawce 25 mg/kg. Całkowitą zawartość komórkową w każdej torebce oznaczano przy użyciu ulicznika Coultera i różne subpopulacje leukocytów oceniano metodąinmiunofluorescencyjnej cytometrii przepływowej.

Model astmy u myszy

Uprzednio opisany mysi model astmy (41) zastosowano do przebadania zdolności siarczanowanych oligosacharydów do hamowania naciekania granulocytów eozynochłonnych do płuc, wywoływanego działaniem aeroalerginy (owoalbuminy, OVA). Myszy C57BL/6, w wieku 6-10 tygodni, uczulono za pomocą wstrzyknięcia i.p. 50 mg OVA/1 mg preparatu Alhydrogel (CSL Ltd., Parkville, Australia) w 0,9% jałowym wodnym roztworze chlorku sodowego w dniach 0 i 12. W dniu 24, myszy eksponowano na działanie aerozolu OVA, użytej w stężeniu 10 mg/ml, w 0,9% wodnym roztworze chlorku sodowego, w ciągu 30 minut, 3 razy, z 1-godzinnymi przerwami. Następnie, na podobnąprowokację eksponowano je w dniach 26 i 28. Aerozol wytwarzano w ilości 6 litrów/minutę przy użyciu rozpylacza, produkującego cząstki o średnicy średniej wynoszącej 39 pm wprost do zamkniętej komory o objętości 800 cm³. W dniu 29 myszy uśmiercono za pomocąprzemieszczenia kręgów szyjnych. Do tchawicy wprowadzono kaniulę i światła dróg oddechowych przemyto 4 razy po 1 ml 0,9% wodnego roztworu chlorku sodowego zawierającego BSA w stężeniu 0,1% obj/obj, w temperaturze 37°C. Na jedno przemycie odzyskiwano około 0,8 ml wkroplonego płynu. Zgromadzono otrzymany u każdego zwierzęcia płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) i oznaczono liczbę komórek przy użyciu typowego hemocytometru. Zawarte w BALF komórki poddano także odwirowaniu i barwieniu różnicowemu przy użyciu roztworu Maya-Grunwalda-Giemsy, przy czym granulocyty eozynochłonne zidentyfikowano wykorzystując kryteria morfologiczne. Dane skwantyfikowano jako liczbę granulocytów obojętnochłonnych/ml BALF. Siarczanowane oligosacharydy podawano zwierzętom albo układowo, przy użyciu wprowadzonych dootrzewnowo mimpomp osmotycznych typu Alzet, albo poprzez płuca jako aerozol. Minipompy osmotyczne wprowadzono w dniu 23, na 24 godziny przed prowokacją OVA. Uwalniały one lek w sposób ciągły, aż do uśmiercenia zwierząt w dniu 29. W przypadku dostarczania aerozolu, myszy eksponowano na działanie siarczanowanych oligosacharydów w 0,9% wodnym roztworze chlorku sodowego, w ciągu 30 minut, 3 razy, z 1-godzinnymi przerwami, w dniach 23, 25 i 27.

Model doświadczalnego autoimmunologicznego zapalenia opon mózgowych i mózgu (EAE)

Otrzymano preparat komórek śledziony w celu adopcyjnego przeniesienia EAE sposobom uprzednio opisanym (43). Mówiąc krótko, szczury Lewis uczulono na mielinowe białko zasadowe, immunizowane komórki śledziony zaktywowano przez podziałanie ConA in vitro, po czym do każdego biorcy przeniesiono i.v. 30 x 106 zaktywowanych ConA komórek efektorowych EAE. Podczas przenoszenia komórek wszczepiono podskórnie minipompy osmotyczne (Alzet) zawierające siarczanowane oligosacharydy. Uwalniały one lek w dawce wynoszącej 70 mg/kg/dzień w ciągu 14 dni. Kliniczne EAE stopniowano według następującego schematu:

184 357

0: brak objawów,

1: dystalna część ogona zwiotczała,

2: cały ogon zwiotczały,

3: ataksja, trudności przy wyprostowaniu,

4: osłabienie tylnej łapy,

5: porażenie tylnej łapy.

Model choroby połączonej ze stanem zapalnym

Chorobę połączoną ze stanem zapalnym wywołano u myszy przez dodanie do wody do picia 5% (wag/obj) soli sodowej siarczanu dekstranu (DSS) dostarczonej przez TdB Consultancy, Uppsala, Szwecja. Roztwór doprowadzono Do pH 8,0 i sączono przez błonę typu „0,45 (i media membrane”. Roztwory DSS zbierano co dzień, powtórnie sączono i objętość ustalano świeżym, podstawowym DSS. Samce myszy BALB/c w wieku 6-7 tygodni przeszukano pod względem masy ciała i sztuki o masie w zakresie od 20 do 23 g zgrupowano w klatkach po 5 myszy/klatkę.

Myszom wstrzykiwano fosforan siarczanowanej mannopentaozy w dawce wynoszącej 20 mg/kg/dzień lub vehiculum (jałową wodę) z 8-godzinymi przerwami, od dnia 0 do dnia 10. Objętość wstrzykiwaną standaryzowano Do 100 ml i wstrzykiwano w kark.

Szybkość pobierania DSS, masę ciała i zaobserwowane objawy u wszystkich myszy punktowano na skali ocen każdego dnia. Wszystkie objawy biegunki i krwawienia odbytniczego punktowano na skali albo jako lekkie albo ciężkie i przypisywano im wartości liczbowe, odpowiednio, 11 4. Rejestrowano także obecność śluzu i włączano do zapisu, punktując jąjako lekką biegunkę. Następnie, sumę punktacji biegunki i krwawienia odbytniczego podzielono przez liczbę zwierząt przeżywających w danej grupie danego dnia. Całkowita punktacja stanowi sumę punktów dla biegunki i krwawienia odbytniczego.

B. Wyniki

Antyangiogenetyczna i przeciwprzerzutowa aktywność zsiarczanowanych oligosacharydów występujących w przyrodzie

Po zsyntetyzowaniu szeregu zsiarczanowanych występujących w przyrodzie oligosachaiydów, poddano je badaniu w szeregu testów biologicznych. W tabeli 1 podsumowano wyniki otrzymane dla siarczanowanych postaci 12 oligosacharydów występujących w przyrodzie. Dla porównania, w tabelę 1 włączono wyniki uzyskane dla aktywności biologicznej suraminy (związku o umiarkowanej aktywności antyangiogenetycznej i hamującej aktywność heparanzy) (42) i heparyny.

Wpierw pokazano, że wszystkie poddawane badaniu zsiarczanowane oligosacharydy posiadały nie znaczącą aktywność przeciwkrzepliwą, to znaczy < 2% aktywności heparyny (tabela 1). Była to ważna ich właściwość, ponieważ heparyna, będąca silnym związkiem o właściwościach przeciwprzerzutowych, wykazywała ograniczoną jedynie przydatność w tym wskazaniu ze względu na jej silną aktywność przeciwkrzepliwą.

Trzy zsiarczanowane występujące w przyrodzie oligosacharydy okazały się nader silnymi inhibitorami angiogenezy u człowieka. Są to, mianowicie, siarczanowany fosforan mannopentaozy (pochodzący z P. holstii), siarczan maltoheksaozy i siarczan maltotetraozy. Spośród wymienionych związków, najsilniej działającymi okazały się fosforan mannopentaozy i maltoheksaoza, dającymi 50% zahamowania przy stężeniu wynoszącym 2 Ug/ml, podczas gdy maltotetraoza dawała 50% zahamowania przy stężeniu wynoszącym 20 Ug/ml. Przykład wyraźnie zaznaczonego oddziaływania hamującego angiogenezę, powodowanego przez siarczan maltoheksaozy użytej w stężeniu 20 Ug/ml, pokazano na fig. 1. Interesujące jest stwierdzenie, że heparyna przejawiała słabą aktywność antyangiogenetyczną. A więc, wydaje się prawdopodobne, że dla przejawienia tego typu aktywności konieczne są siarczanowane oligosacharydy o względnie krótkim łańcuchu. Pełniejsze miareczkowanie hamowania angiogenezy przez związki z serii związków wywodzących się z maltozy pokazano na fig. 2, a przez siarczanowany fosforan mannopentaozy na fig. 3. Można zobaczyć, że w przypadku związków z serii związków stanowiących pochodne maltozy, siarczan maltozy przejawiał niewielką tylko aktywność hamującą, podczas gdy siarczan maltotetraozy i siarczan maltoheksaozy były stosunkowo silnymi inhibitorami (fig. 2).

184 357

Wszystkie przeprowadzone dotyczące angiogenezy eksperymenty przedstawione w tabeli 1 obejmowały wprowadzanie oligosacharydu do podłoża hodowlanego w momencie rozpoczęcia badania angiogenezy. Jednakże, badania wstępne (dane nie pokazane) wskazują na to, że dodanie siarczanu maltoheksaozy po rozpoczęciu odpowiedzi angiogenetycznej, także może wywrzeć działanie hamujące, jeśli chodzi o dalszy nadmierny rozrost naczyń. Tym niemniej jednak, do najbardziej skutecznego zahamowania dochodzi w przypadku wprowadzenia omawianego związku przy rozpoczynaniu hodowli.

Siarczanowane oligosacharydy różniły się znacznie między sobątakże pod względem swej aktywności jako inhibitory heparanazy. Przy czym najsilniej działającymi okazały się siarczanowany fosforan mannopentaozy i siarczan maltoheksaozy. Aktywność tych dwóch związków przypomina aktywność heparyny (tabela 1). Jest rzeczą interesującą, że te dwa związki są także skutecznymi związkami antyangiogenetycznymi. Jednakże, hamowanie angiogenezy nie korelowało się z aktywnością polegającą na hamowaniu czynności heparanazy, przejawianą przez wiele związków'. I tak, na przykład, siarczanowane cykloamylozy były stosunkowo silnymi inhibitorami heparanazy, ale słabymi inhibitorami angiogenezy. Badania przeprowadzone nad związkami z serii związków wywodzących się z maltozy dostarczyły wielu informacji odnoszących się do długości łańcucha i hamowania czynności heparanazy. W tabeli 3 zaprezentowano aktywność polegającą na hamowaniu czynności heparanazy dla całej serii związków wywodzących się z maltozy, w zakresie od disacharydu (maltoza) do heptasacharydu (maltopentaoza). Maltoza nie wykazała aktywności inhibitora, maltotrioza była słabym inhibitorem, maltotetraoza wykazała umiarkowaną aktywność jako inhibitor, podczas gdy penta-, heksa- i heptasacharydy przejawiły wysoką aktywność jako inhibitory·'. Tak więc, dla hamowania czynności heparanazy w stopniu optymalnym potrzebny jest siarczanowany pentasacharyd lub jeszcze dłuższy sacharyd.

Również wiele siarczanowanych cukrów przebadano in vivo pod względem aktywności przeciwprzerzutowej (tabela 1). Ogólnie, stwierdzono występowanie racjonalnie dobrej korelacji między hamowaniem czynności heparanazy a aktywnością przeciwprzerzutową. I tak, siarczanowany fosforan mannopentaozy i siarczan maltoheksaozy, dwa związki o największej aktywności inhibitorów heparanazy, przejawiają zarazem największą aktywność przeciwprzerzutową, przy czym, w rzeczywistości, nie różnią się one wyraźnie od heparyny pod względem swej zdolności do zapobiegania przerzutom (tabela 1). Dwa inne związki, a mianowicie siarczan cyklooktaamylozy i siarczan stachiozy, okazały się umiarkowanie skutecznymi środkami przeciwprzerzutowymi i ta ich właściwość jest zgodna z ich raczej skromną aktywnością inhibitorów czynności heparanazy. Łącznie, dane te sugerują, że siarczanowany fosforan mannopentaozy i siarczan maltoheksaozy posiadają jednocześnie znaczną aktywność antyangiógenetyczną, aktywność przeciwprzerzutową i aktywność polegającą na hamowaniu czynności heparanazy.

Aktywność przeciwprzerzutową siarczanowanych oligosacharydów będących związkami z serii pochodnych maltozy przedstawiono w sposób bardziej szczegółowy na fig. 4. Wraz ze wzrostem długości łańcucha obserwowano stały wzrost aktywności przeciwprzerzutowej oligosacharydów, przy czym najbardziej aktywnymi okazały się penta-, heksa i heptasacharydy. W przypadku podawania drogądóżylną(i.v.) w dawce wynoszącej 2 mg/szczura, siarczan maltozy nie wywierał żadnego działania, jeśli chodzi o tworzenie się przerzutów (fig. 4A), ale przy jego podskórnym (s.c.) podawaniu w dawce wynoszącej 4 mg/szczura obserwowano znaczną aktywność polegającą na hamowaniu powstawania przerzutów (fig. 4B). Wyniki dalszych eksperymentów potwierdziły to, że niezależnie od drogi podawania leku przez wstrzyknięcie (to znaczy i. v., s.c. lub i.p.) siarczanowane oligosacharydy wykazywały porównywalną aktywność przeciwprzerzutową (dane nie pokazane). I rzeczywiście, aktywność przeciwprzerzutową siarczanu maltozy obserwowano tylko wtedy, gdy zwierzętom podawano związek w dużych dawkach. Ponieważ siarczan maltozy jest bardzo słabym inhibitorem heparanazy, wynik taki sugeruje, że hamowanie aktywności heparanazy może nie stanowić jedynej drogi hamowania przez siarczanowane oligosacharydy przerzutów nowotworów, zwłaszcza w przypadku zastosowania dużych dawek oligosacharydów.

184 357

Cykloamylozy zsiarczanowano i włączono do badań, ponieważ przedstawiają one sobą oligosacharydy nieliniowe. Interesujące jest stwierdzenie, że związki te przejawiły umiarkowanąjedynie aktywność (tabela 1), co implikuje, że dla uzyskania optymalnej aktywności wymagane są oligosacharydy liniowe. Następnie, najbardziej aktywne siarczanowane oligosacharydy okazały się o wiele bardziej skutecznymi inhibitorani angiogenezy, tworzenia przerzutów i aktywności heparanazy niż suramina (tabela 1), a więc lek poddawany obecnie próbom klinicznym jako środek antyangiogenetyczny (42).

Ponieważ aktywność antyangiogenetyczna omawianych związków nie zawsze jest bezpośrednio skorelowana z ich aktywnością polegająca na hamowaniu czynności heparanazy, wydawało się prawdopodobne, że siarczanowane oligosacharydy mogą hamować zachodzenie procesu angiogenezy także na zasadzie innych mechanizmów. Jak powyżej wspomniano, wysoce prawdopodobne jest, że niektóre siarczanowane oligosacharydy mogą zakłócać czynność angiogenetycznych czynników wzrostowych przez przerywanie interakcji czynnik wzrostu-siarczan heparanu. Uprzednio wykonane analizy (patrz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr PCT/AU95/00105) wykazały, że wyniki przeprowadzonego w tym przykładzie testu angiogenezy u człowieka w dużym stopniu uzależnione są od działania endogennego bFGF, a w mniejszym stopniu od działania aFGF i VEGF. Toteż, rozmaite siarczanowane oligosacharydy poddano badaniom pod względem ich zdolności do działania jako czynniki konkurencyjne we wzajemnym oddziaływaniu bFGF, aFGF i VEGF z heparyną i siarczanem heparanu.

Stwierdzono, że wraz ze wzrostem długości łańcucha, sulfonowane oligosacharydy stanowiące związki z serii pochodnych maltozy stawały się coraz to bardziej skutecznymi inhibitorami interakcj i bFGF i aFGF z siarczanami heparanu obecnymi na powierzchni komórki (tabela 2), co oznacza, że maltoza była słabym inhibitorem, podczas gdy penta-, heksa- i heptasacharydy okazały się najbardziej aktywne. Siarczanowany fosforan mannopentaozy także przejawiał znaczącą aktywność w tym układzie (tabela 2). Na figurze 5 przedstawiono pełne krzywe hamowania interakcji aFGF-siarczan heparanu przez siarczanowane oligosacharydy z serii pochodnych maltozy. Badania dodatkowe (dane nie pokazane) wykazały, że siarczan maltoheksaozy był także silnym inhibitorem wiązania znakowanej promieniotwórcze heparyny z bFGF I aFGF.

Ponieważ siarczan maltoheksaozy był jednym z najbardziej aktywnych związków antyangiogenetycznych i przeciwprzerzutowych, wpływ stopnia zsiarczanowania na jego aktywność biologiczną zbadano bardziej szczegółowo. Wpierw zauważono, że nawet pomimo wykrycia pewnej aktywności przeciwkrzepliwej dla najbardziej zsiarczanowanej maltoheksao/y, aktywność ta pozostawała ciągle ekstremalnie niska w porównaniu z aktywnością heparyny (tabela 2). Jednakże, wraz ze stopniem zsiarczanowania, obserwowano stałe zwiększanie się zdolności maltoheksaozy do hamowania czynności heparanazy i wiązania się FGF z siarczanem heparanu (tabela 2). Tym niemniej jednak, aktywność polegająca na hamowaniu ulegała spłaszczeniu w obu układach, gdy zsiarczanowanie wynosiło 85 % lub więcej.

Badania nad tworzeniem przerzutów (fig. 6) wykazały również, że wraz ze wzrostem stopnia zsiarczanowania, siarczan maltoheksaozy stawał się coraz to bardziej skutecznym lekiem przeciwprzerzutowym. W przeciwieństwie do tego, zaistniała sugestia, że zsulfonowana w wysokim stopniu maltoheksaoza (90-100% zsulfonowania) była mniej skutecznym inhibitorem angiogenezy (fig. 7). Dane te sugerują, że istnieją tu subtelne różnice pod względem optymalnej struktury siarczanowanych oligosacharydów, niezbędnej do wywarcia hamującego wpływu na angiogenezę i tworzenia przerzutów. Niemniej jednak, zidentyfikowano pewną ilość siarczanowanych oligosacharydów, wywodzących się od oligosacharydów występujących w przyrodzie, które jednocześnie przejawiają silną aktywność przeciwprzerzutową i ant^angiogenetyczną. Związkami tymi są siarczanowany fosforan mannopentaozy z P. holstii oraz siarczan maltopentaozy, siarczan maltoheksao/y i siarczan maltoheptaozy.

Antyanglogenetyc/na i przeciwprzerzutową aktywność siarczanowanych oligosacharydów syntetycznych

Przebadano także syntetyczne siarczanowane oligosacharydy pod względem ich aktywności biologicznej. W tabeli 3 podsumowano wyniki odnoszące się do zdolności siarczanowanych

184 357 oligosacharydów syntetycznych zawierających mannozę, galaktozę lub glukozę do hamowania krzepnięcia, czynności heparanazy i powstawania wiązania czynnik wzrostu-siarczan heparanu. Wszystkie przebadane pod tym względem siarczanowane oligosacharydy wykazały jedynie mało znaczącą aktywność przeciwkrzepliwą. Jednakże, z wyjątkiem trisacharydów złożonych z mannozy oraz z glukozy, wszystkie inne siarczanowane oligosacharydy okazały się w racjonalnym stopniu skutecznymi inhibitorami aktywności heparanazy i powstawania wiązania czynnik wzrostowy-siarczan heparanu. I rzeczywiście, ogólny wniosek jest ten, że siarczanowane oligosacharydy syntetyczne, zawierające od 4 do 6 jednostek heksozy (to znaczy D-mannoza, D-galaktoza i D-glukoza), są w warunkach tych badań wysoce aktywne.

Wyjątkiem jest tu siarczan galaktotriozy, który okazał się zasadniczo tak samo aktywnyjak inni członkowie serii związków wywodzących się z galaktozy.

W przypadku badania w teście angiogenezy u człowieka, siarczanowane oligosacharydy utworzone z mannozy okazały się inhibitorami, z tym, że penta- i heksasacharydy były bardziej aktywne od tetrasacharydu (fig. 8), przypominając, pod względem skuteczności działania, siarczanowany fosforan mannopentaozy. Podobnie, siarczanowane tetra-, penta- i heksasacharydy utworzone z mannozy okazały się tak skuteczne, jako leki przeciwprzerzutowe, jak siarczanowany fosforan mannopentaozy (fig. 9). Siarczanowane oligosacharydy utworzone z galaktozy oraz siarczan glukoheksaozy także wywierały działanie hamujące tworzenie przerzutów (fig. 10), aczkolwiek przejawiały one tendencję do wykazywania nieco mniejszej aktywności od związków zawierających mannozę.

Przeciwzapalna aktywność siarczanowanych oligosacharydów

Jak powyżej wspomniano, kluczową barierę dla dostawania się leukocytów do miejsc ze stanem zapalnym stanowi podśródbłonkowa błona podstawna. W celu przejścia przez tę błonę, leukocyty muszą użyć całego zestawu enzymów rozkładających (11). Szczególnego znaczenia nabiera przy tym endoglikazydaza, hepanaraza, która rozszczepia łańcuchy siarczanu heparanu złączone z błoną podstawną i jest istotnym czynnikiem dla wynaczynienia leukocytów (12,13). I rzeczywiście, tak jak to miało miejsce w przypadku badań nad hamowaniem tworzenia się przerzutów (35), siarczanowane polisacharydy, które hamują aktywność heparanazy są silnymi inhibitorami zapalenia (43,44). W oparciu o te informacje, fachowcy w tej dziedzinie wiedzy mogąprzewidywać, że siarczanowane oligosacharydy, które okazały się silnymi środkami antyangiogenetycznymi i przeciwprzerzutowymi, będą bardzo skutecznymi związkami o działaniu przeciwzapalnym. Szczególne znaczenie, z tego punktu widzenia, mają siarczan maltoheksaozy i siarczan mannopentaozy. Następnie, ponieważ angiogeneza jest związana z przewlekłymi chorobami zapalnymi, takimi jak zapalenie stawów reumatoidalne (18), aktywność angiogenetyczna tych związków stanowić będzie dodatkową wartość w leczeniu stanów zapalnych.

Dowody świadczące na korzyść takiego przewidywania uzyskano w szeregu zwierzęcych modeli stanów zapalnych.

Po pierwsze, siarczan maltoheksaozy, siarczan mannopentaozy i siarczanowany fosforan mannopentaozy wykazały zdolność do hamowania, i to w znaczącym stopniu, wywołanego działaniem tioglikolanu zapalenia torebki powietrznej (tabela 4). I rzeczywiście, w jednym z eksperymentów siarczan mannopentaozy, w pojedynczym wstrzyknięciu, okazał się równie skuteczny jak prednisolon, w przypadku hamowania naciekania leukocytów, przeważnie o charakterze obojętnochłonnym. Natomiast siarczan maltoheksaozy był nieco mniej skuteczny. Nawet jeszcze silniejsze zahamowanie odpowiedzi zapalnej zaobserwowano wtedy, gdy siarczanowane oligosacharydy wstrzyknięto w dwu równych dawkach w odstępie 6-godzinnym.

Po drugie, siarczanowane oligosacharydy przetestowano pod względem ich zdolności do wywierania działania hamującego w mysim modelu astmy przewlekłej. Model ten odznacza się tym, że stosuje się tu intensywny dopływ granulocytów eozynochłonnych do płuc myszy, wywołany prowokacją aeroalergenem (41). Taka odpowiedź zapalna jest charakterystyczna dla astmy przewlekłej u ludzi. W przypadku podawania poprzez minipompy osmotyczne, siarczan maltoheksaozy i siarczan mannopentaozy wyraźnie hamowały nagromadzanie się granulocytów eozynochłonnych w płucach myszy (tabela 5). Również siarczan maltoheksaozy przejawiał

-84 357 w pewnym stopniu aktywność przeciwzapalną, gdy był podawany w postaci aerozolu, w stężeniu wynoszącym 40 mg/ml.

Po trzecie, zarówno siarczan mannopentaozy jak i siarczanowany fosforan mannopentaozy w znaczącym stopniu hamowały EAE w szczurzym modelu choroby (tabela 6). I rzeczywiście, u niektórych zwierząt potraktowanych siarczanowanymi oligosacharydami nie obserwowano objawów dalszego rozwoju choroby. Dane te są zgodne z wynikami wcześniejszych badań wskazującymi na to, że siarczanowane polisacharydy, które hamują aktywność heparanazy, mogą zmniejszać ciężkość EAE (43).

W końcu, fosforan mannopentaozy poddano badaniu sprawdzającemu jego zdolność do wywierania działania hamującego na chorobę jelit połączoną ze stanem zapalnym u myszy. W modelu tym, w którym stan zapalny wywołuje się dodaniem siarczanu dekstranu do wody do picia, doprowadza się do zapalenia okrężnicy, przypominającego zapalenie okrężnicy wrzodziejące i, w mniejszym stopniu, chorobę Chrona. Stwierdzono, że siarczanowany fosforan mannopentaozy podawany w dawce wynoszącej 20 mg/kg/dzień powodował znaczne osłabienie ostrego zapalenia okrężnicy, a także zapobiegał utracie masy ciała powodowanej przez tę chorobę (tabela 7). Kontrole w tym eksperymencie otrzymywały, we wstrzyknięciach, siarczanowane oligosacharydy ale nie siarczan dekstranu w dostarczanej im wodzie do picia.

Tabela 1

Hamowanie angiogenezy, aktywności heparanazy i tworzenia przerzutów u człowieka przez /siarczanowane postacie rozmaitych oligosacharydów występujących w przyrodzie

Związek	Liczba jednostek sacharydu	Aktywność przeciw-krzepl iwaa (%)	Stężenie hamujące 50% (pg/ml)	Tworzenie przerzutów (% kontroli^
Angiogeneza	Heparanaza
Heparyna	około 60	100	>2000	a	20 ±3
Fosforan mannopentaozy SO4	5	0,2	2	2	31 ±3
Rafmoza SO4	3	1,6	200	50	48 ±9
Stachioza SO4	4	3,2	2000	12	36 ±4
Maltoza SO4	2	0	2000	>1000	99 ±9
Maltotetraoza SO4	4	0,8	20	10	72 ±9
Maltoheksaoza SO4	6	1,6	2	1,5	24 ±7
Cykloheksaamyloza SO4	6	0,4	200	8	107 ±7
Cyklohcptaamyloza SO4	7	0,8	200	7	81 ± 14
Cyklooktaamyloza SO4	8	1,6	200	5	36 ±6
Chondroityna tetra S04	4	0	2000	>30	ND
Chondroityna keksa SO4	6	0,2	2000	45	ND
Chondroityna okta SO4	8	ND	1000	ND	ND
Suramina	-	0,1	50	8	74 ±8

^a Aktywność przeciwkrzephwa jako procent aktywności heparyny (100 %) ^b Procentowe kontrolne tworzenie przerzutów ± błąd standardowy średniej (n = 4) w płucach szczurów otrzymujących i v komórki 13762 MAT 12 mg/szczura każdego oligosacharydu podczas wstrzykiwania komórek nowotworowych Wartości podkreślone odnoszą się do związków o najsilniejszym działaniu przeciwprzerzutowym c Fosforan mannopentaozy wyizolowany z drożdży Pichia holstii

ND nie oznaczono

184 357

Tabela 2

Hamowanie aktywności heparanazy i wiązania się czynnika wzrostu z siarczanami heparanu przez siarczanowany fosforan mannopentaozy i siarczanowane oligosacharydy z serii pochodnych maltozy

Siarczanowany oligosacharyd	Stopień /siarczanowania3	% zsiarczanowania	Aktywność przeciwkrzepliwa (%)b	TC50 (gg/ml)c
Heparanaza	bFGF	aFGF
Maltoza	6/8	75	0,2	>100	>200	134
Maltotnoza	10/11	91	0,8	100	145	58,7
Maltotetraoza	11/14	79	1,6	25	65	31,5
Maltopentaoza	15/17	88	3,2	4	37,5	27
Maltoheksaoza	18/20	90	2	5	31,3	27
Maltoheptaoza	18/23	78	3,9	3	10	27
Fosforan mannopentaozy	10/16	63	0,2	5	25	22
Maltoheksaoza	3/20	15	0	>100	187	>200
Maltoheksaoza	9/20	45	0,8	50	45,6	79
Maltoheksaoza	14/20	70	0,4	20	12,5	12,5
Maltoheksaoza	17/20	85	1,7	6	5,4	10,4
Maltoheksaoza	18/20	90	2	6	5,4	18,8
Maltoheksaoza	20/20	100	3,3	5	5,4	19,7

^aRzeczywista liczba grup siarczanowych przyłączonych/teoretyczna maksymalna liczba grup siarczanowych, które mogłyby być sprzęgnięte z każdą cząsteczką

Aktywność przeciwkrzepliwa jako procent aktywności heparyny (100%) ° Stężenie związku potrzebne do zahamowania o 50% aktywności ludzkiej heparanazy płytkowej lub związania mysich komórek 3T3 z immobilizowanym aFGF/bFGF. W przypadku testu heparanazowego, wartość IC50 dla heparyny wynosiła 2 gg/ml

Fosforan mannopentaozy wyizolowany z drożdży Pichia holstii ND Nie oznaczono

Tabela 3

Hamowanie aktywności heparanazy i wiązania się czynnika wzrostu z siarczanami heparanu przez siarczanowane formy rozmaitych oligosacharydów syntetycznych

Siarczanowany oligosacharyd	Stopień zsiarczanowania3	% zsiarczanowania	Aktywność przeciwkrzepliwa (%)b	IC50 (gg/ml)a
Heparanaza	bFGF	aFGF
Mannotnoza	7/11	64	0,3	25	ND	ND
Mannotetraoza	10/14	71	0,4	6	20	5
Mannopentaoza	12/17	71	0,4	4	15	5
Mannoheksaoza	11/20	55	0,8	3	11	5
Galaktotnoza	6,6/11	60	0,7	4	25	ND
Galaktotetraoza	8,3/14	59	1,0	3,5	9	ND
Galaktoheksaoza	14,5/17	72,5	0,7	3,5	11	ND
Glukotrioza	ND	ND	0,1	30	47	ND
Glukoheksaoza	13,4/20	67	0,4	3,5	15	ND

184 357

Rzeczywista liczba grup siarczanowych przyłączonych/ teoretyczna maksymalna liczba grup siarczanowych, któęe mogłyby być sprzęgnięte z każdą cząsteczką

Aktywność przeciwkrzepliwą jako procent aktywności heparyny (100%)

Stężenie związku potrzebne do zahamowania o 50% aktywności ludzkiej heparanazy płytkowej, lub wiązania mysich komórek 3T3 z immbolizowanym aFGF/bFGF. W przypadku testu heparanazowego, wartość IC50 dla heparyny wynosiła 2 Ug/ml

ND Nie oznaczono

Tabela 4

Wpływ siarczanowanych oligosacharydów na zapalenie torebki powietrznej³

Środek leczący	Dawka	Nacieczenie leukocytów do torebki powietrznej0 (% kontroli)
Eksperyment 1	Eksperyment 2
Maltoheksaoza SO4	50 mg/kg	76 ±7	44 ± 12
Maltopentaoza SO4	50 mg/kg	57 ±7	16 ± 2
Fosforan mannopentaozy SO4 (P. holstii)	50 mg/kg	ND	51 ±9
Prednizolon	25 mg/kg	56± 14	44 ±3

Zapalenie torebki powietrznej wywołane wstrzyknięciem tioglikolanu i nacieczeniem leukocytów oceniane po upływie 17 godzin. W eksperymencie 1, dawki leku wstrzykiwano podskórnie w tym samym czasie, co i tioglikolan. W eksperymencie 2, siarczanowane oligosacharydy wstrzykiwano podskórnie w godzinie 0 i w godzinie 7 po wstrzyknięciu tioglikolanu

Dane przedstawiono jako procent liczby leukocytów w nacieku w torebce powietrznej u kontroli ± błąd standardowy średniej. Kontrolom wstrzyknięto tioglikolan, ale nie otrzymały one żadnej dawki leku, wstrzyknięto im tylko wodny roztwór chlorku sodowego Tło nacieczenia leukocytów w torebkach powietrznych, do których wstrzyknięto sam tylko wodny roztwór chlorku sodowego, wynosiło 9 ± 2 tła obserwowanego po wstrzyknięciu tioglikolanu ND Nie oznaczono

Tabela 5

Wpływ siarczanowanych oligosacharydów na wywołane owoalbuminą (OVA) nagromadzenie się granulocytów eozynochłonnych w płucach myszy

Siarczanowany oligosacharyd	Droga podawania	Dawka	Granulocyty eozychłonne/ml BALF (% kontroli)6
Maltoheksaoza	Pompa, 1 p.	50 mg/kg/dzień	57 ±2
Maltoheksaoza	Pompa, i.p.	115 mg/kg/dzień	9 ± 7
Maltoheksaoza	Aerozol	10 mg/mlc	98 ±24
Maltoheksaoza	Aerozol	40 mg/ml°	63 ±23
Mannopentaoza	Pompa, i.p.	50 mg/kg/dzień	63 ± 12

Myszy uczulono na OVA, po czym wywoływano płucny dopływ granulocytów eozynochłonnych przez aerozolowe podawanie OVA. Sulfonowane oligosacharydy wprowadzano albo i.p., przy użyciu mimpomp osmotycznych jdbo poprzez płuca, w postaci aerozolu

Dane wyrażono jako procent liczby granulocytów eozynochłonnych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego(BALF) dla kontroli ± błąd standardowy Kontrolami były zwierzęta poddane prowokacji OVA i otrzymujące wodny roztwór chlorku sodowego albo przy użyciu minipompy osmotycznej, albo poprzez płuca, jako aerozol ^c Stężenie siarczanowanego oligosacharydu w roztworze preparatu aerozolowego

184 357

Tabela 6

Wpływ siarczanowanych oligosacharydów na adopcyjnie przeniesione eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie opon mózgowych i mózgu (EAE)^a

Siarczanowany oligosacharyd“	Liczba zwierząt z EAE/ogólnej liczby zwierząt	Dzień zapoczątkowania średnio	Ciężkość choroby (% kontroli)
Kontrola	6/6	5,5 ± 0,2	100 ± 11
Mannopentaoza	3/5	5,3 ± 0,3	31,5± 15,1
Fosforan mannopentaozy (P holstu)	4/5	5,3 ± 0,3	47,9 ± 16,4

* EAE wywoływano u szczurów Lewis przy użyciu 30 x 10 komórek efektorowych EAE aktywowanych ConA Siarczanowane oligosacharydy podawano s c przy użyciu minipomp osmotycznych wprowadzonych w czasie przenoszenia komórek i uwalniających dawkę wynoszącą 70 mg/kg/dzień Dzień zapoczątkowania EAE średnio u zwierząt, u których rozwinęła się choroba Ciężkość choroby określona skumulowaną kliniczną oceną punktową zwierząt na skali ocen

Tabela 7

Wpływ siarczanowanego fosforanu mannopentaozy na połączoną ze stanem zapalnym chorobąjelit u myszy³

Dzień	Nie leczone0	Leczone0
Punktacja choroby średnia0	Masa ciała (g)	Punktacja choroby średmad	Masa ciała (g)
0	0	23,1	0	22,1
1	0	23,2	0	22,1
2	0	23,6	0	22,6
3	0	23,5	0	22,5
4	0	23,3	0	21,9
5	0	23,4	0	21,9
6	0,47	23,3	0,07	22,4
7	1,40	22,7	0,40	22,4
8	2,47	22,1	0,40	22,3
9	2,87	21,4	0,67	22,2
10	2,00	20,7	0,93	22,1

a Chorobąjelit połączona ze stanem zapalnym wywołana podaniem siarczanu dekstranu w wodzie do picia b Dni od rozpoczęcia podawania siarczanu dekstranu c Zwierzęta nie leczone otrzymywały trzy razy dziennie wstrzyknięcia vehiculum, podczas gdy zwierzęta leczone otrzymywały trzy razy dziennie wstrzyknięcia fosforanu mannopentaozy w dawce wynoszącej 20 mg/kg/dzień d Punktacja choroby średnia stanowi sumę punktacji dla biegunki i krwawienia odbytniczego u zwierząt dla każdego punktu czasowego

184 457

Odnośniki

1. C. P. Dietrich, H. B. Nader i A. J. Straus, Biochem. Biophys. Res. Comm, 111. 865-871 (1983).

2. L. Kjellen i U Lindahl, Annu. Rev. Biochem, 60, 443 -475 (1991).

3. G. David, FASEB J., 7,1023 - 1030 (1993).

4. J. D. Esko, Curr. Opin. Celi Biol, 3, 805-816 (1991).

5. G. J. Colel R. Akeson, Neuron, 2, 1157-1165 (1989).

6. D. R. Coombe, S. M. Watt i C. R. Parish, Blood, 84, 739 -752.

7. A. Yayon, M. Klagsbrun, J. D. Esko, P. Leder i D. M. Omitz, Cell, 64,841 -848 (1991).

8. A. C. Rapraeger, A. Krufka i B. B. Olwin, Science, 252. 1705-1708 (1991).

9. H. Gitay-Goren, S. Soker, I. Vlodavsky i G. Naufeld, J. Biol. Chem, 267. 6093-6098 (1992).

10. P. D. Yurchenko i J. C. Schnitty, FASEB J, 4, 1577-1590 (1990).

11. S.W. Stetler, S. AznavoorianiL. A. Liotta, Annu. Rev. Celi Biol. ,9,541-573(1993).

12. A. Eldor, N. Bar-Ner, Z. Fuks i I. Vlodavsky, Semin. Thromb. Hemost, 13, 475-488 (1987).

13. M. Nakajima, T. Inmura i G. L. Nicolson, J. Cell Biochem, 36, 157-167 (1988).

14. J. E. Turnbull, D. G. Femig, Y Ke, M.C. Wilkinson i J. T. Galagher, J. Biol. Chem., 267, 10337-10341 (1992).

15. H. Mach, D. Volkin, C. J. Burke, C. R. Middaugh, R. J. Linhardt, J. R. Fromm i D. Loganathan, Biochemistry, 32, 5480-5489 (1993).

16. V. Nurcombe, M. D. Ford, J. A. Windschut i P. F. Brtlett, Science, 260,103-106 (1993).

17. T. Spivak-Kroizman, M. A. Lemmon, I. Dikic, J. E. Ladbury, D. Pinchasi, J. Huang, M. Jaye, G. Crumley, J. Schlesinger 11. Lax, Cell, 79, 1015-1024.

18. J. Folkman i H. Brem. Angiogenesis and Inflammation. W: „Inflammation. Basic Principles and Clinical Correlates”, red. red. J. L. Gallin, I. M. Goldstein i R. S. Snyderman, Raven Press, New York (1992).

19. J. Folkman. Tumor Angiogenesis. W: „Cancer Medicine”, red. J. F. Holland, Lea& Febiger, Filadelfia (1991).

20. J. Folkman i M. Klagsbrun, Science, 235. 442-447 (1987).

21. S. Ratner, Invasion Metastasis, 12, 82-100 (1992).

22. P. T. Mora i D. Wood., J. Amer. Chem. Soc, 80, 693.

23. P. S. O’Colla i E. E. Lee, J. Chem. Soc, 2351-2354 (1964).

24. W. L. Evans, D. D. Reynolds i E. A. Talley, Adv. Carbohyd. Chem., 6, 27 (1951).

25. I. J. Goldstein i T. L. Hullar, Adv. Carbohyd. Chem., 21, 431-512 (1966).

26. S. Haq i W. J. Whelan, J. Chem. Soc, 4543 (1956).

27. M. Okada, H. Sumitomo, K. Sumi i T. Sugimoto, J. Amer. Chem. Soc., 17, 2451-2453 (1984).

28. M. Okada, H. Sumitomo, T. Hirasawa, K. Ihaera i Y. Tada, Polym. J, (Tokio), 18, 601-611 (1986).

29. P.S. O’Colla i D. McGrath., Chem. Ind, 178-179 (1962).

30. D. McGrath, E. E. Lee i P. S. O'Colla, Carbohydrate Res, H,, 453-460 (1969).

31. D. D. Reynolds i W. L. Evans, J.Amer. Chem. Soc., 69, 66 (1947).

32. J. H. Glazer i H. E. Conrad, J. Biol. Chem., 254. 6588-6597 (1979).

33. R. F. Andersen, M. C. Cadmus, R. G. Benedict i M. E. Słodki, Arch. Blochem. Biophys, 89,289-292 (1960).

34. R. K. Bretthauer, G. J. Kaczorowski i M. J. Weise, Biochemistry, 12,1251-1256 (1973).

35. C. R. Parish, D. R Coombe, K. B. Jacobsen, F. A. Bennet iP. A. Underwood,Int. J. Cancer., 40, 511-518.

36. Y. Guo i H E. Conrad, Anal. Biochem, 176. 96-104 (1989).

184 357

37. D. B. Rylatt, D. Y. Sia, J. R. Mundy i C. R. Parish, Eur. J. Biochem, 119. 641-646 (1981).

38. K. J. Brown, I. A. Hendry i C. R. Parish, Exp. Cell Res., 217. 132-139 (1995).

39. K. J. Brown i C. R. Parish, Biochemistry, 33, 13918-13927 (1994).

40. M. J. Forrest, P. M. Brooks, T. Takagi i I. Kowanko. W: ,,CRC Handbook ofAnimal Models for the Rheumatic Diseases”. Red. red. R. A. Greenwald i K. S. Diamond, CRC Press, Boca Raton, tom I, str, 125.

41. P. S. Foster, S. P. Hogan, A. J. Ramsay, K. I. Matthaei i Young, J. Exp. Med, 183. 195-201 (1996).

42. S. Lelievre i A. K. Larsen, Cancer Res., 54, 3993-3997 (1994).

43. D. O. Willenborg i C. R. Parish, J. Immunol., 140, 3401-3405 (1988).

44. M. R. Barlett, W. B. Cowden i C. R. Parish, J. Leuk. Biol, 57, 207-213 (1995).

184 357

184 357

Tworzenie przerzutów (% kontroli) Tworzenie przerzutów (% kontroli)

Fig. 9

* *

v>

«Λ '(ti r-H o

μι +J c

o fd

I N g§ c£ (ti Q) S+J

(d	fd	<0 >, C 1 N
1 N	1 N γί n	OOP
	2§	mq_c
	cj3	“£E
£c £8.	sc	0(0(1) ŁEa

184 357

150 ./1

Fig.

π3

Ν φ

fi (U

CP

O •H

CP fi

184 357

Fig.

π5

N <υ c

φ tn o

H σ>

184 357

Fig.

Liczba przerzutów do płuc

Siarczany maltoheksaozy

184 357

Fig.

Absorbancja- - 540nm

Stężenie cukru . (ug/ml)

Maltoza

Maltotrioza

Maltotetraoza

Maltopentaoza

Maltohexaoza

Maltoheptaoza

184 357

Fig. 4

Liczba przerzutów do płuc Liczba przerzutów do płuc

184 357

Fig.

Kontrola 200jug 20^g

184 357

Fig.

Procent angiogenezy kontrolnej

Stężenie (/Ug/ml)

184 357

Angiogeneza kontrolna

μg/mł siarczanu maltoheksaozy

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Siarczanowany oligosacharyd o wzorze (I):

   R]-(Rx)n-R.2 w którym R, i R₂ oraz wszystkie R_x oznaczają heksozową jednostkę monosacharydową i wszystkie one mogą być takie same lub różne, przy czym sąsiednie jednostki monosacharydowe sąpołączone wiązaniami glikozydowymi 1 —> 2,1 — 3,1 —4 i/lub 1—- 6, a n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, pod warunkiem, że oligosacharyd ten nie jest związkiem zawierającym 1 — 4 związane reszty glukozowe ani związkiem zawierającym 1—2 związane reszty fruktozowe.
2. 2. Oligosacharyd według zastrz. 1, znamienny tym, że n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 4, korzystnie 3 lub 4.
3. 3. Oligosacharyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera heksozowe jednostki monosacharydowe wybrane z grupy obejmującej mannozę, altrozę, allozę, talozę, galaktozę, idozę i gulozę.
4. 4. Oligosacharyd według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi go oligosacharyd o wzorze (II):

   Ry-(Ry)n-Ry w którym wszystkie grupy o symbolu R_y sątakie same i wszystkie one oznaczająheksozowe jednostki monosacharydowe, przy czym sąsiednie jednostki monosacharydowe są połączone wiązaniami glikozydowymi 1 —>3,1 —>4i/lub 1 —>6, a n oznacza liczbę całkowitą od 1 do6, pod warunkiem, że oligosacharyd ten niejest związkiem zawierającym 1 —> 4 związane reszty glukozowe.
5. 5. Oligosacharyd według zastrz. 4, znamienny tym, że n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 4, korzystnie 3 lub 4.
6. 6. Oligosacharyd według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że zawiera heksozowe jednostki monosacharydowe wybrane z grupy obejmującej mannozę, altrozę, allozę, talozę, glaktozę, idozę i gulozę.
7. 7. Oligosacharyd według zastrz. 6, znamienny tym, że jako heksozowe jednostki monosacharydowe zawiera mannozę lub galaktozę.
8. 8. Oligosacharyd według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że stanowi go oligosacharyd otrzymywany na drodze enzymatycznej lub chemicznej degradacji polisacharydu występującego w przyrodzie.
9. 9. Oligosacharyd według zastrz. 8, znamienny tym, że stanowi go oligosacharyd pochodzący od chondroityny lub egzopolisacharyd wytwarzany przez diploidalne drożdże Pichia holstii.
10. 10. Oligosacharyd według zastrz. 9, znamienny tym, że stanowi go oligosacharyd wybrany z grupy obejmującej tetra-, heksa- i oktasacharydy pochodzące od chondroityny.
11. 11. Oligosacharyd według zastrz. 8, znamienny tym, że stanowi go fosforan mannopentaozy pochodzący z drożdży Pichia holstii.
12. 12. Kompozycja farmaceutyczna lub weterynaryjna przeznaczona do leczenia antyangiogenetycznego, przeciwprzerzutowego i przeciwzapalnego zawierająca substancję czynną oraz farmaceutycznie lub weterynaryjnie dozwolony nośnik lub rozcieńczalnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden siarczanowany oligosacharyd o wzorze (I):

    R|-(Rx)n-R-2

    184 357 w którym R, i R₂ oraz wszystkie R_x oznaczają heksozową jednostkę monosacharydową i wszystkie one mogąbyć takie same lub różne, przy czym sąsiednie jednostki monosacharydowe sąpołączone wiązaniami glikozydowymi 1—>2,1 —>3,1-4 i/lub 1—>6, a n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, pod warunkiem, że oligosacharyd ten nie jest związkiem zawierającym 1 —> 4 związane reszty glukozowe ani związkiem zawierającym 1—> 2 związane reszty fruktozowe.