CN104470530A - 来自prasinococcale的多糖 - Google Patents

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Abstract

提供了包含可获自微藻类Prasinococcus capsulatus和与P.capsulatus相关的藻株的多糖的组合物，用于在免疫系统的紊乱，例如银屑病和皮肤病状况、内部免疫系统紊乱，特别是肠道炎性状况和呼吸道状况的治疗中预防地和/或治疗上使用。此外，提供了可获自微藻类Prasinococcus capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的多糖的衍生物，以及这样的衍生物在免疫系统的紊乱的治疗中预防地和/或治疗上的用途。

Description

来自PRASINOCOCCALE的多糖
发明领域
本发明涉及包含可获自微藻类Prasinococcus capsulatus和与P.capsulatus相关的藻株的多糖的组合物，用于在免疫系统的紊乱诸如炎性紊乱，例如银屑病和皮肤病学状况的治疗中预防地和/或治疗上使用。此外，提供了可获自微藻类Prasinococcus capsulatus和与P.capsulatus相关的藻株的多糖的衍生物，以及这样的衍生物在免疫系统的紊乱诸如炎性紊乱，例如银屑病和皮肤病学状况的治疗中预防地和/或治疗上的用途。
还提供了可获自微藻类Prasinococcus capsulatus和与P.capsulatus相关的藻株的多糖及其衍生物在制备化妆品和营养组合物中的用途。
发明背景
已开发大型藻类(macroalgae)(海藻)提供长期建立的产品诸如藻酸盐和鹿角菜胶及较新的产品诸如岩藻聚糖，然而，还未以这种方式大量使用微藻类，并且存在源自微藻类的这些产品的相对很少的表征。
发明概述
根据本发明的第一个方面，提供了可获自Prasinococcus capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的形成凝胶的多糖，其中形成凝胶的多糖是包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸单元的大于670 kDa的分子量的硫酸化杂聚合物，用于在免疫系统紊乱，特别是为炎性状况的免疫系统紊乱的治疗中使用。
本发明人已采用一系列方法以确定本发明的多糖及其衍生物的组成。使用本文详述的方法，不希望受关于多糖的结构理论的束缚，本发明人已如所述地表征了多糖及衍生物。因此，在实施方案中，当使用本文所述的方法来表征多糖或衍生物时，其提供了单糖和硫酸组成，如本文所述的。
已显示相对最近地发现的物种Prasinococcus capsulatus产生多糖(Miyashita,等人Prasinococcus capsulatus Gen.Et Sp.Nov.,A New MarineCoccoid Prasinophyte.J.Gen.Appl.Microbiol.,39,571-582(1993)以及Miyashita，等人Composition and nature of extracellular polysaccharideproduced by newly isolated coccoid prasinophyte,Prasinococcus capsulatus.J.Marine Biotechnol.,3,136-139(1995).)。
合适地，与Prasinococcus capsulatus相关的藻株可包括Prasinococcales藻株。在实施方案中，与Prasinococcus capsulatus相关的藻株可包括Prasinoderma singularis。在实施方案中，多糖可以是与微藻类的细胞壁相关的多糖，和/或可存在于微藻类的匀浆中，和/或可以是分泌的多糖或胞外多糖。可以分离的、纯化的、或半纯化的形式提供多糖。在实施方案中，多糖可以是已从细胞生物质中分离的纯化的材料，使得多糖为按重量计至少50％多糖，和更优选地按重量计75％以上多糖，更优选地按重量计85％以上多糖，更优选地按重量计约95％多糖。
在实施方案中，免疫系统紊乱是血管细胞和组织对内部或外部刺激的应答不足、过度或长期的那些。在炎性状况中该应答通常是过度的和/或长期的，导致增加的和保持的免疫细胞(诸如中性粒细胞和T细胞)的活化，其可浸润组织并增加促炎性介质的产生，导致维持的炎症。已确定了多糖可被用于通过以下减轻该活化的效应：例如，通过减少中性粒细胞蛋白酶，诸如弹性蛋白酶的活性；通过减少促炎性蛋白(细胞因子)和活性氧物质从血液和内皮细胞的分泌；以及通过减少血细胞向受影响的组织的浸润。
在本发明的实施方案中，如本文描述的多糖可用于在炎性皮肤状况，包括湿疹、银屑病和特应性皮炎的治疗中使用。
在本发明的实施方案中，如本文描述的多糖可用于在肠的炎性状况的治疗中使用，特别是在肠紊乱，包括肠易激综合征、克罗恩病和溃疡性结肠炎的治疗中使用。
在本发明的实施方案中，如本文描述的多糖可用于在包括以下的呼吸道炎症状况的治疗中使用：哮喘、囊性纤维化病、肺气肿、慢性阻塞性肺紊乱(chronic obstructive pulmonary disorder)、急性呼吸窘迫综合征、或过敏性鼻炎。
用于本发明的多糖的实施方案可通过特征(i)、(ii)、(iii)、(iv)、和(v)的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、或至少五种来表征。
(i)分子量范围
(ii)单糖组成
(iii)免疫调节活性
(iv)硫酸含量(作为分子的分子量的百分比)
(v)粘度/形成凝胶特性
分子量范围
用于本发明的多糖通常具有670 kDa或比670 kDa更大的分子量。
在实施方案中，本发明的多糖可具有在670 kDa至40兆Da的范围内的分子量。在实施方案中，本发明的多糖可具有以下的分子量：大于或等于1兆Da、大于或等于5兆Da、大于或等于10兆Da、大于或等于15兆Da、大于或等于20兆Da、大于或等于25兆Da、大于或等于30兆Da、大于或等于35兆Da、或40兆Da。
在实施方案中，本发明的多糖可包含约
20％至30％葡萄糖
30％至60％半乳糖
4％至19％阿拉伯糖
2％至6％糖醛酸
和小百分比(1％至10％)的其他糖，更特别地
1％–4％鼠李糖
1％–3％木糖
1％–10％甘露糖
(％按重量计)。
在实施方案中，本发明的多糖可包含约
25％至29％葡萄糖
35％至47％半乳糖
14％至15％阿拉伯糖
4％至6％糖醛酸
和小百分比(1％至4％)的其他糖，更特别地
2.4％鼠李糖
1.8％木糖
3.3％甘露糖
(％按重量计)。
在实施方案中，用于本发明的多糖可具有以下的硫酸含量：按重量计约17％至35％、按重量计17％至30％、适当地，按重量计25％至30％、适当地按重量计17％至25％，多糖可适当地具有以下的硫酸含量：按重量计约20％、适当地按重量计约19％。
在实施方案中，用于本发明的多糖可显示体外免疫调节活性，其中例如相对于未被提供多糖的中性粒细胞，多糖可抑制中性粒细胞弹性蛋白酶活性的约60％至90％，特别是60％至80％。
除了治疗上有助于治疗皮肤的炎性状况，还认为本文描述的多糖的实施方案可用于治疗内部免疫系统紊乱，特别是肠炎性状况和呼吸道状况，例如肠炎性状况包括肠紊乱、肠易激综合征、克罗恩病、和溃疡性结肠炎，且呼吸道状况包括哮喘、囊性纤维化病、肺气肿、慢性阻塞性肺紊乱、急性呼吸窘迫综合征、或过敏性鼻炎。这样的状况的治疗可经由多糖的摄取或通过多糖的吸入。还认为，当患者具有潜在的免疫系统紊乱，但不呈现症状时，则可供给本文描述的多糖以使症状的风险最小化。
因此本发明的第二个方面提供了包含可获自P.capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的多糖的营养补充剂，其中形成明胶的多糖是具有比670 kDa更大的分子量的硫酸化杂聚合物，主要包含葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸单元。
此外，当不需要治疗益处时，本发明人认为多糖可为用户有助地提供美容上的优势。
因此本发明的第三个方面是包含可获自P.capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的多糖的美容制品，其中形成明胶的多糖是具有比670 kDa更大的分子量的硫酸化杂聚合物，主要包含葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸单元。
应认识到，本发明的第一方面的多糖的实施方案可用于本发明的第二和第三方面。
多糖的衍生物及其用途
本发明人已确认了，可获自Prasinococcus capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的形成凝胶的多糖的衍生物，其中形成明胶的多糖是具有比670 kDa更大的分子量的硫酸化杂聚合物，包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸单元，也可用于治疗免疫系统紊乱，特别是促进炎性应答的免疫系统紊乱。
因此本发明的第四个方面提供了来自Prasinococcus capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的形成凝胶的多糖的衍生物(低聚糖)，其中形成明胶的多糖是具有比670 kDa更大的分子量的硫酸化杂聚合物，主要包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸单元，其中所述衍生物具有约2 kDa至10 kDa的范围内、或约2 kDa至20 kDa的范围内、约20 kDa至60 kDa的范围内的分子量。
应认识到，本发明的第一方面的多糖的实施方案可用于形成本发明的第四方面的衍生物。
在实施方案中，衍生物可以是具有范围在2 kDa至10 kDa内的分子量的低分子量片段。在实施方案中，衍生物可包括具有范围在20 kDa至60kDa内的分子量的多糖的更大片段。
在实施方案中，约2 kDa至10 kDa的多糖的低分子量片段可包括约
30％至40％葡萄糖
30％至40％半乳糖
8％至14％阿拉伯糖
7％至11％糖醛酸
和小百分比(1％至10％)，适当地小百分比(1％至4％)的其他糖单元(％按重量计)。
在实施方案中，约2 kDa至10 kDa的多糖的低分子量片段可包括约
35％葡萄糖
35％半乳糖
11％阿拉伯糖
9％糖醛酸
和小百分比(1％至10％)，适当地小百分比(1％至4％)的其他糖单元(％按重量计)。
在实施方案中，多糖的大片段(约20 kDa至60 kDa)可包括
25％至28％葡萄糖
35％至55％，适当地35％至45％半乳糖
8％至17％阿拉伯糖，适当地15％阿拉伯糖
4％-6％糖醛酸
和小百分比(1％至4％)的其他糖单元(％按重量计)。
在实施方案中，多糖的大片段(约20 kDa至60 kDa)可包括
25％葡萄糖
50％半乳糖
15％阿拉伯糖
5％糖醛酸
和小百分比(1％至5％)的其他糖单元(％按重量计)。
在实施方案中，本发明的多糖的衍生物可包含按重量计约
8.4％阿拉伯糖
0.7％鼠李糖
2.0％木糖
2.2％GalA(半乳糖醛酸)
57.9％半乳糖
24.6％葡萄糖
3.8％GlcA(葡糖醛酸)。
适当地，在实施方案中，本发明的多糖的衍生物可具有按重量计约20％至30％、适当地按重量计25％至30％的硫酸含量。
在实施方案中，相对于未被提供衍生物的中性粒细胞，多糖的低聚糖衍生物可抑制中性粒细胞弹性蛋白酶释放的约70％至90％、适当地80％至90％。
在实施方案中，相对于其中未被提供衍生物的中性粒细胞，多糖的衍生物可抑制中性粒细胞活性氧物质(ROS)产生的约30％-40％。在实施方案中，相对于未被提供衍生物的角质形成细胞，低聚糖衍生物可抑制人角质形成细胞IL-8基因表达和释放的约70％至100％。该活性比得上良好表征的多糖抗凝血药肝素，肝素抑制弹性蛋白酶释放的约60％-75％，但对ROS产生不具有显著效应。该活性还比得上海藻多糖岩藻依聚糖，岩藻依聚糖抑制弹性蛋白酶释放的约70％至90％，以及角质形成细胞IL-8释放的约80％至90％。
在实施方案中，相对于未被提供衍生物的人角质形成细胞，多糖的低聚糖衍生物可抑制人角质形成细胞IL6和IL17C释放的约50％-70％。在实施方案中，相对于其中未被提供衍生物的人PBMC，多糖的低聚糖衍生物可抑制来自人类外周血单核细胞(PBMC)的干扰素γ的释放的约50％-70％。在实施方案中，相对于未被提供衍生物的中性粒细胞和单核细胞，低聚糖可抑制人中性粒细胞的趋化性的约50％-70％和THP-1(单核细胞)细胞的趋化性的约30％-50％。在实施方案中，相对于其中未被提供衍生物的对照，多糖的低聚糖衍生物可以剂量依赖性方式抑制咪喹莫特诱导的小鼠皮肤炎症。
就约而言意指在在所述值的1％至20％之内，更特别地在10％之内，又更特别地在5％之内，甚至又更特别地2％之内。
本发明的衍生物的实施方案可用于在免疫系统紊乱，特别是促进炎性应答的免疫系统紊乱，更具体地皮肤状况，包括湿疹、银屑病和特应性皮炎的治疗中使用。
本发明的衍生物的实施方案可用于在内部免疫系统紊乱，特别是肠的炎性状况和呼吸道状况，例如肠炎性状况包括肠紊乱、肠易激综合征、克罗恩病、和溃疡性结肠炎，且呼吸道状况包括哮喘、囊性纤维化病、肺气肿、慢性阻塞性肺紊乱、急性呼吸窘迫综合征、或过敏性鼻炎的治疗中使用。
这样的衍生物在这样的治疗中的用途提供了本发明的另外的方面。
适当地，可通过以下本领域已知的任何方法制备衍生物的实施方案：包括水解或酶法水解多糖或通过自由基或光化学方法，诸如由Higashi等人(Controlled photochemical depolymerization of K5 heparosan,abioengineered heparin precursor,Carbohydrate Polymers 86(2011)1365–1370)描述的。
本发明的衍生物的实施方案可以是通过自由基或光化学方法制备的解聚的多糖。
衍生物的实施方案可以是具有按重量计约25％-30％的硫酸含量的低聚糖。
优选地本发明的低聚糖衍生物可具有等于或大于本发明的天然多糖物质的免疫调节特性。
根据本发明的第五个方面，提供了包含来自Prasinococcus capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的多糖的至少一种衍生物的美容制品，其中形成明胶的多糖是具有比670 kDa更大的分子量的硫酸化杂聚合物，主要包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸单元，其中所述衍生物具有范围2 kDa至10 kDa内或约20 kDa至60 kDa的范围内的分子量。
在实施方案中，衍生物可以是具有范围2 kDa至10 kDa内的分子量的低分子量片段。在实施方案中，衍生物可包括具有范围20 kDa至60 kDa内的分子量的多糖的大片段。
在实施方案中，可提供衍生物的大片段和低分子量片段的组合。
根据本发明的第六个方面，提供了包含来自Prasinococcus capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的多糖的至少一种衍生物的营养补充剂，其中形成明胶的多糖是具有比670 kDa更大的分子量的硫酸化杂聚合物，主要包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸单元，其中所述衍生物具有范围2 kDa至10 kDa内或约20 kDa至60 kDa的范围内的分子量。
在实施方案中，衍生物可以是具有范围2 kDa至10 kDa内的分子量的低分子量片段。在实施方案中，衍生物可包括具有范围20 kDa至60 kDa内的分子量的多糖的大片段。
在实施方案中，可提供衍生物的大片段和低分子量片段的组合。
组合物
适当地，可提供如本文讨论的多糖或衍生物作为组合物的一部分。这样的组合物可适于口服、局部、直肠或肠胃外、鼻或肺施用(通过吸入)。在实施方案中，组合物根据用途可用于局部施用至皮肤或用于摄取。
在实施方案中，备用的组合物可呈片剂、胶囊、扁胶囊、或可分散的颗粒的形式，其可，例如，在施用之前悬浮于水中或撒在食物上。组合物可便利地呈现为单位剂型，并可通过食品工业中熟知的任何方法来制备以制备食品和食品补充剂，或可通过制药工业已知的方法来制备以用作药物，例如作为局部药剂。
用于局部施用的组合物可例如作为凝胶、霜或软膏提供。这样的组合物可被直接应用至皮肤或承载在适当的支持物上，诸如绷带、纱布、网丝、或可被应用至待处理的区域的类似物上。
食品制造的领域中的技术人员已知的方法包括，但不限于；粉末形式中的活性剂和其他成分的干混，包含所有组分的乳剂的喷雾干燥或使用挤压技术以形成丸剂或颗粒剂。可选地，组合物可呈液体补药的形式。
多糖或衍生物可提供为药学上可接受的盐或药学上可接受的溶剂化物。在实施方案中，多糖或衍生物可单独，或以与关于施用的预期途径和标准药学实践而选择的药物载体、赋形剂或稀释剂的混合物中来施用。药物载体可以是有机的或无机的、天然的或合成的生理学上可接受的载体，本发明的多糖或其衍生物可与上述载体组合以促进应用。
在实施方案中，多糖或衍生物可掺入任何合适的粘结剂、润滑剂、悬浮剂、涂层剂、增溶剂、载体、或缓冲稳定剂。
本发明的组合物还可包含根据待治疗的状况的需要选择的一种或更多种另外的活性化合物。例如组合物可包含另外的活性化合物，其靶向与本发明的产品靶向的通路或机制不同的通路或机制。这可提供改进的效力，例如协同效应。在实施方案中，多糖或衍生物可与维生素D组合提供。
药用化妆品或美容制品
在实施方案中，本发明的多糖或衍生物可提供为药用化妆品，即具有标明具有医学或药物样益处的生物学活性成分的美容产品。
可选地，本发明的多糖或衍生物可提供为化妆品，其改进皮肤的外观和功能，但没有临床效应。
适当地，用作药用化妆品或美容制品的组合物可提供为本领域已知的，包括，但不限于，面霜、凝胶、精华液、洗涤物、漂洗物、洗发剂、护发素、摩丝等。
本发明的美容制品的实施方案可提供例如为用于局部施用至皮肤的乳霜、精华液、凝胶或软膏。在实施方案中，美容制品可用作抗衰老皮肤制品，用于皮肤调色/平滑或改进皮肤的颜色。这样的制品可适合地使被认为与老化相关的效应诸如皱纹的可视化外观、阳光损伤最小化并可增加皮肤弹性。在这样的美容组合物中，多糖或其衍生物通常可与基础载体或皮肤保湿物质组合来提供。适当地，基础载体与组合物的其他成分相容，并对化妆品的使用者无毒害。通常这样的制品还可包括防腐剂、香精或抗氧化剂。另外，这样的制品可包括水、湿润剂、乙醇、油类、着色剂等。
在实施方案中，可提供包含用于本发明的多糖的美容制品。在优选的实施方案中，可提供具有本文讨论的衍生物的美容制品。
营养补充剂
在实施方案中，本发明的营养补充剂可促进接受该营养补充剂的受试者中的肠道健康。适当地，营养补充剂的实施方案可减少肠内痉挛或不适。在实施方案中，可提供包含用于本发明的多糖的营养补充剂。在优选的实施方案中，可提供具有本文讨论的衍生物的营养补充剂。
在实施方案中，本发明的营养补充剂可配制成胶囊形式以口服。在实施方案中，可提供营养补充剂为营养组合物的一部分。
多糖的制备
在实施方案中，用于本发明的多糖或这样的多糖的衍生物可以是从Prasinococcus capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的培养物的细胞级分或分泌级分分离的多糖。
在实施方案中，用于本发明的多糖或这样的多糖的至少一种衍生物可从Prasinococcus capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的培养物的细胞级分分离。
在实施方案中，用于本发明的多糖或这样的多糖的至少一种衍生物可从Prasinococcus capsulatus或与P.capsulatus相关的藻株的培养物的分泌级分分离。
在实施方案中，Prasinococcus capsulatus的培养物可以是Prasinococcus capsulatus藻株CCMPII94。该藻株为公众可得。培养物可适当地生长在如本领域将已知的藻类培养基上，其中藻类培养基中提供的氮、维生素、二氧化硅或微量金属的修改可如本领域技术人员已知的来做出。藻类培养基可与海水基础或使用合成的海水一起使用。
在实施方案中，可使用具有以下组成的f/2生长培养基：
贮备溶液：
这样的培养基被Sieburth等人，Widespread occurrence of the oceanicultraplankter,Prasinococcus capsulatus(prasinophyceae),the diagnostic“golgi-decapore complex”and the newly described polysaccharide“capsulan”.J.Phycol.35,1032–1043(1999)以及Guillard R.和Ryther J.1962Studies of marine planktonic diatoms.Can.J.Microbiol.8:229-239讨论。
适当的培养基可通过将以下添加至950 ml过滤的海水(盐度29-32ppt)中来做出。
培养基：
通常可将pH设为8.0(2 ml 1M Tris-HCl pH8/升培养基)并且用海水将培养基补足至1升。培养基可由高压灭菌法(例如121℃，15分钟)来灭菌并存储于2℃-8℃下。
可使用P.capsulatus培养物的变体，其中使用如以上的80％的NaH2PO4.2H2O，加上100mg甘油磷酸钠/升并且其中包括两倍浓度的NaNO3和维生素以增加生物量。
根据本发明的另外的方面，提供了产生用于本发明的多糖或该多糖的衍生物的方法，其中该方法包括以下步骤：
培养微藻类，适当地Prasinococcus capsulatus的培养物，特别是Prasinococcus capsulatus藻株CCMPII94。
分离来自培养基的微藻生物量，
浓缩和脱盐培养基，以及
干燥培养基。
适当地，可通过离心分离来自培养基的微藻生物量。在可选的实施方案中，可通过过滤、絮凝、或切向流过滤适当地进行分离。适当地，浓缩可通过切向流过滤。在实施方案中，这可通过使用100 kDa膜。如果还进行透析过滤，这可使培养基脱盐。
适当地，可通过以下提供多糖从培养基的分离
沉淀、
渗析、
切向流过滤和/或
离子交换色谱法
在实施方案中，通过离子交换色谱法提供分离并通过切向流过滤浓缩。
在分离后，可将培养基级分干燥。可使用以下进行干燥：例如，冷冻干燥和热干燥、室温(20℃)下使用减少的大气压强或真空来干燥的盘架干燥(shelf drying)、喷雾干燥、旋转干燥、或旋转快速干燥。
适当地，可通过喷雾干燥浓缩的并脱盐的培养基进行干燥。
还可处理细胞(细胞团块)以提取靶多糖，例如提取的步骤可以是热水萃取的步骤或酶消化步骤或另一个适当的提取方案。
可使用例如，压力破坏、球磨研磨、声处理、或共混(高速或华林(Waring))进行提取。
在优选的实施方案中，方法可提供多糖的衍生物，其中该衍生物通过由自由基或光化学方法解聚天然多糖，随后使用尺寸排阻色谱法或切向流色谱法分级分离以产生限定分子量的低聚糖级分来制备。
治疗
多糖、其衍生物或包含多糖或其衍生物的组合物可用于治疗若干医疗状况。治疗包括可有益人或非人动物的任何方案。治疗可以是关于现存状况的或可以是预防的(预防性治疗)。治疗可包括治愈、减轻或预防效应。
适当地，多糖、其衍生物或包含多糖或其衍生物的组合物可提供为片剂或胶囊。适当地，多糖、其衍生物或包含多糖或其衍生物的组合物可以以持续释放制剂施用。适当地，可向动物，包括人，提供多糖、其衍生物或包含多糖或其衍生物的组合物作为膳食补充剂，其将向动物提供保护益处和/或在治疗上用于调节免疫应答，特别是调节动物特别是人的炎性应答。
施用
本发明提供了用作药剂的用于使用的多糖、或本发明的衍生物、或包含其的组合物。药剂可用于人类使用或兽医使用。适当地，在兽医使用中动物患者可以是陆栖动物，更适当地伴侣动物或性能动物(performanceanimal)。适当地，患者可以是人。适当地，多糖的衍生物或包含多糖或其衍生物的组合物可局部应用至患者，例如应用至皮肤。
可通过口服、局部、直肠或肠胃外、鼻或肺(通过吸入)途径施用本发明的产品。通常，医师将确定将最适合于个体患者的实际剂量，并且其会随着具体患者的年龄、体重和反应而变化。一般地，本发明的产品的治疗有效的每日口服剂量可能变化范围从1至50mg/kg待治疗的受试者的体重，优选地10至20mg/kg。以上剂量是平均情况的示例。当然，可存在其中应用更高或更低剂量范围的个别实例，且这在本发明的范围内。
因此，提供了本发明的第一方面的多糖或本发明的第四方面的衍生物的施用的方法，用于治疗免疫系统的紊乱，特别是炎性状况、更特别是皮肤的炎性状况，包括湿疹、银屑病和特应性皮炎和/或内部免疫系统紊乱，特别是肠道炎性状况和呼吸道状况，例如肠道炎性状况包括肠道紊乱、肠易激综合征、克罗恩病和溃疡性结肠炎，且呼吸道状况包括哮喘、囊性纤维化病、肺气肿、慢性阻塞性肺紊乱、急性呼吸窘迫综合征或过敏性鼻炎，其中该方法包括在需要其的受试者中提供治疗有效量的多糖和/或衍生物。
除非上下文另有要求，否则本发明的各方面的优选的特征和实施方案是关于各其他方面已作必要的修正。
本文引用的各文件、文献、专利申请或专利通过引用以其整体明确并入本文，意指读者应该阅读并考虑其作为本文的一部分。即本文引用的文件、文献、专利申请或专利在本文中没有重复，仅为简明的原因。提及引用的包含在文本中的材料或信息不应被理解为承认该材料或信息是公知常识或在任何国家中是公知的一部分。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，术语“包括(comprise)”或“包括(include)”、或词形变化诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”、“包括(includes)”或“包括(including)”将被理解为暗示包括所述的整数或整数的组，但不排除任何其他整数或整数的组。
本发明的实施方案现将仅参考附图通过示例的方式来讨论，其中
图1a和b示出了显示纯度和分子量的P.capsulatus多糖的示例性HPLC-尺寸排阻色谱图，其中(a)是来自使用折射率检测的多糖的HPLC-尺寸排阻分析的示例性色谱图，且样品高于Biosep 4000柱的分辨率(最高标准670 kDa)，且(b)是来自使用光电二极管阵列检测的多糖的尺寸排阻分析的示例性色谱图和等值线图，其中样品高于使用的Biosep 4000柱的分辨率。仅低波长下的最小吸光度。
图2a和b示出了显示基于使用折射率检测，YMC120 Diol柱的纯度和分子量的P.capsulatus多糖衍生物的两个示例性HPLC-尺寸排阻色谱图，并且在6.5分钟后的峰与流动相缓冲液相关。实例批次指示方法的良好再现性且1->8 kDa范围的LMW材料。
图3a、3b、3c和3d示出了来自P.capsulatus多糖和多糖衍生物的使用甲醇分解-TMS衍生GC-FID方法的单糖分析的示例性色谱图，其中(a)是甲醇分解-TMS GC-FID方法中使用的混合的单糖标准的示例性色谱图，具有以下列表数据；(b)是来自P.capsulatus多糖的单糖分析的示例性色谱图，显示关键单糖峰，基于与具有以下列表数据的混合的标准和内部标准比值的比较；(c)是来自多糖衍生物(大多糖片段20-60 kDa)的单糖分析的示例性色谱图，显示了关键单糖峰，基于与具有以下列表数据的混合的标准和内部标准比值的比较；(d)是来自多糖衍生物(小多糖片段2-10 kDa)的单糖分析的示例性色谱图，显示了关键单糖峰，基于与具有以下列表数据的混合的标准和内部标准比值的比较。
图3e示出了来自P.capsulatus多糖和多糖衍生物的单糖分析的示例性数据的表，将甲醇分解-GC-FID方法与TFA-水解-HPAEC-PAD方法比较，其中小多糖衍生物(2-10 kDa)和HMW天然多糖的重复样品表示不同的制品。数据显示为％单糖组成。虽然百分比发生变化，但两种方法都显示了相似单糖的存在。虽然以比甲醇分解-TMS GC-FID方法更低的百分比，但来自TFA/HPAEC-PAD方法的示例性数据显示了半乳糖在所有样品中的存在。这可由于用于水解的更强酸性条件(TFA)。
图3f和g示出了P.capsulatus多糖和多糖衍生物的TFA处理的水解产物的示例性纸色谱图以确定单糖组成，其中(f)示出了来自由TFA-HPAEC单糖分析方法的P.capsulatus多糖水解产物的纸色谱图的示例性结果(数据显示于图3e中)，示出单糖组成。各标志物为25μg。溶剂乙酸乙酯：吡啶：水8:2:1染色剂：苯胺氢邻苯二甲酸酯(其中Xyl＝木糖、Fuc＝岩藻糖、Ara＝阿拉伯糖、Man＝甘露糖、Glc＝葡萄糖、Gal＝半乳糖、GalA＝半乳糖醛酸、Rib＝核糖、Rha＝鼠李糖、Samp＝P.capsulatus多糖样品)。在P.capsulatus多糖和多糖衍生物中鉴定的主要单糖支持图3b-e中显示的数据。图3g示出了起因于来自TFA-HPAEC单糖分析方法的P.capsulatus水解产物的纸色谱图(图3e)，示出了单糖组成。各标志物为25μg。溶剂丁醇：乙酸：水12:3:5染色剂：苯胺氢邻苯二甲酸酯(其中Xyl＝木糖、Fuc＝岩藻糖、Ara＝阿拉伯糖、Man＝甘露糖、Glc＝葡萄糖、Gal＝半乳糖、GalA＝半乳糖醛酸、Rib＝核糖、Rha＝鼠李糖、Samp＝P.capsulatus多糖样品)。在P.capsulatus多糖和多糖衍生物中鉴定的主要单糖支持图3b-f中显示的数据。
图4示出了使用沉降平衡的P.capsulatus多糖的示例性分子量估值，其中提供了使用沉降平衡技术的P.capsulatus天然多糖的近似分子量的示例性计算。样品在0.1M NaCl中以0.5mg/ml来运行。在通过沉降平衡分析分子量之前，进行沉降速度实验以评估异质性。用1mm柱子以1400rpm的转速实现数据拟合。P.capsulatus天然多糖计算为具有38.62兆道尔顿的分子量。
图5示出了显示P.capsulatus多糖衍生物在自由基解聚后的纯化的示例性尺寸排阻色谱图。在解聚后使用尺寸排阻色谱纯化(Superdex 30树脂)并脱盐P.capsulatus多糖衍生物。监测214nm处的吸光度(浅蓝)(i)，A280(深蓝(ii))(顶图)和传导性(绿色)(iii)(下图)。从30分钟开始收集的3ml级分，在UV监测器和级分收集器之间具有3ml延迟。在主峰中可见两个宽尺寸范围并且以下被收集：
43-61分钟＝大片段衍生物(20-60kDa),
61-61分钟＝小片段衍生物(2-10kDa),
100分钟以后洗脱的材料(与盐峰共洗脱-绿色(ⅲ))是单糖。
图6示出了P.capsulatus多糖、和多糖的衍生物对人中性粒细胞弹性蛋白酶活性的效应，其中显示了P.capsulatus多糖、和多糖衍生物对人中性粒细胞弹性蛋白酶活性的效应的示例性数据。数据示出了来自数个批次的产品的平均弹性蛋白酶活性±SD，相对于对照的％。用藻类多糖和衍生物的处理导致弹性蛋白酶活性的减少。
图7示出了P.capsulatus多糖、和多糖的衍生物对人中性粒细胞ROS产生的效应，其中显示了P.capsulatus多糖、和多糖衍生物对人中性粒细胞活性氧物质(ROS)产生的效应的示例性数据(所有样品为0.1mg/ml)。数据示出了来自数个批次的产品的平均ROS信号±SD，相对于对照的％。用藻类多糖和衍生物的处理导致ROS的减少。
图8示出了P.capsulatus多糖、和多糖的衍生物对BHK细胞存活力的效应，其中提供了P.capsulatus多糖和多糖衍生物对BHK细胞存活力的效应的示例性数据(所有样品为0.1mg/ml)。数据示出了来自数个批次的产品的平均细胞活性±SD，相对于对照的％。用藻类多糖和衍生物的处理导致观察到对细胞存活力的效应。
图9a和9b示出了在用10ng/ml的IL1β或10ng/ml TNFα刺激原代人角质形成细胞后，P.capsulatus多糖衍生物对IL8释放或IL8基因表达的效应，其中(a)是P.capsulatus多糖和多糖衍生物对来自用10ng/ml的IL1β刺激后的原代人角质形成细胞的IL8释放的效应的示例性数据(所有样品为0.1mg/ml)。数据示出相对于仅IL1β对照的％释放±SD。进行岩藻依聚糖和肝素处理用于比较。用多糖的处理导致了来自角质形成细胞的IL8分泌的减少；(b)P.capsulatus多糖衍生物对用10ng/ml的TNFα刺激后的原代人角质形成细胞表达的IL8基因的效应的示例性数据(所有样品为0.1mg/ml)。数据示出使用仅TNFα对照作为校准，且GAPDH作为看家基因的％相对基因表达±SD。进行岩藻依聚糖处理用于比较。用多糖衍生物的处理导致角质形成细胞的IL8基因表达的减少。
图10示出了P.capsulatus多糖衍生物对原代人角质形成细胞的IL8释放的效应，其中提供了P.capsulatus多糖衍生物(2-10 kDa)对由用10ng/ml的TNFα、20ng/ml IL17A，或两者组合刺激后的原代人角质形成细胞的IL8释放的效应的示例性数据。数据示出了对于以下，以pg/ml计的角质形成细胞的IL8释放：对照孔(无刺激或仅细胞因子)和用小多糖衍生物、岩藻依聚糖，或NF-κB抑制剂SC-514处理的孔。用多糖衍生物的处理导致角质形成细胞的IL8分泌的减少。
图11a和11b示出了P.capsulatus多糖衍生物对原代人角质形成细胞的IL8、IL17C和IL6释放的剂量依赖性效应，其中(a)提供了P.capsulatus多糖衍生物(2-10 kDa)对用10ng/ml TNFa & 50ng/ml IL17A刺激的角质形成细胞的IL8释放的效应的示例性数据。数据指示多糖以剂量依赖性形式抑制IL8的释放。其以相似的剂量比NF-κB抑制剂(SC-514)和MAPK p38抑制剂(SB203580)具有更大的效力。显示了用于比较的低分子量(LMW)肝素；(b)P.capsulatus多糖衍生物(2-10 kDa)对用10ng/ml TNFa & 50ng/mlIL17A & 10μM组胺刺激的角质形成细胞的IL17C & IL6释放的效应的示例性数据。数据指示多糖以剂量依赖性形式抑制IL17C & IL6的释放。显示了用于比较的低分子量(LMW)肝素
图12示出了P.capsulatus多糖衍生物对原代人外周血单核细胞的IFNγ释放的剂量依赖性效应，其中提供了P.capsulatus多糖衍生物(2-10 kDa)对用10μg/ml植物血凝素和10ng/ml IL1β刺激的外周血单核细胞的干扰素γ(IFNγ)释放的效应的示例性数据。数据指示多糖以剂量依赖性形式抑制IFNγ释放。这种效应取决于血细胞培养的时长而变化。显示了用于比较的低分子量(LMW)肝素。
图13示出了P.capsulatus多糖衍生物对原代人中性粒细胞趋化性的效应，其中提供了P.capsulatus多糖衍生物对IL8刺激的中性粒细胞趋化性的效应的示例性数据(所有样品为0.1mg/ml)。相对发光单位±SD指示每个处理中迁移的中性粒细胞的数目(其通过发光信号来可视化)，其中仅IL8是对照。用多糖衍生物的处理导致中性粒细胞趋化性的减少。
图14示出了P.capsulatus多糖衍生物对THP-1(单核细胞)趋化性的剂量依赖性效应，其中提供了P.capsulatus多糖衍生物(2-10 kDa)对MCP-1(单核细胞趋化蛋白)刺激的THP-1(前单核细胞系)趋化性的效应的示例性数据。用多糖的处理导致了THP-1趋化性的剂量依赖性减少。在制品间存在一些变化，用更大片段显示更强的抑制(60％-70％)，尽管这可能是非特异性效应。
图15示出了P.capsulatus多糖衍生物对小鼠皮肤炎症的剂量依赖性效应，其中提供了在IMQ处理并多糖给药9天后，P.capsulatus多糖衍生物(2-10 kDa)对咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠皮肤炎症的效应的示例性数据。炎症由组织学参数，包括表皮和角质形成细胞增殖和白细胞浸润的评分来测量。显示多糖以剂量依赖的方式抑制皮肤炎症。
*表示通过具有Dunnett事后分析的ANOVA的统计显著性。
图16a示出了表征本发明的P.capsulatus多糖及其多糖衍生物的特性的统计表。
图16b示出了基于以下两种不同分析方法计算出的P.capsulatus多糖的硫酸含量：用于硫酸的生物化学板测定(Terho方法)，与用于硫的ICP-OES(随后数字换算为硫酸)相比。检测到的％硫酸在两种方法之间具有良好的一致性，证实多糖的高硫酸含量。
实施例
实施例1-Prasinococcus capsulatus藻株培养物的生长
将P.capsulatus藻株培养物以50或100 mL f/2培养基维持在实验室中，伴随连续光照并在环境(实验室)温度(全年范围18℃–28℃)下。为了建立较大的实验室培养物，将贮备培养物最初接种进250ml或500ml的f/2培养基中并生长至对数生长期。将250ml或500ml培养物接种进10或20升包含116℃高压灭菌30分钟的f/2培养基的具有带PTFE进气孔和排气过滤器的通气孔螺钉的透明的聚碳酸酯广口玻璃瓶。将无机磷酸盐和微量金属各自高压灭菌并分别加入至高压灭菌后的培养基主体中。
可使用不同量的CO2/空气混合物，伴随不同水平的照明和温度。具体地，用空气大力喷射10和20 L培养物，伴随连续照明，使用白色荧光灯管在以下环境(实验室)温度下：全年18℃–28℃度范围。
可选地，可使用许多不同实验性和大规模培养系统以生长P.capsulatus。具体地，使用200升实验性规模微藻类光生物反应器系统(国际专利WO2011/031161 A1；挪威专利320950)，具有f/2生长培养基，用空气和1-2％CO2充气，并在18℃–28℃温度范围连续照明(≤350微摩尔/m2/sec；7-10cm光路)。
实施例2-从培养基中收获多糖。
可通过各种离心分离和过滤技术从培养基中获得多糖。具体地，收获密集的实验室培养物(10-20升)，并转移至4 x 600 ml Heraeus Multifuge3L-R离心机的离心分离罐中。每批次以4500g离心分离2小时。转移培养基(上清液)，同时将藻细胞沉淀在离心罐中。使用Whatman3号过滤器通过真空过滤(以除去剩余的细胞)进一步澄清上清液。
然后使用Pall Centramate以0.1m25 kDa截留分子量(MWCO)的T-系列膜使该上清液经历交叉流过滤。只要在多糖的MW之下，可使用其他MWCO。样品解冻后通过Whatman 3号过滤器再过滤，然后循环通过膜。滞留物再循环，直到浓缩至x10原始体积。然后将其再稀释至原始体积并重复，以确保在渗透物中除去盐和培养基组分。在过程中监测导电性。收集滞留样品并使用Buchi小型喷雾干燥仪B-290喷雾干燥以提供干燥的多糖粉末。使用任何合适技术的进一步MWCO可用于分离靶多糖，但具体地，使用300 kDa MWCO Vivaspin(Sartorius)通过离心分离的分离用于产生高MW级分。
可选地，可使用许多不同实验性和大规模系统从大规模培养物的培养基中收获多糖。具体地，使用碟片式Westphalia离心机以20-60升/小时运行从200升光生物反应器分离培养物。将培养物从微藻光生物反应器直接泵入碟片式离心机，伴随将培养基组分收集在IBC中。
然后将上清液用5微米过滤器(PURTREX PX05-97/8)预过滤，并使用具有GR60P 25kDa MWCO膜的组合系统M38-H-2.25-3(Alfa Laval)进行交叉流过滤。样品浓缩×10，并然后加入3倍体积的水(600升)渗滤(除去盐、培养基组分和低分子量材料)。始终监测电导性，并收集滞留样品。包含滞留物的多糖可使用许多不同大范围干燥系统进一步喷雾干燥。具体地，使用移动小型喷雾干燥系统(GEA Process Engineering)，以200℃的入口温度，和90℃-99℃的出口温度，以2.3-2.7kg/小时雾化，并从旋风分离器和袋式过滤器回收干燥的多糖。
实施例3-从细胞团块中收获多糖。
还可处理由除去培养基得到的细胞团块以产生靶多糖。这可通过热水萃取技术、酶消化或其他各种提取方法来进行。具体地，将细胞转移至50mL无菌管中并以10,000g离心2h。除去剩余的上清液并将细胞冷冻保存用于以后提取和处理。为了处理，可将细胞溶解，并使用标准萃取技术除去产物。具体地，将细胞冻融三次，之后萃取。然后将它们与等体积的Tris-HCl pH 8混合，与酶碱性蛋白酶2.5 L DX(Novozyme)以1体积酶对100体积样品的浓度混合，并在60℃在搅拌下温育过夜。除去样品，以10,000g旋转以沉淀细胞碎片，并除去上清液。该上清液针对水使用8 kDaMWCO使用10体积的水以36小时内4次更换来透析。脱盐的上清液可冷冻或喷雾干燥以产生多糖样品。使用任何合适技术的进一步MWCO可用于分离靶多糖，但具体地，使用300 kDa MWCO Vivaspin(Sartorius)通过离心分离的分离用于产生高MW级分。
实施例4-解聚和低聚糖纯化。
可使用技术，诸如酶消化或酸水解将高分子量靶多糖解聚为更小的片段。具体地，其可通过将过氧化氢引入进热的多糖溶液，以产生攻击糖苷键的自由基来解聚(Rota C等人2005 Free radical generation during chemicaldepolymerization of heparin.Anal Biochem.344(2):193-203.以及Petit AC等人2006 Free-radical depolymerization with metallic catalysts of anexopolysaccharide produced by a bacterium isolated from a deep-seahydrothermal vent polychaete annelid.Carbohydrate Polymers 64:597–602.)。关键变量是过氧化氢与多糖的比值、温度和pH控制。以约2mg/ml将固体多糖样品加入水中，溶解并在水浴中在搅拌下加热到60℃。加入铜盐溶液以得到0.01 M的浓度。使用连接到包含氢氧化钠的泵的pH调节器，将样品设置为pH 7.5。此时反应通过以下来启动：通过恒定的流速，例如0.5ml/min将过氧化氢泵入进容器，当需要时通过旋转打开氢氧化钠泵用pH调节器设置维持pH在7。反应运行期望的周期后，停止泵，并使用20％乙酸降低pH(5μL/ml反应)，将chelex 100(Sigma)以60mg/ml反应加入，并且在旋转搅拌器上混合反应直到澄清。从整个反应除去chelex并贮存于-20℃。通过以下从反应中纯化产物：通过使用Q-琼脂糖(GE)阴离子交换用钠离子交换任何剩余的铜离子，随后通过Superdex 30(GE)使用bench柱和具有A214、A280和导电性检测器的Buchi色谱仪的尺寸排阻色谱脱盐/分离。以50mM Tris-HCl pH7.5、50mM氯化钠流动相平衡Q-琼脂糖柱，随后负载解聚反应，并用流动相均以10ml/min进一步洗涤20-30min。然后将结合的多糖用5M氯化钠溶液洗脱并收集。以水作为流动相将洗脱物以1ml/min在5ml批次中加入至尺寸排阻bench柱Superdex30。分离进行超过120分钟，同时使用法Pharmacia级分收集器收集3ml级分。鉴定、合并、并冷冻干燥不同多糖分子量范围的级分。具体地，通常收集表示2-10kDa和20-60 kDa两个尺寸范围的衍生物，但可收集其他尺寸。将衍生物的贮备溶液注入在尺寸排阻HPLC柱(Biosep4000，YMC Diol300或YMCDiol120)上以确认近似分子量(见下文)。
实施例5-确定近似分子量。
多糖和多糖衍生物分子量使用具有折光率(Waters 2410)和光电二极管阵列(210-380nm)检测(Waters 996)的Waters Alliance HPLC(2695)通过尺寸排阻色谱法来估计。30℃-37℃下以0.2微米过滤的50mM Tris-HCl pH7、1mM EDTA、和0.9％NaCl流动相平衡YMC300-Diol或Biosep4000尺寸排阻柱。使用右旋糖酐标准(Fluka:12、27、50、80、270、670 kDa)校准柱通过注射20微升到流动相中，以0.5或1ml/min(YMC300或Biosep4000)用10或15分钟等度分离运行。使用公式Kav＝(保留时间–V0)/(Vt-V0)并将Kav与分子量绘图生成标准曲线。将样品以20微升的0.1mg/ml溶液注射进流动相并根据标准运行。数据用Millennium Waters软件手动整合，有或没有减去空白基线。将样品的保留时间与标准曲线生成的那些比较，以使用以上公式计算近似分子量。
另外，天然P.capsulatus多糖的分子量可通过沉降平衡技术来估计。具体地，使用配备了扫描吸收光学的Beckman XL-I分析离心机(AUC)用于沉降平衡。将样品在水中以0.5mg/ml重悬于0.1M氯化钠中。进行沉降速度实验，以评估样品确认和异质性，并评估随后沉降平衡所需的参数。沉降平衡以1400rpm的转速和1mm柱来进行。
实施例6-确定近似硫酸含量。
各种方法可用于确定靶多糖和多糖衍生物的硫酸含量。具体地，硫酸确定基于由Terho T & Hartiala K的方法来进行(Method for thedetermination of sulphate content of glycosaminoglycans.AnalyticalBiochemistry(1971)41(2):471-476)。将25μl在水中的1mg/ml样品或对照(软骨素Sigma C4384或肝素Sigma H3393)放置于反应瓶中。加入1MHCl得到终浓度0.5-1M HCl，并将小瓶在100℃下加热2小时。将水解的样品在真空下使用Speed Vac(具有RCT60冷井的Jouan RC10/10)在60℃-65℃旋转蒸发直到干燥(通常1-2小时)。将干燥的水解产物溶于250微升的水中(0.1mg/ml)。
由1mM硫酸制备标准以得到浓度在0.048、0.096、0.192、0.288、0.384、0.432、0.48μg硫酸的测定。将100微升的各样品、标准、对照或空白(仅水)吸取进eppendorf，向其加入400微升乙醇，并完全混合。将125微升该混合物加入96孔测定板的一式三份孔中，将50μl BaCl2缓冲液(均在无水乙醇中新鲜制备的0.2M乙酸、0.1mM氯化钡、1.6mM碳酸氢钠)加入至各孔中，随后75μl玫棕酸钠溶液(在无水乙醇中新鲜制备的0.05mg/ml、1mg/ml L-维生素C)。板以中等速度振摇30秒，避光温育10分钟，并再次振摇。着色强度在吸光度酶标仪(BioTek Power Wave HT)中使用Gen5软件在520nm处来测量。吸光率通过将各样品、标准或对照的平均吸光率减去空白的平均吸光率来计算。标准曲线通过测绘针对各硫酸标准的硫酸浓度的空白吸光率而生成，且样品和对照的硫酸含量是内插得到的。以稀释度和体积校正该值以得到％硫酸＝((平均ΔA520X40)/50)X100。
还通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)进行硫酸确定。将10mg多糖重悬于1ml水中，并然后在硝酸：盐酸(王水)中萃取。样品雾化并将产生的气溶胶运送到发生激发的等离子体炬。通过射频电感耦合等离子体产生硫的特性原子线谱。谱由光栅分光光度计分散且线条的强度由光电倍增管进行监测。处理来自光电倍增管的光电流，且硫含量基于硫标准计算(多点校准)并由数学公式转换为硫酸值。
实施例7-确定单糖组成。
单糖组成可使用许多不同的方法来确定。具体地，单糖组成通过甲醇分解和三甲基硅烷(TMS)衍生化，随后使用具有火焰离子化检测(GC-FID)的Shimadzu GC-2014组成分析来确定。反应小瓶在熔炉中450℃下高温清洗6小时。将100微克样品(作为10mg/ml溶液)转移至小瓶并将5nmol鲨肌醇内标加入至各样品。包含5nmol各单糖标准的小瓶还装配为包含鲨肌醇(I8132 Sigma)、阿拉伯糖(A3131 Sigma)木糖(X-1500 Sigma)、甘露糖(M6020 Sigma)、岩藻糖(F2252 Sigma)、鼠李糖(R3875 Sigma)、半乳糖(G0750 Sigma)、葡萄糖、葡萄糖胺(G4875)、半乳糖胺(G0500)、葡糖醛酸(G5269)、半乳糖醛酸(48280 Fluka)、唾液酸(均制备为100mM贮备溶液)。将全部小瓶在真空下在Speed Vac(具有RCT60冷井的Jouan RC10/10)中60℃-65℃下干燥直到干燥(通常1-2小时)。加入40微升纯的甲醇，如上将样品再次干燥，并然后重悬于100微升0.5M甲醇HCl中。将小瓶在加热块(heat bloc)中85℃下加热4小时。冷却后，加入20微升纯的吡啶以中和HCl，并且然后加入20微升纯乙酸酐，以重新-N-乙酰化任何游离的伯胺(在室温下30分钟)。然后将小瓶再次干燥(如上speed vac)，加入40微升纯的甲醇溶液进行洗涤，将小瓶重新干燥(如上speed vac 10-30分钟)。然后加入40微升纯的TMS试剂并充分混合，以悬浮样品。将小瓶密封并放置至少10分钟，然后注射1微升在具有火焰离子化检测的ShimadzuGC-2014上(300℃不分流进样)。柱为ZB5-ms30 m x 0.25mm，内径(i.d.)x0.25μm膜厚度。分析生成的色谱图。手动调整各样品的截留面积，直到确定20-30个峰。峰面积和保留时间与单糖标准有关。
各峰计算为：
比值＝峰面积/内标峰面积；
标准比值＝标准面积/各标准的内标面积；
纳摩尔＝(5纳摩尔/标准比值)×样品比值；
存在于原始样品中的各单糖的％＝纳摩尔/总纳摩尔×100。
P.capsulatus多糖的单糖组成还通过三氟乙酸(TFA)水解随后高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)来确定。将P.capsulatus多糖及衍生物的样品以约10mg/ml重悬于2M TFA中。将其在加热器中120℃下温育1小时，30分钟后伴随剧烈摇动。然后将其离心，并回收上清液。将沉淀用0.5ml水洗涤，重新离心并将该洗涤液与原始上清液汇合。将回收的溶液在真空下干燥以除去TFA并且将干燥的剩余物重悬于1ml水中。将1/10样品的稀释物连同标准单糖、二糖和糖醛酸的稀释系列一起注射在Dionex PA1柱上。(该混合物中包含岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、纤维二糖、麦芽糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸)。样品经梯度分离，并用PAD分辨。回收的单糖通过与标准比较来计算。
还将10微升的TFA水解产物(标称的100-160微克多糖)装载在2张Whatman 20号纸上。单糖标准混合物-核糖、鼠李糖、木糖、岩藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸-也被加载。纸色谱法通过一片纸在丁醇/乙酸/水12:3:5流动相中运行30小时，并且其他在乙酸乙酯/吡啶/水8:2:1流动相中运行3天而通过电荷分离来进行。用苯胺氢邻苯二甲酸酯染色纸片以可视化单糖。
实施例8-确定细胞毒性。
各种不同的基于细胞的筛选测定法可用于确定靶物质的细胞毒性。具体地，细胞毒性通过测量多糖和多糖衍生物对BHK细胞系(仓鼠肾成纤维细胞ECACC 85011433)的代谢活性的效应来检查。收获90％融合的BHK细胞，并以1x104个细胞/孔在100微升新鲜制备的培养基(格拉斯哥极限必需培养基(GMEM)，10％胎牛血清、5％胰蛋白磷酸盐肉汤，2mM L-谷氨酰胺)中铺板于96孔白色微量培养板中。将其37℃、5％CO2下放置1小时以允许>80％附着至孔。将11微升Hanks平衡盐溶液(HBSS)中的1mg/ml多糖样品、仅HBSS对照、岩藻依聚糖(HBSS中1mg/ml)对照、和多柔比星(HBSS中10微克/ml、1微克/ml)对照加入至一式三份孔中并将板在37℃5％CO2下温育16-18小时。允许板室温复苏30分钟，然后加入100微升细胞滴度辉光试剂(Promega)。将板在板振荡器上混合2分钟并然后室温下温育10分钟。所得的各孔的发光使用Gen5软件在酶标仪(BioTek,Synergy 3)上来测量。计算各样品或对照的平均发光。指定HBSS对照孔为100％代谢活性，且针对其计算样品发光值％活性＝(测试孔/对照孔)*100。岩藻依聚糖和多柔比星对照应在既定的值之内。
实施例9-对中性粒细胞弹性蛋白酶活性的效应
用于测量多糖对中性粒细胞弹性蛋白酶的酶活性的效应的不同的方案是可能的。具体地，弹性蛋白酶活性通过将多糖与刺激的新鲜分离的人中性粒细胞温育，随后释放的酶与标记的底物反应，并在酶标仪上比色测定来测量。将新鲜分离的人中性粒细胞重悬于HBSS(无Ca和Mg)并在血细胞计数器计数细胞。将细胞离心并重悬于HBSS中，得到2.5×106个细胞/ml的浓度。将22微升的样品、对照或HBSS加入至微管中，然后是：25微升细胞松弛素B(HBSS中以40mg/ml以得到终浓度5mg/ml)；25微升TNFα(HBSS中以80ng/ml以得到终浓度10ng/ml，以及对于未刺激的对照，使用25微升HBSS代替TNFα)；150微升中性粒细胞悬液(或对于仅培养基对照组加入150微升HBSS代替细胞)。轻轻地混合内容物，并将管在37℃下温育30分钟。温育后，将25微升fMLP(HBSS中以1微克/ml以得到100ng/ml的终浓度)，或HBSS加入至未刺激的对照组中。管在37℃下温育另外45分钟。在Heraeus Biofuge上以5000rpm离心管5分钟以沉淀细胞，并将25微升上清液转移至96孔黑色微量板的一式三份孔中。将150微升Tris HCl pH 7.5和20微升中性粒细胞弹性蛋白酶底物1(在Tris-HCl pH 7.5中0.5 mg/ml)加入至各孔，除了不包含底物的空白孔。该板转移至预热的(37℃)酶标仪(BioTek Powerwave HT)并使用Gen5软件每5分钟在405nm处采集读数持续1小时。在10分钟和1小时之间的4个数据点上计算Vmax。计算各样品、对照或空白的均值Vmax。指定对照孔(用底物刺激细胞，但无测试样品)Vmax为100％，并且针对其计算样品和对照以生成％弹性蛋白酶活性：％活性＝(测试孔Vmax/对照孔Vmax)*100。
实施例10-对角质形成细胞细胞因子释放和基因表达的效应。
多糖和多糖衍生物对角质形成细胞的效应可使用各种不同培养基中的许多不同细胞系或原代细胞在有或没有促炎性刺激物下来评估。所得到的细胞因子释放可通过不同的方法诸如多重阵列或ELISA来评估。具体地，原代角质形成细胞(Promocell C12003)在具有钙和补充剂的完全角质形成细胞生长培养基(Promocell C20011)中37℃、5％CO2下生长直到70％-90％融合。其通过胰酶消化收获、洗涤并以30,000个细胞/孔播种于24孔板组织培养板的孔中。细胞生长直到～80％-90％融合(～56小时)，并且然后将培养基更换为具有0.5mM钙的基础培养基(Promocell C20211)，持续另外16-18小时。然后将样品(HBSS中1mg/ml)、对照(HBSS中岩藻依聚糖1mg/ml)或空白(仅HBSS媒介物)加入至孔中(X10稀释)6-8小时，然后加入促炎性刺激物，或在SC514和SB203580(分别为NfkB和MAPK p38抑制剂)的情况下1-2小时。促炎性刺激物为10ng/ml TNFα或10ng/ml IL1β或20ng/ml IL17A、或10ng/ml TNFα和20ng ml IL17两者的组合。其他刺激物为10ng/mL TNFα和50mg/ml IL17A组合，或10ng/ml TNFα、50mg/ml IL17A和10μM组胺组合。将细胞再温育16-18小时，在此点，收集上清液并储存于-80℃。在收集上清时用PBS代替上清以洗涤细胞，并然后将此代替为350微升RNAeasy裂解缓冲液(Qiagen)。将缓冲液、溶解的细胞和细胞内含物转移至管中存储于-80℃下。
收集的上清液通过ELISA分析人IL8、IL6或IL17C内含物(Peprotech用于IL8和IL6；R和D系统用于IL17C)。在酶标仪上在A450-630nm处读取测定(BioTek PowerWave HT，使用Gen5软件)，并且定量通过读取标准曲线来做出。将未刺激的对照中细胞因子的浓度从测试孔和刺激的对照孔中的浓度中减去。刺激的对照孔被指定为IL8的100％分泌，并且样品针对其来计算％分泌＝(校正的测试孔pg/ml/校正的对照孔pg/ml)*100。
使用Qiagen RNAeasy Plus试剂盒从细胞溶解产物中提取RNA。在分光光度计上定量得到的RNA以检查浓度范围。cDNA通过使用QiagenQuantitect逆转录试剂盒(RNA的起始体积为4微升)，同时通过酶消化除去基因组DNA，然后逆转录(RT)步骤来生成。将cDNA加入至包含IL8(Qiagen)或作为管家基因的GAPDH(Qiagen)的引物的PCR反应(1或2微升)，和Qiagen QuantiFast SYBR PCR预混液(25微升反应体积)中。使用标准设置(60℃退火并延伸，40个循环)在Mx3005P实时PCR仪(Stratagene)上进行PCR。使用MxPro软件获得测试和对照样品的循环阈值(Ct)值。通过比较靶基因和管家基因评估靶基因的相对表达(通过ΔΔCT法具有可比的表达，且靶基因和管家基因PCR显示可比较的扩增效率)，并用刺激的对照孔cDNA指定为校准样品(100％基因表达)。
实施例11-对由刺激的人外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子释放的效应。
物质对来自PBMC的细胞因子的释放的效应可使用许多不同细胞格式、刺激物和持续时间来测量。具体地，P.capsulatus多糖衍生物的效应通过与分离的PBMC的温育来测量。PBMC通过histopaque(Sigma)梯度离心从新鲜血液中来分离，在修饰的HBSS培养基(PAA)中洗涤，并重悬于完全RPMI 1640培养基(PAA)中。将200,000个PBMC连同仅对照的培养基一起加入至96 v-孔聚丙烯板中。所选浓度下的多糖，连同对照SC514和SB203580(分别为NfkB和MAPK p38抑制剂)一起加入至细胞并37℃、5％CO2下温育1小时。将植物血凝素(PHA)(10微克/ml)和IL1β(10ng/ml)加入至各孔中，除了未刺激的对照，并且板在37℃、5％CO2下温育2或3天。为了收集培养基，以1000rpm离心板并将上清液转移至另外的板以存储于-80℃中，然后分析细胞因子。通过ELISA(Peprotech)分析收集的上清液中干扰素γ(IFNγ)含量。在酶标仪上在450-630nm处读取测定(BioTekPowerWave HT，使用Gen5软件)，并且定量通过读取标准曲线来进行。将未刺激的对照中细胞因子的浓度从测试孔和刺激的对照孔中的浓度中减去。刺激的对照孔被指定为IFNγ的100％分泌，并且针对该对照来计算样品＝(校正的测试孔pg/ml/校正的对照孔pg/ml)*100。
实施例12-对来自中性粒细胞氧化爆发的效应。
存在使用不同细胞、刺激物和物质测量由免疫细胞产生的活性氧物质的许多方案。具体地，多糖和多糖衍生物对氧化爆发的抑制使用以试剂DCFH-DA染色的人中性粒细胞来测量。将新鲜分离的人中性粒细胞重悬于HBSS(无Ca和Mg)并在血细胞计数器计数细胞。将细胞以1x106重悬于HBSS中，与等体积的HBSS中的40μM DCFH-DA混合，并在37℃、5％CO2下温育30分钟。除了空白(仅HBSS)和未染色的细胞对照的一式三份孔之外，将100微升染色的细胞加入至黑色96孔微量板的各孔中。将20微升的1mg/ml的样品、HBSS或对照(在HBSS中1μM浓度的二苯基氯化碘盐(DPI))加入至包含染色的细胞的一式三份孔中。除了未刺激的对照孔，通过加入50微升PMA(在HBSS中4nM)刺激细胞产生ROS。ROS氧化DCFH-DA产生的荧光通过在荧光板读器(Biotek Synergy 3)上在37℃下485/528nm处每10分钟动力学阅读持续2.5小时来测量。计算并消隐平均荧光。PMA刺激的细胞的平均荧光数据被指定为100％应答并且针对其计算样品和对照：％氧化爆发＝(样品荧光/PMA刺激的细胞荧光)*100。
实施例13-对血细胞趋化性的效应
使用不同类型的免疫细胞，用不同的趋化性试剂进行趋化性测定。具体地，测量了多糖和多糖衍生物对中性粒细胞的趋化性的效应。使用Histopaque从新鲜血液中分离人中性粒细胞。90微升在包含BSA 0.1％、25mM HEPES(Sigma)的HBSS中2.5x106/ml的新鲜分离的中性粒细胞，在聚丙烯96孔板(Greiner)的各孔中与10微升的测试化合物(在选定的浓度例如2-50μM)或媒介物对照混合，并预温育30分钟。当预温育细胞和测试化合物时，制备趋化性96孔板(3微米筛目)(Corning)的下室(lowerchamber)。IL8(Sigma)在包含BSA 0.1％、25mM HEPES的HBSS中以所需剂量(例如0.37ng/ml至10ng/ml终浓度)制成。每下测定室加入235微升。对于阴性对照，使用235微升的HBSS(具有Ca/Mg、BSA 0.1％、25mM HEPES)代替IL8。然后将下测定室在37℃CO25％下温育30-60分钟以预平衡培养基。然后将上孔转移至下孔，并且将来自聚丙烯预温育的各孔的75微升中性粒细胞加入至趋化性板的上室中的孔。整个板在37℃CO25％下温育30分钟。
从培养箱中取出测定板。丢弃上孔内含物，并将上孔转移至室温下包含Accutase酶(Sigma)180微升/孔的96孔板中。室温下将板放置在板振荡器上5分钟。丢弃上室，并根据制造商说明书使用细胞滴度辉光试剂(Promega)测量存在于白板中的细胞数目(还参见实施例8)。将100微升细胞滴度辉光试剂加入包含网状细胞和Accutase的96孔发光板的各孔中，并且RT下在板振荡器上混合2min，然后RT下温育10min。使用Gen 5软件在Synergy 2酶标仪上测量发光信号。针对培养基加仅细胞的对照消隐数据，并且％迁移通过与仅IL8趋化性100％对照相比来计算。
此外，还使用THP-1人原单核细胞系(HPA 88081201)评估了P.capsulatus多糖衍生物对单核细胞的趋化性的效应。在选择浓度下的多糖衍生物(一式三份孔)与具有25mM HEPES、2mM谷氨酰胺和0.1％BSA(Sigma)的RPMI 1640培养基(PAA)中的2x106/ml THP-1细胞在96 v-孔聚丙烯(PP)板(Greiner)中混合。还以一式三份设置了仅细胞的对照。细胞和多糖在37℃5％CO2下温育30分钟。将235微升相同培养基中的10ng/ml的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)(Peprotech)加入至96孔5微米网状趋化性板(Corning)的下室，使用测定培养基作为阴性对照。将上板修整，并将板在37℃5％CO2下温育30分钟以预平衡培养基。测定通过从PP板将75微升THP-1细胞(～150,000个细胞)和测试样品转移进包含MCP-1的趋化性板的上室来进行。小心采集以确保细胞完全悬浮并混合良好，然后转移。板在37℃5％CO2下温育120分钟。趋化性通过以下来测量：从上室中除去培养基，将膜转移至包含180微升的Accutase酶(Sigma)的板中，震摇5分钟并丢弃膜。将100微升细胞滴度辉光试剂(Promega–如对于中性粒细胞趋化性)加入至测定板的下孔并加入至包含Accutase的板中。将其震摇2分钟，温育10分钟，并然后将200微升的孔内含物转移至白色96-孔板中并使用Gen5软件在Synergy 2酶标仪(Biotek)上测量发光。使用仅培养基和细胞的对照消隐数据，将来自下室和accutase样品的值进行汇合，并且％趋化性通过与仅细胞MCP-1对照孔(100％趋化性)比较来计算。
实施例14-对咪喹莫特(IMQ)处理的BALB/c小鼠中皮肤炎症的效应。
存在使用不同类型的小鼠、基因诱导物和外部刺激评估测试物质对小鼠模型中皮肤炎症的效应的许多方案。具体地，P.capsulatus多糖衍生物对皮肤炎症的效应使用IMQ-诱导的BALB/c小鼠模型来评估。测试组包括幼稚加媒介物组、仅IMQ组、IMQ加媒介物组、3种不同浓度(1％、0.1％、0.01％)的多糖加媒介物组、以及环磷酰胺对照(在0.5％CMC中10mg/kg)，具有8只小鼠/组。将多糖溶解于包含聚丙烯酸钠盐、甘油、对羟基苯甲酸酯和咪唑烷基脲的含水凝胶(＝媒介物)中。将500微升的测试凝胶每日应用至剃背小鼠，4小时后应用50mg的IMQ乳霜(5％)。凡士林用于幼稚小鼠测试组的情况下，并且每天一次口服给药环磷酰胺。每天进行皮肤外观(脱屑(scaling)、折叠、红斑)观察，以提供疾病活动指数。给药重复进行4天，之后对来自每组的4只小鼠进行采样，并且然后直到实验第9天时对所有剩余小鼠进行取样。来自所有小鼠的皮肤样品固定在福尔马林中，包埋、切片、并用苏木精和曙红染色。对切片进行以下评分：上皮细胞增生、角质形成细胞增殖(角化过度)、白细胞浸润和增加血管形成。将评分针对测试试剂绘图以确定与IMQ加媒介物对照相比的多糖处理的效应。
尽管已关于特定实施例具体显示并描述本发明，但本领域技术人员应当理解，可做出形式和细节上的各种变化而不偏离本发明的范围。

Claims (23)

1.一种形成凝胶的多糖，所述形成凝胶的多糖是从Prasinococcales目的微藻细胞可获得的，其中所述形成凝胶的多糖是包含葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和糖醛酸单元的至少670 kDa的分子量的硫酸化杂聚合物，用于在免疫系统紊乱的治疗中使用。
2.如权利要求1所述的形成凝胶的多糖，其中所述多糖由以下方法产生：
任选地，培养来自Prasinococcales目下的科的微藻细胞以及
从所述微藻细胞培养基中提取由所述微藻细胞分泌的微藻多糖。
3.如权利要求1或权利要求2所述的形成凝胶的多糖，用于在选自以下的免疫系统紊乱的治疗中使用：炎性皮肤状况，包括湿疹、银屑病和特应性皮炎，肠的炎性状况，包括肠易激综合征、克罗恩病和溃疡性结肠炎，或呼吸道的炎性状况，包括哮喘、囊性纤维化病、肺气肿、慢性阻塞性肺紊乱、急性呼吸窘迫综合症、或过敏性鼻炎。
4.如任一项前述权利要求中所述的形成凝胶的多糖，其中所述多糖是从Prasinoderma singularis或Prasinococcus capsulatus可获得的。
5.如任一项前述权利要求中所述的形成凝胶的多糖，所述形成凝胶的多糖包含按重量计约
20％至30％葡萄糖
30％至60％半乳糖
4％至19％阿拉伯糖
2％至6％糖醛酸和1％至10％的其他糖单元。
6.如权利要求5所述的形成凝胶的多糖，其中所述其他糖单元包含
鼠李糖
木糖和
甘露糖。
7.如任一项前述权利要求中所述的形成凝胶的多糖，其中所述多糖具有按重量计约17％至35％的硫酸含量。
8.如任一项前述权利要求中所述的形成凝胶的多糖，其中所述多糖具有按重量计约20％的硫酸含量。
9.如任一项前述权利要求中所述的形成凝胶的多糖，其中相对于未被提供多糖的中性粒细胞，所述多糖抑制中性粒细胞中的中性粒细胞弹性蛋白酶活性的约60％至90％。
10.一种营养补充剂，所述营养补充剂包含权利要求1至9的任一项的多糖。
11.一种美容制品，所述美容制品包含如权利要求1至9的任一项中所述的多糖，优选地其中所述美容制品包含基础载体或皮肤保湿物质。
12.一种如权利要求1至9的任一项中所述的形成凝胶的多糖的衍生物，其中所述衍生物具有约2 kDa至60 kDa的范围内的分子量。
13.如权利要求12中所述的衍生物，其中所述衍生物具有范围2 kDa至10 kDa内的分子量。
14.如权利要求13中所述的衍生物，其中所述衍生物包含按重量计约
30％至40％葡萄糖
30％至40％半乳糖
8％至14％阿拉伯糖
7％至11％糖醛酸
和1％至10％的其他糖单元。
15.如权利要求12中所述的衍生物，其中所述衍生物具有范围20 kDa至60 kDa内的分子量。
16.如权利要求15中所述的衍生物，其中所述衍生物包含按重量计约
25％至28％葡萄糖
35％至55％半乳糖
8％至17％阿拉伯糖
4％-6％糖醛酸
和1％至5％的其他糖单元。
17.如权利要求12至16的任一项所述的衍生物，其中所述衍生物抑制中性粒细胞弹性蛋白酶释放的约70％至90％。
18.如权利要求12至17的任一项所述的衍生物，其中相对于未被提供衍生物的中性粒细胞，所述衍生物抑制中性粒细胞活性氧物质产生的约30％-40％。
19.如权利要求12至18的任一项所述的衍生物，其中相对于未被提供衍生物的角质形成细胞，所述衍生物抑制人角质形成细胞IL-8基因表达和IL8释放的约70％-100％。
20.一种美容制品，所述美容制品包含如权利要求12至19的任一项所述的衍生物。
21.一种营养补充剂，所述营养补充剂包含如权利要求12至19的任一项所述的衍生物。
22.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至9的任一项所述的多糖或如权利要求12至19的任一项所述的衍生物。
23.一种制备如权利要求1至9的任一项所述的多糖或如权利要求12至19的任一项所述的衍生物的方法，所述方法包括以下所述步骤：
-培养来自Prasinococcales目的微藻细胞，特别是Prasinodermasingularis，或P.capsulatus细胞，以及
-从培养物的细胞级分或分泌级分分离所述多糖或其衍生物。
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