CN116284490A - 一种野桑蚕蛹多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种野桑蚕蛹多糖及其制备方法和应用。该多糖由野桑蚕蛹粉末提取得到，其为由α‑D‑葡萄糖组成的同多糖，包含1,4‑连接的、1,4,6‑连接的和1‑连接的α‑D‑葡萄糖残基，上述糖残基的摩尔比为4:1:1。该野桑蚕蛹多糖具有显著的免疫调节活性，可用于制备药物，也可用于制备增强免疫的保健品和食品，具有较佳的应用前景和商业价值，还可提高蚕蛹的利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及动物多糖应用技术领域，具体地说，涉及一种野桑蚕蛹多糖及其制备方法和应用。
背景技术
多糖是由10个以上单糖通过糖苷键聚合而成的天然高分子物质，广泛存在于植物、动物、微生物，其中动物多糖的研究较少。多糖不但是构成生命的四大基本物质之一，而且具有显著的生物活性，包括免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等活性。因其明显的治疗效果和几乎无毒副作用，在生物医学领域受到越来越多的关注。
野桑蚕(Bombyx mandarina M.)隶属节肢动物门、昆虫纲、鳞翅目、蚕蛾科、蚕蛾属。蚕蛹为蚕蛾科昆虫蚕的蛹，是蚕业主要副产物，也是药膳同源传统中药材，具有很高的营养和药用价值。《本草纲目》等古代医药著作中记载，蚕蛹具有生津止渴、补气养血、消食理气、祛风湿等功效，可治疗小儿疳瘦、蛔虫病、多种心血管疾病、慢性肝炎等疾病。现代研究表明，蚕蛹含有丰富的生物活性化合物，包括蛋白质、油脂、多糖、甲壳素、维生素等。
目前，对于野桑蚕蛹多糖的精细结构及其免疫活性的研究及应用尚未见任何报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种野桑蚕蛹多糖及其制备方法和应用。
其具体技术方案为：
本发明提供了一种野桑蚕蛹多糖，其为由α-D-葡萄糖组成的同多糖。
进一步地，所述的野桑蚕蛹多糖的重均分子量为200000-300000Da(如200000、205000、210000、215000、220000、225000、230000、234100、235000、240000、245000、250000、255000、260000、265000、270000、275000、280000、285000、290000、295000、300000Da)；在本发明的一个实施例中，所述的野桑蚕蛹多糖的重均分子量为234100Da。
进一步地，所述的野桑蚕蛹多糖的化学结构中包含1,4-连接的、1,4,6-连接的和1-连接的α-D-葡萄糖残基，其摩尔比为4:1:1。
进一步地，所述的野桑蚕蛹多糖的化学结构中，主链包含1,4-α-D-葡萄糖残基和1,4,6-α-D-葡萄糖残基，支链包含1-α-D-葡萄糖残基。
进一步地，所述的野桑蚕蛹多糖包含如下结构：
其中，n为205-308的整数(如205、208、210、212、215、218、220、222、225、228、230、232、235、238、240、242、245、248、250、252、255、258、260、262、265、268、270、272、275、278、280、282、285、288、290、292、295、298、300、302、305、308)。
本发明还提供了一种野桑蚕蛹多糖的制备方法，其包括对野桑蚕蛹进行提取的步骤。
进一步地，所述的制备方法包括通过水提醇沉法提取得到粗多糖的步骤。
进一步地，所述的制备方法还包括(如通过离子交换柱层析)对粗多糖进行纯化的步骤。
在本发明的一个实施例中，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)取野桑蚕蛹粉末，用石油醚浸提脱脂，得到脱脂野桑蚕蛹粉末；
(2)将步骤(1)所得的脱脂野桑蚕蛹粉末用水浸提，将所得水提物依次经浓缩、醇沉、除蛋白得到粗多糖；
(3)将步骤(2)所得的粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液；
(4)将步骤(3)所得的洗脱液用透析袋进行透析浓缩。
任选地，(5)将步骤(4)完成后的透析袋内液体冷冻干燥。
进一步地，步骤(1)中，野桑蚕蛹粉末与石油醚的料液比为1:1-10(如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10)；在本发明的一个实施例中，该料液比为1:4。
进一步地，步骤(1)中，浸提温度为石油醚的沸点，即30-120℃(如30、40、50、60、70、80、90、100、110、120℃)。
进一步地，步骤(1)中，浸提次数为1-5次(如1、2、3、4、5次)；在本发明的一个实施例中，浸提次数为3次。
进一步地，步骤(1)中，每次浸提时间为1-10小时(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时)；在本发明的一个实施例中，每次浸提时间为5小时。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)包括：取野桑蚕蛹粉末，加入石油醚，沸点温度下浸提，收集沉淀，得到脱脂野桑蚕蛹粉末。
进一步地，步骤(2)中，脱脂野桑蚕蛹粉末与水的料液比为1:1-10(如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10)；在本发明的一个实施例中，该料液比为1:3。
进一步地，步骤(2)中，浸提温度为85-100℃(如85、80、95、100℃)；在本发明的一个实施例中，浸提温度为97℃。
进一步地，步骤(2)中，浸提次数为1-5次(如1、2、3、4、5次)；在本发明的一个实施例中，浸提次数为3次。
进一步地，步骤(2)中，每次浸提时间为1-10小时(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时)；在本发明的一个实施例中，每次浸提时间为6小时。
进一步地，步骤(2)中，醇沉步骤中，水提物浓缩液与醇的体积比为1:1-10(如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10)；在本发明的一个实施例中，该体积比为1:4。
进一步地，步骤(2)中，醇沉步骤中，醇为乙醇。
进一步地，步骤(2)中，除蛋白采用Sevage法。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)包括：将步骤(1)所得的脱脂野桑蚕蛹粉末，热水浸提，收集上清液，浓缩，加入无水乙醇，收集沉淀，烘干，除去其中的蛋白质，得到粗多糖。
进一步地，步骤(3)中，离子交换柱为纤维素柱，该纤维素柱的填料为DEAE-纤维素。
进一步地，步骤(3)中，洗脱所用洗脱剂为蒸馏水。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)包括：将步骤(2)所得的粗多糖的水溶液依次经过纤维素柱，收集洗脱液，浓缩。
进一步地，步骤(4)中，透析袋的截留分子量为5000-10000Da(如5000、6000、7000、8000、9000、10000Da)；在本发明的一个实施例中，该截留分子量为7000Da。
在本发明的一个实施例中，步骤(4)包括：将步骤(3)所得洗脱液置于透析袋中进行透析，持续3天，透析两天。
本发明还提供一种上述方法制备得到的粗多糖。
本发明还提供一种上述野桑蚕蛹多糖在制备预防和/或治疗败血症、脚气病、过敏性疾病、胃肠功能紊乱、高血脂症、高血压、糖尿病、癌症的药物中的应用。
本发明还提供一种上述野桑蚕蛹多糖在制备增强免疫的保健品和食品中的应用。
上述应用中，上述多糖可单独使用，也可与其他活性成分联合使用。
本发明的发明人自野桑蚕蛹分离纯化得到野桑蚕蛹多糖，并对其分子量、单糖组成、化学结构等进行了结构分析鉴定，确定了其重均分子量和结构组成。细胞实验表明，该多糖具有显著的免疫调节活性。尤其是在2.5μg/mL浓度时，T细胞的增殖率最高；在5μg/mL浓度时，B细胞和RAW264.7细胞增殖率最高。基于此，该多糖可用于制备增强免疫的药物、保健品和食品，具有较佳的应用前景和商业价值，还可提供蚕蛹的利用价值。
附图说明
图1所示为野桑蚕蛹多糖的红外图谱。
图2所示为野桑蚕蛹多糖的HPLC图谱。
图3所示为野桑蚕蛹多糖的化学结构。
图4所示为野桑蚕蛹多糖的1H NMR图谱。
图5所示为野桑蚕蛹多糖的13C NMR图谱。
图6所示为野桑蚕蛹多糖的1H-1H COSY图谱。
图7所示为野桑蚕蛹多糖的HMQC图谱。
图8所示为野桑蚕蛹多糖的HMBC图谱。
图9A所示为野桑蚕蛹多糖对T细胞增殖的影响的实验结果。
图9B所示为T细胞的形态图(A：空白组，B：LPS组，C：1.25μg/mL BMM-S，D：2.5μg/mLBMM-S，E：5μg/mL BMM-S)。
图10A所示为野桑蚕蛹多糖对B细胞增殖的影响的实验结果。
图10B所示为B细胞的形态图(A：空白组，B：LPS组，C：1.25μg/mL BMM-S，D：2.5μg/mL BMM-S，E：5μg/mL BMM-S)。
图11A所示为野桑蚕蛹多糖对巨噬细胞增殖的影响的实验结果。
图11B所示为巨噬细胞的形态图(A：空白组，B：LPS组，C：1.25μg/mL BMM-S，D：2.5μg/mL BMM-S，E：5μg/mL BMM-S)。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
在本发明中，“野桑蚕(Bombyx mandarina M.)”指的是节肢动物门、昆虫纲、鳞翅目、蚕蛾科、蚕蛾属的一种野生昆虫，其包含卵、幼虫、蛹和成虫。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1野桑蚕蛹多糖BMM-S的提取与分离纯化
1.1水提醇沉法提取野桑蚕蛹粗多糖
称取200g干燥的野桑蚕蛹(由四川省农业科学院蚕业研究所提供)，粉碎，将野桑蚕蛹粉末与石油醚按1:4的料液比置于烧杯中，沸点温度(沸点60-90℃)下恒温水浴5h，收集滤渣，重复3次。将脱脂野桑蚕蛹粉末与蒸馏水按1:3的料液比置于烧杯中，97℃水浴6h，收集上清液离心后浓缩，重复3次，最终将全部的上清液浓缩至200mL。按1:4加入无水乙醇，静置使其沉淀，收集沉淀并烘至干燥，除去沉淀中的蛋白质，从而获得野桑蚕蛹粗多糖。
1.2DEAE-纤维素柱层析法分离纯化野桑蚕蛹粗多糖
精确称取50g DEAE-52纤维素，并将其溶解在超纯水中，充分搅拌，若纤维素不成块状且无明显颗粒则停止搅拌。静置过夜，将上清液弃去，放置待用。配置0.5mol/L NaOH浸泡纤维素，6h后，弃上清液，用超纯水洗涤至中性。弃上清，加0.5mol/L HCl浸泡纤维素，6h后，弃上清液，超纯水洗涤至中性。再弃上清，加入0.5mol/L NaOH再次浸泡纤维素6h，用超纯水洗涤至中性，得到活化的DEAE-52纤维素，静置备用。
将活化的DEAE-52纤维素装柱，以蒸馏水为流动相压柱平衡3h后即可对粗多糖进行分离纯化。将稀释后的粗多糖离心后取上清液(6mL)均匀加进活化的DEAE纤维素柱中，以蒸馏水为流动相。采用苯酚-硫酸法对多糖进行测定。收集洗脱液，将洗脱液浓缩至5mL。使用透析袋(Mw≥7000Da)进行透析，持续48h，离心后收集上清液冷冻干燥，得到野桑蚕蛹多糖，命名为BMM-S。
实施例2野桑蚕蛹多糖BMM-S的结构鉴定
2.1分子量的测定
精确称取10mg野桑蚕蛹多糖BMM-S样品(实施例1所得，下同)，加1mL ddH2O溶解，超声处理5min，进行凝胶渗透色谱分析。
2.2红外谱分析
精确称取5mg野桑蚕蛹多糖BMM-S样品，与KBr进行混匀、研磨、压片，傅里叶红外光谱仪(FT-IR)中在4000cm-1-400cm-1范围内扫描。
2.3单糖组成成分分析
将单糖标准品(葡萄糖、甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯塔、岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸)和通过TFA酸水解后的10mg野桑蚕蛹多糖BMM-S样品，以KH2PO4和乙腈作为流动相进行高效液相色谱(HPLC)分析。
2.4核磁共振分析
精确称取50mg野桑蚕蛹多糖BMM-S样品，溶于0.5mL重水(D2O)中，离心，上清液装入核磁管中，在核磁共振仪(NMR)上检测。
2.5甲基化分析
精确称取20mg野桑蚕蛹多糖BMM-S样品，加500μL DMSO(二甲基亚砜)，混匀后加10mg的NaOH，至不溶解为止。超声20min，加0.1mL CH3I(碘甲烷)，超声30min，超声期间控制超声水浴温度为18℃-20℃。加水终止反应。用氯仿萃取产物，萃取4次，合并氯仿相，干燥后得甲基化多糖。甲基化多糖经TFA完全酸水解后，加入0.1mL甲醇，干燥后加入0.5mL NaBD4，室温反应2h，加入乙酸中和，加入0.1mL甲醇，吹干，重复2次，得甲基化完全酸水解产物。
干燥后加0.5mL新配制的吡啶和乙酸酐混合溶液(1:1)，120℃反应30min。冷却至室温，干燥后加入0.5mL甲醇，干燥后加入1mL二氯甲烷，12000rpm/min离心20min，取上清液，置样品瓶中用于GC-MS分析。
2.6检测结果
2.6.1野桑蚕蛹多糖BMM-S的分子量
野桑蚕蛹多糖BMM-S的分子质量如表1所示，其中，野桑蚕蛹多糖BMM-S的重均分子量约为234100Da。
表1野桑蚕蛹多糖(BMM-S)的分子质量
2.6.2野桑蚕蛹多糖BMM-S的红外谱分析
野桑蚕蛹多糖BMM-S的傅里叶红外光谱图谱如图1所示，在3423.082cm-1处有一明显的最宽的吸收峰，归属于多糖羟基的伸缩振动；信号2923.602cm-1归属于多糖次甲基C-H的伸缩振动；信号1635.366cm-1归属于C＝O的伸缩振动；1402.017cm-1处的信号归属于C-H的变角振动；1083.815cm-1和1039.460cm-1处的信号在1200～1000cm-1范围内，归属于C-O-C的伸缩振动，为吡喃糖环的特征峰。信号580.478cm-1表明BMM-S存在α构型。
2.6.3野桑蚕蛹多糖BMM-S的单糖组成成分分析
将野桑蚕蛹多糖BMM-S水解成单糖后，采用高效液相色谱对其进行单糖组成分析，结果如图2所示。野桑蚕蛹多糖BMM-S的主要的单糖成分是葡萄糖(98.31％)，保留时间为27.044min。甘露糖、鼠李糖、半乳糖等是次要的单糖成分。
2.6.4野桑蚕蛹多糖BMM-S的气相色谱与质谱分析
甲基化结果如表2所示，表明野桑蚕蛹多糖BMM-S主要由1,4-，1,4,6-和1-Glcp组成，且对应的比例约为4:1:1。因此，结合FT-IR、HPLC和GC-MS的结果，推测BMM-S的主链为1,4-α-D-Glcp，侧链为与O-6相连的1-α-D-Glcp(图3)。
表2野桑蚕蛹多糖(BMM-S)甲基化分析结果
2.6.5野桑蚕蛹多糖BMM-S的NMR谱分析
野桑蚕蛹多糖BMM-S在1H NMR谱(图4)和1H-1H COSY(图6)的异头区δ4.8-5.3ppm显示了三个信号，结合文献表明，野桑蚕蛹多糖BMM-S结构中只存在α-吡喃糖，这与FT-IR分析结果一致。根据甲基化分析结果和文献，异头区信号δ5.27ppm、5.23ppm和4.84ppm分别对应于残基A(1,4-α-D-Glcp)、残基B(1,4,6-α-D-Glcp)和残基C(1-α-D-Glcp)的H-1。其余δ3.08-3.84ppm的信号归因于每个单糖中C-2～C-6上的质子共振。水的氢信号为δ4.70ppm。在13C NMR谱中(图5)，异头碳区域中δ99.80ppm、99.95ppm和98.66ppm分别归属于残基A、残基B和残基C。δ77-60ppm之间的信号归属于葡萄糖残基中C-2～C-6的信号。根据1H-1H COSY(图6)和HMQC(图7)实验的相关性，对1H(表3)和13C NMR(表4)谱中的信号进行了归属。HMQC谱中信号δ3.29/76.48和3.37/74.80ppm的偏移表明，残基A和残基B的C-4存在取代。而信号δ3.66/71.10和3.92/71.10ppm证实残基B的CH2-O-取代。δ3.70/60.34和3.73/60.34ppm处的信号表明存在CH2没有被取代的糖残基。在BMM-S的HMBC谱中(图8)，信号δ3.83/71.44ppm符合残基A中H6和C3之间的相关性。另外，信号δ3.29/72.85ppm与残基A中H4和C2之间的相关性一致。
表3野桑蚕蛹多糖(BMM-S)的1H的化学位移
表4野桑蚕蛹多糖(BMM-S)的13C的化学位移
实施例3野桑蚕蛹多糖的免疫调节活性研究
3.1试剂和仪器
RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗、0.5％胰蛋白酶、DMSO、脂多糖、CCK-8试剂盒等，均为市售商品。
酶标仪、细胞培养箱、倒置荧光显微镜。
3.2检测方法
野桑蚕蛹多糖BMM-S对T细胞、B细胞和RAW264.7细胞增殖的药理评价通过CCK-8试剂盒法检测。配制细胞培养液(90％ RPMI-1640培养基、10％胎牛血清、1％双抗)。将对数生长期细胞(1×105个细胞/mL)添加到96孔板(100μL/孔)中并孵育24h(5％ CO2，37℃)。将不同浓度的野桑蚕蛹多糖BMM-S(终浓度1.25、2.5、5μg/mL)加入96孔板(100μL/孔)中，孵育24h。脂多糖LPS(终浓度5μg/mL)和细胞培养液分别用作阳性对照(LPS组)和阴性对照(空白组)。按照CCK-8试剂盒说明检测细胞活性。在450nm处检测光密度(OD)值。倒置荧光显微镜用于观察细胞形态和细胞数量的变化。细胞活力的计算方法为：细胞增殖率(％)＝[(As-Ac)/(Ac-Ab)]×100％，其中Ac为阴性对照组(空白组)吸光度，Ab为细胞培养液吸光度，As为实验组(BMM-S)或阳性对照组(LPS组)的吸光度。
3.3统计与分析
数据处理采用SPSS 26软件单因素方差分析结合最小显著差值法，分析实验组和对照组之间的显著性差异。所有展示的数据均为mean±SD。*P<0.05表示实验组与对照组之间具有显著差异，**P<0.01表示实验组与对照组之间具有极显著差异。
3.4检测结果
3.4.1野桑蚕蛹多糖BMM-S对T细胞增殖的影响
野桑蚕蛹多糖BMM-S对T细胞增殖效果如图9A所示。与空白组(细胞增殖率为0)相比，野桑蚕蛹多糖BMM-S和LPS可极显著促进T细胞增殖。当野桑蚕蛹多糖BMM-S终浓度为2.5μg/mL时，T细胞的增殖效率达到最大值，提高了78.31％，与LPS(5μg/mL)促进T细胞增殖的效率相当。从T细胞的形态图可看出(图9B)，T细胞在细胞培养液中呈圆球形，状态良好；BMM-S刺激下的细胞团均大于空白组，且细胞团随BMM-S浓度的增加先增大后减小；当BMM-S的终浓度为2.5μg/mL时，细胞团最大，细胞数量最多；LPS刺激下的细胞团比空白组大。
3.4.2野桑蚕蛹多糖BMM-S对B细胞增殖的影响
野桑蚕蛹多糖BMM-S对B细胞增殖效果如图10A所示。与空白组(细胞增殖率为0)相比，LPS(5μg/mL)可极显著促进B细胞增殖，增殖率为64.81％。当野桑蚕蛹多糖BMM-S终浓度为2.5μg/mL和5μg/mL时，能极显著促进B细胞增殖；当野桑蚕蛹多糖BMM-S终浓度为1.25μg/mL时，能显著促进B细胞增殖。且当野桑蚕蛹多糖BMM-S终浓度为5μg/mL时，增殖率最大为83.60％，高于LPS(5μg/mL)刺激的B细胞增殖率。从B细胞的形态图可看出(图10B)，B细胞在细胞培养液中呈圆球形，状态良好；BMM-S刺激下的细胞形成大簇，数量增加，细胞团均大于空白组，且细胞团随BMM-S浓度的增加而增大；当BMM-S的终浓度为5μg/mL时，细胞团最大，细胞数量最多；LPS刺激下的细胞团比空白组大。
3.4.3野桑蚕蛹多糖BMM-S对RAW264.7细胞增殖的影响
野桑蚕蛹多糖BMM-S对RAW264.7细胞增殖效果如图11A所示。与空白组(细胞增殖率为0)相比，LPS(5μg/mL)可极显著促进巨噬细胞增殖，增殖率为89.14％。当野桑蚕蛹多糖BMM-S终浓度为1.25、2.5、5μg/mL时，均能极显著促进巨噬细胞增殖。在相同浓度(5μg/mL)下，野桑蚕蛹多糖BMM-S刺激的巨噬细胞增殖率(95.09％)高于LPS。从巨噬细胞的形态图可看出(图11B)，巨噬细胞在细胞培养液中贴壁生长，呈圆形或椭圆形，状态良好；BMM-S刺激下细胞数量均比空白组多，且细胞数量随BMM-S浓度的增加而增加；LPS刺激下的细胞数量比空白组多。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种野桑蚕蛹多糖，其为由α-D-葡萄糖组成的同多糖。
2.如权利要求1所述的野桑蚕蛹多糖，其特征在于，所述的野桑蚕蛹多糖的化学结构中包含1,4-连接的、1,4,6-连接的和1-连接的α-D-葡萄糖残基，其摩尔比为4:1:1。
3.如权利要求1所述的野桑蚕蛹多糖，其特征在于，所述的野桑蚕蛹多糖的化学结构中，主链包含1,4-α-D-葡萄糖残基和1,4,6-α-D-葡萄糖残基，支链包含1-α-D-葡萄糖残基。
4.如权利要求1所述的野桑蚕蛹多糖，其特征在于，所述的野桑蚕蛹多糖包含如下结构：
其中，n为205-308的整数。
5.如权利要求1-4任一项所述的野桑蚕蛹多糖，其特征在于，所述的野桑蚕蛹多糖的重均分子量为200000-300000Da，优选为234100Da。
6.一种权利要求1-5任一项所述的野桑蚕蛹多糖的制备方法，其包括对野桑蚕蛹进行提取的步骤：
优选地，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)取野桑蚕蛹粉末，用石油醚浸提脱脂，得到脱脂野桑蚕蛹粉末；
(2)将步骤(1)所得的脱脂野桑蚕蛹粉末用水浸提，将所得水提物依次经浓缩、醇沉、除蛋白得到粗多糖；
(3)将步骤(2)所得的粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液；
(4)将步骤(3)所得的洗脱液用透析袋进行透析浓缩。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的野桑蚕蛹粉末与石油醚的料液比为1:1-10，优选为1:4；
优选地，所述的浸提温度为石油醚的沸点，即30-120℃；
优选地，所述的浸提次数为1-5次，优选为3次；
优选地，所述的浸提时间为1-10小时，优选为5小时。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的脱脂野桑蚕蛹粉末与水的料液比为1:1-10，优选为1:3；
优选地，所述的浸提温度为85-100℃，优选为97℃；
优选地，所述的浸提次数为1-5次，优选为3次；
优选地，所述的浸提时间为1-10小时，优选为6小时；
优选地，所述的水提物浓缩液与醇的体积比为1:1-10，优选为1:4；
优选地，所述的醇为乙醇。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的离子交换柱为纤维素柱，其填料为DEAE-纤维素；
优选地，洗脱所用洗脱剂为蒸馏水；
步骤(4)中，所述的透析袋的截留分子量为5000-10000Da，优选为7000Da。
10.一种权利要求1-5任一项所述的多糖在制备预防和/或治疗败血症、脚气病、过敏性疾病、胃肠功能紊乱、高血脂症、高血压、糖尿病、癌症的药物或制备增强免疫的保健品和食品中的应用。
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