CN108117614B - 低分子量肝素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗和/或预防肝纤维化的低分子量肝素。所述低分子量肝素的数均分子量(Mn)的范围为2800～5000Da，重均分子量(Mw)的范围为6100～13000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3000～4500Da，重均分子量(Mw)的范围为6200～12000Da，进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3200～4400Da，重均分子量(Mw)的范围为6300～11000Da，再进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3250～4200Da，重均分子量(Mw)的范围为6400～10500Da。

Description

低分子量肝素
技术领域
本发明涉及一种新低分子量肝素以及其用于制备预防或治疗肝纤维化的药物的用途。
背景技术
纤维化疾病是组织在受到持续性的损伤后，因为非正常的、过度修复造成富含胶原蛋白的细胞外基质(ECM)沉积在组织及器官中，使实质细胞丧失原有的功能。纤维化疾病包括累及多系统的疾病，如系统性硬化症、多灶性纤维化、硬皮病、肾源性的多系统纤维化。也包括器官组织特异性疾病，如肺、肝脏、肾脏纤维化等疾病。
因为不同的纤维化病变涉及的器官及组织不同，暴露于不同的环境因素，并且组成的细胞类型不同，但纤维化过程均具有类似的病理过程：上皮细胞发生持续性损伤，分泌过量的细胞因子和生长因子。这些因子进一步刺激间充质细胞前体的招募和激活，形成肌成纤维细胞，随后分泌大量的细胞外基质。在正常的生理条件下，组织经过修复后，纤维化基质将被降解，成纤维细胞将发生凋亡，或逆转成为非活性细胞。但在纤维化疾病条件下，正常的清理及逆转化程序被破坏，实质细胞逐渐被肌成纤维细胞取代，失去了正常功能，导致了纤维化疾病的发生。
在西方世界，纤维化类疾病最终为死亡率贡献了高达45％的百分率，在发展中国家尚缺乏统计数据。尽管纤维化疾病发病者众多，但对于涉及到的分子机制研究是初步的，更缺乏有效的治疗方法。
肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质(特别是胶原物质)过度沉积，是机体对各种病因引起的慢性肝损伤后的一种损伤修复反应，是肝硬化的早期可逆阶段，如不及时治疗则可能进展成为失代偿期肝硬化并出现各种终末期肝病并发症。众所周知，我国是肝病大国。我国卫生部在2006年全国人群乙肝等有关疾病血清流行病学调查结果显示，我国人群乙肝表面抗原携带率为7.18％，据此推算，大概有9300万的乙肝感染者。根据卫生部数据统计，2004～2012年我国上报病毒性肝炎发病，病例13501863例,年均发病例数为1500207例。肝纤维化是慢性病毒性肝炎向肝硬化转变的中间环节，对其进行早期干预可有效防治肝硬化的发生。
发明内容
肝素是一类硫酸化、多分散、线性的糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAGs)，是最重要的抗凝药物之一。在临床上广泛应用于防治血栓栓塞性疾病。此外，肝素及其衍生物具有广泛的生物学活性，包括协调细胞黏附、调控细胞生长和增殖、发育过程、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、新血管发生、病毒入侵和肿瘤转移等等。
肝素是多靶点药物，除具有抗凝血的活性外，还具备与多种生长因子，趋化因子相互结合的能力，抑制炎症细胞的招募，以及趋化因子与其受体相互作用，协调炎症细胞的黏附、组织浸润等作用。肝素具有直接与TGF-β或CTGF等纤维化活化因子结合的能力，直接抑制纤维化的进程。
根据在美国肝病研究协会(AASLD)年会上展示的一项意大利小型研究的结果，采用β-降解方式，即，经成盐、酯化、碱水解工艺得到的依诺肝素(Enoxaparin)治疗对肝功能失代偿症状具有预防作用(参见Villa E,CammàC,Marietta M,et al.Enoxaparinprevents portal vein thrombosis and liver decompensation in patients withadvanced cirrhosis[J].Gastroenterology,2012,143(5):1253-1260.e4.)。在另一个临床实验中，将依诺肝素作为慢性乙肝的辅助治疗手段，血清透明质酸和IV型胶原蛋白水平经治疗后显著下降，胶原增生也同时减少，肝功能得到恢复(参见Shi J,Hao J H,Ren W H,et al.Effects of heparin on liver fibrosis in patients with chronic hepatitisB[J].Worldjournal of gastroenterology:WJG,2003,9(7):1611-1614.)。在动物实验水平，依诺肝素可以减轻硫己酰胺所致的大鼠肝纤维化(36％)，同时促进肝细胞的再生能力，减轻纤维化的其他症状(参见Assy N,Hussein O,Khalil A,et al.The beneficialeffect of aspirin and enoxaparin on fibrosis progression and regenerativeactivity in a rat model of cirrhosis[J].Digestive diseases and sciences,2007,52(5):1187-1193)。以BDL结扎的动物模型比较测定几种市场上常见的肝素例如Nadroparin、Tinzaparin、依诺肝素的抗肝纤维化活性，Nadroparin与依诺肝素均能有效降低血清碱性磷酸酶和γ-谷氨酰酶的水平，降低肝坏死面积，及纤维化面积。在CCl4引发的肝纤维化动物模型中，依诺肝素可以抑制肝细胞的凋亡及肝组织坏死(参见Kukner A,ToreF,Firat T,et al.The preventive effect of low molecular weight heparin onCCL4-induced necrosis and apoptosis in rat liver[J].Annals of hepatology,2009,9(4):445-454)。另外，还有研究报道Fraxiparin-pluronic F127共聚物可以抑制肝纤维化的形成(参见Lee J H,Lee H,Joung Y K,et al.The use of low molecularweight heparin–pluronic nanogels to impede liver fibrosis by inhibition theTGF-β/Smad signaling pathway[J].Biomaterials,2011,32(5):1438-1445)。
对于经多种降解方法得到的低分子量肝素(low molecular weight heparins，LMWH)干预纤维化类疾病的作用，目前也已经多有报道。但由于不同的降解方法识别肝素的序列位点不同，对纤维化疾病的干预作用效果也截然不同。因此，对于治疗纤维化类疾病的LMWH类药物，需要系统性筛选其活性，并进行构效关系研究，才能得到治疗疾病的有效组分，从而提高分子对各类疾病治疗选择性，达到结构功能的最佳匹配状态。
本发明的发明人致力于肝素产业技术的创新研究，利用麦芽糖结合蛋白(MaltoseBinding Protein，MBP)融合表达技术，实现了系列肝素酶的高活性、可溶性表达和工业化生产，系列肝素酶被列为中国药典标准酶(Heparinase，分别为MBP-HepI(以下也简称为肝素酶I)、MBP-HepII(以下也简称为肝素酶II)、MBP-HepIII(以下也简称为肝素酶III)，可以分别参见中国专利ZL200410038098.6、ZL201010259905.2，以及ZL201010259913.7)。并初步建立了组合酶法制备LMWH的新工艺(参见中国专利ZL201210328649.7)。在此基础上，本发明人经过深入地研究，成功获得了本发明的新型低分子量肝素，并发现本发明的低分子量肝素具有预防或治疗肝纤维化的功能。
本发明涉及以下内容：
1.一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为2800～5000Da，重均分子量(Mw)的范围为6100～13000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3000～4500Da，重均分子量(Mw)的范围为6200～12000Da，进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3200～4400Da，重均分子量(Mw)的范围为6300～11000Da，再进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3250～4200Da，重均分子量(Mw)的范围为6400～10500Da。
2.根据项1所述的低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，优选在25wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的20wt％以上，优选在25wt％以上。
3.根据项1或2所述的低分子量肝素，其中，其重均分子量的分子量分布为：分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的10wt％以上，优选在15wt％以上，且在30wt％以下，优选在27wt％以下。
4.根据项1～3中任一项所述的低分子量肝素，其中，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的25wt％以下，优选20wt％以下。
5.根据项1～4中任一项所述的低分子量肝素，其中，该肝素的数均分子量为3500～4000Da，重均分子量为6200～7500Da，优选其数均分子量为3600～3800Da，重均分子量为6500～7300Da,进一步优选其数均分子量为3700～3800Da，重均分子量为7000～7300Da。
6.根据项1～4中任一项所述的低分子量肝素，其中，该肝素的数均分子量为3500～4200Da，重均分子量为7500～11000Da，优选其数均分子量为3500～4100Da，重均分子量为8500～10500Da，进一步优选其数均分子量为4000～4100Da，重均分子量为9800～10500Da。
7.根据项1～4中任一项所述的低分子量肝素，其中，该肝素的数均分子量为3000～3600Da，重均分子量为6700～7400Da，优选其数均分子量为3100～3500Da，重均分子量为6800～7300Da，进一步优选其数均分子量为3200～3300Da，重均分子量为6900～7200Da。
8.根据项1～7中任一项所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶降解肝素而得到的。
9.根据项8所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶I、II和/或III降解肝素而得到的。
10.根据项5所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶I降解肝素而得到的。
11.根据项6所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶II降解肝素而得到的。
12.根据项7所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶III和肝素酶II联合降解肝素而得到的。
13.根据项1～12中任一项所述的低分子量肝素在用于制备用于治疗或预防肝纤维化的药物中的用途。
14.根据项1～12中任一项所述的低分子量肝素在用于制备用于缓解肝部胶原蛋白形成的药物中的用途。
15.一种用于治疗或预防肝纤维化的方法，其包括：向有所需要的哺乳动物或人给药项1～12中任一项所述的低分子量肝素。
16.一种用于缓解肝部胶原蛋白形成的方法，其包括：向有所需要的哺乳动物或人给药项1～12中任一项所述的低分子量肝素。
17.根据项1～12中任一项所述的低分子量肝素，其用于治疗或预防肝纤维化。
18.根据项1～12中任一项所述的低分子量肝素，其用于缓解肝部胶原蛋白形成。
附图说明
图1示出实验例1中各组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)的含量。
图2示出实验例2中各组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)的含量。
图3示出实验例1中各组小鼠的肝病理组织切片的照片，其中，A表示健康组；B表示H3组；C表示阳性药物组；D表示阴性对照组。
图4示出实验例2中各组小鼠的肝病理组织切片的照片，其中，A表示阳性对照组；B表示I-11组；C表示II-11组；D表示III-II-5组；E表示III-I-5组；F表示III-I-9组；G表示III-II-9组；H表示阴性对照组。
图5示出实验例1中各组小鼠的肝组织的羟脯氨酸含量。
图6示出实验例2中各组小鼠的肝组织的羟脯氨酸含量。
具体实施方式
以下，对本文的实施方式进行具体说明。
<本发明的低分子肝素>
本发明涉及具有治疗和/或预防肝纤维化的低分子量肝素。在下文中，除非另有说明，百分比表示重量百分比。
在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为2800～5000Da，重均分子量(Mw)的范围为6100～13000Da，优选其数均分子量(Mn)的范围为3000～4500Da，重均分子量(Mw)的范围为6200～12000Da，进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3200～4400Da，重均分子量(Mw)的范围为6300～11000Da，再进一步优选其数均分子量(Mn)的范围为3250～4200Da，重均分子量(Mw)的范围为6400～10500Da。即本发明涉及的低分子量肝素其数均分子量(Mn)可以为例如约2900Da，3100Da，3300Da，3400Da，3500Da，3600Da，3700Da，3800Da，3900Da，4000Da，4100Da，4300Da，4400Da，4600Da，4700Da，4800Da，4900Da。本发明涉及的低分子量肝素其重均分子量(Mw)可以为例如约6400Da，6500Da，6600Da，6700Da，6800Da，6900Da，7000Da，7100Da，7200Da，7300Da，7400Da，7500Da，7600Da，7700Da，7800Da，7900Da，8000Da，8100Da，8200Da，8300Da，8400Da，8500Da，8600Da，8700Da，8800Da，8900Da，9000Da，9100Da，9200Da，9300Da，9400Da，9500Da，9600Da，9700Da，9800Da，9900Da，10000Da，10100Da，10200Da，10300Da，10400Da，10600Da，10700Da，10800Da，10900Da，11100Da，11200Da，11300Da，11400Da，11500Da，11600Da，11700Da，11800Da，11900Da，12100Da，12200Da，12300Da，12400Da，12500Da，12600Da，12700Da，12800Da，12900Da。
在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的30wt％以下，优选在25wt％以下，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的20wt％以上，优选在25wt％以上。
在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的10wt％以上，优选在15wt％以上，且在30wt％以下，优选在27wt％以下。
在本发明的一个实施方案中，涉及一种低分子量肝素，其重均分子量的分子量分布为：分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的25wt％以下，优选20wt％以下。
在一个具体的实施方式中，该低分子量肝素的数均分子量为3500～4000Da，重均分子量为6200～7500Da，优选数均分子量为3600～3800Da，重均分子量为6500～7300Da，优选其数均分子量为3700～3800Da，重均分子量为7000～7300Da。具体来说，该低分子量肝素的数均分子量为3768Da，重均分子量为7160Da。其重均分子量的分布为分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的22.273wt％，分子量在3000Da以上且小于5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的15.842wt％，分子量在5000Da以上且小于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的21.674wt％，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的40.211wt％。该低分子量肝素是利用肝素酶I降解得到的。
在一个具体的实施方式中，该低分子量肝素的数均分子量为3500～4200Da，重均分子量为7500～11000Da，优选数均分子量为3500～4100Da，重均分子量为8500～10500Da，优选其数均分子量为4000～4100Da，重均分子量为9800～10500Da。具体来说，该低分子量肝素的数均分子量为4073Da，重均分子量为10255Da。其重均分子量的分布为分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的4.524wt％，分子量在3000Da以上且小于5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的8.110wt％，分子量在5000Da以上且小于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的16.860wt％，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的70.506wt％。该低分子量肝素是利用肝素酶II降解得到的。
在一个具体的实施方式中，该肝素的数均分子量为3000～3600Da，重均分子量为6700～7400Da，优选其数均分子量为3100～3500Da，重均分子量为6800～7300Da，进一步优选其数均分子量为3200～3300Da，重均分子量为6900～7200Da。具体来说，该低分子量肝素的数均分子量为3298Da，重均分子量为7122Da。其重均分子量的分布为分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的24.988wt％，分子量在3000Da以上且小于5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的19.681wt％，分子量在5000Da以上且小于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的26.001wt％，分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的29.330wt％。该低分子量肝素是利用肝素酶III和肝素酶II联合降解得到的。
在本发明中，上述重均分子量、数均分子量，以及分子量分布可以采用公知的方法检测，例如按照在Wu,Jingjun等人"Controllable production of low molecular weightheparins by combinations of heparinase I/II/III."Carbohydrate polymers 101(2014):484-492中所记载的方法进行检测，其具体的检测步骤可以参见下述实施例中描述的方法。如果其它公知的检测方法检测的结果与该方法的检测结果不一致时，本发明所涉及的低分子量肝素的重均分子量、数均分子量和分子量分布以本发明实施例中所采用的方法为准。
<低分子肝素用于抑制肝纤维化的效果>
本发明涉及的低分子肝素能够用于治疗或预防肝纤维化。
本发明涉及该低分子肝素在制备治疗或预防肝纤维化的药物中的用途。
肝纤维化是指肝组织在受到急性肝损伤后，持续反复受到损伤，内细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)成分过度增生与异常沉积，导致肝脏结构功能异常的病理变化，功能上表现为肝功能减退、门静脉高压等。肝纤维化不是一个独立的疾病，而是很多慢性肝病共同病理过程，也是发展成为肝硬化必经中间环节。其中，抑制或减轻肝损伤病变是抑制肝纤维化形成的根本策略。
通过给予本发明的低分子量肝素，与阴性对照组相比，可以有效地降低肝纤维化小鼠血清中的谷丙转氨酶的含量，说明本发明的低分子量肝素可以有效的恢复肝功能的总体指标。在另外的一组实验中，给予SFDA唯一通过的肝纤维化治疗药物IFN-γ时，其与阴性对照组相比，给药后小鼠血清中的谷丙转氨酶的含量还有一定的程度的升高。而给药本发明的低分子量肝素的结果优于给药SFDA临床肝纤维化治疗药物IFN-γ的效果。
通过给予本发明的低分子量肝素，可以有效地抑制肝纤维化小鼠肝细胞的形变，作用类似于IFN-γ类似。说明本发明的低分子量肝素具有降低肝纤维化形成的功能。目前在临床上只有IFN-γ一种抗肝纤维化的药物，而IFN-γ在使用过程中，患者可出现发热、寒颤、心率加快、肌痛、头痛、关节痛、乏力、纳差等症状,称为流感样综合征。开发低分子量肝素作为抑制肝纤维化形成的药物，可以作为IFN-γ的替代药品，减少患者的副作用。
通过给予本发明的低分子量肝素，可以有效地降低肝纤维化小鼠肝脏中的羟脯氨酸的含量，表明其能够有效地降低肝纤维化小鼠肝脏中的胶原蛋白的含量，由于胶原蛋白的沉积是纤维化病变最明显的特征，因此胶原蛋白含量的降低表明肝纤维化得到了控制。
虽然不意在受理论限制，但本发明得到的低分子肝素是通过酶法降解得到的低分子肝素，其降解机理完全不同于通过化学法得到的依诺肝素。
<本发明的低分子肝素的生产>
在生产本发明涉及的低分子量肝素的过程中使用了不同种类的肝素酶，这些肝素酶可以是通过任何方法获得的肝素酶，包括肝素酶I、II和III，其只要是具有肝素酶的活性即可，其中优选使用肝素酶I、II、III。现有技术中，肝素酶I的E.C.号为E.C.4.2.2.7，肝素酶III的E.C.号为E.C.4.2.2.8。也可以采用购买的肝素酶，例如购自Sigma公司或IBEX公司买到的肝素酶I、II、III。肝素酶也可以是通过分子生物学方法构建的重组肝素酶I、II和III或者肝素酶I、II和III与任何融合伴侣形成的融合蛋白。根据本发明一个优选的实施方案，肝素酶I、II和III是肝素酶I、II和III的融合蛋白，尤其是包含MBP的肝素酶I、II和III的融合蛋白。
肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III也可以是与任何融合伴侣形成的融合蛋白，只要具有肝素酶I、II和III的活性即可。根据本文一个优选的实施方案，肝素酶I、II和III是肝素酶I、II和III和融合伴侣形成的融合蛋白，尤其是麦芽糖结合蛋白(MBP)和肝素酶I、II和III的融合蛋白。肝素酶I和MBP的融合蛋白在下文中有时被称为MBP-HepA(参见中国专利ZL200410038098.6，授权公告号CN1312183C)，肝素酶II和MBP的融合蛋白在下文中有时被称为MBP-HepB(参见中国专利ZL 201010259905.2，授权公告号CN101942024B)，肝素酶III和MBP的融合蛋白在下文中有时被称为MBP-HepC(参见中国专利ZL 201010259913.7，授权公告号CN101942025B)。优选肝素酶I、II和III分别具有中国专利ZL201210328649.7，授权公告号CN103173506B的序列表中SEQ ID NO:1～3所述的序列。
在生产本发明涉及的低分子量肝素时，肝素酶I、II、III或它们的任意组合与底物肝素进行反应的方式可以分批的、连续的或半连续的，本领域普通技术人员可以根据生产的需要适当地选择。对于反应的时间、反应装置而言，只要是可以得到目标的低分子量肝素即可，可以由本领域普通技术人员适当确定。
在一个具体的实施方案中，在生产本发明的低分子量肝素的方法中，向反应器中加入底物肝素溶液，然后加入肝素酶I、II或III中的一种或两种以上，与底物肝素进行反应。随着反应的进行，肝素逐渐被降解，每隔一段时间对反应液进行监测，在适当的时候终止反应。将上述反应终止了的混合溶液用纤维素膜真空初滤装置进行初滤，再利用超滤装置进行超滤得到次滤液。然和加入乙醇混合均匀后，离心弃上清收集沉淀，然后往沉淀中加入丙酮洗涤并用旋转蒸发仪进行减压蒸干即得到低分子量肝素产品粉末。本领域技术人员可以理解上述方法仅仅为示例性的，也可以采用其他方法获得通过酶反应降解后的低分子量肝素。
肝素酶I、II和III各自的用量，本领域普通技术人员可以参考不同酶的活性根据生产所需来适当确定，优选每种酶的用量为肝素酶I在每升反应液10IU～500IU的范围，优选在100IU～250IU的范围。肝素酶II在每升反应液10IU～500IU的范围，优选在100IU～200IU的范围。肝素酶III在每升反应液10IU～500IU的范围，优选25～100IU。其中IU表示：在温度为30℃，pH7.4条件下，每分钟产生1μmol 4,5不饱和末端产物的酶量。
用于生产本发明的低分子量肝素的底物肝素可以商购，也可以从动物中直接提取，例如可以从猪小肠粘膜提取。肝素二糖单位主要为L-艾杜糖醛酸和N-硫酸化的氨基葡萄糖通过α(1→4)糖苷键连接。
用于生产本发明的低分子量肝素的底物可以购买自例如河北常山生化药业股份有限公司的肝素、烟台东诚生化股份有限公司、深圳市海普瑞药业股份有限公司、常州千红生化制药股份有限公司、美药星(南京)制药有限公司等。
本发明中使用底物肝素的浓度可以由本领域技术人员来确定，没有特定地限制，优选为1～100g/L。本发明中使用的底物肝素是大分子量的未分级的肝素，其分子量例如可以是分布在5000～30000，平均分子量为20000。
在进行本发明的生产方法之前，可以将底物肝素添加到缓冲液中，配制到合适的浓度。所使用的缓冲液只要不损害肝素酶I、II、III或它们的组合的酶活即可。在一个具体的生产方法中，采用的是20mM Tris、20mM CaCl2、50mM NaCl，并用1mM盐酸调节pH为7左右，例如7.4～7.6的缓冲液。在另一个具体的生产方法中，采用的是5.0mM CaCl2和200mM NaCl的去离子水溶液中，然后用1M HCl溶液调节pH至7.0的缓冲溶液。
对肝素酶I、II、III或它们的组合与底物肝素进行反应时的温度没有具体限定，只要是不会使肝素酶I、II、以及III失活的温度即可，例如可以设定为10～45℃，最优选30℃。
对于肝素酶I、II、III或它们的组合与底物肝素进行反应的时间没有具体限定，本领域技术人员可以根据所添加的肝素酶的酶活、底物的浓度和反应的温度可以适当选择，在一个具体的方法中，肝素酶I、II、III或它们的组合与底物反应的时间可以5分钟～10小时，也可以为10分钟～4小时。
在本发明所述的低分子肝素的生产方法中，在肝素酶I、II、III或它们的组合与底物肝素进行反应的过程中，对反应的溶液进行监测的方式可以根据反应体系来适当选择，在一个具体的方法中，利用紫外分光光度计检测231nm处的吸光度的变化，随着反应的进行231nm处的吸光度A231不断增加，从而通过吸光度的增加来确定反应进行的程度。
在反应的过程中，当按照上述方法测定反应进行到所期望的程度时，可以终止反应，以进一步分离以获得超低分子量肝素或低分子量肝素。其中对于终止反应的方法，本领域技术人员可以根据其掌握的知识来选择，例如加入终止反应的试剂，或提高温度以使酶失活。在一个具体的实施方式中，终止反应时加盐酸调节pH值至2.0后停留3分钟，再用2.0M的NaOH将pH值调回7.0。从不添加其它的杂质的观点来看，优选提高反应体系的温度使酶失活从而终止反应。在一个具体的实施方式中，将整个反应体系放置在100℃水浴中10分钟，从而使酶降解底物的反应终止。
在本发明所述的生产方法中，如果需要添加两种或以上种类的肝素酶时，可以先添加一种肝素酶与底物肝素反应，在反应进行一段时间后，终止反应，然后再加入其它的肝素酶继续反应，并最终终止反应。也可以同时加入两种或两种以上肝素酶进行反应待反应进行到期望的程度时终止反应。
实施例1低分子量肝素1的制备(以下，也称为低分子量肝素I-11)
将5g肝素(购买自常山生化药业，产品名：肝素钠，其分子量分布在5000～30000，平均分子量为20000)与100mLTris缓冲液(20mM Tris，50mM NaCl，20mM CaCl2)混合配置成50g/L肝素溶液(pH 7.6)，向该配置的50g/L肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL200410038098.6制备的肝素酶I。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝46.3)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素1(也命名为：产品I-11)。
然后针对产品I-11按照如下方法进行分子量、以及分子量分布的分析。
分子量及其分布测定方法。
采用凝胶排阻高效液相色谱法测定低分子量肝素的重均分子量(Mw)，数均分子量(Mn)和分布系数(P)。色谱柱为TSK-GEL G2000SWXL(TOSOH，日本)，控制流速为0.5mL/min，柱温35℃，进样体积为25μL。采用WATERS(1525，美国)色谱系统，紫外检测器和示差检测器以先后次序串联连接于色谱柱的出口，紫外检测器波长为234nm。分子量及其分布测定方法可以参考Wu,Jingjun等人"Controllable production of low molecular weightheparins by combinations of heparinase I/II/III."Carbohydrate polymers 101(2014):484-492中所记载的方法。
通过上述方法分析的结果显示，产品I-11的数均分子量为3768Da，重均分子量为7160Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品I-11总量的22.273wt％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品I-11总量的15.842wt％，重均分子量5K-8K的肝素占产品I-11总量的21.674wt％，重均分子量大于8K的肝素占产品I-11总量的40.211wt％。
实施例2低分子量肝素2的制备(以下，也称为低分子量肝素III-II-5)
向与实施例1同样方法配置的50g/L肝素溶液100mL中添加过量的按照ZL201010259913.7制备的肝素酶III(215IU)反应到终点时，采用紫外吸收光谱(A231)测定肝素酶的反应终点(控制在A231＝20)，然后添加按照ZL201010259905.2方法制备的肝素酶II(20IU)，当A231达到反应控制点(A231＝61)时，使反应结束。结束的方法为取一定体积的反应溶液(300ml)，在100℃沸水浴灭活5～10min，冷却至室温，加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，搅拌10min，然后在室温下4000r/min离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素2(也命名为：产品III-II-5)。
然后针对产品III-II-5进行分子量、以及分子量分布的分析。按照上述实施例1的方法进行分析的结果显示，产品III-II-5的数均分子量为3298Da，重均分子量为7122Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品III-II-5总量的24.988wt％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品III-II-5总量的19.681wt％，重均分子量5K-8K的肝素占产品III-II-5总量的26.001wt％，重均分子量大于8K的肝素占产品III-II-5总量的29.330wt％。
实施例3低分子量肝素3(以下，也称为低分子量肝素II-11)的制备
向与实施例1同样方法配置的50g/L肝素溶液100mL中一次性添加总酶活为100IU的按照ZL201010259905.2制备的肝素酶II。使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液在231nm光吸收A231。当A231达到反应控制点(A231＝46.5)时，使反应结束，结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶液中的酶灭活5～10min，然后取出反应体系冷却至室温，向反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，然后在室温下以4000r/min的速度离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm的膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素3(也命名为：产品II-11)。
然后针对产品II-11进行分子量、以及分子量分布的分析。按照上述实施例1的方法进行分析的结果显示，产品II-11的数均分子量为4073Da，重均分子量为10255Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品II-11总量的4.524wt％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品II-11总量的8.110wt％，重均分子量5K-8K的肝素占产品II-11总量的16.860wt％，重均分子量大于8K的肝素占产品III-2总量的70.506wt％。
对比例1
从河北常山生化购买未分级肝素，按照上述实施例1中描述的方法进行检测，通过实施例1中描述的方法检测的该肝素(UFH)的数均分子量Mn为14000，重均分子量为24899。
对比例2
从河北常山生化药业购买伊诺肝素，该肝素的数均分子量为4372，重均分子量为5679。采用本发明中描述的方法对伊诺肝素进行分子量分析。
通过上述实施例1中描述的方法分析的结果显示，伊诺肝素的分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占伊诺肝素总量的20.71wt％，重均分子量为3K-5K的肝素占伊诺肝素总量的55.42wt％，重均分子量5K-8K的肝素占伊诺肝素总量的13.16wt％，重均分子量大于8K的肝素占伊诺肝素总量的10.71wt％。
对比例3低分子量肝素4(以下，也称为低分子量肝素H3)的制备
向与实施例1同样方法配置的100mL肝素溶液(河北常山生化药业)(50g/L，20mMTris，50mM NaCl，20mM CaCl2，pH 7.6)添加过量的按照ZL201010259913.7制备的肝素酶III(215IU)反应到终点时，采用紫外吸收光谱(A231)测定肝素酶的反应终点(一般控制在A231为20左右)，然后添加按照ZL200410038098.6方法制备的肝素酶I(20IU)，当A231达到反应控制点(A231＝120)时，使反应结束。结束的方法为取一定体积的反应溶液(300ml)，在100℃沸水浴灭活5～10min，冷却至室温，加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，搅拌10min，然后在室温下4000r/min离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素4(也命名为：产品H3)。
按照上述实施例1的方法进行分析的结果显示，产品H3的数均分子量为1170Da，重均分子量为1883Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品H3总量的83.778wt％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品H3总量的12.215wt％，重均分子量5K-8K的肝素占产品H3总量的3.702wt％，重均分子量大于8K的肝素占产品H3总量的0.305wt％。
对比例4低分子量肝素5(以下，也称为低分子量肝素III-I-5)的制备
向与实施例1同样方法配置的100mL肝素溶液(河北常山生化药业)(50g/L，20mMTris，50mM NaCl，20mM CaCl2，pH 7.6)添加过量的按照ZL201010259913.7制备的肝素酶III(215IU)反应到终点时，采用紫外吸收光谱(A231)测定肝素酶的反应终点(一般控制在A231为20左右)，然后添加按照ZL200410038098.6方法制备的肝素酶I(20IU)，当A231达到反应控制点(A231＝59)时，使反应结束。结束的方法为取一定体积的反应溶液(300ml)，在100℃沸水浴灭活5～10min，冷却至室温，加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，搅拌10min，然后在室温下4000r/min离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素5(也命名为：产品III-I-5)。
按照上述实施例1的方法进行分析的结果显示，产品III-I-5的数均分子量为1595Da，重均分子量为4007Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品III-I-5总量的57.292wt％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品III-I-5总量的20.037wt％，重均分子量5K-8K的肝素占产品III-I-5总量的14.573wt％，重均分子量大于8K的肝素占产品III-I-5总量的8.098wt％。
对比例5低分子量肝素6(以下，也称为低分子量肝素III-I-9)的制备
向与实施例1同样方法配置的100mL肝素溶液(河北常山生化药业)(50g/L，20mMTris，50mM NaCl，20mM CaCl2，pH 7.6)添加过量的按照ZL201010259913.7制备的肝素酶III(215IU)反应到终点时，采用紫外吸收光谱(A231)测定肝素酶的反应终点(一般控制在A231为20左右)，然后添加按照ZL200410038098.6方法制备的肝素酶I(20IU)，当A231达到反应控制点(A231＝111.2)时，使反应结束。结束的方法为取一定体积的反应溶液(300ml)，在100℃沸水浴灭活5～10min，冷却至室温，加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，搅拌10min，然后在室温下4000r/min离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素6(也命名为：产品III-I-9)。
按照上述实施例1的方法进行分析的结果显示，产品III-I-9的数均分子量为1219Da，重均分子量为2809Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品III-I-9总量的79.341wt％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品III-I-9总量的13.961wt％，重均分子量5K-8K的肝素占产品III-I-9总量的5.401wt％，重均分子量大于8K的肝素占产品III-I-9总量的1.297wt％。
对比例6低分子量肝素7(以下，也称为低分子量肝素III-II-9)的制备
向与实施例1同样方法配置的100mL肝素溶液(河北常山生化药业)(50g/L，20mMTris，50mM NaCl，20mM CaCl2，pH 7.6)添加过量的按照ZL201010259913.7制备的肝素酶III(215IU)反应到终点时，采用紫外吸收光谱(A231)测定肝素酶的反应终点(一般控制在A231为20左右)，然后添加按照ZL201010259905.2方法制备的肝素酶II(20IU)，当A231达到反应控制点(A231＝84)时，使反应结束。结束的方法为取一定体积的反应溶液(300ml)，在100℃沸水浴灭活5～10min，冷却至室温，加6倍体积的无水乙醇，在室温下搅拌10min，搅拌10min，然后在室温下4000r/min离心15min，收集沉淀，加入质量是沉淀2～3倍的去离子水溶解，使用0.22μm膜过滤，收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块，然后送冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干，然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末，得到低分子量肝素7(也命名为：产品III-II-9)。
按照上述实施例1的方法进行分析的结果显示，产品III-II-9的数均分子量为2779Da，重均分子量为6077Da，其中分子量分布为重均分子量小于3K的肝素占产品III-II-9总量的31.681wt％，重均分子量为3K-5K的肝素占产品III-II-9总量的22.304wt％，重均分子量5K-8K的肝素占产品III-II-9总量的24.794wt％，重均分子量大于8K的肝素占产品III-II-9总量的21.221wt％。
需要说明的是在上述实施例中利用两种不同的肝素酶进行降解时，涉及两次酶解反应各自的反应终点的确认，在上述实施例和比较例给出的两步酶反应的终点是各自的终点，在本发明中利用一种肝素酶进行降解之后，当达到检测的A231的数值之后，将检测装置清零，并重新检测利用另一种肝素酶进行降解的终点。
表1实施例和对比例得到的低分子量肝素的分子量分布总结
Figure BDA0001303541030000161
Figure BDA0001303541030000171
实验例1早期肝硬化动物模型建立及抗肝纤维化药效学评1
用CCl4与橄榄油(40％：60％，CCl4最终量为0.3mg/kg)混合液腹腔注射到C57BL/6小鼠(20-25g，8-12周龄)，经8周每周注射两次，以诱发小鼠的肝纤维化。
针对上述处理过的小鼠，在给予CCl4的同时也给药对比例3得到的肝素，在给药之前，按照Lu G,Lin J,Curnutte J T,et al.Reversal of Heparin-InducedAnticoagulation By Andexanet Alfa,a Universal Antidote for Factor XaInhibitors[J].Blood,2015,126(23):2329-2329文献中的方法检测各组中的肝素的抗凝活性，其中抗凝活性的单位IU表明低分子量肝素抗凝血级联反应Xa的能力。然后根据检测结果的抗凝活性确定给药剂量，从而使得每天经腹腔注射给予300IU/kg的对比例3的肝素。除给药组之外，设置阳性药物对照组，向肝硬化模型小鼠给药IFN-γ(购买自上海凯茂生物医药有限公司，其为SFDA唯一通过肝纤维化作为适应症的临床药物)，每天腹腔注射给药，剂量为100IU/kg(其中IU是指：能抑制50％细胞病变或50％病毒空斑形成效应的IFN-γ最高稀释度的倒数)。此外，设置阴性控制组，以与上述同样的方法建立肝纤维化动物模型，每天给予相同量的生理盐水作为对照，上述每组小鼠5只。
在如上所述给予CCl4造模持续8周，并同时在造模开始即给予上述的肝素药物或阳性对照药物IFN-γ进行干预，至第8周结束实验。实验结束后，杀死小鼠，尾静脉取血，并获得肝组织与血清用于下述生化指标检测，测定小鼠的肝损伤及纤维化程度。
针对上述各组获取的各组的静脉血，参照朱旭,郑利平.冠心病患者血清超敏C反应蛋白,肌钙蛋白,血脂水平变化及临床意义[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(7):258-260中描述的方法获取血清，然后检测获得的血清中的谷丙转氨酶(ALT)含量(南京建成生物工程研究所试剂盒)，各组的结果如图1所示。分析数据结果表明，阴性对照组的血清谷丙转氨酶(ALT)含量显著升高，而阳性药物组(给药IFN-γ组)及其他肝素组均没有显著的作用。
按照Jo D,Nashabi A,Doxsee C,et al.Epigenetic regulation of genestructure and function with a cell-permeable Cre recombinase[J].Naturebiotechnology,2001,19(10):929-933中描述的方法，对获取的肝组织进行肝组织病理切片HE染色，获得的病理切片如图3所示，结果表明与健康组相比，阴性对照组肝细胞明显肿胀变性，有明显纤维间隔形成，表明利用CCl4成功地获得了肝纤维化模型小鼠。阳性对照给药IFN-γ组对肝纤维化小鼠的肝细胞形变有一定的抑制作用，而H3组没有作用。
精确称取湿重30～100mg的各小组的小鼠肝组织放入试管中，准确加水解液1ml，混匀。加盖后95℃或者沸水浴水解20分钟(水解10分钟时混匀一次使水解更充分)。然后调pH值至6.0～6.8左右。加蒸馏水至10ml，混匀；取3～4ml稀释的水解液加适量活性炭(约20～30mg左右，以上清液离心后澄清无色为准)混匀，3500转/分离心10分钟，小心取上清1ml作为检测样品，然后采用购买自南京建成羟脯氨酸测定试剂盒来测定样品中羟脯氨酸的含量，并用以表征肝脏中所含有的胶原蛋白的含量。结果如图5所示。可以看出阳性药物IFN-γ组有效地降低了羟脯氨酸的含量，即有效地降低了肝部胶原蛋白的含量，H3组没有降低羟脯氨酸的含量。
实验例2早期肝硬化动物模型建立及抗肝纤维化药效学评2
将8周龄雄性C57BL6小鼠随机分组(n＝8)。药物筛选组每周两次注射溶于橄榄油(40:60)的CCl4，持续4周，头四周剂量为4mg/kg，第二个四周剂量为2.5mg/kg(i.p.)。阳性对照(PC)组通过仅注射相同体积的橄榄油。在CCl4注射后12小时，将不同组的酶降解肝素，或相同体积的盐水作为阴性对照(NC)组注射到小鼠中(i.p.)。所有动物在8周后处死。收集肝脏和血液，按照实验例1所述的方法用于下述不同生理学指标的测定。
采集到的血清放入-20℃冰箱中，测定ALT时从冰箱中取出，并在冰上解冻。分析数据结果表明(图2)，阴性对照组的血清谷丙转氨酶(ALT)含量显著升高，给予实施例1的产品I-11，实施例2的产品III-II-5，实施例3的产品II-11，对比例4的产品III-I-5，对比例5的产品III-I-9，对比例6的产品III-II-9后，谷丙转氨酶(ALT)均有显著下降，但均略高于健康组，说明这些组中获得的低分子量肝素可以有效的恢复肝功能的总体指标。
按照实验例1中的方法，对获取的肝组织进行肝组织病理切片HE染色，获得的病理切片如图4所示，结果表明与健康组相比，阴性对照组肝细胞明显肿胀变性，有明显纤维间隔形成，表明利用CCl4成功地获得了肝纤维化模型小鼠。从图4中可以看出肝素I-11，II-11，III-II-5组抑制了肝细胞的形变，而其他组则没有显示出明显的效果。从肝组织染色的结果可以看出实施例1-3中获得的肝素I-11，II-11，III-II-5具有降低纤维化形成的功能。
按照实验例1中的方法，采用购买自南京建成羟脯氨酸测定试剂盒来测定样品中羟脯氨酸的含量，并用以表征肝脏中所含有的胶原蛋白的含量。结果如图6所示。可以看出给药实施例1-3中获得的I-11、III-II-5组、II-11组均有效地降低了羟脯氨酸的含量，即有效地降低了肝部胶原蛋白的含量，表明给药实施例中得到的低分子量肝素均能缓解胶原蛋白的形成，证明肝纤维化程度减轻，其中尤其是给药肝素I-11时，其羟脯氨酸的含量基本接近健康小鼠的含量。而给药对比例4的产品III-I-5，对比例5的产品III-I-9，对比例6的产品III-II-9则无法有效地降低小鼠的羟脯氨酸含量。

Claims (12)

1.一种低分子量肝素，其数均分子量(Mn)的范围为3100～4100Da，重均分子量(Mw)的范围为7000～10500Da，其重均分子量的分子量分布为：分子量小于3000Da的肝素占该低分子量肝素全部的25wt％以下，分子量在3000～5000Da的肝素占该低分子量肝素全部的20wt％以下，分子量在5000～8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的15wt％以上，且在27wt％以下；分子量大于8000Da的肝素占该低分子量肝素全部的25wt％以上，且在70.506wt％以下。
2.根据权利要求1所述的低分子量肝素，其中，该肝素的数均分子量为3700～3800Da，重均分子量为7000～7300Da。
3.根据权利要求1所述的低分子量肝素，其中，该肝素的数均分子量为3500～4100Da，重均分子量为8500～10500Da。
4.根据权利要求1所述的低分子量肝素，其中，该肝素的数均分子量为4000～4100Da，重均分子量为9800～10500Da。
5.根据权利要求1所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶降解肝素而得到的。
6.根据权利要求5所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶I、II和/或III降解肝素而得到的。
7.根据权利要求2所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶I降解肝素而得到的。
8.根据权利要求4所述的低分子量肝素，其中，所述低分子量肝素是利用肝素酶II降解肝素而得到的。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的低分子量肝素，其用于治疗或预防肝纤维化。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的低分子量肝素，其用于缓解肝部胶原蛋白形成。
11.根据权利要求1～8中任一项所述的低分子量肝素在用于制备用于治疗或预防肝纤维化的药物中的用途。
12.根据权利要求1～8中任一项所述的低分子量肝素在用于制备用于缓解肝部胶原蛋白形成的药物中的用途。
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