CN101294177B - 一种制备低分子量肝素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备低分子量肝素的方法。该方法,是以肝素为底物,用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解肝素,得到低分子量肝素;所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白,是具有序列表中的SEQ ID №:1的氨基酸残基序列的蛋白质。本发明的方法采用具有较高酶活的麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白制备肝素,通过控制降解反应中的不同吸光度A235时终止反应,得到具有理想平均分子量和分子量分布较窄的,活性较高的低分子量肝素寡糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备低分子量肝素的方法,特别涉及一种利用肝素酶I融合蛋白MBP-HepA制备低分子量肝素的方法。
背景技术
肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷键交替形成的粘多糖,具有六糖或八糖重复单位的线形链状结构,其分子量在3000-37000之间,平均分子量为15000。自1916年首次发现肝素以来,其在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂的应用越来越受到人们的关注。此外,肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能。但是,由于肝素具有抗凝活性,所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等副作用,从而大大限制了肝素在临床上的应用。
低分子量肝素(简称LMWHs)(Robert J.Linhardt,PH.D.And Nur Sibel Guany,M.S,Seminar in Thrombosis and Hemostasis,1999,25(3):5-16)是在分离普通肝素时得到的一些低分子量组分,或肝素裂解后产生的小分子片段,长度约为普通肝素的1/3。LMWHs分子量在3000-8000Da之间,平均分子量为5000Da左右。与普通肝素相比,通过体内、外实验发现,在同等剂量下,LMWHs的抗凝作用小于肝素,但其体内和体外抗血栓作用明显强于肝素。此外,LMWHs还具有一些其它优势,如分子量小,生物利用度高,血浆半衰期长;不与肝素结合蛋白结合,因此有更稳定的量效关系,按体重给药,控制剂量,不需要进行实验室监测;较少与血小板结合,不易引起血小板减少。所以LMWHs既能有效防止血栓形成,又能减少出血等不良反应,是一种安全有效的抗血栓药物,可作为肝素的替代物。不同聚合度的肝素寡糖能和不同蛋白因子作用,从而呈现不同的生物学作用。分子量分布范围窄,相对比较均一的LMWHs的药效较好。在对LMWHs进行质量控制方面,各生产单位均规定了其平均分子量及分子量分布范围。近年来又有科研人员提出超低分子量肝素的概念,虽没有明确的定义,但应是指二糖以上而低于低分子量肝素平均分子量的一系列寡糖(分子量在2500以下)。超低分子量肝素尽管具有很高的抗Xa因子活性,但其抗IIa因子活性却很低。人们还发现,一些包括二糖在内的寡糖也有某些生理活性。所以,生产所需平均分子量的LMWHs及分子量分布范围窄的肝素寡糖,具有重要的意义。
目前,LMWHs的制备方法(张万忠,王云山,马润宇,苏志国,国生化药物杂志,2001,22(1):48-51)主要有化学裂解法和酶降解法。化学降解法是工业上常采用的方法,主要有亚硝酸降解法、β-消去降解法、过氧化氢降解法、高碘酸、次氯酸、硫酸-氯磺酸和γ-照射法等。但是,化学裂解肝素反应剧烈,工艺复杂,反应控制难,使得肝素分子中的某些功能基团在反应过程中或多或少地被破坏,因而,某些生物活性功能在不同程度被或多或少的破坏。而酶降解法由于反应条件温和、产率高及对环境无毒性,而且反应操作简便、控制容易,成为许多糖生物学研究工作者的研究热点。美国专利(Nielsen,US 5106734,1992)利用235nm处的吸光度值控制产品质量,可制备出具有理想平均分子量的低分子肝素产品。于广利等(于广利,王群,管华诗,徐家敏,Robert J.Linhardt,青岛海洋大学学报,2002,32(2):231-235)利用肝素酶对牛肺肝素进行控制酶解,得到了聚合度2~20的寡糖纯品。高宁国等(高宁国,程秀兰,杨敬,张树政,微生物学报,1999,39(1):64-67)筛选出了一种能产肝素酶的鞘胺醇肝菌,并利用所产生的酶降解肝素,得到了一系列具有抗平滑肌增生活性而抗凝活很低的肝素寡糖。但是,这些方法中所用到的肝素酶需要经过多步的纯化步骤,收率较低,造成酶的成本非常昂贵(肝素黄肝菌产生的商品肝素酶的价格为40美元/U),限制了酶法制备低分子肝素的发展。利用重组菌株生产肝素酶I是一条极有前景的途径,但通常情况下重组肝素酶I极容易形成包涵体,需要复杂的复性过程才能形成活性蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备低分子量肝素的方法。
本发明所提供的制备低分子量肝素的方法,是用麦芽糖结合蛋白和肝素酶I形成的多功能融合蛋白降解肝素,得到低分子量肝素。
所述方法中,所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白,是具有序列表中的SEQ ID №:1的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的序列1由756个氨基酸残基组成。
所述方法中,所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白是将可表达所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白的重组表达载体转入大肠杆菌中,然后诱导表达得到的融和蛋白;
所述方法中,所述可表达所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白的重组表达载体是将肝素酶I的编码基因插入pMAL-p2x或pMAL-c2x载体的BamHI和HindIII识别位点间得到的重组表达载体。所述肝素酶I的编码基因段具有自序列表中序列2的5′端第1180-2271位核苷酸序列。
所述方法中,所述大肠杆菌为大肠杆菌TB1。
所述方法中,所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应是在可溶解肝素的溶剂中进行;所述可溶解肝素的溶剂为含3.5mM CaCl2和200mM NaCl的超纯水溶液;
所述方法中,所述肝素的初始浓度为1-100g/l;优选为50g/l。
所述方法中,所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白的用量为0.4——4.0IU/g肝素,优选为1.6IU/g肝素。
所述方法中,反应温度可为10——45℃,优选为25——35℃。
所述方法中,所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应终止反应时反应液的A235为30-50;所述反应用盐酸调节pH值至2.0终止反应。
所述方法中,可根据式8所示的数均分子量与麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应液与反应初始时反应液相比的235nm处的吸光度的增加值ΔA235的关系式,通过控制所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应过程终止时反应液的235nm处的吸光度,获得目的数均分子量的低分子量肝素;
式8中Mn为数均分子量,ΔA235为麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应液与反应初始时反应液相比的吸光度的增加值。
所述方法中,所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应的初始pH为6.5——8.0。
所述方法中,还包括将所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应获得的产物进行纯化;所述纯化的步骤是将终止反应后的反应液过滤除去蛋白,然后将滤液用截留分子量为3000——10000Da的超滤膜进行过滤,在滤液中加入是滤液体积2-3倍的乙醇混合均匀后离心弃上清收集沉淀,加入丙酮洗涤减压蒸干即得到低分子量肝素或超低分子量肝素产品粉末。
上述制备低分子量肝素的装置也属于本发明的保护范围,该装置,包括反应器1、超滤装置2和储液罐3;所述超滤装置2为错流式超滤膜(回流液流向与滤液流向正交),反应器1的反应液出口通过泵与超滤装置2的反应液入口8连接,超滤装置2的回流液出口5与反应器1连接,超滤装置2的滤液出口7与储液罐3连接。
本发明的方法采用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白制备肝素,由于麦芽糖结合蛋白具有提高其融合载体蛋白可溶性的能力,因此重组表达MBP-HepA活性很高;从而提高了降解肝素的效率;另一方面本发明的方法可以采用菌体破碎粗酶液来进行反应,在后续工艺中采用过滤及超滤的方法来获得最终产物,因此本发明的方法极大地降低了生产的成本。此外,利用麦芽糖结合蛋白(MBP)的亲和吸附能力,可以很容易实现肝素酶I的定向固定化,使酶的反复使用成为可能,从而提高酶反应效率,降低酶的使用成本;从而进一步降低低分子量肝素的生产成本。
本发明通过检测235nm处的吸光度值来监测反应的进行程度,从而控制反应时间可以很容易得到分子量分布范围窄的低分子量肝素(平均分子量可根据需要调节)。由于MBP-HepA的生产、固定化和使用成本可以大幅度的降低,因此利用该融合蛋白生产具有理想平均分子量且分子量分布范围窄的低分子量肝素的方法具有巨大的工业应用价值。
附图说明
图1为表达载体pMAL-hepA的构建过程示意图
图2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶I基因电泳图谱
图3为融合肝素酶生产LMWH膜生物反应器示意图
图4为反应过程中235nm处的吸光度随时间的变化曲线图
图5为反应混合液数均分子量Mn与A235(235nm处的吸光度)关系曲线图
图6为反应混合液数均分子量Mn与重均分子量Mw关系曲线图
图7为吸光度为48.4时终止反应进行过滤纯化处理所得到的低分子量肝素产品照片
具体实施方式
下述实施例中的实验方法,如无特别说明,均为常规方法。
下述实施例中的百分含量,如无特别说明,均为质量百分含量。
实施例1、麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白(MBP-HepA)的获取
1、含有肝素酶I编码基因的表达载体pMal-hepA的构建
表达载体pMAL-hepA的构建过程如图1所示,具体过程如下:从肝素黄杆菌(Flavabacterium heparinum)(购买自IAM)的染色体组DNA中扩增肝素酶I基因,所用的上下游引物分别为5′GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3′(带下划线的碱基为BamHI的酶识别位点),5′CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3′(带下划线的碱基为HindIII酶识别位点),分别引入BamHI和HindIII酶识别位点。
PCR扩增的反应体系为:50ng模板DNA,100pmol每种引物,1×扩增缓冲液(北京天为生物技术有限公司),200μmol/L每种dNTP,1单位高保Pfu酶;扩增程序为:95摄氏度变性5分钟,50-60(51、53、55、57或59℃)摄氏度引物退火45秒,72摄氏度引物延伸90秒,30个循环后,72摄氏度延伸5分钟结束反应。该PCR结果如图2所示,表明扩增得到1.1kb的肝素酶I基因片段。测序表明,该片段具有自序列表中序列2的5′端第1180-2271位核苷酸序列。图2中,泳道2-6分别为引物退火温度为51、53、55、57或59℃扩增结果,泳道1为分子量marker(条带大小依次为15kb、10kb、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、750bp),箭头所指处为1.1kb目标片段。
将上述得到的PCR产物用BamHI和HindIII双酶切后,分别插入到pMal-p2x或pMal-c2x载体的BamHI和HindIII酶识别位点之间,得到pMal-c2x重组载体或pMal-p2x重组载体,将pMal-c2x重组载体或pMal-p2x重组载体分别转化大肠杆菌JM109,以5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3’和5’CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’为引物,通过菌落PCR筛选转化子,提取可得到1.1kb PCR产物的转化子中的pMal-c2x重组载体或pMal-p2x重组载体,分别通过BamHI和HindIII双酶切验证。将通过BamHI和HindIII双酶切得到1.1kb片段的质粒进行测序,将含有具有序列表中序列2的核苷酸序列的肝素酶I融合蛋白编码基因的pMal-c2x重组载体或pMal-p2x重组载体命名为pMal-c2x-hepA或pMal-p2x-hepA。在pMal-c2x-hepA和pMal-p2x-hepA中,hepA基因与lacZα基因之间有两个连续的终止密码TAGTAA,表达了MBP-hepA融合蛋白后,从而能够有效地终止蛋白翻译不会表达lacZα蛋白。
将pMal-c2x-hepA或pMal-p2x-hepA转化大肠杆菌TB1,得到重组工程菌,将重组工程菌提取质粒,进行酶切和测序鉴定,将鉴定结果表明正确的转入了pMal-c2x-hepA的重组工程菌命名为TB1-pMal-c2x-hepA,将鉴定结果表明正确的转入了pMal-p2x-hepA的重组工程菌命名为TB1-pMal-p2x-hepA。
2、麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白(MBP-HepA)的诱导表达和粗酶液提取
从平板中挑取TB1-pMal-c2x-hepA菌落于5mL LB培养基中,37℃隔夜培养(12~14h),然后按体积百分含量为1%的接种量接入含氨苄青霉素Amp(终浓度为100μg/mL)的100mL LB培养基中,37℃培养3小时(即菌株培养至对数生长期),加入1mM IPTG,于15℃,200rpm进行诱导培养21小时,得到的培养液在4℃,10000rpm离心10min,收集菌体。
将上述收集得到的TB1-pMal-c2x-hepA菌体用pH为7.4、含0.2M NaCl的0.017mol/L Tris缓冲液洗涤菌体2次,按每2ml菌液离心得到的菌体加入1ml Tris缓冲液的比例,将菌体悬浮在pH为7.4、含0.2M NaCl的0.017mol/L Tris缓冲液中,在冰浴中超声破碎(输出功率为300W,每次超声3秒和间歇3秒的处理99次)。细胞破碎液在4℃,13000rpm离心30min,取上清液得无细胞麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白粗酶液。
3、麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白(MBP-HepA)粗提酶液活力的测量
粗提酶液的酶活力的检测采用232nm的光吸收法,1IU的酶活的定义为30℃每分钟产生1μmol不饱和键的反应效力。取肝素底物溶液0.5ml,加入步骤3中所得的粗酶液,其它体积以Tris缓冲液补充,最终的反应液体积为1.5ml,测单位时间内在232nm的吸光度变化ΔA232。消光系数ε=3800M-1。测定结果表明上述提取得到的粗酶液的活力为4000IU/L粗酶液。
实施例2、低分子量肝素的生产
1、麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白生产低分子量肝素过程中反应混合液分子量之间的关系以及数均分子量与A235(235nm处的吸光度)关系的检测
1)麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白生产低分子量肝素过程中A235(235nm处的吸光度)的变化
以商品肝素(购于河北常山生化药业股份有限公司)为原料,将商品肝素加入到50mL含3.5mM CaCl2和200mM NaCl的超纯水溶液中,然后用1M HCl溶液调节pH至7.0,配成肝素的浓度为50g/L的溶液,即得到肝素溶液。
将上述肝素溶液50mL加热至30℃恒温,加入1mL实施例1制备的酶活为4000IU/L的麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白粗酶液,进行反应,随着反应的进行,肝素被逐渐被降解为低分子量肝素,生成的4,5-不饱和糖苷键增多,在235nm下的吸光度不断增加,每隔一段时间监测反应液的A235,并取出一部分按照下述方法进行重均分子量Mw、数均分子量Mn(按照欧洲药典法所示的方法进行)测定:
所得的反应液采用高效排阻色谱法来测定其平均分子量及其分布(Ahsan A,Jeske W,Mardiguian J,J.Pharm.Sci.1994,83:197-201)。采用的凝胶色谱柱为TSK-Gel G3000SW,所用的缓冲液为pH 5.0,含质量百分含量2.84%的Na2SO4缓冲液。具体操作过程如下:
使用岛津色谱仪(LC-10A),色谱柱的出口接紫外检测器,紫外检测器出口接示差折光检测器。柱温35℃,流速0.5mL/min,检测波长为235nm。取低分子量肝素标准品(10mg/mL,流动相配制)25μL进样,同时记录两检测器色谱图,精确测出样品到达两检测器的时间差,将两色谱图时间对准得到色谱柱的校正曲线,校正中用的保留时间以示差折光检测器的保留时间为准。按以下公式计算:
其中:∑RI和∑UV234分别为示差折光检测器色谱图中有效峰的总面积和紫外检测器色谱图中有效峰的总面积。Mna为的数均分子量3700(EPCRS);RIi和UV234i分别为i时间点两检测器色谱图的峰高,Mi为i时间点的分子量。
均匀选择5-7个Mi与对应的停留时间(Rti)作线性回归,得到分子量对数值与保留时间的线性方程,即获得色谱柱的标准曲线,要确保相关系数r>0.99。
然后待测样品溶液25μL进样,记录示差折光检测器色谱图,按下列式子计算样品的重均分子量Mw、数均分子量Mn及其分子量分布D:
上述实验得到的不同反应时间的反应液的A235数值的变化情况图如图4所示。图4表明,反应初期反应液的A235随时间的增加而增加,二者呈直线性关系,反应后期随着时间的增加A235渐渐趋于恒定。
2)麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白生产低分子量肝素过程中反应混合液分子量与A235(235nm处的吸光度)关系
由数均分子量的定义(混合物各组分分子量与组分摩尔数的乘积/总摩尔数)可知,C/Mn,u为原来的总摩尔数,C/Mn为反应后的总摩尔数,ΔA235/ε为增加的摩尔数,所以有
C/Mn=C/Mn,u+ΔA235/ε
上式两边同时乘以C就可以得到式(7)所示的反应混合液的数均分子量Mn与A235(235nm处的吸光度)间存在的关系(US005106734):
其中:Mn,u为肝素原料的数均分子量,ΔA235为自反应初始时吸光度的增加值,C为初始肝素原料浓度(g/L),ε为摩尔吸光系数。
利用步骤1)检测得到的各个反应时间点的数均分子量和反应液的A235符合式7所示的关系,具体为 (式8)
利用步骤1)检测得到的各个反应时间点的数均分子量和重均分子量数据,以重均分子量为横坐标,以数均分子量为纵坐标作图,结果如图6(反应混合液数均分子量Mn与重均分子量Mw关系曲线图)所示,反应结束后可根据图6求出反应混合物的重均分子量Mw。
2、麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白生产低分子量肝素过程中不同A235(235nm处的吸光度)终止反应制备出低分子量肝素产品
1)本发明低分子量肝素的生产的装置
麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白生产低分子量肝素的反应装置如图3所示,包括带搅拌器的反应器1、超滤装置2和储液罐3;其中。超滤装置2为错流式超滤膜(回流液流向与滤液流向正交),包括超滤膜4、回流液出口5、滤液出口7、反应液入口8。反应器1的反应液出口通过泵与超滤装置2的反应液入口8连接,超滤装置2的回流液出口5与反应器1连接,超滤装置2的滤液出口7与储液罐3连接。
本实施例中超滤装置2购自美国密理博(Millipore)公司,型号为Biomax 8,其中,超滤膜4的截留分子量为8000道尔顿。反应器1为150mL带夹层的玻璃瓶,内层直径为4.8cm,外层直径为7.8cm,高度为10.5cm,搅拌器直径为2.0cm;储液罐3为100mL玻璃质锥形瓶。
上述反应器工作时,底物和酶在反应器1中反应完毕后,用纤维素膜孔径为0.2微米的真空抽虑装置(是纤维膜铺于过滤漏斗上,与真空泵连接组成的抽滤装置,所用纤维素膜购自上海兴亚净化材料厂,直径为50毫米;所用真空泵为隔膜式真空泵,购自日本爱发科(ULVAC)公司,型号为DTC-21;滤液容器为250mL玻璃质锥形瓶)进行抽虑得到初滤液,之后将初滤液转移回反应器1,通过泵泵入超滤装置2中反应液入口8,沿着超滤膜4包围的空间向上流动至回流液出口5回流过滤,回流液通过回流液出口5流回反应器1中继续被泵入超滤装置2中反应液入口8不断循环回流过滤,此过程中,部分分子和液体通过超滤膜4滤出,通过超滤液通过滤液出口7进入储液罐3中,储液罐3得到的液体即为超滤液。
2)本发明低分子量肝素的生产
以商品肝素(购于河北常山生化药业股份有限公司)为原料,将商品肝素加入到50mL含3.5mM CaCl2和200mM NaCl的超纯水溶液中,然后用1M HCl溶液调节pH至7.0,配成肝素的浓度为50g/L的溶液,即得到肝素溶液。
将分别将9份50mL的上述制备的肝素溶液分别置于步骤1)所述的麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白生产低分子量肝素的反应装置的反应器中,加热至30℃恒温,分别加入1mL酶活为4000IU/L的粗酶液,每隔一段时间监测反应液的A235,分别将这些组反应液在不同的A235(具体如表1所示)加盐酸调节pH值至2.0终止反应后,用上述纤维素膜孔径为0.2微米的真空抽虑装置(是纤维膜铺于过滤漏斗上,与真空泵连接组成的抽滤装置,所用纤维素膜购自上海兴亚净化材料厂,直径为50毫米;所用真空泵为隔膜式真空泵,购自日本爱发科(ULVAC)公司,型号为DTC-21;滤液容器为250mL玻璃质锥形瓶)进行抽滤后得到不同的A235时终止反应的反应液的初滤液样品,然后将反应液的初滤液样品泵入步骤1)所述装置的超滤装置中用超滤膜(截留分子量为8000道尔顿)对初滤液过滤后得到不同的A235时终止反应的反应液的次滤液。分别往各组次滤液中加入2.5倍体积的乙醇混合均匀后,离心弃上清收集沉淀,然后将沉淀中分别加入丙酮洗涤减压蒸干即得到不同的A235时终止反应得到的低分子量肝素产品粉末。
用步骤1的步骤1)所述的方法检测不同的A235时终止反应得到的低分子量肝素产品粉末水溶液的重均分子量(Mn)和数均分子量(Mw)以及分布系数,并按照欧洲药典5.0所述的方法检测不同的A235时终止反应得到的低分子量肝素产品粉末的抗Xa及抗IIa活性,结果如表1所示,结果表明当A235处于30~55时,能够得到完全符合欧洲药典要求(抗Xa活性不少于70IU/mg,抗Xa活性与抗IIa活性比值不少于1.5)的低分子量肝素产品,表明融合肝素酶I能够有效的用于低分子量肝素的清洁生产,并且在A235处于30~55时,得到低分子量肝素的分布系数也较小,说明在此范围内可以得到分子量分布范围窄的低分子量肝素。其中,吸光度A235为48.4时终止反应进行过滤纯化处理所得到的低分子量肝素产品照片如图7所示。
表1不同A235时终止反应所得产品参数比较
终止反应时的A235 | 数均分子量Mn | 重均分子量Mw | 分布系数D | 抗Xa活性 | 抗Xa活性与抗IIa活性比值 |
20.6 | 7578 | 4982 | 1.52 | 412.18 | 1.2 |
30.8 | 6883 | 4674 | 1.47 | 385.29 | 2.1 |
40.7 | 6282 | 4550 | 1.38 | 262.62 | 2.4 |
46.7 | 5038 | 3498 | 1.44 | 154.95 | 2.2 |
48.4 | 4916 | 3379 | 1.45 | 133.86 | 2.3 |
51.5 | 4641 | 3230 | 1.44 | 116.69 | 4.1 |
64.2 | 3979 | 3063 | 1.30 | 65.56 | 2.2 |
75.2 | 3938 | 3163 | 1.25 | 55.21 | 4.2 |
88.9 | 3314 | 2828 | 1.17 | 44.99 | 3.6 |
序列表
Claims (7)
1.一种制备低分子量肝素的方法,是用麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素,得到低分子量肝素;
所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白,是具有序列表中的SEQ ID №:1的氨基酸残基序列的蛋白质;
所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白是将可表达所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白的重组表达载体转入大肠杆菌中,然后诱导表达得到的融和蛋白;所述可表达所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白的重组表达载体是将肝素酶I的编码基因插入pMAL-p2x或pMAL-c2x载体的BamHI和HindIII识别位点间得到的重组表达载体;
所述方法中,所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应终止反应时反应液的A235为30-55;所述反应用盐酸调节pH值至2.0终止反应;
所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应是在可溶解肝素的溶剂中进行;所述可溶解肝素的溶剂为含3.5mM CaCl2和200mM NaCl的超纯水溶液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述肝素的初始浓度为1-100g/l;所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白的用量为0.4-4.0IU/g肝素。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述肝素的初始浓度为50g/l;所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白的用量为1.6IU/g肝素。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述方法中,反应温度为10-45℃;所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应的初始pH为6.5-8.0。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述方法中,反应温度为25-35℃。
6.根据权利要求1-5中任意所述的方法,其特征在于:所述方法中,还包括根据式8所示的数均分子量与麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应液与反应初始时反应液相比的235nm处的吸光度的增加值ΔA235的关系式,通过控制所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应过程终止时反应液的235nm处的吸光度,获得目的数均分子量的低分子量肝素;
所述式8中Mn为数均分子量,ΔA235为麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应液与反应初始时反应液相比的吸光度的增加值。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述方法中,还包括将所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶I的融合蛋白降解肝素的反应获得的产物进行纯化;所述纯化的步骤是将终止反应后的反应液过滤除去蛋白,然后将滤液用截留分子量为3000-10000Da的超滤膜进行过滤,在滤液中加入是滤液体积2-3倍的乙醇混合均匀后离心弃上清收集沉淀,加入丙酮洗涤减压蒸干即得到低分子量肝素或超低分子量肝素产品粉末。
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