CN105504097B - 一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用，其特征在于，所述硫酸化肝素寡糖分子的非还原端含有由肝素酶酶解产生的不饱和双键，含有糖醛酸衍生物和糖胺衍生物，其具有式I所示结构，其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Ra、Rb、Rc和Rd独立地为SO3 ‑或H；Rx'、Ry'和Rz'独立地为COCH3或SO3 ‑，n为1‑3。通过本发明的制备方法制备得到硫酸化程度可控的硫酸化寡糖，该硫酸化肝素寡糖的体外抑制乙酰肝素酶活性很高，其抑制细胞粘附和迁移的活性高出肝素4‑5倍，小鼠体内抗肿瘤转移的活性也比肝素高2‑3倍，具有较好的抗肿瘤转移效果和较高的特异性。

Description

一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物领域，涉及一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是人类健康的重大威胁，更严重的是，肝癌、肺癌等恶性肿瘤易发生转移，目前尚无抑制肿瘤转移的药物，导致肿瘤转移治疗困难，使肿瘤转移成为肿瘤患者死亡的最重要原因。肿瘤细胞要实现侵袭和迁移，有两个过程非常关键：一是突破由细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和基膜(basement membrane，BM)构成的屏障,二是形成新生血管。ECM和BM是肿瘤细胞侵袭及转移的屏障，恶性肿瘤细胞要实现扩散和转移，必须穿过ECM及BM进入循环。在这个过程中ECM各种成分和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfateproteoglycans，HSPGs)的降解必不可少。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是目前发现的哺乳动物体内唯一能切割硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)的内切-β-D-葡萄糖醛酸酶。HPA识别HS的特异结构，不完全切割HS侧链，只在某些位点切割HS侧链的糖苷键，将其降解为10-15个糖单位大小的短糖链。另外，HS侧链可以结合很多生物活性分子如生长因子、细胞因子、趋化因子、成形素和凝血蛋白等。HPA通过降解HS释放活性生长因子，这些生长因子能促进肿瘤血管生成、肿瘤生长、侵袭和转移。因此，HPA对肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要作用，而HPA抑制剂的研究和筛选已成为人类寻找癌症治疗潜在药物的新方向。
长期以来的临床证据显示肝素具有抗肿瘤功能，且近年来低分子肝素辅助抗肿瘤正在开展临床试验。经过长期的研究，肝素的抗肿瘤作用在业界已得到普遍的认识和认可，肝素的抗肿瘤可能主要是通过抑制肿瘤转移进行体现，更进一步体现为抑制体内乙酰肝素酶的活性。
肝素作为传统抗凝血药，其抗凝血活性是主要用途，但其结构的多样性导致其具有多种生物活性。在肝素的非抗凝应用中，其抗凝血活性是常见的和中药的副作用。因此，肝素的抗凝活性是其抗肿瘤转移方面应用的一个重大不利因素，容易引起出血等副作用。肝素的非抗凝活性应用中一个重要的研究方面就是在保留肝素基本结构的基础上，破坏其抗凝血活性。在抗肿瘤转移方面，肝素的乙酰肝素酶抑制活性较高高，但细胞层次上对肿瘤生长抑制、肿瘤细胞侵袭和粘附的抑制活性都不显著，在抗肿瘤转移小鼠实验中结果较差，不能显著的抑制肿瘤转移的发生。其中主要的原因可能是肝素的特异性不高，可以和多种内源性物质发生作用，降低了与乙酰肝素酶结合的能力。
CN101824100A公开了具有如下结构式的肝素寡糖十二聚体：
该肝素寡糖时十二聚体具有抗血管平滑肌细胞增殖的用途。但是该发明的寡糖并不具有显著的抑制肿瘤细胞粘附和迁移的能力。
CN 104764847A公开了含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法，在该对比文件中公开了以下4种六糖和3种八糖片段：
dp6a △HexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S；
dp6b △HexA2S-GlcNS6S-HexA2S-GlcNAc-HexA 2S-GlcNS6S；
dp6c △HexA-GlcNS6S-HexA-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6S；
dp6d △HexA-GlcNS6S-HexA 2S-GlcNAc6S-HexA 2S-GlcNS6S；
dp8a △HexA2S-GlcNS-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S；
dp8b △HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA-GlcNS]-HexA2S-GlcNS6S；
dp8c △HexA2S-GlcNS6S-[HexA 2S-GlcNAc-HexA-GlcNAc6S]-HexA 2S-GlcNS6S；
该发明仅是解决了含N-乙酰化结构肝素寡糖难制备以及结构测定问题，在抑制体内乙酰肝素酶的活性方面并无显著改善。
因此，在本领域中，期望能够得到一种具有抑制体内乙酰肝素酶活性，并能降低其抗凝血活性的肝素寡糖。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种硫酸化肝素寡糖，所述硫酸化肝素寡糖分子的非还原端含有由肝素酶酶解产生的不饱和双键，含有糖醛酸衍生物和糖胺衍生物，其具有式I所示结构：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Ra、Rb、Rc和Rd独立地为SO3 -或H；Rx′、Ry′和Rz′独立地为COCH3或SO3 -，n为1-3。
在本发明中n为1-3，即为1、2或3，当n＝1时，所述硫酸化肝素寡糖为硫酸肝素六糖，当n＝2时，所述硫酸化肝素寡糖为硫酸肝素八糖，当n＝3时，所述硫酸化肝素寡糖为硫酸肝素十糖。
在本发明硫酸化肝素寡糖的结构中有双键，所以该硫酸化肝素寡糖在紫外区232nm附近有较强的吸收峰，可以非常方便的用于肝素寡糖的定性和定量检测。
本发明的硫酸肝素寡糖具有良好的乙酰肝素酶抑制活性和抑制肿瘤转移活性，其糖链较短，分子量小，完全没有抗凝血活性，同时硫酸化肝素寡糖具有较高的特异性，能特异性的抑制乙酰肝素酶，抑制肿瘤转移。
在本发明所述的硫酸化肝素寡糖中，式I中平均每个双糖单元中磺酸基个数不少于2个，例如平均每个双糖单元中磺酸基个数可以为2个、3个、4个或5个，平均每个双糖单元中乙酰基不多于0.5个，例如可以是0.5个或0.4个，平均每个双糖单元的葡萄糖胺6-位和3-位磺酸基都不少于0.5个，例如可以是0.5个、0.8个、1个、1.5个或2个。
所述每个双糖单元中基团(例如磺酸基、乙酰基或葡萄糖胺6-位和3-位磺酸基)的个数是指以整个肝素寡糖中磺酸基的个数平均到每个双糖单元所得到的个数，例如如果硫酸化肝素八糖中有共有2个乙酰基，则平均到每个双糖单元中乙酰基的数量为0.5个。
优选地，式I中糖醛酸为葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。
优选地，与式I中所含羧基和/或磺酸基成盐的阳离子选自Na+、K+或Ca2+。
上述结构式中，葡萄糖醛酸中的羧基或者磺酸基都带有负电荷，因此一般要与一些阳离子成盐，通常是Na+、K+和Ca2+。
优选地，所述硫酸化肝素寡糖为具有以下结构的化合物中的任意一种或至少两种的组合：
DP6肝素六糖衍生物：
ΔU3S-ANS3S-I-ANS3S-G3S-ANS3S6S
ΔU3S-ANS-I3S-ANS3S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S-G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-G2S3S-ANS3S6S
DP8肝素八糖衍生物：
ΔU3S-ANS3S-I-ANS3S-I3s-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU3S-ANS-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-I3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6S
DP10肝素十糖衍生物：
ΔU3S-ANS3S-I-ANS3S-I-ANS6S-I-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU3S-ANS-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-I3S-ANS6S-I3S-ANS6S–G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS6S-I2S3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-G2S3S-ANS3S6S
以上结构中，ΔU表示I表示α-L-艾杜糖醛酸，G代表β-D-葡萄糖醛酸，A代表α-D-葡萄糖胺。NS表示氨基上的磺酸基，2S、3S、6S等表示糖环的2-O，3-O和6-O位置的磺酸基。
第二方面，本发明提供了如第一方面所述的硫酸化肝素寡糖的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)利用肝素酶降解肝素，分离、纯化得到肝素寡糖；
(2)利用硫酸化试剂对步骤(1)得到的肝素寡糖进行硫酸化，得到所述硫酸化肝素寡糖。
在本发明所述硫酸化肝素寡糖的制备方法中，步骤(1)所述肝素酶为肝素酶I。
在本发明所述硫酸化肝素寡糖的制备方法中，步骤(1)所述利用肝素酶降解肝素时需加入缓冲液，优选为pH 7.0的Tris-HCl缓冲液。
优选地，步骤(1)所述肝素酶的加酶量为15～25IU/g肝素，例如16IU/g肝素、16.5IU/g肝素、17IU/g肝素、17.5IU/g肝素、18IU/g肝素、18.5IU/g肝素、19IU/g肝素、19.5IU/g肝素、20IU/g肝素、21.5IU/g肝素、22IU/g肝素、23IU/g肝素或24IU/g肝素，优选18～23IU/g肝素。
优选地，步骤(1)所述利用肝素酶降解肝素的温度为4～37℃，例如5℃、8℃、10℃、12℃、15℃、18℃、20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃，优选为8～25℃。
优选地，步骤(1)所述降解的时间为8～24小时，例如9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时或23小时，优选为10～20小时。
优选地，步骤(1)所述利用肝素酶降解肝素包括在降解之后于95℃灭活5～10min，例如5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min、8min、8.5min、9min、9.5min或9.8min，优选为5～8min，进一步优选为6min。
优选地，步骤(1)所述分离包括超滤，优选为利用10KDa超滤离心管进行超滤。
优选地，步骤(1)所述纯化为利用柱层析法分离提纯。
利用柱层析法分离后经过浓缩、脱盐和冻干等过程获得肝素寡糖。
在本发明所述硫酸化肝素寡糖的制备方法中，在步骤(2)所述硫酸化之前包括将步骤(1)得到的肝素寡糖进行溶胀处理；
优选地，所述溶胀处理使用的溶剂为DMF。
优选地，步骤(2)所述硫酸化试剂为(CH3)3N·SO3。
优选地，相对于1g肝素寡糖，硫酸化试剂的用量为1～10g，例如1.2g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或9.8g。
优选地，步骤(2)所述硫酸化的温度为60～120℃，例如63℃、65℃、70℃、73℃、75℃、78℃、80℃、83℃、85℃、88℃、90℃、93℃、95℃、98℃、100℃、115℃、118℃或120℃。
优选地，步骤(2)所述硫酸化的时间为1～12小时，例如1.5小时、2小时、2.3小时、2.5小时、2.8小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、10.5小时、11小时或11.5小时。
在本发明中，通过控制肝素寡糖与硫酸化试剂的比例、反应温度和反应时间，可以控制肝素寡糖的硫酸化程度，得到不同程度硫酸基取代的肝素寡糖。
在本发明中，硫酸化试剂对步骤(1)得到的肝素寡糖进行硫酸化后，需要对反应混合物进行后处理和纯化，即向反应混合物中加入10倍体积纯水溶解沉淀，转入截留分子量为100～500Da的透析袋，透析三天后，利用P10柱脱盐，浓缩后，利用阳离子交换柱除去阳离子杂质，用高纯NaOH、KOH或Ca(OH)2等中和酸性，浓缩后经过冻干或乙醇沉淀可以得到相应的硫酸化肝素寡糖。
作为本发明的优选技术方案，本发明所述硫酸化肝素寡糖的制备方法包括以下步骤：
(1)利用肝素酶I于4～37℃下降解肝素8～24h，加酶量为15～25IU/g肝素，所用缓冲液为pH 7.0的Tris-HCl缓冲液，降解之后于95℃灭活5～10min，利用10KDa超滤离心管进行超滤分离、而后利用柱层析法分离提纯得到肝素寡糖；
(2)利用硫酸化试剂在60～120℃下对步骤(1)得到的肝素寡糖进行硫酸化1～12小时，得到所述硫酸化肝素寡糖。
本发明利用所述制备方法可以得到硫酸化程度不同的硫酸化寡糖，所述硫酸化肝素寡糖中每个糖链的非还原端有一个双键，该双键来源于肝素酶酶解构成中的消除反应，由于结构中有双键，所以寡糖在紫外区232nm附近有较强的吸收峰，可以非常方便的用于肝素寡糖的定性和定量检测。该双键在肝素寡糖硫酸化过程中基本不发生变化。肝素本身没有强的特征吸收峰，因此肝素类物质只能采用DMB染色法等进行检测，但该方法灵敏度较低，且不能适用于复杂体系。因此双键的存在，极大方便了肝素寡糖及其衍生物的检测，在生物代谢过程的检测中也可以发挥重要作用。
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的硫酸化肝素寡糖在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
本发明的硫酸化肝素寡糖具有良好的乙酰肝素酶抑制活性和抑制肿瘤转移活性，其可以作为抗肿瘤药物或者作为抗肿瘤活性成分制备成为抗肿瘤药物，以用于肿瘤的治疗，预防和抑制肿瘤的转移。
在本发明的硫酸化肝素寡糖中，不同程度磺酸化的肝素六糖、肝素八糖和肝素十糖都有显著的抑制活性，在磺酸化程度相同的情况下，链长不同，其对乙酰肝素酶的抑制活性也会有所不同，抑制活性的大小表现为：磺酸化肝素六糖<磺酸化肝素十糖<磺酸化肝素八糖。在链长相同的情况下，不同程度硫酸化的肝素寡糖对乙酰肝素酶的抑制活性也有所不同，表现为：低度硫酸化(10-40％)肝素寡糖<高度硫酸化(60-90％)肝素寡糖<中度硫酸化(40-60％)肝素寡糖。在硫酸化肝素寡糖的结构上，糖胺6-位磺酸化和糖胺3-位磺酸化对乙酰肝素酶抑制活性贡献较大。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的硫酸化肝素寡糖具有良好的乙酰肝素酶抑制活性和抑制肿瘤转移活性，其糖链较短，分子量小，完全没有抗凝血活性，无抗凝活性和出血风险。通过本发明的制备方法可以制备得到硫酸化程度可控的硫酸化寡糖，该硫酸化肝素寡糖的体外抑制乙酰肝素酶活性很高，其抑制细胞粘附和迁移的活性高出肝素4-5倍，小鼠体内抗肿瘤转移的活性也比肝素高2-3倍，具有较好的抗肿瘤转移效果和较高的特异性。
附图说明
图1为本发明实施例1利用Bio-Gel P-10(2.5×100cm)层析柱分离肝素寡糖的结果图；
图2为本发明实施例1得到的等聚合度的肝素寡糖的分子量分布图；
图3为本发明实施例1得到的肝素十糖的UPLC-MS的总离子流图；
图4为本发明实施例1得到的肝素十糖的UPLC-MS的总离子流图(局部)及对应峰的归属图；
图5为肝素八糖(A)与40％硫酸化的肝素八糖(B)的HSQC谱及对应的一维氢谱图(δH ppm 6.1～3.165/δC ppm 112～52.6)；
图6为硫酸化的肝素寡糖对乙酰肝素酶抑制活性测定结果图；
图7为硫酸化的肝素寡糖对HeLa细胞的细胞粘附抑制活性结果图；
图8为硫酸化的肝素寡糖对HeLa细胞的细胞迁移抑制活性结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1肝素寡糖的制备
取肝素24g，加入240mL的Tris-HCl缓冲溶液，搅拌溶解，加入480IU的肝素酶I，搅拌均匀后，置于10℃环境下酶解反应16h。反应完成后，将反应混合物加热至95℃灭活6min，10KDa超滤离心管超滤。滤液用Bio-Gel P-10(2.5×100cm)层析柱分离，0.2M的NH4HCO3作为洗脱液，收集1.75～2.15倍柱体积的组分得到肝素四糖混合物，收集1.35～1.75倍柱体积的组分得到肝素六糖混合物，收集1.05～1.35倍柱体积的组分得到肝素八糖糖混合物，收集0.85～1.05倍柱体积的组分得到肝素十糖混合物，收集0.75～0.85倍柱体积的组分得到肝素十二糖混合物，旋转蒸发除去NH4HCO3后，冻干得到相应肝素寡糖。
如图1所示，为肝素寡糖的Bio-Gel P-10(2.5×100cm)层析柱分离图，由图可以看出：通过P10柱进行分离后，肝素寡糖根据分子量的不同分成了不同的峰，通过收集峰尖处组分可以获得不同聚合度的寡糖。
图2为等到的等聚合度肝素寡糖的分子量分布图，由图可以看出：寡糖分子量分布峰尖而对称，说明寡糖分子量分布范围较窄，同时分子量分布从十二糖到四糖逐渐降低，说明寡糖质量符合要求。
肝素寡糖的结构利用UPLC-MS等方式进行了表征确认，例如，图3为本发明得到的肝素十糖的UPLC-MS的总离子流质谱图，图4为肝素十糖的总离子流图中对应峰的归属图，其中，ΔUx,y,z(图中已经给出了具体的x、y、z的值)中x代表寡糖链中糖单元数，y代表寡糖链中总的磺酸基数目，z表示寡糖链中总的乙酰基数目；LR代表结合区域。由图4结构归属可以看出，其中肝素十糖中绝大多数寡糖都是肝素十糖，仅有少部分是高度硫酸化的肝素八糖。以上表征结果说明寡糖制备是成功的，纯度满足要求。
实施例2 20％～80％硫酸化的肝素八糖的制备
称取0.54g肝素八糖原料，转移至反应瓶中，加入25mL无水DMF，搅拌溶解。称取0.86g(CH3)3N·SO3，在搅拌下逐渐加入上述溶液中，搅拌10min。塞好瓶盖，将反应瓶置于80℃油浴中搅拌反应4h。停止反应后，自然冷却至室温。将固体以90mL纯水溶解，用2M NaOH调节pH至接近中性。将溶液转移至截留分子量为100～500Da的透析袋中，透析三天后，以BaCl2检验透析液中是否存在大量硫酸根。若没有，则先以2M NaOH调节pH至中性，在旋转蒸发仪上浓缩至10mL左右。上P2柱，以纯水洗脱，以部分收集器收集洗脱液。测定232nm吸光度，确定肝素八糖衍生物的位置，以BaCl2检验收集液是否存在大量硫酸根，收集无盐部分的肝素八糖硫酸化衍生物。浓缩至10mL左右，上Dowex阳离子交换柱，纯水洗脱，以部分收集器收集洗脱液测定232nm吸光度，确定肝素八糖衍生物的位置，收集含肝素八糖衍生物组分，小心的用0.1M的高纯NaOH溶液调节pH至7.0后，浓缩冻干即可得到20％硫酸化的肝素八糖。
相对于0.54g肝素八糖原料，通过如表1中所示调节反应原料中(CH3)3N·SO3的投料量以及反应温度和反应时间可以控制得到所述硫酸化程度的肝素寡糖。
表1
例如可以通过以下反应条件以及投料量的调整获得相应硫酸化程度的肝素寡糖：
将(CH3)3N·SO3的量调整为1.67g，反应温度调整为90℃，反应时间调整为4h，其余操作均相同，可制得40％硫酸化的肝素八糖。
将(CH3)3N·SO3的量调整为3.34g，反应温度调整为90℃，反应时间调整为6h，其余操作均相同，可制得60％硫酸化的肝素八糖。
将(CH3)3N·SO3的量调整为5.01g，反应温度调整为100℃，反应时间调整为8h，其余操作均相同，可制得80％硫酸化的肝素八糖。
图5为肝素八糖(A)与40％硫酸化的肝素八糖(B)的HSQ C谱及对应的一维氢谱图(δH ppm 6.1～3.165/δC ppm 112～52.6)，由图可以看出，硫酸化反应后，肝素八糖的信号峰发生了显著变化，出现了很多的新信号，说明出现了天然肝素不存在的结构，与硫酸化衍生的预期是一致的。
实施例3 40％和60％硫酸化的肝素八糖的乙酰肝素酶抑制活性
采用文献[Hammond E,Li CP,Ferro V.Development of a colorimetric assayfor heparanase activity suitable for kinetic analysis and inhibitorscreening.Anal.Biochem.2011；396:112-116]中所述方法，测定硫酸化肝素寡糖的乙酰肝素酶抑制活性，即具体实验操作如下：
实验组的反应液由40mM的乙酸钠缓冲液(pH 5.0)和100mM的磺达肝癸钠，以及特定浓度的硫酸化肝素八糖组成，对照组的反应液中以与硫酸化肝素八糖同样浓度的SST0001对照品替代硫酸化肝素八糖。向96孔板中各孔加入100μL实验组或对照组的反应液，然后分别加入乙酰肝素酶开始反应，乙酰肝素酶的终浓度为140pM。将96孔板用胶带密封后在37℃下孵育2-24h，完成反应后，加入100μL含有1.69mM WST-1的0.1M NaOH溶液终止反应。将96孔板再次密封后于60℃孵育60min。冷却至室温后，测定584nm吸光度值。按照如下方法计算药物的抑制率：
抑制率＝(1–样品吸光度值/对照组吸光度值)×100％
根据以上方法，测得硫酸化肝素寡糖的对乙酰肝素酶的抑制活性如图6所示，由图可见，40％硫酸化的肝素八糖(Hep8-40％)对乙酰肝素酶的半抑制浓度(IC50)为43ng/mL，60％硫酸化的肝素八糖(Hep8-60％)对乙酰肝素酶的半抑制浓度(IC50)为57ng/mL。
实施例4 20％和60％硫酸化的肝素八糖的细胞粘附测定
在本实施例中，应用以下方法测定20％和60％硫酸化的肝素八糖的细胞粘附性：
(1)包被基底膜：用灭菌二蒸水分别配制2种溶液：10g/L BSA(1％)，50mg/LMatrigel，1：8稀释液；Matrigel以50μL/孔分别加入96孔培养板，4℃过夜；
(2)水化基底膜:吸出培养板中残余液体，每孔加入50μL含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30min；
(3)细胞的准备：取正常培养的HeLa细胞，PBS清洗三次后，将细胞分对照组(不添加药物，仅添加相应体积的PBS)和实验组(添加肝素和硫酸化肝素八糖，浓度均为62.5μg/mL)，培养24h。
(4)接种细胞：取正常培养或步骤(3)中肝素/HS寡糖的衍生物处理24h的肿瘤细胞，PBS清洗三次后加入0.5mL胰酶消化。严密关注消化情况，消化完成后，加5mL培养基充分吹打，使细胞分散成单细胞悬液。计数，根据计数结果调整细胞悬液浓度，使细胞密度为105个细胞/mL，每孔100μL细胞悬液接种于包被Matrigel的96孔培养板中，每组平行3个样本；
(5)培养细胞：37℃二氧化碳培养箱培养1h，弃去各孔培养液，用PBS冲洗1次，之后每孔加入200μL新鲜培养基，观察并照相；
(6)检测：每孔加入10μLCCK-8染料溶液，37℃二氧化碳培养箱培养3h后，多功能酶标仪读数，以肝素对照组为参照，按下述公式计算抑制率。
抑制率＝(1-处理组吸光值/对照组吸光)×100％
根据以上方法，测得肝素(Heparin)对HeLa细胞粘附的抑制率为8.3％，20％硫酸化的肝素八糖(Hep8-20％)对HeLa细胞粘附的抑制率为45.3％，60％硫酸化的肝素八糖(Hep8-60％)对HeLa细胞粘附的抑制率为37.9％。
实施例5 40％和60％硫酸化的肝素八糖的细胞迁移测定
在本实施例中，通过以下方法测定40％和60％硫酸化的肝素八糖的细胞迁移：
(1)实验前将Transwell小室放置于24孔板中，下室加入600ul的DMEM液体培养基，上室加入100ul的DMEM液体培养基，培养箱过夜待用；
(2)细胞的准备：取对数生长期的HeLa细胞，胰酶消化，计数细胞浓度，将细胞分对照组(不添加肝素或肝素寡糖，仅添加相应体积的PBS)和实验组(添加肝素和硫酸化肝素八糖，浓度均为62.5μg/mL)。分别用无血清、含2.5％BSA的DMEM培养基和无血清、含相应肝素寡糖的2.5％BSA DMEM培养基稀释细胞，调整细胞浓度为2.5×105个/mL。
(3)加800μL含5％FBS的培养基至Transwell小室的下室。
(4)加400μL步骤(2)的细胞悬液至Transwell小室的上室内。
(5)置于温度37℃、CO2浓度5％的培养箱中培养8小时。
(6)小心吸去上室内的液体，用棉签轻柔的擦拭小室膜的内面以去除未迁移的细胞。注意操作轻柔，避免损坏小室的膜。
(7)将小室移入另一个含有400μL细胞染液的24孔板，在室温下染色细胞10分钟。
(8)用蒸馏水轻柔的洗Transwell小室3-5次，置于室温令其自然风干。
(9)在显微镜下计数细胞并拍照。
(10)将小室转入另一干净24孔板中，每空加入200μL细胞溶解液，置摇床上。
(11)室温下孵育10分钟后，取100μL细胞溶解液加入96孔板，在560nm处读取吸光度值。以肝素对照组为参照，按下述公式计算转移率和抑制率：
转移率＝处理组吸光值/对照组吸光值×100％
抑制率＝[1-(处理组粘附率/对照组粘附率)]×100％
根据以上方法，测得细胞粘附结果如图7所示，表明肝素(Heparin)对HeLa细胞迁移的抑制率为12.6％，40％硫酸化的肝素八糖(Hep8-40％)对HeLa细胞迁移的抑制率为57.3％，60％硫酸化的肝素八糖(Hep8-60％)对HeLa细胞迁移的抑制率为43.5％。
实施例6 40％和60％硫酸化的肝素八糖的抗肿瘤转移性
在本实施例中通过以下方法对40％和60％硫酸化的肝素八糖的抗肿瘤转移性进行测定：
通过尾静脉将B16-BL6小鼠黑色素瘤细胞(2×105)注射到C57BL/6小鼠体内，小鼠分为对照组(不添加肝素寡糖，以PBS作为对照)和实验组(添加40％硫酸化的肝素八糖，每只小鼠200μg)，每组10只小鼠。3周后，解剖小鼠，在Bouin溶液中固定小鼠肺部，计算小鼠肺部肿瘤个数。我们将使用荧光素酶标记的B16-BL6小鼠黑色素瘤细胞，通过IVIS-200荧光成像系统每周检测转移瘤的形成。图片将在腹部注射2.5mg荧光素10min后采集。
根据以上方法，测得抗肿瘤转移性结果如图8所示，由图可知，肝素(Heparin)对小鼠体内肿瘤转移的抑制率为17.3％，40％硫酸化的肝素八糖(Hep8-40％)对小鼠体内肿瘤转移的抑制率为65.1％，60％硫酸化的肝素八糖(Hep8-60％)对小鼠体内肿瘤转移的抑制率为56.2％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (28)

1.一种硫酸化肝素寡糖，其特征在于，所述硫酸化肝素寡糖分子的非还原端含有由肝素酶酶解产生的不饱和双键，含有糖醛酸衍生物和糖胺衍生物，其具有式I所示结构：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Ra、Rb、Rc和Rd独立地为SO3 -或H；Rx'、Ry'和Rz'独立地为COCH3或SO3 -，n为1-3；
式I中平均每个双糖单元中磺酸基个数不少于2个，平均每个双糖单元中乙酰基不多于0.5个，平均每个双糖单元的葡萄糖胺6-位和3-位磺酸基都不少于0.5个。
2.根据权利要求1所述的硫酸化肝素寡糖，其特征在于，式I中糖醛酸为葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸。
3.根据权利要求1所述的硫酸化肝素寡糖，其特征在于，与式I中所含羧基和/或磺酸基成盐的阳离子选自Na+、K+或Ca2+。
4.根据权利要求1所述的硫酸化肝素寡糖，其特征在于，所述硫酸化肝素寡糖为具有以下结构的化合物中的任意一种或至少两种的组合：
DP6肝素六糖衍生物：
ΔU3S-ANS3S-I-ANS3S-G3S-ANS3S6S
ΔU3S-ANS-I3S-ANS3S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S-G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-G2S3S-ANS3S6S
DP8肝素八糖衍生物：
ΔU3S-ANS3S-I-ANS3S-I3s-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU3S-ANS-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-I3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6S
DP10肝素十糖衍生物：
ΔU3S-ANS3S-I-ANS3S-I-ANS6S-I-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU3S-ANS-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S-I3S-ANS6S-I3S-ANS6S-G3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I3S-ANS3S6S-I3S-ANS6S-I3S-ANS6S–G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS6S-I2S3S-ANS6S-G2S3S-ANS3S6S
ΔU2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-I2S3S-ANS3S6S-G2S3S-ANS3S6S。
5.根据要求1-4中任一项所述的硫酸化肝素寡糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)利用肝素酶降解肝素，分离、纯化得到肝素寡糖；
(2)利用硫酸化试剂对步骤(1)得到的肝素寡糖进行硫酸化，得到所述硫酸化肝素寡糖。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述肝素酶为肝素酶I。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述利用肝素酶降解肝素时需加入缓冲液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为pH 7.0的Tris-HCl缓冲液。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述肝素酶的加酶量为15～25IU/g肝素。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述肝素酶的加酶量为18～23IU/g肝素。
11.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述利用肝素酶降解肝素的温度为4～37℃。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述利用肝素酶降解肝素的温度为8～25℃。
13.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述降解的时间为8～24小时。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述降解的时间为10～20小时。
15.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述利用肝素酶降解肝素包括在降解之后于95℃灭活5～10min。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述灭活的时间为5～8min。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述灭活的时间为6min。
18.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述分离包括超滤。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，利用10KDa超滤离心管进行超滤。
20.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述纯化为利用柱层析法分离提纯。
21.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)所述硫酸化之前包括将步骤(1)得到的肝素寡糖进行溶胀处理。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述溶胀处理使用的溶剂为DMF。
23.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述硫酸化试剂为(CH3)3N·SO3。
24.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，相对于1g肝素寡糖，硫酸化试剂的用量为1～10g。
25.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述硫酸化的温度为60～120℃。
26.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述硫酸化的时间为1～12小时。
27.根据权利要求5-9、11、13、15、18-26中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)利用肝素酶I于4～37℃下降解肝素8～24小时，加酶量为15～25IU/g肝素，所用缓冲液为pH 7.0的Tris-HCl缓冲液，降解之后于95℃灭活5～10min，利用10KDa超滤离心管进行超滤分离、而后利用柱层析法分离提纯得到肝素寡糖；
(2)利用硫酸化试剂在60～120℃下对步骤(1)得到的肝素寡糖进行硫酸化1～12小时，得到所述硫酸化肝素寡糖。
28.根据权利要求1-4中任一项所述的硫酸化肝素寡糖在制备抗肿瘤转移药物中的应用。
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