JP2015517587A - プラシノコッカス目由来の多糖類 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)分子量範囲
(ii)単糖組成
(iii)免疫調節活性
(iv)硫酸エステル含量(分子の分子量のパーセンテージとして)
(v)粘性/ゲル形成性特性
本発明における使用のための多糖類は、典型的には、670kDaまたは670kDaを超える分子量を有する。
20〜30%のグルコース
30〜60%のガラクトース
4〜19%のアラビノース
2〜6%のウロン酸
および僅かなパーセンテージ(1〜10%)の他の糖、より詳細には、
1〜4%のラムノース
1〜3%のキシロース
1〜10%のマンノース
(重量%)を含むことができる。
25〜29%のグルコース
35〜47%のガラクトース
14〜15%のアラビノース
4〜6%のウロン酸
および僅かなパーセンテージ(1〜4%)の他の糖、より詳細には、
2.4%のラムノース
1.8%のキシロース
3.3%のマンノース
(重量%)を含むことができる。
本発明者らは、プラシノコッカス・カプスラタスまたはP.カプスラタス関連株から得ることができるゲル形成性多糖類であって、グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む、670kDaを超える分子量の硫酸化ヘテロポリマーであるゲル形成性多糖類の誘導体もまた、免疫系障害、特に、炎症性応答を促進する免疫系障害の処置において用いることができることを決定した。
30〜40%のグルコース
30〜40%のガラクトース
8〜14%のアラビノース
7〜11%のウロン酸
および僅かなパーセンテージ(1〜10%)、適切には、僅かなパーセンテージ(1〜4%)の他の糖単位
(重量%)を含むことができる。
35%のグルコース
35%のガラクトース
11%のアラビノース
9%のウロン酸
および僅かなパーセンテージ(1〜10%)、適切には、僅かなパーセンテージ(1〜4%)の他の糖単位
(重量%)を含むことができる。
25〜28%のグルコース
35〜55%、適切には、35〜45%のガラクトース
8〜17%のアラビノース、適切には、15%のアラビノース
4〜6%のウロン酸
および僅かなパーセンテージ(1〜4%)の他の糖単位
(重量%)を含むことができる。
25%のグルコース
50%のガラクトース
15%のアラビノース
5%のウロン酸
および僅かなパーセンテージ(1〜5%)の他の糖単位
(重量%)を含むことができる。
8.4%のアラビノース
0.7%のラムノース
2.0%のキシロース
2.2%のGalA(ガラクツロン酸)
57.9%のガラクトース
24.6%のグルコース
3.8%のGlcA(グルクロン酸)
を含むことができる。
適切には、本明細書に論述する多糖類または誘導体は、組成物の一部として提供することができる。そのような組成物は、経口、局所、直腸または非経口、経鼻または経肺投与(吸入による)に適し得る。実施形態において、組成物は、用途に応じて皮膚への局所適用向けでも、摂取向けでもよい。
実施形態において、本発明の多糖類または誘導体は、薬用化粧品、即ち、医学的または薬物様利益を有するとされる生物学的活性成分を有する化粧製品として提供することができる。
実施形態において、本発明の栄養補助食品は、栄養補助食品を与えた対象における健康な腸管を促進することができる。適切には、栄養補助食品の実施形態は、腸における筋痙攣または不快感を減少させることができる。実施形態において、栄養補助食品は、本発明における使用のための多糖類を含んだ状態で提供することができる。好ましい実施形態において、栄養補助食品は、本明細書に記述されている誘導体を用いて提供することができる。
実施形態において、本発明における使用のための多糖類またはそのような多糖類の誘導体は、プラシノコッカス・カプスラタスまたはP.カプスラタス関連株の培養物の細胞画分または分泌画分から単離された多糖類となり得る。
保存液:
微量元素: g/リットル ビタミンミックス: g/リットル
Na2EDTA・2H2O 4.16 ビタミンB12 0.0005
(シアノコバラミン)
FeCl3・6H2O 3.15 チアミンHCl(ビタミンB1)0.1
CuSO4・5H2O 0.01 ビオチン 0.0005
ZnSO4・7H2O 0.022
CoCl2・6H2O 0.01
MnCl2・4H2O 0.18
Na2MoO4・2H2O 0.006
培地:
g/リットル
NaNO3 0.075
NaH2PO4・2H2O 0.00565
微量元素保存液 1mL
ビタミンミックス保存液 1mL
微細藻類、適切には、プラシノコッカス・カプスラタス、特に、プラシノコッカス・カプスラタス藻類株CCMPII94の培養物を培養するステップと、
培養培地から微細藻類バイオマスを分離するステップと、
培養培地を濃縮し、脱塩するステップと、
培養培地を乾燥させるステップと
を含む方法が提供される。
沈殿、
透析、
接線流濾過および/または
イオン交換クロマトグラフィー
によって達成することができる。
多糖類、その誘導体または多糖類もしくはその誘導体を含有する組成物を用いて、多数の病状を処置することができる。処置は、ヒトまたは非ヒト動物に利益をもたらし得る任意の投与計画を包含する。処置は、現存する状態に対するものであっても、予防的(防止的処置)であってもよい。処置は、治癒的、軽減的または予防的効果を包含することができる。
本発明は、薬として用いるための本発明の多糖類もしくは誘導体またはこれを含有する組成物を提供する。薬は、ヒト利用または獣医学的利用のためのものとなり得る。適切には、獣医学的利用において、動物患者は、陸生動物、より適切には、コンパニオンアニマルまたは競技用(performance)動物となり得る。適切には、患者は、ヒトとなり得る。適切には、多糖類の誘導体または多糖類もしくはその誘導体を含有する組成物は、患者に局所的に適用することができ、例えば、皮膚に塗布することができる。
実験室において、50または100mLのf/2培地において、連続光、外界(実験室)温度(1年を通じて18〜28℃範囲)でP.カプスラタス株培養物を維持した。大規模の実験用培養物を用意するために、始めにストック培養物を250mlまたは500mlのf/2培地に播種し、対数期まで増殖させた。116℃で30分間オートクレーブしたf/2培地を含有する、PTFE空気吸入口および空気排出口フィルターを有するベントスクリューを備える10または20リットル透明ポリカーボネートカーボイ(carboy)に、250mlまたは500ml培養物を播種した。無機リン酸塩および微量金属を単独でオートクレーブし、オートクレーブ後に培地のバルクに別々に加えた。
多糖類は、様々な遠心分離および濾過技法によって培養培地から得ることができる。具体的には、高密度実験用培養物(10〜20リットル)を収集し、Heraeus Multifuge 3L−R遠心分離機の4×600ml遠心分離ポットに移した。遠心分離は、バッチ毎に4500gで2時間行った。遠心分離ポットにおいて藻類細胞をペレット化する一方、培養培地(上清)を移した。Whatman no.3フィルターを用いて、真空濾過により上清をさらに清澄化した(残渣細胞を除去するため)。
培地の除去から得られた細胞ペレットを加工して、標的多糖類を生成することができる。この操作は、熱水抽出技法、酵素消化または様々な他の抽出プロトコールによって行うことができる。具体的には、細胞を50mL無菌チューブに移し、2時間10,000gで遠心分離した。残存する上清を除去し、後の抽出および加工のために細胞を凍結して貯蔵した。加工するために、細胞を溶解し、標準抽出技法を用いて産物を取り出すことができる。具体的には、抽出前に細胞を3回凍結融解した。次に、これを等容量のTris−HCl pH8と混合し、100容量の試料に対し1容量の酵素の濃度で酵素アルカラーゼ(alcalase)2.5L DX(Novozyme)と混合し、一晩60℃で撹拌しつつインキュベートした。試料を取り出し、10,000gでスピンして細胞デブリをペレット化し、上清を取り出した。この上清を、10容量バッチの水を用いて4回交換しつつ、36時間かけて8kDa MWCO膜を用いて水に対して透析した。脱塩した上清を凍結または噴霧乾燥して、多糖類試料を生成することができる。いずれかの適切な技法を用いたさらに別のMWCOにより標的多糖類を単離してもよいが、具体的には、遠心分離による300kDa MWCO Vivaspin(Sartorius)を用いた分離により高MW画分を生成した。
高分子量標的多糖類は、酵素消化または酸加水分解等の技法を用いて、より小型の断片へと脱重合することができる。具体的には、熱い多糖類溶液へと過酸化水素を導入して、グリコシド結合を攻撃するフリーラジカルを生成することによって、これを脱重合することができる(Rota Cら、2005 Free radical generation during chemical depolymerization of haparin.Anal Biochem.344(2):193〜203およびPetit ACら、2006 Free−radical depolymerization with metallic catalysts of an exopolysaccharide produced by a bacterium isolated from a deep−sea hydrothermal vent polychaete annelid.Carbohydrate Polymers 64:597〜602.)。鍵となる変数は、過酸化水素対多糖類の比、温度およびpH制御である。固体の多糖類試料を、およそ2mg/mlとなるよう水に加え、溶解し、ウォーターバスにおいて撹拌しつつ60℃に温めた。銅塩溶液を加えて0.01M濃度とした。水酸化ナトリウムを含有するポンプに接続されたpHコントローラを用いて、試料をpH7.5に設定した。この時点において、一定の流速、例えば、0.5ml/分で容器へと過酸化水素をポンプ移送することにより反応を開始し、必要に応じて水酸化ナトリウム用ポンプを作動させることにより、pH7を維持するようにpHコントローラを設定した。反応を所望の期間行ったらポンプを停止し、20%酢酸(5マイクロL/ml反応液)を用いてpHを下げ、60mg/ml反応液のキレックス(chelex)100(Sigma)を加え、透明になるまで回転スターラーにおいて反応液を混合する。キレックスから全反応液を取り出し、−20℃で貯蔵した。Q−セファロース(sepharose)(GE)陰イオン交換を用いてあらゆる残存銅イオンをナトリウムイオンと交換し、続いてベンチカラムならびにA214、A280および導電率の検出器を備えるBuchi Sepacoreシステムを用いたSuperdex 30(GE)によるサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩/分離することにより、反応液から産物を精製した。50mM Tris−HCl pH7.5、50mM塩化ナトリウム移動相においてQ−セファロースカラムを平衡化し、続いて脱重合反応液をロードし、移動相でさらに20〜30分間洗浄し、これらは全て10ml/分で行った。続いて、結合した多糖類を5M塩化ナトリウム溶液で溶出させ、収集した。サイズ排除ベンチカラムSuperdex30へと、1ml/分で水を移動相として、5mlバッチにおいて溶離液を加えた。120分間かけて分離を行い、Pharmacia画分収集器を用いて3ml画分を収集した。異なる多糖類分子量範囲の画分を同定し、プールし、凍結乾燥した。具体的には、通常、2〜10kDaおよび20〜60kDa誘導体を表す2種のサイズ範囲を収集したが、他のサイズを収集してもよい。誘導体の保存液をサイズ排除HPLCカラム(Biosep4000、YMC Diol300またはYMC Diol120)に注入して、近似分子量を確認した(後述を参照)。
屈折率(Waters 2410)および光ダイオードアレイ(210〜380nm)検出(Waters 996)によるWaters Alliance HPLC(2695)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、多糖類および多糖類誘導体の分子量を推定した。30〜37℃で、0.2ミクロンで濾過した50mM Tris−HCl pH7、1mM EDTAおよび0.9%NaClの移動相において、YMC300−DiolまたはBiosep4000サイズ排除カラムのいずれかを平衡化した。移動相に20マイクロLを注入し、0.5または1ml/分(YMC300またはBiosep4000)流して、10または15分間無勾配分離することにより、デキストラン標準(Fluka:12、27、50、80、270、670kDa)を用いてカラムを較正した。式Kav=(保持時間−V0)/(Vt−V0)を用いて、Kav対分子量をプロットすることにより、検量線を作成した。0.1mg/ml溶液20マイクロLの試料を移動相に注入し、標準の通り流した。ブランクベースライン減算ありまたはなしで、Millennium Watersソフトウェアを用いてデータを手作業で組み入れた。試料の保持時間を検量線と比較して、上述の式を用いて近似分子量を計算した。
様々な方法を用いて、標的多糖類および多糖類誘導体の硫酸エステル含量を決定することができる。具体的には、Terho T&Hartiala K(Method for the determination of sulphate content of glycosaminoglycans.Analytical Biochemistry(1971)41(2):471〜476)による方法に基づき、硫酸エステル決定を行った。25μlの水に溶解した1mg/ml試料または対照(コンドロイチンSigma C4384またはヘパリンSigma H3393)を、反応バイアルに置いた。1M HClを加えて0.5〜1M HClの最終濃度とし、バイアルを100℃で2時間加熱した。真空下60〜65℃にて乾燥するまで(通常1〜2時間)Speed Vac(RCT60冷蔵トラップを備えるJouan RC10/10)を用いて、加水分解した試料を回転蒸発した。乾燥した加水分解産物を、250マイクロLの水に溶解した(0.1mg/ml)。
単糖組成は、多数の異なる方法を用いて決定することができる。具体的には、メタノリシスおよびトリメチルシラン(TMS)誘導体化と、続く水素炎イオン化検出によるShimadzu GC−2014(GC−FID)を用いた組成解析により、単糖組成を決定した。炉型乾燥器において450℃6時間で反応バイアルを熱浄化した。100マイクロgの試料(10mg/ml溶液として)をバイアルに移し、5nmolのscyllo−イノシトール内部標準を各試料に加えた。scyllo−イノシトール(I8132 Sigma)、アラビノース(A3131 Sigma)、キシロース(X−1500 Sigma)、マンノース(M6020 Sigma)、フコース(F2252 Sigma)、ラムノース(R3875 Sigma)、ガラクトース(G0750 Sigma)、グルコース、グルコサミン(G4875)、ガラクトサミン(G0500)、グルクロン酸(G5269)、ガラクツロン酸(48280 Fluka)、シアル酸(全て100mM保存液として調製)を含有する、5nmolの各単糖類標準を含有するバイアルも用意した。真空下60〜65℃で乾燥するまで(通常1〜2時間)、speed−vac(RCT60冷蔵トラップを備えるJouan RC10/10)において全バイアルを乾燥させた。40マイクロLの無希釈メタノールを加え、上述の通りに試料を再度乾燥させ、次に100マイクロLの0.5MメタノールHClに再懸濁した。バイアルを85℃のヒートブロックにおいて4時間加熱した。冷却後に、20マイクロLの無希釈ピリジンを加えてHClを中和し、次に20マイクロLの無希釈無水酢酸を加えて、あらゆる遊離一級アミンを再度N−アセチル化した(30分間、室温)。続いて、バイアルを再度乾燥させ(上述の通りspeed vacで)、40マイクロLの無希釈メタノールを加えて洗浄し、バイアルを再乾燥させた(10〜30分間、上述の通りspeed vacで)。続いて、40マイクロLの無希釈TMS試薬を加え、徹底的に混合して試料を再懸濁した。バイアルを密封し、水素炎イオン化検出によるShimadzu GC−2014に1マイクロLを注入(300℃スプリットレス注入)する前に、少なくとも10分間放置した。カラムは、ZB5−ms、30m×0.25mm i.d.×0.25μmフィルム厚であった。作成されたクロマトグラムを解析した。20〜30個のピークが同定されるまで、試料毎に面積カットオフを手作業で調整した。ピーク面積および保持時間は、単糖類標準と相関した。
比=ピーク面積/内部標準ピーク面積;
標準比=標準面積/標準毎の内部標準面積;
nモル=(5nモル/標準比)×試料比;
本来の試料に存在する各単糖類の%=nモル/総nモル×100
様々な異なる細胞ベースのスクリーニングアッセイを用いて、標的材料の細胞毒性を決定することができる。具体的には、BHK細胞株(ハムスター腎臓線維芽細胞ECACC 85011433)の代謝活性における多糖類および多糖類誘導体の効果を測定することにより、細胞毒性を試験する。90%コンフルエントのBHK細胞を収集し、96ウェルホワイトマイクロプレートにおいて、100マイクロLの新鮮に調製された培養培地(グラスゴー最小必須培地(GMEM)、10%ウシ胎仔血清、5%トリプトースリン酸ブロス(Tryptose Phosphate Broth)、2mM L−グルタミン)における1×104細胞/ウェルで蒔く。これを1時間37℃で5%CO2において放置して、ウェルに>80%接着させる。11マイクロLの、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)に溶解した1mg/ml多糖類(poysaccharide)試料、HBSSのみ対照、フコイダン(1mg/ml、HBSSに溶解)対照およびドキソルビシン(10マイクロg/ml、1マイクロg/ml、HBSSに溶解)対照を、1組3ウェルに加え、プレートを16〜18時間37℃で5%CO2においてインキュベートした。プレートを30分間室温に戻し、その後、100マイクロLのCell titre glow試薬(Promega)を加える。プレートをプレート振盪機において2分間混合し、次に10分間室温でインキュベートする。プレートリーダー(BioTek、Synergy 3)においてGen5ソフトウェアを用いて、ウェル毎の生じた発光を測定する。試料または対照毎の平均発光を計算する。HBSS対照ウェルを100%代謝活性として指定し、これに対して試料発光値を計算する:%活性=(被験ウェル/対照ウェル)*100。フコイダンおよびドキソルビシン対照は、確立された値の内となるべきである。
好中球エラスターゼ酵素活性における多糖類の効果の測定のために異なるプロトコールが可能である。具体的には、多糖類と刺激された新鮮に単離されたヒト好中球とのインキュベーションと、続く放出された酵素と標識された基質との反応およびプレートリーダーにおける比色分析測定により、エラスターゼ活性を測定した。新鮮に単離されたヒト好中球をHBSS(CaおよびMg不含)に再懸濁し、血球計算器において細胞を計数した。細胞を遠心分離し、HBSSに再懸濁して、2.5×106細胞/mlの濃度を得た。22マイクロLの試料、対照またはHBSSをマイクロチューブに加え、続いて:25マイクロLのサイトカラシンB(HBSSに溶解した40mg/ml、最終濃度5mg/mlとなる);25マイクロLのTNFα(HBSSに溶解した80ng/ml、最終濃度10ng/mlとなる。非刺激対照にはTNFαの代わりに25マイクロLのHBSSを用いる);150マイクロLの好中球懸濁液(あるいは培地のみ対照群には、細胞の代わりに150マイクロLのHBSSを加える)を加えた。内容物を穏やかに混合し、チューブを37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後に、25マイクロLのfMLP(HBSSに溶解した1マイクロg/ml、最終濃度100ng/mlとなる)を加える、あるいはHBSSを非刺激対照群に加える。チューブをさらに45分間37℃でインキュベートした。チューブをHeraeus Biofugeにおいて5000rpmで5分間遠心分離して、細胞をペレット化し、25マイクロLの上清を、96ウェルブラックマイクロプレートに1組3ウェルで移す。150マイクロLのTris HCl pH7.5および20マイクロLの好中球エラスターゼ基質1(Tris−HCl pH7.5に溶解した0.5mg/ml)を、基質を含有しないブランクウェルを除く各ウェルに加えた。プレートを予熱した(37℃)プレートリーダー(BioTek Powerwave HT)に移し、Gen5ソフトウェアを用いて405nmでの読み取りを5分毎に1時間行った。10分間および1時間の間の4個のデータ点にわたりVmaxを計算した。試料、対照またはブランク毎に平均Vmaxを計算した。対照ウェル(基質で刺激した細胞、但し被験試料なし)Vmaxを100%として指定し、これに対して試料および対照を計算して、%エラスターゼ活性を得る:%活性=(被験ウェルVmax/対照ウェルVmax)*100。
ケラチノサイト細胞における多糖類および多糖類誘導体の効果は、炎症促進性刺激ありまたははしで、様々な異なる増殖培地において、広範な異なる細胞株または初代細胞を用いて評価することができる。得られたサイトカイン放出は、マルチプレックスアレイまたはELISA等、異なる方法により評価することができる。具体的には、カルシウムおよびサプリメントを含有する完全ケラチノサイト増殖培地(Promocell C20011)において37℃、5%CO2で70〜90%コンフルエントになるまで初代ケラチノサイト(Promocell C12003)を増殖させた。これをトリプシン処理により収集し、洗浄し、24ウェルプレート組織培養プレートのウェルにウェル当たり30,000細胞で播種した。ほぼ80〜90%コンフルエントとなるまで(ほぼ56時間)細胞を増殖させ、次に培地を、0.5mMカルシウムを含む基本培地(Promocell C20211)にさらに16〜18時間交換した。次いで試料(HBSSに溶解した1mg/ml)、対照(HBSSに溶解したフコイダン1mg/ml)またはブランク(HBSS媒体のみ)を、ウェル(×10希釈)に炎症促進性刺激を加える6〜8時間前に加えた、あるいはSC514およびSB203580(それぞれNfkBおよびMAPK p38阻害剤)の場合は1〜2時間前に加えた。炎症促進性刺激は、10ng/ml TNFアルファもしくは10ng/ml IL1ベータもしくは20ng/ml IL17Aのいずれかまたは10ng/mlTNFアルファおよび20ng/ml IL17両方の組み合わせであった。他の刺激は、10ng/ml TNFアルファおよび50mg/ml IL17Aの組み合わせまたは10ng/ml TNFアルファ、50mg/ml IL17Aおよび10マイクロMヒスタミンの組み合わせであった。細胞をさらに16〜18時間インキュベートし、その時点で上清を収集し、−80℃で貯蔵した。収集の際に、上清をPBSと置き換えて細胞を洗浄し、次にこれを350マイクロLのRNAeasy溶解バッファー(Qiagen)と置き換えた。バッファー、溶解した細胞および細胞内容物を、−80℃における貯蔵のためのチューブに移した。
PBMCからのサイトカインの放出における物質の効果は、多くの異なる細胞フォーマット、刺激および持続時間を用いて測定することができる。具体的には、単離されたPBMCとのインキュベーションによりP.カプスラタス多糖類誘導体の効果を測定した。histopaque(Sigma)勾配遠心分離により新鮮血からPBMCを単離し、変法HBSS培地(PAA)において洗浄し、完全RPMI1640培地(PAA)に再懸濁した。200,000個のPBMCを、培地のみ対照と共に96vウェルポリプロピレンプレートに加えた。選択された濃度の多糖類を、対照SC514およびSB203580(それぞれNfkBおよびMAPK p38阻害剤)と共に細胞に加え、1時間37℃、5%CO2でインキュベートした。フィトヘマグルチニン(PHA)(10マイクロg/ml)およびIL1ベータ(10ng/ml)を、無刺激対照を除く各ウェルに加え、プレートを37℃、5%CO2で2または3日間インキュベートした。培地を収集するために、プレートを1000rpmで遠心分離し、サイトカイン解析に先立ち、−80℃における貯蔵のために上清をさらに別のプレートに移した。ELISA(Peprotech)により、収集された上清をインターフェロンガンマ(IFNガンマ)含量に関して解析した。マイクロプレートリーダー(Gen5ソフトウェアを用いたBioTek PowerWave HT)で450−630nmにおけるアッセイを読み取り、検量線を読み取ることにより定量化を行った。無刺激対照におけるサイトカインの濃度を、被験ウェルおよび刺激した対照ウェルにおける濃度から減算した。刺激された対照ウェルをIFNガンマの100%分泌として指定し、この対照に対して試料を計算した=(補正した被験ウェルpg/ml/補正した対照ウェルpg/ml)*100。
異なる細胞、刺激および基質を用いた、免疫細胞からの活性酸素種の産生を測定するための多数のプロトコールが存在する。具体的には、ヒト好中球を用いて多糖類および多糖類誘導体による酸化バーストの阻害を測定し、ヒト好中球を試薬DCFH−DAで染色した。新鮮に単離されたヒト好中球を、HBSS(CaおよびMg不含)に再懸濁し、血球計算器において細胞を計数した。HBSSにおいて1×106となるよう細胞を再懸濁し、HBSSに溶解した40マイクロMの等容量のDCFH−DAと混合し、30分間37℃、5%CO2でインキュベートした。100マイクロLの染色細胞は、ブランク(HBSSのみ)および非染色細胞対照の1組3ウェルは別として、ブラック96ウェルマイクロプレートの各ウェルに加えた。20マイクロLの1mg/mlの試料、HBSSまたは対照(塩化ジフェニレンヨードニウム(diphenyleneiodium chloride)(DPI)1マイクロM濃度、HBSSに溶解)を、染色細胞を含有する1組3ウェルに加えた。刺激なし対照ウェルを除き、50マイクロLのPMA(HBSSにおける4nM)の添加により細胞を刺激してROS産生させた。蛍光プレートリーダー(Biotek Synergy 3)において37℃でROSによるDCFH−DAの酸化により生じた蛍光を測定し、485/528nm動態を10分毎に2.5時間読み取った。平均蛍光を計算し、ブランク処理した。PMA刺激細胞の平均蛍光データを100%応答として指定し、これに対し試料および対照を評価した:%酸化バースト=(試料蛍光/PMA刺激細胞蛍光)*100。
走化性アッセイは、異なる走化性物質により、異なる種類の免疫細胞を用いて行うことができる。具体的には、好中球の走化性における多糖類および多糖類誘導体の効果を測定した。Histopaqueを用いて新鮮血からヒト好中球を単離する。BSA 0.1%、25mM HEPES(Sigma)を含むHBSSにおける2.5×106/mlの90マイクロLの新鮮に単離された好中球を、ポリプロピレン96ウェルプレート(Greiner)の各ウェルにおいて、10マイクロLの被験化合物(選択された濃度、例えば、2〜50マイクロM)または媒体対照と混合し、30分間プレインキュベートする。細胞および被験化合物をプレインキュベートしつつ、走化性96ウェルプレート(3ミクロンメッシュ)(Corning)の下部チャンバーを調製する。BSA 0.1%、25mM HEPESを含むHBSSにおいて、要求される用量(例えば、0.37ng/ml〜10ng/ml最終濃度)でIL8(Sigma)を調製する。下部アッセイチャンバー毎に235マイクロLを加える。陰性対照のため、IL8の代わりに235マイクロLのHBSS(Ca/Mg、BSA 0.1%、25mM HEPESを含有)を用いる。続いて、下部アッセイチャンバーを37℃、CO2 5%で30〜60分間インキュベートして、培地を前平衡化する。次に、上部ウェルを慎重に下部に移し、ポリプロピレンプレインキュベーションプレートの各ウェル由来の75マイクロLの好中球を、走化性プレートの上部チャンバーにおけるウェルに加える。プレート全体を37℃、CO2 5%で30分間インキュベートする。
異なる種類のマウス、遺伝的誘導因子および外部刺激を用いた、マウスモデルにおける皮膚炎症における被験物質の効果を評価するための多数のプロトコールが存在する。具体的には、IMQ誘導によるBALB/cマウスモデルを用いて、皮膚炎症におけるP.カプスラタス多糖類誘導体の効果を評価した。被験群は、未処置プラス媒体群、IMQのみ群、IMQプラス媒体群、3種の異なる濃度(1、0.1、0.01%)の多糖類プラス媒体群およびシクロホスファミド対照(10mg/kg、0.5%CMCに溶解)を包含し、1群当たり8匹のマウスであった。ポリアクリル酸ナトリウム塩、グリセロール、パラベンおよびイミダゾリジニルウレア(=媒体)を含有する水性ゲルに多糖類を溶解した。50mgのIMQクリーム(5%)塗布の4時間前に、500マイクロLの被験ゲルをマウスの剪毛した背中に毎日塗布した。未処置マウス被験群の場合、ワセリンを用い、シクロホスファミドを1日1回経口投薬した。皮膚外観(鱗屑形成(scaling)、ひだ形成(folding)、紅斑)の観察を毎日行って、疾患活性指数を得た。投薬を4日間反復し、その後、各群由来の4匹のマウスをサンプリングし、続いて実験を9日目まで行い、残存する全マウスをサンプリングした。全マウス由来の皮膚試料をホルマリンに固定し、包埋し、切片作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。上皮過形成、ケラチノサイト増殖(角化症)、白血球浸潤および血管新生の増加に関してスライドをスコア化した。スコアを被験薬剤に対してプロットして、IMQプラス媒体対照と比較した多糖類処置の効果を決定した。
Claims (23)
- プラシノコッカス目由来の微細藻類細胞から得ることができるゲル形成性多糖類であって、免疫系障害の処置における使用のための、グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびウロン酸単位を含む少なくとも670kDaの分子量の硫酸化ヘテロポリマーであるゲル形成性多糖類。
- 任意選択で、プラシノコッカス目の科由来の微細藻類細胞を培養し、微細藻類細胞培養培地から、微細藻類細胞によって分泌された微細藻類多糖類を抽出する
プロセスによって産生される、請求項1に記載のゲル形成性多糖類。 - 湿疹、乾癬およびアトピー性皮膚炎を包含する炎症性皮膚状態、過敏性腸症候群、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する腸管の炎症状態、または喘息、嚢胞性線維症、肺気腫、慢性閉塞性肺障害、急性呼吸促迫症候群もしくはアレルギー性鼻炎を包含する呼吸器系の炎症状態から選択される免疫系障害の処置における使用のための、請求項1または請求項2に記載のゲル形成性多糖類。
- プラシノデルマ・シンギュラリス(Prasinoderma singularis)またはプラシノコッカス・カプスラタスから得ることができる、先行するいずれかの請求項に記載のゲル形成性多糖類。
- 重量で約
20〜30%のグルコース
30〜60%のガラクトース
4〜19%のアラビノース
2〜6%のウロン酸および1〜10%の他の糖単位
を含む、先行するいずれかの請求項に記載のゲル形成性多糖類。 - 他の糖単位が、
ラムノース
キシロースおよび
マンノース
を含む、請求項5に記載のゲル形成性多糖類。 - 約17〜35重量%の硫酸エステル含量を有する、先行するいずれかの請求項に記載のゲル形成性多糖類。
- 約20重量%の硫酸エステル含量を有する、先行するいずれかの請求項に記載のゲル形成性多糖類。
- 多糖類が与えられていない好中球と比べて、好中球における好中球のエラスターゼ活性を約60〜90%阻害する、先行するいずれかの請求項に記載のゲル形成性多糖類。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の多糖類を含む栄養補助食品。
- 好ましくは、基礎担体または皮膚保湿物質を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の多糖類を含む化粧品調製物。
- 約2kDa〜60kDaの範囲内の分子量を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載のゲル形成性多糖類の誘導体。
- 2〜10kDaの範囲内の分子量を有する、請求項12に記載の誘導体。
- 重量で約
30〜40%のグルコース
30〜40%のガラクトース
8〜14%のアラビノース
7〜11%のウロン酸および
1〜10%の他の糖単位
を含む、請求項13に記載の誘導体。 - 20〜60kDaの範囲内の分子量を有する、請求項12に記載の誘導体。
- 重量で約
25〜28%のグルコース
35〜55%のガラクトース
8〜17%のアラビノース
4〜6%のウロン酸および
1〜5%の他の糖単位
を含む、請求項15に記載の誘導体。 - 好中球のエラスターゼ放出を約70〜90%阻害する、請求項12〜16のいずれか一項に記載の誘導体。
- 誘導体が与えられていない好中球と比べて、好中球活性酸素種産生を約30〜40%阻害する、請求項12〜17のいずれか一項に記載の誘導体。
- 誘導体が与えられていないケラチノサイトと比べて、ヒトケラチノサイトのIL−8遺伝子発現およびIL8放出を約70〜100%阻害する、請求項12〜18のいずれか一項に記載の誘導体。
- 請求項12〜19のいずれかに記載の誘導体を含む化粧品調製物。
- 請求項12〜19のいずれかに記載の誘導体を含む栄養補助食品。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の多糖類または請求項12〜19のいずれかに記載の誘導体を含む組成物。
- − プラシノコッカス目由来の微細藻類細胞、特に、プラシノデルマ・シンギュラリスまたはP.カプスラタス細胞を培養するステップと、
− 培養物の細胞画分または分泌画分から多糖類またはその誘導体を単離するステップと
を含む、請求項1〜9のいずれかに記載の多糖類または請求項12〜19のいずれかに記載の誘導体を調製する方法。
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