CN103173506B - 控制生产低分子量肝素的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开一种低分子量肝素或超低分子量肝素的生产方法。该方法利用选自肝素酶I、II和III中两种以上的肝素酶来降解肝素从而生产低分子量肝素或超低分子量肝素。

Description

控制生产低分子量肝素的方法

技术领域

本发明涉及一种控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法，该方法利用选自肝素酶I、II和III中两种以上的肝素酶来降解肝素从而生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法。

背景技术

肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖的重复单位的线性链状结构，其分子量在3000-37000Da之间，在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂使用。此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能。但是，由于肝素具有抗凝活性，所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等副作用，从而大大限制了肝素在临床上的应用。

低分子量肝素(低分子量肝素寡糖)(简称LMWH)的分子量通常是指在3000-8000Da之间，且分子量可以在4000Da、5000Da、6000Da、7000Da或其在3000-8000Da内的任何组合之间；超低分子量肝素是指(平均)分子量在3000Da以下的肝素。与普通肝素相比，通过体内、体外实验发现，在同等剂量下，(超)低分子量肝素的抗凝作用小于肝素，但其体内和体外抗血栓作用明显强于肝素。此外，(超)低分子量肝素还具有一些其它优势，如分子量小，生物利用度高，血浆半衰期长；不与肝素结合蛋白结合，因此有更稳定的量效关系，按体重给药，控制剂量，不需要进行实验室监测；较少与血小板结合，不易引起血小板减少。所以(超)低分子量肝素既能有效防止血栓形成，又能减少出血等不良反应，是一种安全有效的抗血栓药物，可作为肝素的替代物。

发明内容

(超)低分子量肝素制备主要是传统的化学裂解法工艺。肝素酶法制备(超)低分子量肝素除了具备酶工程普遍化的生产条件温和，环境友好，能耗低，效率高等优点外，还有其特殊的优势。肝素酶制备(超)低分子量肝素工艺与传统的化学裂解法的比较如表1所示，除了酶使用成本过于昂贵外，酶法制备明显占据了优势。因此，如何开发高效清洁低成本的酶法制备低分子量肝素工艺关键在于如何降低酶的成本。

表1低分子量肝素制备工艺中肝素酶法与传统化学裂解法的比较

肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素或硫酸乙酰肝素的多糖裂解酶，在许多种微生物中发现，包括棒杆菌Corynebacteriumsp.、鞘胺醇杆菌Sphingobacteriumsp.、枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis、环状芽孢杆菌Bacilluscirculans、解肝素拟杆菌Prevotellaheparinolytica、粪便拟杆菌BacteroidesstercorisHJ-15和肝素黄杆菌Flavabacteriumheparinum(Sasiekharan,R.1991Ph.D.Thesis,HavardUniversity)。来自肝素黄杆菌的肝素酶是商业化的唯一来源。来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有三种，分别命名为肝素酶I(EC4.2.2.7)、肝素酶II(NoECcode)和肝素酶III(EC4.2.2.8)(RobertJ.Linhardtetal.,PurificationandcharacterizationofheparinlyasesfromFlavobacteriumheparinumJBC1992Vol.267：24347-24355)。

采用肝素酶I来降解肝素生产(超)低分子量肝素时存在一些问题，比如反应比较迅速，反应条件不易控制；对切割位点的选择性较差，容易切割肝素大分子中的戊糖活性中心，使产物的抗凝活性大大降低，影响药效的发挥；酶的稳定性较差，反应过程中容易失活等等。其中对切割位点的选择性差是较为严重的不利影响。

为了更深入地理解这一点，应该先明确肝素类药物的抗凝机理。普通肝素、低分子量肝素、戊糖都是通过加快抗凝血酶Ⅲ灭活凝血因子的速度而起到抗凝作用，该类药物的主要作用是抗Xa和抗IIa因子活性。通过对肝素类药物抗Xa活性与抗IIa活性的研究发现，抗Xa活性对分子质量不敏感，抗IIa活性则依赖分子质量的大小。分子质量越大，抗IIa活性越强。肝素对IIa因子灭活有赖于肝素-抗凝血酶-IIa因子三联复合物的形成，此时肝素同时结合于抗凝血酶和因子IIa，要实现这种连接肝素至少要含有18个糖单位，其中起“桥梁”作用需要13个单糖，另需5个单糖作为识别片段。每个单糖平均分子质量为300Da，因此分子质量一定要达到5400Da以上才具有抗IIa活性。普通肝素平均分子质量15000Da，绝大多数分子在5400Da以上，其抗Xa与抗IIa活性之比约为1:1。低分子肝素平均分子质量为4000-5000Da，分子质量在5400Da以上的分子片段所占比例较小，一般情况下其抗Xa:抗IIa活性约1.5:1～4:1。

本发明人意外地发现，使用不同种类肝素酶来生产低分子量肝素可以获得意想不到的效果。

因此，本发明人得到了一种肝素酶的混合物，优选包括肝素酶I、II和III中的至少两种。

本文提供一种控制生产低分子量肝素的方法，包括组合使用肝素酶的混合物。

具体的，本文提供了一种控制生产低分子量肝素的方法，包括组合使用选自下列的至少两种：肝素酶I、II和III。

本文涉及一种控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法，利用肝素酶I和肝素酶II来降解肝素生产低分子量肝素。

本文涉及一种控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法，利用肝素酶I和肝素酶III来降解肝素生产低分子量肝素。

本文涉及一种控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法，利用肝素酶II和肝素酶III来降解肝素生产低分子量肝素。

本文涉及一种控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法，利用肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III来降解肝素生产低分子量肝素。

具体来说本文涉及以下内容：

(1).一种控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法，该方法包括向底物肝素中添加两种或两种以上肝素酶，使两种或两种以上肝素酶与底物肝素反应来生产低分子量肝素或超低分子量肝素。

(2).根据(1)所述的方法，其中所述两种或两种以上肝素酶选自肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III。

(3).根据(2)所述的方法，其中所述两种肝素酶为肝素酶I和肝素酶III。

(4).根据(2)所述的方法，其中所述两种肝素酶为肝素酶II和肝素酶III。

(5).根据(2)所述的方法，其中所述肝素酶I、肝素酶II或肝素酶III是以融合蛋白形式存在的肝素酶I、肝素酶II或肝素酶III。

(6).根据(5)所述的方法，其中所述以融合蛋白形式存在的肝素酶I、肝素酶II或肝素酶III可以是肝素酶I和肝素酶II的融合蛋白，肝素酶I和肝素酶III的融合蛋白、肝素酶II和肝素酶III的融合蛋白，或肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的融合蛋白。

(7).根据(5)所述的方法，其中所述肝素酶I是与麦芽糖结合蛋白融合的肝素酶I，所述肝素酶II是与麦芽糖结合蛋白融合的肝素酶II，所述肝素酶III是与麦芽糖结合蛋白融合的肝素酶III。

(8).根据(7)所述的方法，其中所述肝素酶I具有SEQIDNo:1所述的序列，所述肝素酶II具有SEQIDNo:2所述的序列，所述肝素酶III具有SEQIDNo:3所述的序列。

(9).根据(1)～(8)中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素：

重均分子量在8000Da以下，优选在7000Da以下，进一步优选在6000Da以下；

重均分子量小于8000Da的分子在所有低分子量肝素产物中所占的质量分数不小于60%，优选不小于65%，进一步优选不小于70%；

低分子量肝素的抗Xa因子大于70IU/mg，优选大于等于80IU/mg，进一步优选大于100IU/mg；以及

抗Xa/抗IIa大于1.5，优选大于1.56，进一步优选大于1.6。

(10).根据(1)～(8)中任一项所述的方法，其中，

所述超低分子量肝素的重均分子量在3000Da以下，优选在2500Da以下。

(11).一种用于生产低分子量或超低分子量的肝素酶的混合物，其包括选自肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III中的至少两种。

(12).一种控制生产低分子量或超低分子量硫酸乙酰肝素的方法，该方法包括向底物硫酸乙酰肝素中添加两种或两种以上肝素酶，使两种或两种以上肝素酶与底物硫酸乙酰肝素反应来生产低分子量硫酸乙酰肝素。

(13).根据(12)所述的方法，其中所述两种或两种以上肝素酶选自肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III。

附图说明

图1肝素酶I裂解肝素生产低分子量肝素或超低分子量肝素过程的示意图。

图2低分子量肝素或超低分子量肝素酶法生产的一个实施方式的工艺示意图。

图3肝素酶I、II、III及其组合降解肝素的寡糖PAGE图(其中Hp代表底物肝素，HS代表底物硫酸乙酰肝素)。

其中：1：Hp和肝素酶I的反应产物；

2：Hp和肝素酶II的反应产物；

3：HS和肝素酶II的反应产物；

4：HS和肝素酶III的反应产物；

5：Hp和肝素酶I+III的反应产物；

6：HS和肝素酶I+III的反应产物；

7：Hp和肝素酶I+II+III的反应产物；

8：HS和肝素酶I+II+III的反应产物。

具体实施方式

以下，对本文的实施方式进行具体说明。

<肝素酶及肝素酶混合物>

本文中涉及两种或两种以上的肝素酶，这些肝素酶可以是通过任何方法获得的肝素酶，包括肝素酶I、II和III，以及融合蛋白形式的肝素酶。这些肝素酶只要具有肝素酶的活性即可，其中优选使用肝素酶I、II、III。上述这些肝素酶可以采用商业购买的肝素酶，例如购自Sigma公司或IBEX公司的肝素酶I、II、III。肝素酶也可以是通过分子生物学方法构建的重组肝素酶I、II和III或者以融合蛋白形式存在的肝素酶I、II和III。

肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III之间也可以形成融合蛋白，例如可以构建肝素酶I和肝素酶II的融合蛋白，肝素酶I和肝素酶III的融合蛋白、肝素酶II和肝素酶III的融合蛋白，以及肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的融合蛋白，只要可以分别具有肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III的活性即可。

肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III也可以是与任何融合伴侣形成的融合蛋白，只要具有肝素酶I、II和III的活性即可。根据本文一个优选的实施方案，肝素酶I、II和III是肝素酶I、II和III和融合伴侣形成的融合蛋白，尤其是麦芽糖结合蛋白(MBP)和肝素酶I、II和III的融合蛋白。肝素酶I和MBP的融合蛋白在下文中有时被称为MBP-HepA(参见中国专利ZL200410038098.6，授权公告号CN1312183C)，肝素酶II和MBP的融合蛋白在下文中有时被称为MBP-HepB(参见中国专利ZL201010259905.2，授权公告号CN101942024B)，肝素酶III和MBP的融合蛋白在下文中有时被称为MBP-HepC(参见中国专利ZL201010259913.7，授权公告号CN101942025B)。优选肝素酶I、II和III分别具有序列表SEQIDNO:1～3所述的序列。

本文的两种或两种以上肝素酶可以以肝素酶混合物的形式提供，该混合物与底物肝素或硫酸乙酰肝素反应。该肝素酶混合物优选包括肝素酶I、II和III中的两种以上。其中，任意两种肝素酶优选的比例在10:90～90:10的范围，可以为20:80～80:20的范围，可以为30:70～70:30的范围，可以为400:60～60:40，可以为50:50的范围，所述比例以酶活比计。就包含肝素酶I、II和III的混合物而言，优选肝素酶I在肝素酶混合物中所占的比例在10～80%的范围，肝素酶II在肝素酶混合物中所占的比例在10～80%的范围，肝素酶III在肝素酶混合物中所占的比例在10～80%的范围。肝素酶I:肝素酶II:肝素酶III的比例可以为1:1:1。

在本文的一个具体的实施方案中，肝素酶的混合物是肝素酶I和肝素酶III的混合物，其中肝素酶I和肝素酶III的混合比例的范围为9:1～1:9，可以为8:2～2:8，可以为1:1～5:1，可以为2:1～5:1(肝素酶I:肝素酶III)。

在本文的另一个具体的实施方案中，肝素酶的混合物是肝素酶II和肝素酶III的混合物，其中肝素酶II和肝素酶III的混合比例的范围为9:1～1:9，可以为8:2～2:8，可以为1:1～5:1，可以为2:1～4:1(肝素酶II:肝素酶III)。

<低分子量肝素或超低分子量肝素的生产方法>

本文涉及一种控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法，该方法包括向底物肝素中添加两种或两种以上肝素酶，使两种或两种以上肝素酶与底物肝素反应来生产低分子量肝素或超低分子量肝素。

关于两种或两种以上肝素酶的描述参照上文。在本文涉及的生产方法中，任意两种肝素酶优选的使用比例在10:90～90:10的范围，优选在30:70～70:30的范围使用，优选50:50的范围使用，所述比例以酶活比计。就组合使用肝素酶I、II和III的方法而言，优选肝素酶I在肝素酶混合物中所占的比例在10～80%的范围，肝素酶II在肝素酶混合物中所占的比例在10～80%的范围，肝素酶III在肝素酶混合物中所占的比例在10～80%的范围。肝素酶I:肝素酶II:肝素酶III的比例可以为1:1:1。

在本文的一个具体的实施方案中，肝素酶I和肝素酶III以9:1～1:9，优选8:2～2:8，进一步优选1:1～5:1，尤其优选2:1～5:1(肝素酶I:肝素酶III)的范围使用，用于生产超低分子量肝素或低分子量肝素。

在本文的另一个具体的实施方案中，肝素酶II和肝素酶III以9:1～1:9，优选8:2～2:8，进一步优选1:1～5:1，尤其优选2:1～4:1(肝素酶II:肝素酶III)的范围使用，用于生产超低分子量肝素或低分子量肝素。

肝素酶I、II、III或它们的组合与底物肝素进行反应的方式可以为分批的、连续的或半连续的，本领域普通技术人员可以根据生产的需要适当地选择。对于反应的时间、反应装置而言，只要是可以得到目标的超低分子量肝素或低分子量肝素即可，可以由本领域普通技术人员适当确定。

在一个具体的实施方案中，在本文所涉及的控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法中，可以例如如图2所示的装置来进行生产。向图2所示的反应器中加入底物肝素溶液，然后加入肝素酶I、II或III中的两种以上，与底物肝素进行反应。随着反应的进行，肝素逐渐被降解为低分子量肝素或超低分子量肝素，每隔一段时间对反应液进行监测，在适当的时候终止反应。将上述反应终止了的混合溶液用纤维素膜真空初滤装置进行初滤，再利用超滤装置进行超滤得到次滤液。然和加入乙醇混合均匀后，离心弃上清收集沉淀，然后往沉淀中加入丙酮洗涤并用旋转蒸发仪进行减压蒸干即得到(超)低分子量肝素产品粉末。

在一个具体的实施方案中，利用肝素酶I和肝素酶II来降解肝素生产低分子量肝素。肝素酶I和肝素酶II可以同时或以任何顺序先后与底物肝素进行反应。

在一个具体的实施方案中，利用肝素酶I和肝素酶III来降解肝素生产低分子量肝素。肝素酶I和肝素酶III可以同时或以任何顺序先后与底物肝素进行反应，优选先添加肝素酶III反应一段时间后，再添加肝素酶I进行反应。但也可以先添加肝素酶I与底物肝素进行反应一段时间之后，再添加肝素酶III进行反应。

在一个具体的实施方案中，利用肝素酶II和肝素酶III来降解肝素生产低分子量肝素。肝素酶II和肝素酶III可以同时或以任何顺序先后与底物肝素进行反应，优选先添加肝素酶III反应一段时间后，再添加肝素酶II进行反应。但也可以先添加肝素酶II与底物肝素进行反应一段时间之后，再添加肝素酶III进行反应。

在一个具体的实施方案中，利用肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III来降解肝素生产低分子量肝素。其中肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III可以以任意的顺序先后与肝素作用，也可以同时与肝素作用。

肝素酶I、II和III各自的用量，本领域普通技术人员可以参考不同酶的活性根据生产所需来适当确定，优选每种酶的用量为肝素酶I在每升反应液50IU～500IU的范围，优选在100IU～250IU的范围。肝素酶II在每升反应液50IU～500IU的范围，优选在100IU～200IU的范围。肝素酶III在每升反应液10IU～500IU的范围，优选25～100IU。其中IU表示：在温度为30℃，pH7.4条件下，每分钟产生1μmol4,5不饱和末端产物的酶量。

本文中涉及用于生产低分子量肝素的底物肝素可以商购，也可以从动物中直接提取，例如可以从猪小肠粘膜提取。肝素二糖单位主要为L-艾杜糖醛酸和N-硫酸化的氨基葡萄糖通过α(1→4)糖苷键连接。

在本文中使用的肝素可以购买自例如河北常山生化药业股份有限公司的肝素、烟台东诚生化股份有限公司、深圳市海普瑞药业股份有限公司、常州千红生化制药股份有限公司、美药星(南京)制药有限公司等。

此外本文中使用的肝素酶还能够以硫酸乙酰肝素为底物生产低分子量的硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素二糖单位主要为D-葡糖糖醛酸和N-乙酰化的氨基葡萄糖通过α(1→4)糖苷键连接(参见NehaS.Gandhi，andRicardoL.Mancera.TheStructureofGlycosaminoglycansandtheirInteractionswithProteins.ChemBiolDrugDes,2008,72:455-482)。硫酸乙酰肝素例如可以购买自Sigma公司。

本文中底物肝素、底物硫酸乙酰肝素的浓度可以由本领域技术人员来确定，没有特定地限制，优选为1～100g/L。

在进行本文的生产方法之前，可以将底物肝素或硫酸乙酰肝素添加到缓冲液中，配制到合适的浓度。所使用的缓冲液只要不损害肝素酶I、II、III或它们的组合的酶活即可。在一个具体的生产方法中，采用的是20mMTris、20mMCaCl₂、50mMNaCl，并用1mM盐酸调节pH为7左右，例如7.4～7.6的缓冲液。在另一个具体的生产方法中，采用的是5.0mMCaCl₂和200mMNaCl的去离子水溶液中，然后用1MHCl溶液调节pH至7.0的缓冲溶液。

对肝素酶I、II、III或它们的组合与底物肝素进行反应时的温度没有具体限定，只要是不会使肝素酶I、II、以及III失活的温度即可，例如可以设定为10～45℃，最优选30℃。

对于肝素酶I、II、III或它们的组合与底物肝素进行反应的时间没有具体限定，本领域技术人员可以根据所添加的肝素酶的酶活、底物的浓度和反应的温度可以适当选择，在一个具体的方法中，肝素酶I、II、III或它们的组合与底物反应的时间可以5分钟～10小时，也可以为10分钟～4小时。

在本文所述的方法中，在肝素酶I、II、III或它们的组合与底物肝素进行反应的过程中，对反应的溶液进行监测的方式可以根据反应体系来适当选择，在一个具体的方法中，利用紫外分光光度计检测235nm处的吸光度的变化，随着反应的进行235nm处的吸光度A₂₃₅不断增加，从而通过吸光度的增加来确定反应进行的程度。

在反应的过程中，当按照上述方法测定反应进行到所期望的程度时，可以终止反应，以进一步分离以获得超低分子量肝素或低分子量肝素。其中对于终止反应的方法，本领域技术人员可以根据其掌握的知识来选择，例如加入终止反应的试剂，或提高温度以使酶失活。在本文的一个具体的实施方式中，终止反应时加盐酸调节pH值至2.0后停留3分钟，再用2.0M的NaOH将pH值调回7.0。从不添加其它的杂质的观点来看，优选提高反应体系的温度使酶失活从而终止反应。在本文的一个具体的实施方式中，将整个反应体系放置在100℃水浴中10分钟，从而使酶降解底物的反应终止。

在本文所述的方法中，可以先添加一种肝素酶与底物肝素反应，在反应进行一段时间后，终止反应，然后再加入其它的肝素酶继续反应，并最终终止反应。也可以同时加入两种或两种以上肝素酶进行反应待反应进行到期望的程度时终止反应。

对于生产低分子量或超低分子量硫酸乙酰肝素的方法而言，除了采用的底物是硫酸乙酰肝素之外，其余与生产低分子量或超低分子量的肝素的方法基本相同。

<低分子量肝素或超低分子量肝素>

在本文所述的方法的目的在于得到超低分子量或低分子量的肝素，肝素的分子量是采用高效排阻色谱法来测定的产物的平均分子量，包括重均分子量M_w和数均分子量M_n。具体的测定方法如实施例所描述的。

欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(重均分子量(M_w)小于8000Da，并且分子量低于8000Da的肝素所占的质量分数不少于60%。此外目前通常认为在重均分子量(M_w)在3000Da以下的肝素为超低分子量肝素，对于超低分子量的肝素的分子量分布还没有更为具体的规定。

根据下文具体示出的实施例中得到的产物的分子量的数据显示，利用本文所描述的方法可以得到超低分子量肝素或低分子量肝素。

除了产物的重均分子量M_w和数均分子量M_n之外，肝素产品的抗Xa、IIa因子的活性也是衡量肝素产品的重要参数。关于肝素的抗Xa、IIa因子的检测可以参照欧洲药典，其中对于低分子量肝素产品欧洲药典规定抗Xa不得小于70IU/mg，抗Xa因子与抗IIa因子的活性比值不得小于1.5。目前对于超低分子量的抗Xa、IIa因子还没有更为具体的规定。测定抗Xa、IIa因子的方法参见下述实施例。

根据本文所述的方法，得到的低分子量肝素的重均分子量在8000Da以下，优选在7000Da以下，进一步优选在6000Da以下，且重均分子量小于8000Da的分子在所有低分子量肝素产物中所占的质量分数不小于60%，优选不小于65%，进一步优选不小于70%。

根据本文所述的方法，得到的超低分子量肝素的重均分子量在3000Da以下，优选在2500Da以下。

根据本文所述的方法，得到的低分子量肝素的抗Xa因子大于70IU/mg，优选大于等于80IU/mg，进一步优选大于100IU/mg，且抗Xa/抗IIa大于1.5，优选大于1.56，进一步优选大于1.60。

实施例

下面结合具体实施例对本文作进一步说明，但本文并不限于以下实施例。此外，在实施例中使用的是MBP-HepA、MBP-HepB和MBP-HepC作为肝素酶I、II和III的代表，本领域技术人员应当理解，任何形式的肝素酶I、II和III均可以用于实现本发明的目的。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

本文中涉及的菌株为E.coliTB1(pMAL-hepA)和E.coliTop10(pMAL-hepC)。用到的实验设备和仪器如表2所示。

表2本文中使用的仪器设备

仪器名称	型号	厂家
			MBPTrap	HP(1ml)	GE Healthcare
高速冷冻离心机	KUBOTA6930	KUBOTA公司(日本)
			低温超高压细胞破碎机	JN-3000PLUS	广州聚能生物科技有限公司
培养箱	SHH50.250JS	重庆永生实验仪器厂
			超净工作台		北京昌平长城空气净化工程公司
紫外－可见分光光度计	UV－1206	日本岛津制作所
			pH电极	CHNO60(828)	奥立龙公司
电子分析天平	AR5120，AR2140	奥豪斯公司
			超低温冰箱	ULTRA LOW	SANYO ULTRA LOW
膜包	Biomax8	Millipore
			隔膜式真空泵	DTC-21	ULVAC公司
旋转蒸发仪	CVE-2000	EYELA
			高效液相色谱系统		Shimadzu Co.,Japan

检测方法：

DNS法测定葡萄糖浓度

配制不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0，单位为mg/mL)的葡萄糖(利用10mg/mL葡萄糖标准溶液进行稀释)，取1mL糖溶液，加入1mLDNS试剂，100℃下反应5分钟后迅速冷却，加入4mL水，以空白样调零，在510nm处测定溶液吸光度，绘制标准曲线，并进行线性拟合。适当稀释待测的糖溶液，方法同上，测定A₅₁₀，根据拟合的公式即可求出待测液中的葡萄糖浓度。

DNS试剂及葡萄糖标准液的配制如下：

(1)DNS试剂：

A液：在300mL4.5%的NaOH溶液中加入880mL1%的3，5-二硝基水杨酸和255g四水和酒石酸钾钠(罗谢尔盐)；

B液：10g结晶酚中加入22mL10%NaOH，加水稀释至100mL，摇匀；

C液：69mLB液中加入6.9gNaHSO3；

A液和B液混合，直到罗谢尔盐完全溶解；

在密封容器中避光保存，可使用1年的时间。

(2)10mg/mL葡萄糖标准溶液：

在分析天平上准确称取1g分析纯无水葡萄糖(预先干燥至恒重)，用少量蒸馏水溶解后，转移至100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得浓度为10mg/mL的标准葡萄糖溶液。

在本文中使用的MBP-HepA、MBP-HepB和MBP-HepC的生产方法可以具体参见中国专利ZL200410038098.6、中国专利ZL201010259905.2和中国专利ZL201010259913.7。在此简述用于生产超低分子量或低分子量肝素的酶液的制备和融合酶的保存及活性追踪。

(1)粗酶液制备：收获诱导培养后的菌体E.coliTop10(pMAL-hepC))后，用反应缓冲液(20mMTris，200mMNaCl，充分溶解后用1M的盐酸调节pH值至7.4，4℃保存)重悬，超声破碎(操作条件为99×3×3，功率300W)后12000rpm离心30分钟收集上清即为粗酶液。

(2)液体冷冻保存：将以上制备的粗酶液用MBPTrap亲和柱进行纯化，然后在纯化所得酶液按每管10μl量分装于若干200μL容量离心管中于-80℃冷冻保存，定时取样检测活性。

酶法生产(超)低分子量肝素

酶法生产，例如(超)低分子量肝素酶法制备工艺示意图如图2所示。图2中超滤装置购自美国密理博(Millipore)公司，型号为Biomax8，截留分子量为8000Da。反应器为150mL带夹层的玻璃瓶，内层直径为4.8cm，外层直径为7.8cm，高度为10.5cm，搅拌器直径为2.0cm。除图2中的主要装置外，还包括一个孔径为0.2微米的纤维素膜真空初滤装置。纤维素膜真空初滤装置中所用纤维素膜购自上海兴亚净化材料厂，直径为50毫米。所用容器为250mL玻璃质锥形瓶。所用真空泵为隔膜式真空泵，购自日本爱发科(ULVAC)公司，型号为DTC-21。

(超)低分子量肝素制备过程如下：以商品肝素(购于河北常山生化药业股份有限公司)为底物，将商品肝素加入到100mL含5.0mMCaCl₂和200mMNaCl的去离子水溶液中，然后用1MHCl溶液调节pH至7.0，配成肝素浓度为50g/L的底物溶液。将上述底物溶液水浴加热至30℃恒温，加入1mL制备的酶活为7000IU/L的肝素酶I、II或III的粗酶液，或它们的混合物的粗酶液，进行反应。随着反应的进行，肝素被逐渐被降解为低分子量肝素，生成的4，5-不饱和糖苷键增多，在235nm下的吸光度A₂₃₅不断增加，每隔一段时间测定反应液的A₂₃₅监测反应进行，以便根据需要适时终止反应。终止反应时加盐酸调节pH值至2.0后停留3分钟再用2.0M的NaOH将pH值调回7.0。将上述反应终止液用纤维素膜真空初滤装置进行初滤，再利用超滤装置进行超滤得到次滤液。接下来往次滤液中加入2.5倍体积的乙醇混合均匀后，离心弃上清收集沉淀，然后往沉淀中加入丙酮洗涤并用旋转蒸发仪进行减压蒸干即得到(超)低分子量肝素产品粉末。

分子量测定

实施例1所得的(超)低分子量肝素产品采用高效排阻色谱法来测定其平均分子量(包括重均分子量M_w和数均分子量M_n)及分布。采用的凝胶色谱柱为TSKGelG3000SW,30mm×750mm,TosohCo.,Japan。所用的高效液相色谱系统包括计算机控制系统、蠕动泵(LC-10ATvp)、自动进样器(SIL-10ADvp)、紫外检测器(SPD-M10Avp)、示差检测器(RID-10A)。其中紫外检测器与示差检测器相互串联，示差检测器相接在紫外检测器后面。所用流动相为pH5.0，含质量百分含量2.84%的Na₂SO₄缓冲液。柱温35℃，流速0.5mL/分钟，紫外检测器检测波长为235nm。

(超)低分子量肝素分子量标准品是购自EDQM(EuropeanDirectoratefortheQualityofMedicines)的heparinlow-molecular-masscalibrationBRP(BiologicalReferencePreparation)(H0190000,M_n3800,formolecularweightdetection)。标准品及待测品均用流动相配制为10mg/mL，以25μl进样，同时记录两检测器色谱图，精确测出样品到达两检测器的时间差，将两色谱图时间对准得到色谱柱的校正曲线，校正中用的保留时间以示差折光检测器的保留时间为准。在目标区域内分别对RI曲线和UV曲线做积分得到曲线包围的面积∑RI和∑UV₂₃₅，首先求出面积比r：

$r=\frac{\mathrm{\&Sigma;RI}}{\mathrm{\&Sigma;}{\mathrm{UV}}_{235}}---\left(1\right)$

然后按(2)式求出f因子：

$f=\frac{M_{\mathrm{na}}}{r}---\left(2\right)$

(2)式中M_na为低分子量肝素分子量标准品的数均分子量3800Da。则曲线上任何一时间点对应的分子量M_i可以用(3)式求解：

$M_i=f\frac{{\left(\mathrm{RI}\right)}_i}{{\left({\mathrm{UV}}_{235}\right)}_i}---\left(3\right)$

(3)式中(RI)_i和(UV₂₃₅)_i分别为曲线上任何一时间点对应的RI信号和UV信号。

重均分子量M_w可以用(4)式求解：

$M_w=\frac{\mathrm{\&Sigma;}\left[{\left(\mathrm{RI}\right)}_i{M}_i\right]}{\mathrm{\&Sigma;}\left[{\left(\mathrm{RI}\right)}_i\right]}---\left(4\right)$

数均分子量M_n可以用(5)式求解：

$M_n=\frac{\mathrm{\&Sigma;}{\left(\mathrm{RI}\right)}_i}{\mathrm{\&Sigma;}[{\left(\mathrm{RI}\right)}_i/M_i]}---\left(5\right)$

分布系数D可以用(6)式求解：

$D=\frac{M_w}{M_n}---\left(6\right)$

此外，得到的超低分子量肝素或低分子量肝素中分子量少于8000Da的肝素分子占总产物的质量分数测定方法如下：

用Mi<8000Da所对应的RI曲线包围的面积比上RI曲线总面积即位分子量少于8000Da的质量分数X，如(7)所示：

$X=\frac{\mathrm{\&Sigma;}{\left(\mathrm{RI}\right)}_{i<8000}}{\mathrm{\&Sigma;}\left(\mathrm{RI}\right)}\&times;100\%---\left(7\right)$

抗Xa、IIa因子活性检测

(超)低分子量肝素的抗Xa、IIa因子活性检测参照欧洲药典。本文中采用的方法为体外通过抗凝血酶(以下简称ATIII)与(超)低分子量肝素标准品比较以测定供试品加速抑制Xa因子(以下简称抗Xa因子)、IIa因子(以下简称抗IIa因子)的活性。

(1)溶液配制：

Tris-HCl缓冲液(pH7.4)：取Tris6.08g和NaCl8.77g，加水500mL使之溶解，加牛血清蛋白10g，用HCl调节pH值至7.4，加水稀释至1000mL。Tris-EDTA缓冲液(pH8.4)：取Tris3.03g、NaCl5.12g和EDTA·2Na1.4g，加水250mL使之溶解，用HCl调节pH值至8.4，加水稀释至500mL。(超)低分子量肝素标准品及供试样品溶液：(超)低分子量肝素活性标准品购自EDQM(EuropeanDirectoratefortheQualityofMedicines)的heparinlow-molecular-massforassayBRP(BiologicalReferencePreparation)(H0185000,fordetectionofanti-factorXaactivityandanti-factorIIaactivity)。用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)分别将标准品(S)和供试品(T)稀释成4个不同浓度的溶液，各剂量间的剂距比控制在1:0.7～1:0.6。该浓度应在剂量对数～反应的线性范围内，检测抗Xa因子时一般为每毫升0.025IU～0.2IU，检测抗IIa因子时一般为每毫升0.015IU～0.075IU。

ATIII溶液：ATIII购自Chromogenix公司(Sweden)。检测抗Xa因子时以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制成1IU/mL的溶液；检测抗IIa因子时以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制成0.5IU/mL的溶液。

发色底物溶液：检测抗Xa因子时用发色底物S-2765(N-α-benzyloxycarbonyl-D-arginyl-L-glycyl-L-arginine-p-nitroaniline-dihydrochloride)，购自Chromogenix公司(Sweden)。检测抗IIa因子时用发色底物S-2238(H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl-arginine-p-nitroaniline-dihydrochloride)，购自Chromogenix公司(Sweden)。两种发色底物均用去离子水制成0.003M的溶液储存，临用前用Tris-EDTA缓冲液(pH8.4)稀释至0.0005M。

抗Xa因子溶液：用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制，调试浓度，使之在用0.9%NaCl替代(超)低分子量肝素的抗Xa实验中，在405nm处的吸光度值处于0.6～0.7之间。

抗IIa因子溶液：用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)溶解并稀释成5IU/mL的溶液。

(2)测定方法：

取1.5mL离心管16支，分别标记T₁，T₂，T₃，T₄及S₁，S₂，S₃，S₄。各浓度平行做两管。每管分别加入4种浓度的供试品(T)或标准品(S)稀释液50μl，混匀，注意不要有气泡。按S₁，S₂，S₃，S₄，T₁，T₂，T₃，T₄，T₁，T₂，T₃，T₄，S₁，S₂，S₃，S₄顺序排列，37℃水浴平衡1分钟后加入发色底物溶液250μl，混合，37℃水浴保温4分钟，各加30%的醋酸溶液375μl终止反应。用1cm光程的半微量比色皿，以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)为空白，测定405nm处的吸光度。以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)代替供试品溶液(平行做两管)同法操作作为空白对照管，在16管开始和结尾时，分别测定空白对照管的吸光度。两者吸光度不得有显著性差异。以吸光度为纵坐标，标准品溶液(或供试品溶液)为浓度对数值为横坐标做线性回归，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4×4法实验设计，计算效价及实验误差。平均信限率(FL%)不得大于15%。

实施例1肝素酶I、II、III及其组合降解肝素或硫酸乙酰肝素的寡糖 PAGE图

将肝素酶I、II、III及其组合形式分别加入到肝素或硫酸乙酰肝素中，反应24h，具体来说分别是将(1)肝素酶I添加到底物肝素中反应24小时、将(2)肝素酶II添加到底物肝素中反应24小时、将(3)肝素酶II添加到底物硫酸乙酰肝素中反应24小时、将(4)肝素酶III添加到底物硫酸乙酰肝素中反应24小时、将(5)肝素酶I和肝素酶III添加到底物肝素中反应24小时、将(6)肝素酶I和肝素酶III添加到底物硫酸乙酰肝素中反应24小时、将(7)肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III添加到底物肝素中反应24小时、将(8)肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III添加到底物硫酸乙酰肝素中反应24小时，对上述得到的降解产物进行寡糖PAGE分析，结果如图3所示。泳道1是肝素被肝素酶I降解后的产物，泳道2是肝素被肝素酶II降解后的产物，泳道3是硫酸乙酰肝素被肝素酶II降解后的产物，泳道4硫酸乙酰肝素被肝素酶III降解后的产物，泳道5是肝素被肝素酶I和肝素酶III降解后的产物，泳道6是硫酸乙酰肝素被肝素酶I和肝素酶III降解后的产物，泳道7是肝素被肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III降解后的产物，泳道8硫酸乙酰肝素被肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III降解后的产物。分子量标准在图中标出。由泳道5和7可以看出肝素酶I、肝素酶III以及肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III混合使用比单独使用一种酶降解的彻底。

实施例2肝素酶I及肝素酶III降解肝素的比较

将等量的肝素酶I和肝素酶III分别加入到肝素溶液中，在30℃条件下彻底降解，反应直至A₂₃₅不发生变化。然后将产品过膜、沉淀并减压蒸干。对蒸干后的产品进行分子量鉴定和抗Xa、IIa因子活性检测，结果如表2所示。其中1#样品是肝素酶I降解所得产物，分子量较低，且抗Xa和抗IIa活性也偏低，说明肝素酶I可以切割肝素的抗凝活性中心结构，随着切割时间的延长，大多数活性中心都被破坏；2#样品为肝素酶III降解所得产物，与1#样品相比分子量较大，重要的是抗Xa和抗IIa活性远远大于1#，满足欧洲药典规定的抗Xa因子不得小于70IU/mg，抗Xa与抗IIa因子的比值不得小于1.5的要求。该实验初步说明了肝素酶III不会切割肝素的抗凝活性中心结构，将其应用于(超)低分子量肝素的生产应更具优势。实施例2可以作为本文控制生产(超)低分子量肝素方法的对比例。

表2肝素酶I和肝素酶III彻底酶解所得(超)低分子量肝素产品各指标汇总

由此可见，单一使用肝素酶I来裂解肝素，会出现由于肝素酶I的特性而导致选择性差，导致抗Xa因子不符合要求；而单独使用肝素酶III来裂解肝素的平均分子量太高，不符合要求。

实施例3肝素酶III及肝素酶III、I组合使用降解肝素的比较

为了检验肝素酶I和肝素酶III的作用位点存在差异，设计了如下实验。首先用肝素酶III降解肝素，在30℃条件下彻底降解，反应直至A₂₃₅不发生变化，然后取出一半溶液，再向其中加入肝素酶I进行裂解，另一半溶液留作对照，最后将两个样品分别减压蒸干。对蒸干后的产品进行分子量鉴定和抗Xa、IIa因子活性检测，结果如表3所示。其中2#样品是肝素酶III降解所得产物(参见实施例2)，分子量为8299；3#样品是先利用肝素酶III在与实施例5相同的条件下，在30℃条件下彻底降解，然后又经肝素酶I降解10小时后的产物，分子量是5120；4#样品是先肝素酶III在与实施例5相同的条件下，在30℃条件下彻底降解，然后又经肝素酶I降解至A₂₃₅不再变化的产物，分子量为2856，通过分子量的比较得知在肝素酶III彻底降解的情况下，肝素酶I还能进一步将其降解。因此可得如下结论：肝素酶I和III对肝素的作用位点不同，肝素酶I降解地更剧烈，而肝素酶III作用比较柔和，肝素中肝素酶1的作用位点更多，会将肝素降解为更低的分子量，同时会降解对肝素活性很重要的五糖活性中心，所以控制反应难度相对较大；而肝素中肝素酶3的作用位点很少，且不会破坏五糖活性中心，所以比较容易控制反应的进行，用于生产(超)低分子量肝素时反应条件容易控制。

表3肝素酶III及与肝素酶I组合酶解所得(超)低分子量肝素产品各指标汇总

实施例4肝素酶I及肝素酶III、I组合使用降解肝素的比较

将肝素酶I彻底降解肝素的结果与先经肝素酶III彻底降解再用肝素酶I降解的结果进行比较，结果见表4。其中1#样品是肝素酶I降解所得产物(参见实施例5)，4#样品是先肝素酶III极端条件下降解，然后又经肝素酶I降解后的产物，两者的分子量相差无几，但是抗Xa、抗IIa的活性却相差很大，4#样品明显优于1#样品。因此，该实验说明，降解到同样分子量的产品，用肝素酶III与肝素酶I组合的方式要明显优于肝素酶I。如果在反应时间上再加以控制的话，肝素酶III与肝素酶I组合降解肝素生产的(超)低分子量肝素完全可以达到药典的要求。

表4肝素酶I及与肝素酶III组合酶解所得(超)低分子量肝素产品各指标汇总

实施例5利用肝素酶III和肝素酶I的不同组合来制备低分子量肝素

实施例5-1：

(1)100ml反应液：肝素50g/L、20mMTris、20mMCaCl₂、50mMNaCl、用1mM的盐酸调节pH为7.6。

(2)酶的配比：5IU肝素酶III、10IU肝素酶I

(3)具体反应步骤：

向100ml反应液液中加入5IU肝素酶III，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中，反应4小时，调节pH为7.4后加入10IU的肝素酶I，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中反应15分钟。100℃水浴10分钟终止反应，10000g高速离心，取上清，加入6倍的无水乙醇沉淀，去除上清，然后冷冻干燥得4.75g产品，质量收率为95%。

(4)测定分子量：

重均分子量M_w=6970Da，数均分子量M_n=4107Da，多分散性PD=1.697，重均分子量少于8000Da的肝素分子占总产物的质量分数为65.41%。满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(重均分子量小于8000Da，其中分子量低于8000Da的肝素所占的质量分数不少于60%)。

(5)超/低分子量肝素活性测定

抗Xa因子为184.39IU/mg，平均信限率(FL%)为8.0488；抗IIa因子为115.10IU/mg，平均信限率(FL%)为4.822；抗Xa/抗IIa=1.60均满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(抗Xa活性大于70IU/mg，且抗Xa与抗IIa活性之比大于1.5)。

实施例5-2：

(1)100ml反应液：肝素50g/L、20mMTris、20mMCaCl₂、50mMNaCl、用1mM的盐酸调节pH为7.6。

(2)酶的配比：5IU肝素酶III、25IU肝素酶I

(3)具体反应步骤：

向100ml反应液液中加入5IU肝素酶III，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中，反应4小时，调节pH为7.4后加入25IU的肝素酶I，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中反应15分钟。100℃水浴10分钟终止反应，10000g高速离心，取上清，加入6倍的无水乙醇沉淀，去除上清，然后冷冻干燥得4.72g产品，质量收率为94.4%。

(4)测定分子量：

重均分子量M_w=4726Da，数均分子量M_n=2313Da，多分散性PD=2.043，分子量少于8000Da的肝素分子占总产物的质量分数为85.52%，满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(重均分子量小于8000Da，其中分子量低于8000Da的肝素所占的质量分数不少于60%)。

(5)超/低分子量肝素活性测定

抗Xa因子为81.66IU/mg，平均信限率(FL%)为6.5917；抗IIa因子为52.36IU/mg，平均信限率(FL%)为3.474；抗Xa/抗IIa=1.56均满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(抗Xa活性大于70IU/mg，且抗Xa与抗IIa活性之比大于1.5)。

实施例5-3

(1)100ml反应液：肝素50g/L、20mMTris、20mMCaCl₂、50mMNaCl、用1mM的盐酸调节pH为7.6。

(2)酶的配比：5IU肝素酶III、25IU肝素酶I

(3)具体反应步骤：

向100ml反应液液中加入5IU肝素酶III，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中，反应4小时，调节pH为7.4后加入25IU的肝素酶I，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中反应60分钟。100℃水浴10分钟终止反应，10000g高速离心，取上清，加入6倍的无水乙醇沉淀，去除上清，然后冷冻干燥得4.54g产品，质量收率为90.8%。

(4)测定分子量：

重均分子量M_w=1969Da，数均分子量M_n=1078Da，多分散性PD=1.826，分子量少于8000Da的肝素分子占总产物的质量分数为99.94%。

(5)低分子量肝素活性测定

抗Xa因子为23.87IU/mg，平均信限率(FL%)为5.4028；抗IIa因子为1.84IU/mg，平均信限率(FL%)为7.6035；抗Xa/抗IIa=13.01。

实施例6利用肝素酶III和肝素酶II的不同组合来制备低分子量肝素

实施例6-1

(1)100ml反应液：肝素50g/L、20mMTris、20mMCaCl₂、50mMNaCl、用1mM的盐酸调节pH为7.6。

(2)酶的配比：5IU肝素酶III、10IU肝素酶II

(3)具体反应步骤：

向100ml反应液液中加入5IU肝素酶III，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中，反应4小时，调节pH为7.6后加入10IU的肝素酶II，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中反应15分钟。100℃水浴10分钟终止反应，10000g高速离心，取上清，加入6倍的无水乙醇沉淀，去除上清，然后冷冻干燥得4.76g产品，质量收率为95.2%。

(4)测定分子量：

重均分子量M_w=6309Da，数均分子量M_n=4119Da，多分散性PD=1.532，分子量少于8000Da的肝素分子占总产物的质量分数为78.00%，满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(分子量(M)小于8000Da，其中重均分子量低于8000Da的肝素所占的质量分数不少于60%)。

(5)超/低分子量肝素活性测定

抗Xa因子为169.94IU/mg，平均信限率(FL%)为9.2457；抗IIa因子为77.228IU/mg，平均信限率(FL%)为8.2169；抗Xa/抗IIa=2.20均满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(抗Xa活性大于70IU/mg，且抗Xa与抗IIa活性之比大于1.5)。

实施例6-2

(1)100ml反应液：肝素50g/L、20mMTris、20mMCaCl₂、50mMNaCl、用1mM的盐酸调节pH为7.6。

(2)酶的配比：5IU肝素酶III、10IU肝素酶II

(3)具体反应步骤：

向100ml反应液液中加入5IU肝素酶III，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中，反应4小时，调节pH为7.6后加入10IU的肝素酶II，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中反应50分钟。100℃水浴10分钟终止反应，10000g高速离心，取上清，加入6倍的无水乙醇沉淀，去除上清，然后冷冻干燥得4.7g产品，质量收率为94%。

(4)测定分子量：

重均分子量M_w=5861Da，数均分子量M_n=3835Da，多分散性PD=1.528，分子量少于8000Da的肝素分子占总产物的质量分数为83.00%，满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(重均分子量小于8000Da，其中分子量低于8000Da的肝素所占的质量分数不少于60%)。

(5)超/低分子量肝素活性测定

抗Xa因子为151.35IU/mg，平均信限率(FL%)为10.299；抗IIa因子为77.127IU/mg，平均信限率(FL%)为6.3126；抗Xa/抗IIa=1.96均满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(抗Xa活性大于70IU/mg，且抗Xa与抗IIa活性之比大于1.5)。

实施例6-3

(1)100ml反应液：肝素50g/L、20mMTris、20mMCaCl₂、50mMNaCl、用1mM的盐酸调节pH为7.6。

(2)酶的配比：5IU肝素酶III、20IU肝素酶II

(3)具体反应步骤：

向100ml反应液液中加入5IU肝素酶III，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中，反应4小时，调节pH为7.6后加入20IU的肝素酶II，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中反应40分钟。100℃水浴10分钟终止反应，10000g高速离心，取上清，加入6倍的无水乙醇沉淀，去除上清，然后冷冻干燥得4.67g产品，质量收率为93.4。

(4)测定分子量：

重均分子量M_w=5439Da，数均分子量M_n=3581Da，多分散性PD=1.519，分子量少于8000Da的肝素分子占总产物的质量分数为88.00%，满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(重均分子量小于8000Da，其中分子量低于8000Da的肝素所占的质量分数不少于60%)。

(5)超/低分子量肝素活性测定

抗Xa因子为123.69IU/mg，平均信限率(FL%)为5.9866；抗IIa因子为51.091IU/mg，平均信限率(FL%)为6.7643；抗Xa/抗IIa=2.42均满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(抗Xa活性大于70IU/mg，且抗Xa与抗IIa活性之比大于1.5)。

实施例7利用肝素酶I和肝素酶III组合制备低分子量肝素

(1)100ml反应液：肝素50g/L、20mMTris、20mMCaCl₂、50mMNaCl、用1mM的盐酸调节pH为7.4。

(2)酶的配比：10IU肝素酶I、5IU肝素酶III

(3)具体反应步骤：

向100ml反应液中加入10IU肝素酶I，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中，反应15分钟，100℃水浴10分钟终止反应，10000g高速离心，取上清，调节pH为7.6后加入5IU的肝素酶III，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中反应4小时。100℃水浴10分钟终止反应，10000g高速离心，取上清，加入6倍的无水乙醇沉淀，去除上清，然后冷冻干燥得4.76g产品，质量收率为95.2%。

(4)测定分子量：

重均分子量M_w=6856Da，数均分子量M_n=4453Da，多分散性PD=1.54，重均分子量小于8000Da的肝素分子占总产物的质量分数为73.00%，满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(重均分子量小于8000Da，其中分子量低于8000Da的肝素所占的质量分数不少于60%)。

(5)低分子量肝素活性测定

抗Xa因子为153.06IU/mg，平均信限率(FL%)为6.6085；抗IIa因子为87.618IU/mg，平均信限率(FL%)为3.8183；抗Xa/抗IIa=1.75均满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(抗Xa活性大于70U/mg，且抗Xa与抗IIa活性之比大于1.5)。

实施例8肝素酶II和肝素酶III组合制备低分子量肝素

(1)100ml反应液：肝素50g/L、20mMTris、20mMCaCl₂、50mMNaCl、用1mM的盐酸调节pH为7.6。

(2)酶的配比：10IU肝素酶II、5IU肝素酶III

(3)具体反应步骤：

向100ml反应液液中加入10IU肝素酶II，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中，反应10分钟，100℃水浴10分钟终止反应，10000g高速离心，取上清，调节pH为7.6后加入5IU的肝素酶III，置于转速为170rpm的30℃恒温摇床中反应4小时。100℃水浴10分钟终止反应，10000g高速离心，取上清，加入6倍的无水乙醇沉淀，去除上清，然后冷冻干燥得4.74g产品，质量收率为94.8%。

(4)测定分子量：重均分子量Mw=6442Da，数均分子量Mn=4187Da，多分散性PD=1.539，重均分子量小于8000Da的肝素分子占总产物的质量分数为78.00%，满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(重均分子量小于8000Da，其中分子量低于8000Da的肝素所占的质量分数不少于60%)。

(5)低分子量肝素活性测定

抗Xa因子为142.01IU/mg，平均信限率(FL%)为6.4469；抗IIa因子为75.449IU/mg，平均信限率(FL%)为11.216；抗Xa/抗IIa=1.88均满足欧洲药典EP7.0中关于低分子量肝素的要求(抗Xa活性大于70U/mg，且抗Xa与抗IIa活性之比大于1.5)。

表3实施例5～实施例8的结果

根据上述结果可见，通过使用本文所述的方法，得到的产物的分子量分布均匀，活性中心的保持率高。这是因为肝素酶III与肝素酶I或II的作用有所不同，其作用位点选择性强，利用肝素酶III作用后的肝素的戊糖中心的保持率高，但是分子量比较高，达不到欧洲药典7.0的要求，故再用肝素酶1或者肝素酶2短时间裂解，就可降低分子量，达到欧洲药典关于分子量的要求。使用本文的方法可以避免使用肝素酶I的缺点，生产出高活性的(超)低分子量肝素。

此外，根据本文实施例的结果可以知道，本领域技术人员可以根据要求选择合适的酶量、底物浓度、反应温度、反应时间等参数从而生产满足不同分子量、抗Xa活性、抗Xa/抗IIa参数、小于8000Da的分子所占的比例的要求。此外，也可以通过调节上述参数来确定生产低分子量肝素或超低分子量肝素。

同样当底物为硫酸乙酰肝素时，还可以同样调节上述参数来生产不同的低分子量硫酸乙酰肝素。

根据上述结果可以知道，利用本文的方法生产的(超)低分子量肝素完全可以达到药典的要求，是非常有用的。

不需另外的说明，相信本领域普通技术人员可使用上文所述的说明和示例性的实施例，制备和利用本文，并且实现所要求保护的方法。应该理解的是上述说明和实施例仅详细说明了一些优选的实施方案的。对本领域技术人员显而易见的是，可作出各种修改和等价方案而不偏离本文实质和范围。

Claims (16)

1.一种控制生产低分子量肝素或超低分子量肝素的方法，该方法包括向底物肝素中添加两种肝素酶，使两种肝素酶与底物肝素反应来生产低分子量肝素或超低分子量肝素,

所述两种肝素酶为肝素酶I和肝素酶III或为肝素酶II和肝素酶III，

其中先添加肝素酶III，再添加肝素酶I，或者

先添加肝素酶III，再添加肝素酶II，

其中当所述两种肝素酶为肝素酶I和肝素酶III时，肝素酶I与肝素酶III的混合比例为2:1，以酶活比计；当所述两种肝素酶为肝素酶II和肝素酶III时，肝素酶II与肝素酶III的混合比例为2:1，以酶活比计。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肝素酶I、肝素酶II或肝素酶III是以融合蛋白形式存在的肝素酶I、肝素酶II或肝素酶III。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述肝素酶I是与麦芽糖结合蛋白融合的肝素酶I，所述肝素酶II是与麦芽糖结合蛋白融合的肝素酶II，所述肝素酶III是与麦芽糖结合蛋白融合的肝素酶III。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述肝素酶I具有SEQIDNo:1所述的序列，所述肝素酶II具有SEQIDNo:2所述的序列，所述肝素酶III具有SEQIDNo:3所述的序列。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素：

重均分子量在8000Da以下；

重均分子量小于8000Da的分子在所有低分子量肝素产物中所占的质量分数不小于60％；

低分子量肝素的抗Xa因子大于70IU/mg；以及

抗Xa/抗IIa大于1.5。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素：

重均分子量在7000Da以下。

7.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素：重均分子量在6000Da以下。

8.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素：

重均分子量小于8000Da的分子在所有低分子量肝素产物中所占的质量分数不小于65％。

9.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素：

重均分子量小于8000Da的分子在所有低分子量肝素产物中所占的质量分数不小于70％。

10.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素：

低分子量肝素的抗Xa因子大于等于80IU/mg。

11.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素：

低分子量肝素的抗Xa因子大于100IU/mg。

12.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素：抗Xa/抗IIa大于1.56。

13.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述低分子量肝素：抗Xa/抗IIa大于1.60。

14.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，

所述超低分子量肝素的重均分子量在3000Da以下。

15.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，

所述超低分子量肝素的重均分子量在2500Da以下。

16.一种控制生产低分子量或超低分子量硫酸乙酰肝素的方法，该方法包括向底物硫酸乙酰肝素中添加两种肝素酶，使两种肝素酶与底物硫酸乙酰肝素反应来生产低分子量硫酸乙酰肝素或超低分子量硫酸乙酰肝素，

所述两种肝素酶为肝素酶I和肝素酶III或为肝素酶II和肝素酶III，

其中先添加肝素酶III，再添加肝素酶I或者先添加肝素酶III，再添加肝素酶II，

其中当所述两种肝素酶为肝素酶I和肝素酶III时，肝素酶I与肝素酶III的混合比例为2:1，以酶活比计；当所述两种肝素酶为肝素酶II和肝素酶III时，肝素酶II与肝素酶III的混合比例为2:1，以酶活比计。