CN109913517A - 硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的制备及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种硫酸乙酰肝素/肝素（HS/Hp）的不同区域寡糖的制备及纯化方法。所述方法以市售肝素为原料，利用肝素酶Ⅰ特异性酶解含有3个亚硫酸根的高硫二糖，精确控制酶解反应条件达到部分酶解，得到含高硫二糖的高硫酸化区域寡糖，同时也使得HS/Hp中含NS和NAc结构的低度硫酸化寡糖片段富集下来，从而制备了系列含不同结构的低硫酸化区域寡糖。通过凝胶色谱法和离子交换高效液相色谱分离提纯了二糖至十糖一系列低度硫酸化的HS/Hp寡糖。本发明建立的制备HS/Hp的不同区域寡糖的方法快速简便，并且成本低，为HS/Hp的结构与功能研究提供重要的糖库样品，也为肝素类新型药物的开发提供了重要的前驱体。
Description
技术领域
本发明提供硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的制备及纯化方法，属于天然产物制备纯化领域。
背景技术
硫酸乙酰肝素（HS）和肝素（Hp）是糖胺聚糖（GAG）家族中最复杂的碳水化合物，主要由不同的二糖单元通过β（1-4）糖苷键交替连接形成的线性硫酸化的多糖。HS长链中含有3种不同硫酸化程度的区域，高硫酸化区域(S-domain)、低度硫酸化(NA/NS domain)以及无硫区域(NA domain)，它们交替排列组成了复杂的链状结构。而Hp长链的70-80%为高硫二糖与HS的高硫区域结构相似。研究发现，HS/Hp的高度硫酸化和低度硫酸化区域利用自身的特异结构和序列与许多活性蛋白质的相互作用调控着许多重要生物功能，如细胞的生长调控、信号传导，细胞粘附和迁移，炎症，抗凝，神经发育和再生等。它们的生物学意义使HS/Hp成为新型药物（如抗肿瘤抗病毒药物等）开发的重要靶标。因此对不同硫酸化区域的HS/Hp寡糖的制备及其结构鉴定对HS/Hp的结构与功能的研究提供重要的标准糖库样品，也为肝素类新型药物的开发提供了重要的前驱体。
肝素酶对HS和Hp二糖具有不同的底物特异性，其中肝素酶I对含有高硫二糖具有酶解特异性。近年来已有报道利用肝素酶I通过完全酶解肝素来制备含有稀有结构的肝素寡糖。但是未见制备HS/Hp的不同区域寡糖的报道。本发明利用肝素酶I的底物特异性通过控制酶反应条件达到不同程度的部分酶解，以同时制备一系列含有不同结构高度硫酸化和低度硫酸化区域的寡糖片段。因此本发明在制备路线和技术方法上具有创新性。
发明内容
本发明的目的在于提供硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的制备及纯化方法，以肝素为原材料，利用肝素酶Ⅰ能特异性酶解含有3个亚硫酸根的高硫二糖，精确地控制酶解反应条件达到部分酶解，得到含高硫二糖的高度硫酸化区域寡糖，同时也使得HS / Hp中含NS和NAc结构的低度硫酸化寡糖片段富集下来，从而制备了系列含不同结构的低硫酸化区域寡糖。通过凝胶色谱法分离收集得到不同聚合度的HS/Hp肝素粗样品，除掉流动相中的NH4HCO3后，再用离子交换高效液相色谱（SAX-HPLC）分离收集得到低度硫酸化HS / Hp肝素寡糖纯品。
本发明的具体技术方案为：
一种HS / Hp不同区域寡糖的制备及纯化方法，其步骤为：
(1)以肝素为原料，利用肝素酶Ⅰ部分酶解制备一系列含不同区域结构的寡糖；
(2)酶解产物用凝胶色谱法分离收集，后经除流动相、冷冻干燥，得到不同聚合度的HS/ Hp
寡糖粗样品。
(3)用SAX-HPLC方法分别对步骤（2）中得到HS / Hp寡糖粗样品进一步的细分；经除盐与冷冻干燥之后得到纯化的HS / Hp寡糖。
(4)再将步骤(2)收集得到的HS / Hp寡糖粗样品分别加入肝素复合酶完全酶解，用SAX-HPLC法对其进行二糖组分分析鉴定。
具体步骤如下：
步骤（1）的具体步骤为：称量50-200 mg 市售肝素溶解在5-10mL Tris-HCl缓冲液，加入10-60 mIU肝素酶I于36-40 ℃加热酶解24h后终止反应，12000 r／min离心10 min，取上清液，冷冻干燥。
步骤（2）的具体步骤为：利用凝胶色谱层析柱分离步骤（1）的酶解样品140 mg，以0.1-0.2M NH4HCO3为流动相，洗脱流速15-18 mL/h，以UV 232 nm检测，分别收集二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的洗脱峰；所收集的对应的洗脱液在50-60 ℃烘箱挥发NH4HCO3，-80℃冷冻干燥，分别得到含有不同区域结构不同聚合度的二糖、四糖、六糖、八糖、十糖寡糖粗样品。
步骤（3）的具体步骤为：将步骤（2）中制备的HS/Hp寡糖粗样品各50-100 ug分别溶解于pH 3.0-4.0 的水，用SAX-HPLC法在不同NaCl浓度浓度下线性梯度洗脱，分离收集HS/Hp寡糖，分别透析、冷冻干燥，得到HS/Hp寡糖纯品。
步骤（4）的具体步骤为：取步骤（2）制备的HS/Hp寡糖粗样品各30-80 ug，分别加入2-4 mIU肝素酶Ⅰ、2-4 mIU肝素酶Ⅱ和2-4 mIU肝素酶Ⅲ，进行完全酶解，反应体系为80-150uL醋酸钠缓冲液（含有0.1 mol/L醋酸钠、0.1 mmol/L醋酸钙和100 ug /mL的牛血清蛋白，pH 7.0)，酶解产物用SAX-HPLC法分析并确定二糖组分。
具体操作步骤如下：
1.硫酸乙酰肝素/肝素（HS / Hp ）寡糖的制备
称量50-200 mg 市售肝素溶解在5-10mL Tris-HCl缓冲液（含20 mmol/L Tirs和5mmol/L氯化钙，pH 7.40)，加入10-60 mIU肝素酶I于36-40℃酶解24h，100℃灭活5 min终止反应终止反应,12000 r／min离心10 min，取上清液，冷冻干燥。
HS/Hp寡糖的分离收集
取步骤1冻干样140 mg用3mL 0.1-0.2 M NH4HCO3溶解，过聚丙烯酰胺凝胶色谱柱(Bio-Gel P-10 )，以0.1-0.2M NH4HCO3为流动相，洗脱流速15-18 mL/h，用UV 232 nm检测收集，分别收集二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的洗脱峰。所得的各个寡糖组分洗脱液在50-60℃烘箱去除NH4HCO3（本步骤重复3次），-80 ℃真空冷冻干燥后得到含不同区域结构不同聚合度的系列HS/Hp寡糖粗样品。
HS/Hp寡糖的细分
取步骤2制备的二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的HS/Hp寡糖粗样品各50-100 ug，分别溶解于pH 3.0-4.0 的水，利用SAX-HPLC，在不同NaCl浓度下线性梯度洗脱，分离收集HS/Hp寡糖。把收集到的肝素寡糖分别装入相应规格的透析膜，在超纯水中透析3 天后，冷冻干燥得到二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的HS/Hp寡糖纯品。
SAX-HPLC方法具体参数为：色谱柱为ProPac PA1（4×250 mm）；流动相：A相为pH3.5 H2O，B相为pH3.5 2M NaCl；流速1-1.5 mL/min；UV 232 nm检测。
HS/Hp寡糖二糖组分分析
把步骤（2）中制备的二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的HS/Hp寡糖各取30-80 ug，别加入2-4 mIU肝素酶Ⅰ、2-4 mIU肝素酶Ⅱ和2-4 mIU肝素酶Ⅲ，进行完全酶解，反应体系为80-150uL醋酸钠缓冲液（含有0.1 mol/L醋酸钠、0.1 mmol/L醋酸钙和100 ug /mL的牛血清蛋白，pH 7.0)，37 ℃水浴反应24小时，100℃灭活5 min终止反应。酶解产物用SAX-HPLC分析，色谱柱为ProPac PA1（4×250mm），流动相:A相为pH 3.5 H2O，B相为pH 3.5 2M NaCl，UV 232nm检测，流速1 mL/min，线性梯度洗脱。检测图谱和标样二糖图谱比对，确定二糖组分，从而进行结构鉴定。
本发明的优点在于：利用肝素酶I的底物特异性，通过控制酶反应条件达到不同程度的部分酶解，以同时制备一系列含有不同结构高度硫酸化和低度硫酸化区域的寡糖片段。本发明在制备路线和技术方法上未见报道，具有创新性。
附图说明
图1聚丙烯酰胺凝胶色谱柱（Bio-Gel P-10）分离HS/Hp寡糖色谱图。
图2 强阴离子高效液相色谱法分析dp2色谱图。
图3 强阴离子高效液相色谱法分析dp4色谱图。
图4 强阴离子高效液相色谱法分析dp6色谱图。
图5 强阴离子高效液相色谱法分析dp8色谱图。
图6 强阴离子高效液相色谱法分析dp10色谱图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
以制备五种含不同区域结构HS/Hp寡糖粗样（二糖、四糖、六糖、八糖和十糖）为例：
1.硫酸乙酰肝素/肝素（HS / Hp）寡糖的制备
称量200 mg 市售肝素溶解于10 mL Tris-HCl缓冲液（含20 mmol /L Tris和5 mmol /L氯化钙，HCl调pH 7.40)，加入20mIU肝素酶I，于40℃烘箱酶解24h后，100℃灭活5 min终止反应,12000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃冷冻干燥5小时。
二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的分离收集
取上述冻干样140mg，用3mL 0.2M NH4HCO3溶解，并用聚丙烯酰胺凝胶色谱柱(Bio-GelP-10 )分离，收集的各个肝素寡糖（二糖、四糖、六糖、八糖和十糖）对应的色谱峰。于55 ℃烘箱72 h挥发NH4HCO3，-80℃真空冷冻干燥后分别得到5种不同聚合度的系列HS/Hp寡糖粗样品，根据标样dp2出峰时间，分别把这些寡糖标记为dp2、dp4、dp6、dp8和dp10。其中dp表示Degree of polymerization,e.g.dp2 is disaccharide,dp2代表二糖）（见图1）。
聚丙烯酰胺凝胶色谱法具体参数如下：凝胶色谱柱：Bio-Gel P-10（2.5 cm×150cm），流速：18 mL/h，总上样体积：3 mL，总上样量：140 mg，流动相: 0.2 mol/L NH4HCO3，柱温：室温，检测器：UV检测器，检测波长：232 nm。
寡糖二糖组分分析
取步骤2中制备的dp4、dp6、dp8和dp10粗样品各50 ug，不同样品中分别加入4 mIU肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，于37℃完全酶解24 h，反应体系为100 uL醋酸钠缓冲液（含有0.1 mol/L醋酸钠、0.1 mmol/L醋酸钙和100 ug /mL的牛血清蛋白，pH 7.0)，酶解产物用浓缩仪干燥。
另分别取所得干燥样品50 ug，用200uL pH 3.5的水溶解，SAX-HPLC分析，具体参数如下：色谱柱：ProPac PA1（4×250 mm），流速: 1 mL/min，上样量：≦100 ug，流动相: A为 pH 3.5 H2O，B为pH 3.5 2M NaCl，柱温：室温，检测器：UV检测器，检测波长：232 nm，梯度洗脱：0-0.5 M NaCl （2.1-35.1 min），0.5 - 1.0 M NaCl（35.1-57.1 min)。
检测图谱和标样二糖图谱比对，确定各个寡糖的二糖组分。根据检测图谱二糖峰面积进行二糖组分分析，结果见下表1。从表中可以看出，制备的寡糖随着聚合度的增加（dp4、dp6、dp8和dp10），含NAc-dp2总量从1.084 %增加到24.276 %，而NS-dp2、2S-dp2和6S-dp2的含量逐渐减少。表明利用肝素酶I的部分酶解法可富集含低度硫酸化区域结构的寡糖，寡糖中含NAc结构二糖增加以及含2S和6S结构二糖的减少，从而降低寡糖硫酸化程度。同时各寡糖组分中含3个亚硫酸根二糖均为主要成分约占50 %，表明各组分中也同时存在含高硫区域结构的寡糖。以上结果表明，利用本方法可成功制备系列高度硫酸化和低度硫酸化的HS/Hp二糖、四糖、六糖、八糖和十糖。
表1 HS/Hp-dp4、dp6、dp8和dp10糖的二糖组分表
实施例 2
以制备十五种低度硫酸化HS/Hp寡糖纯品为例：
1.酶解硫酸乙酰肝素/肝素（HS/Hp）
称量100 mg 市售肝素溶解于5mL Tris-HCl缓冲液（含20 mmol /L Tris和5 mmol /L氯化钙，HCl调pH 7.40），加入10 mIU肝素酶I于40 ℃烘箱酶解24 h后，100 ℃灭活5 min终止反应，12000 r/min离心10 min，取上清液，冷冻干燥。
寡糖的制备
取上述冻干样140mg，用3mL 0.2M NH4HCO3溶解，用聚丙烯酰胺凝胶色谱柱(Bio-GelP-10)分离，并收集的各个肝素寡糖对应的色谱峰。于55 ℃烘箱72 h挥发NH4HCO3，-80℃真空冷冻干燥后得到5种不同聚合度的系列HS/Hp寡糖粗样品，分别是dp2、dp4、dp6、dp8、dp10寡糖粗样品。（其中dp表示Degree of polymerization,e.g.dp2 is disaccharide,dp2代表二糖）。
聚丙烯酰胺凝胶色谱法具体参数如下：凝胶色谱柱：Bio-Gel P-10（2.5 cm×150cm），流速: 18mL/h，总上样体积：3 mL，总上样量：140 mg，流动相:0.2mol/L NH4HCO3，柱温：室温，检测器：UV检测器，检测波长：232 nm。
寡糖二糖组分分析
取步骤2中制备的dp4、dp6、dp8、dp10粗样品各50 ug，各样品中分别加入4 mIU肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，于37 ℃完全酶解24 h，反应体系为100 uL醋酸钠缓冲液（含有0.1 mol/L醋酸钠、0.1 mmol/L醋酸钙和100 ug /mL的牛血清蛋白，pH 7.0)，酶解产物用浓缩仪干燥。取50 ug干燥样品用200 uL pH 3.5的水溶解，SAX-HPLC分析二糖，梯度洗脱为0-0.5 M NaCl （2.1-35.1 min），0.5 - 1.0 M NaCl（35.1-57.1 min)。SAX-HPLC方法具体参数如下：色谱柱：ProPac PA1（4×250 mm），流速: 1 mL/min，上样量：≦100 ug，流动相: A为pH 3.5 H2O，B为pH 3.5 2M NaCl，柱温：室温，检测器：UV检测器，检测波长：232nm；
检测图谱和标样二糖图谱比对，确定各个寡糖的二糖组分。根据检测图谱二糖峰面积进行二糖组分分析。
寡糖的细分
把步骤3中制备的dp4、dp6、dp8、dp10粗样品各取50 ug溶解于200 uL pH 3.5的水，用强阴离子高效液相色谱法进行分析。
dp4和dp6在0-0.8M NaCl (2.1-7.1 min)，0.8-1.5M NaCl (7.1-47.1 min)，1.5-2M NaCl (47.1-52.1min)条件下线性梯度洗脱分离。
dp8和dp10在0-1.0M NaCl (2.1-7.1 min)，1.0-1.7M NaCl (7.1-57.1 min)，1.7-2M NaCl (57.1-62.1 min)条件下线性梯度洗脱分离。
SAX-HPLC方法具体参数如下：色谱柱：ProPac PA1（4×250 mm） ，流速: 1 mL/min，上样量：≦200 ug，流动相:A: pH 3.5 H2O，B: pH3.5 2M NaCl，柱温：室温；检测器：UV检测器；检测波长：232nm；
图2-6分别是dp2、dp4、dp6、dp8和dp10 SAX-HPLC分析图谱。收集各个寡糖对应的色谱峰，用超纯水于透析膜（MW:500）透析3天，-80 ℃冷冻5 h后冷冻干燥，获得细分四糖、六糖、八糖和十糖纯品。
dp4有3个主要的四糖dp4a:ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)-ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)；dp4b:ΔHexA-GlcNS(6S)-ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)；dp4c:ΔHexA(2S)-GlcNS-ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)；
dp6可被细分成6个主要的六糖(dp6a、dp6b、dp6c、dp6d、dp6e和dp6f)。
dp8可被细分成6个主要的八糖(dp8a、dp8b、dp8c、dp8d、dp8e和dp8f)。
dp10被细分成多种结构的寡糖，且各个结构寡糖之间的含量不相上下。
总结：该方法可以一次性制备出至少15个聚合度不同的高度硫酸化和低度硫酸化HS/Hp寡糖纯品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (1)
1.一种硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的制备及纯化方法，其特征在于：具体步骤如下：
1）硫酸乙酰肝素/肝素的区域寡糖的制备：以肝素为原料，通过控制肝素酶I酶解反应条件达到部分酶解以制备硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖；酶解条件为：50-200 mg肝素溶解在5-10mL Tris-HCL缓冲液，加入10-60 mIU肝素酶I于36-40℃加热酶解24 h后终止反应，12000 r／min离心10 min，取上清液，冷冻干燥；
2）硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的分离收集：利用聚丙烯酰胺凝胶色谱柱，以0.1-0.2M NH4HCO3流动相，洗脱流速15-18 mL/h，并在UV 232 nm下测量洗脱液的吸光度，分离步骤1）酶解得到的酶解样品，分别收集二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的洗脱峰；接着将各洗脱峰收集的洗脱液于50-60 ℃烘箱挥发流动相NH4HCO3，-80 ℃冷冻干燥，分别得到不同区域的二糖、四糖、六糖、八糖和十糖粗样品；
3）硫酸乙酰肝素/肝素的不同区域寡糖的细分：分别取步骤2）中收集的硫酸乙酰肝素/肝素寡糖粗样品各50-100 ug溶解于pH 3.0-4.0的水中，用强阴离子高效液相色谱法，在不同NaCl浓度下线性梯度洗脱，分离收集对应的硫酸乙酰肝素/肝素寡糖；把收集到的各寡糖装入相应规格的透析膜，在超纯水中透析3天后，冷冻干燥分别得到二糖、四糖、六糖、八糖和十糖的硫酸乙酰肝素/肝素寡糖纯品。
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