WO2006093175A1

WO2006093175A1 - フコイダンの製造方法並びにフコイダン及びフコイダン含有組成物

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Publication number: WO2006093175A1
Application number: PCT/JP2006/303834
Authority: WO
Inventors: Koji Hatano; Yasushi Nakamoto; Yuu Kanetsuki
Original assignee: Ube Industries, Ltd.
Priority date: 2005-03-01
Filing date: 2006-03-01
Publication date: 2006-09-08
Also published as: JPWO2006093175A1; CN101098894A; EP1854813A1

Description

明細書

フコィダンの製造方法並びにフコィダン及びフコィダン含有組成物技術分野

[0001] 本発明は、海藻から得られる重量平均分子量 1 , 000， 000〜2, 000， 000の高分子量フコィダンの製造方法、並びに高分子量フコィダン及び高分子量フコィダンを含有するフコィダン含有組成物、特に皮膚科領域用組成物 (化粧料、皮膚細胞賦活剤及びアレルギー剤）に関する。

背景技術

[0002] フコィダンは主要構成糖として硫酸化フコースを含む酸性多糖高分子の一種であり

、モズクやコンブなどの褐藻類に含まれる粘性成分である。フコィダンは、抗腫瘍、抗胃潰瘍、抗ウィルス、抗炎症、抗血液凝固、免疫増強など種々の薬理作用を有する。カロえて、保湿機能、皮膚細胞賦活作用、抗アレルギー作用、凝集作用、増粘作用、界面活性作用などを有しているため、化粧料や皮膚科薬剤の領域で期待される物質である。

フコィダン又はフコィダン含有物をモズク、コンブ、ワカメ，ヒバマタ等の褐藻類から製造する方法にっレ、ては多くの技術が開示されてレ、る。

尚、本明細書における「フコィダン含有物」は、原料藻体からフコィダンを抽出する任意のフコィダン製造方法を用いて得られた固体状又は液体状の物質であってフコイダンを含有するものを称することとする。

一般的なフコィダン製造方法では、酸性条件下でフコィダンが抽出される（特許文献：！〜 7)。し力、しながら、フコィダンは単糖がァセタール結合で繋がっている構造であるため、酸性条件での加熱、あるいは長期間の保存によって分子量が低下するとレ、う問題が存在する。

[0003] フコィダンについては、各種分子量のものが知られている。

例えば、特許文献 6には、養殖イトモズクから得られる重量平均分子量 500, 000 のフコィダンが記載されてレ、る。

また、特許文献 7には、養殖ォキナヮモズクから得られる重量平均分子量 500, 00 0〜600, 000のフコィダン力 S記載されてレヽる。

特許文献 3には、ォキナヮモズクから pH2〜8の条件下、オートクレーブにより加圧熱水抽出を行うことで得られる重量平均分子量 10, 000〜500, 000のフコィダンが記載されている。

特許文献 4には、ォキナヮモズクからの有機酸による抽出によって得られる重量平均分子量 180, 000のフコィダンが記載されている。

特許文献 8にはモズク藻体を熱水抽出して得られる重量平均分子量約 100, 000 のフコィダンが記載されてレ、る。

さらに、特許文献 9には、ホソモズクを中性で熱水抽出して得られる重量平均分子量 50, 000〜500， 000のフコィダン力 S記載されてレヽる。

し力、しながら、天然物を原料として得られるフコィダンについて重量平均分子量 1， 000, 000を超えるフコィダンの製造方法はこれまで提示されてレ、なレ、。

非特許文献 2には重量平均分子量が 909, 000のフコィダンが記載されているが、分子量測定の標準品としてプルランを用いている。プノレランは直鎖状の多糖であり、一方フコィダンは分岐を多く有する多糖であるため、両者の分子量と分子サイズの関係には大きな隔たりがある。従って、フコィダンなどの分岐状の多糖を、プルランを標準品として分子量を測定した場合、多角度光散乱検出器を用いて測定される重量平均分子量よりかなり大きな数値になる。実際、発明者らによって、プルランを標準品としたフコィダンの分子量の測定を行ったところ、多角度光散乱検出器での重量平均分子量が 1， 845， 000であるのに対して（実施例 3参照）、プノレランを標準品とした分子量の測定では 17, 400, 000であった（参考例 1参照）。

一方、化粧料は種々の成分により構成される。それらの成分中の増粘剤は、化粧料中の薬剤の粘性を保持し、乳化剤などと共にその組成の安定性に寄与するだけでなぐ化粧料の使用感触（滑らかさ、しっとり感、ベとつかないなど）に与える影響が大きい (非特許文献 1)。

コンブ、ァラメ、ワカメから分離精製されるフコィダンについては、その粘性に着目して化粧料へ応用されている（特許文献 11)。特許文献 11には、フコィダンを含む化粧料を皮膚に塗布した場合、滑らかで使用感に優れており、皮膚をしっとりとした滑らかな状態に保つことが記載されている。

特許文献 12には、褐藻類のマツモ属、モズク属、カジメ属、レツソニァ属、マクロシスティス属、ヒバマタ属、ァスコフイラム属及びダービリア属のフコィダンに生体ヒアルロン酸合成作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用、ヒスタミン遊離抑制作用を有することが記載されている。

し力、しながら、ォキナヮモズク属（Cladosiphon)由来のフコィダンを化粧料又は皮膚科領域の薬剤に用いることは提示されてレ、なレ、。

このように、フコィダンは化粧料ゃ抗アレルギー作用など皮膚科領域の薬剤として期待されているが、これまでに、これらの分野で重要な粘性、使用感触又は抗アレルギー作用などのフコィダンの機能とその重量平均分子量との関係について検討された事例はない。

特許文献 1 :特開平 10— 191940号公報

特許文献 2 :特開平 11 35591号公報

特許文献 3：特開平 2000— 239301号公報

特許文献 4：特開平 2000— 239302号公報

特許文献 5 :特開平 2000— 351801号公報

特許文献 6：特開平 10— 195106号公報

特許文献 7：特開平 10— 237103号公報

特許文献 8 :特開平 7— 138166号公報

特許文献 9：特開平 10— 70970号公報

特許文献 10：特公平 6— 11763号公報

特許文献 11：特公平 7— 14850号公報

特許文献 12 :特開平 11一 21247号公報

特許文献 13 :特開平 2001— 151788号公報

非特許文献 1 :光井武夫編，「新化粧品学」，第 1版 4刷，南山堂， 1999, p. 5 - 7, p . 147 - 148

非特許文献 2 : "理研メカブフコィダン"、 [online] , [平成 18年 2月 22日検索]、インタ¹ ~ネット http://www.rike— vita. co. jp/ prouse/health/mekabuiukoidan.ntml > 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、化粧料や皮膚科領域の薬剤として期待される高分子量フコィダンを製造する方法及び高分子量フコィダンを含む化粧料等を提供することを課題とする。課題を解決するための手段

[0006] 本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ォキナヮモズク属（Cladosiphon)のモズクを pH6. 0以上の中性〜アルカリ性で熱水抽出し、限外ろ過による低分子化合物除去の操作を経て、最終的な pHを 6. 5以上に調整することにより重量平均分子量 1 , 000, 000〜2， 000, 000のフコィダンを取得した。さらに、こうして得られたフコィダンが長期間安定に存在することを見出し、本発明を完成した。

即ち、第 1の発明は、ォキナヮモズク属（Cladosiphon)のモズク藻体を pH6. 0以上で熱水抽出し、 PH6. 5以上を維持して低分子化合物除去の操作を行い、かつ最終的な pHを 6. 5以上に調整して得ることを特徴とする、重量平均分子量が 1 , 000, 0 00〜2, 000, 000であり、かつ安定なフコィダンの製造方法である。

[0007] 第 2の発明は、上記第 1の発明の方法で得られたフコィダンである。

[0008] 第 3の発明は、重量平均分子量が 1 , 000, 000〜2, 000, 000であるフコィダンである。

[0009] 第 4の発明は、第 2または第 3の発明において、乾燥残渣の重量が 1. 0〜2. 0重量 %である水溶液の C型粘度計による 20i"pm、 25°〇での粘度が600〜1500111?& ' 3 であるフコィダンである。

[0010] 第 5の発明は、第 2〜第 4のいずれかの発明のフコィダンを含む、フコィダン含有組成物である。

[0011] 第 6の発明は、第 5の発明のフコィダン含有組成物を、化粧料、皮膚細胞賦活剤又は抗アレルギー剤としたものである。

発明の効果

[0012] 本発明の製造方法によれば、重量平均分子量 1 , 000, 000〜2, 000, 000のフコィダンが得られる。これは、従来技術の製造方法では得られなかった高分子量のフコィダンである。斯かるフコィダンは、保湿性等に優れ、化粧料及び皮膚科領域の薬剤等におけるフコィダン含有組成物の成分として有効であるのみならず、保存安定性に優れる。

発明を実施するための最良の形態

[0013] 本発明の原料としてのモズクは高分子量フコィダンの含有率の高さからォキナヮモズク属（Cladosiphon)のモズクが好ましレ、。また、そのモズクは生の状態であっても乾燥された状態であってもよぐアルコールなどで脱水処理されたものでも良い。

[0014] 本発明の製造方法で得られる重量平均分子量 1 , 000, 000〜2, 000, 000の高分子量フコィダンは、化粧料 (化粧水、ヘアートリートメント等)及び皮膚科領域の薬剤 (皮膚細胞賦活剤又は抗アレルギー剤）等の組成物の成分として好適に含有させること力 Sできる。

以下、本発明の高分子量フコィダンの製造方法を工程に沿って説明する。 <熱水抽出工程 >

抽出操作は，最初に水道水あるいは精製水にモズクを懸濁させて懸濁液とした上で行われる。これらの水の使用量は効率良くフコィダンを抽出できる量であれば特に限定されないが、例えば乾燥モズクを用いる場合には、乾燥モズク lgに対して水 50 〜300g使用することが好ましい。

[0015] 次いで、上記懸濁液を抽出開始時にはアルカリ性水溶液にするために水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩や水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物を溶解させる力 S、食品添加物としても使用できる水酸化カリウムが好ましい。このアルカリ性水溶液の濃度は、 0. 005-0. ImolZL (リットル）が好ましい。

[0016] フコィダンの抽出時には、フコィダン含有液体の脱色、脱臭のため濃度 30重量％の過酸化水素水を適宜量 (例えば乾燥モズクを使用した場合には乾燥モズクの重量に対して 0〜2倍量)使用しても良い。

熱水抽出の抽出温度は 70〜： 100°C、抽出時間は 0. 5〜2時間とすることが好ましレ、。抽出温度が高すぎ、あるいは時間が長すぎると分子量低下に繋がるためである。 pHは 6· 0以上に保持する。

抽出後の懸濁液は遠心分離機やフィルタープレス等の粘性物質を効率よくろ過できる装置を用いて抽出残渣を除去される。その際、珪藻土等のろ過助剤を加えてもよぐより完全に脱色するためには、ろ過前に活性炭を加えても良い。

[0017] <低分子化合物除去工程 >

抽出残渣を除いた後の透明なフコィダン含有液体は、限外ろ過又は透析等の方法により、低分子化合物が除去されるが、時間的な効率面から限外ろ過が好ましい。限外ろ過膜としては、分画分子量が 6, 000- 10, 000のものを使用する事が好ましレヽ。なお、酸性条件下での操作は分子量を低下させる傾向があるため、低分子化合物除去の操作が終了するまで、 pHを 6. 5以上、好ましくは ρΗ6. 5〜7. 5に保持することが必要である。

[0018] < ρΗ調整工程 >

限外ろ過後のフコィダン含有液体は、塩酸、硫酸等の鉱酸によって中和しても良い力保存安定性及び化粧料などとしての使用を考慮して ρΗ6. 5以上、好ましくは pH 6. 5〜7. 5に保持することが必要である。これは、一般に皮膚刺激性等から弱酸性力中性域が好ましいことによる。

[0019] こうして得られた透明水溶液であるフコィダン含有液体は、そのまま化粧料等の原料として用いても良いが、スプレードライや凍結乾燥の手法で粉末化しても良ぐまたアルコールをカ卩えて析出した沈殿をろ別し、定法で乾燥して使用しても良い。但しろ別した沈殿を加熱乾燥する場合には、分子量低下を避けるために 70°C以下で行うことが好ましい。

実施例

[0020] ぐ実施例 1 >

トンガ産モズク（Cladosiphon novae-caledoniae)の生の藻体に濃度 50重量⁰ /oとなるようにエタノールを添加し、 30分間浸漬して脱色した後、エタノール分を遠心ろ過によってできる限り除いて加工モズクを調製した。

水 1350ml中に前記加工モズク 150gを入れ、続いて濃度 30重量％の過酸化水素水 13. 2gと水酸ィ匕カリウム 0. 84gをカロえ、 90〜95°Cで 1時間持した。 50°Cまで冷却後、残渣をろ別して除いた。

得られたろ液力 Η = 6 · 3であったため、 lmol/L (リットル）の水酸化カリウム水溶液で ρΗ = 7· 2とした。

次いで、分画分子量 10000の限外ろ過膜を用いて体積として約 1Z5量にまで濃縮した。

得られた水溶液を ImolZL (リットル）の希硫酸で pH = 6. 5に調製した。

さらに、この溶液をカタラーゼ処理して過酸化物を分解させて、フコィダン水溶液を得た。

上記フコィダン水溶液の乾燥残渣の重量（70°C， 8時間，常圧）は、元の水溶液に対して 1. 2重量％であった。

また、このフコィダン水溶液からフコィダンをエタノール沈殿させ（実施例 2参照）、多角度光散乱検出器にて重量平均分子量を測定したところ 1， 845, 000であった（実施例 3参照)。

以下、このフコィダン水溶液を「高分子量フコィダン水溶液（実施例 1)」と称する。 <比較例 1 >

トンガ産モズク（Cladosiphon novae-caledoniae)の生の藻体に濃度 50重量⁰ /₀となるようにエタノールを添加し、 30分間浸漬して脱色した後、エタノール分を遠心ろ過によってできる限り除いて加工モズクを調製した。

水 1350ml中に前記加工モズク 150gを入れ、続いて濃度 30重量％の過酸化水素水 13. 2gを加えた後、濃度 lmol/L (リットル）の希硫酸で pH = 3に調整し、 90〜9 5°Cで 1時間攪拌した。 50°Cまで冷却後、残渣をろ別して除いた。

得られた水溶液を濃度 ImolZL (リットル）の水酸化カリウムで pH = 6. 5に調製した。

以下、「酸性抽出フコィダン水溶液」と称する。 [0022] <実施例 2 >エタノール沈殿物の調製

高分子量フコィダンのエタノール沈殿物の調製

実施例 1で得られた高分子量フコィダン水溶液 100gを、 50°C、減圧下で水を除き、体積を約 1/2量に濃縮した。得られた濃縮液の体積の 4倍量のエタノールを添カロしてフコィダンを沈殿させ、遠心分離（3000rpm、 5分、 4°C)した。その後、得られた残渣をエタノールで 2回洗浄し、減圧下（0. OOlMPa)、温度 50°Cで乾燥させて高分子量フコィダンのエタノール沈殿物（0. 876g)を調製した。

以下、「高分子量フコィダン」と称する。

[0023] く比較例 2 >加水分解フコィダン水溶液及びそのエタノール沈殿物の調製

実施例 1で得られた高分子量フコィダン水溶液 100gを 2規定の硫酸で pH5に調整し、それぞれの温度、時間で加熱処理（70°Cで 1時間、 70°Cで 2時間、 90°Cで 1時間）し、加水分解フコィダン水溶液を得た。

これら加水分解フコィダン水溶液を、以下、それぞれ、加水分解フコィダン水溶液（ 70°C、 1時間）、加水分解フコィダン水溶液（70°C、 2時間）、加水分解フコィダン水溶液（90°C、 1時間）と称す。

これら加水分解フコィダン水溶液 100mlから同様にエタノール沈殿を行って、加水分解フコィダンのエタノール沈殿物を得た。

これら加水分解フコィダンのエタノール沈殿物を、以下、それぞれを「加水分解フコィダン（70°C、 1時間）」、「加水分解フコィダン（70°C、 2時間）」、「加水分解フコイダン（90°C、 1時間）」と称す。

[0024] <実施例 3 > 重量平均分子量の測定

実施例 2で得られた高分子量フコィダン及び比較例 2で得られた加水分解フコイダンの各エタノール沈殿物を、それぞれ濃度 0. ImolZL (リットル）の塩化ナトリウム水溶液に溶解し、 0. 05重量％の溶液とした後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC) ( カラム： SB-806HQ (Shodex製）、カラム温度：室温 (25°C)、溶離液：濃度 0. lmol/L (リットル）の塩化ナトリウム水溶液、流速： 1. Oml/min,検出器: RI検出器)に付し、それぞれのフコィダンの重量平均分子量 (Mw)を多角度光散乱検出器 (DAWN EO S (登録商標第 4377194号）： Wyatt製）により解析した。その結果を表 1に示す。

[0025] [表 1]

<参考例 1 >

実施例 3で使用した高速液体クロマトグラフィー、カラム、 RI検出器を用い、市販のプノレラン (分子量 180〜788, 000)を標準として相対的に高分子フコィダンの重量平均分子量を求めたところ、 17, 400, 000であった。

<実施例 4_ 1 > 粘度の測定

実施例 1で調製した高分子量フコィダン水溶液 (乾燥残渣の重量： 1. 2重量％)、実施例 2で調製した各加水分解フコィダン水溶液および比較例 1で調製した酸性抽出フコィダン水溶液について、 C型粘度計により 20rpm、 25°Cで粘度を測定した。その結果を表 2に示す。

[表 2]

[0027] 実施例 1で調製した高分子量のフコィダン水溶液は高レ、粘性を示すのに対し、比較例 2で調製した加水分解フコィダン水溶液及び比較例 1で調製した酸抽出フコィダン水溶液の粘性は低いことが明らかとなった。

[0028] <実施例 4_ 2 >

トンガ産モズク（Cladosiphon novae-caledoniae)の生の藻体に濃度 50重量⁰/。となるようにエタノールを添加し、 30分間浸漬して脱色した後、エタノール分を遠心ろ過によってできる限り除いて加工モズクを調製した。

得られたろ液が pH = 6. 4であったため、 lmol/L (リットル）の水酸化カリウム水溶液で pH = 6. 8とした。

得られた水溶液を ImolZL (リットル）の希硫酸で pH = 6. 6に調製した。

上記フコィダン水溶液の乾燥残渣の重量（70°C， 8時間，常圧）は、元の水溶液に対して 1. 88重量％であった。

また、このフコィダン水溶液から実施例 2と同様にして、フコィダンをエタノール沈殿させ、多角度光散乱検出器にて重量平均分子量を測定したところ 13. 0 X 10⁵であつた。

また、実施例 4—1と同様に粘度を測定したところ、粘度は 1070mPa ' sであった。 <実施例 4 3 >

水 1350ml中に前記加工モズク 150gを入れ、続いて濃度 30重量％の過酸化水素水 13. 2gと水酸ィ匕カリウム 0. 84gをカロえ、 90〜95。Cで 1時間携枠した。 50°Cまで冷却後、残渣をろ別して除いた。

得られたろ液が pH = 6. 4であったため、 lmol/L (リットル）の水酸化カリウム水溶液で pH = 7. 5とした。

次いで、分画分子量 10000の限外ろ過膜を用いて体積として約 1Z5量にまで濃縮した。得られた水溶液を lmol/L (リットル）の希硫酸で pH = 6. 7に調製した。

上記フコィダン水溶液の乾燥残渣の重量（70°C， 8時間，常圧）は、元の水溶液に対して 1. 51重量％であった。

また、このフコィダン水溶液から実施例 2と同様にして、フコィダンをエタノール沈殿させ、多角度光散乱検出器にて重量平均分子量を測定したところ 13. 2 X 10⁵であつた。

また、実施例 4—1と同様に粘度を測定したところ、粘度は 1050mPa ' sであった。 <実施例 4_4 >

トンガ産モズク（Cladosiphon novae-caledoniae)の生の藻体に濃度 50重量⁰ /oとなるようにエタノールを添加し、 30分間浸漬して脱色した後、エタノール分を遠心ろ過によってできる限り除いて得た加工モズク 5ロットについて、実施例 1にしたがって高分子量フコィダン水溶液を調整し、それぞれの乾燥残渣の重量と粘度とを調べた。なお、乾燥残渣の重量は 70°C、 8時間、常圧下で乾燥したものの、元の水溶液の重量に対する重量比（重量％)であり、粘度は C型粘度計を用い、 25°Cで測定した。

[表 3]

<実施例 5 >化粧水の調製

(1)高分子量フコィダンの化粧水の調製

実施例 1で調製した高分子量フコィダン水溶液（乾燥残渣の重量： 1. 2%) 9. 95g にフエノキシエタノールを 0. 05gカロえ、高分子量フコィダンの化粧水を調製した。以下、「高分子量フコィダンの化粧水」と称する。

(2)加水分解フコィダンの化粧水の調製実施例 2で得られた加水分解フコィダン (90°C, 1時間）エタノール沈殿物 0. 6gを精製水に溶解（乾燥残渣の重量： 1. 2重量⁰ /₀)して 49. 75gとし、フエノキシエタノール 0 . 25gを添加し、加水分解フコィダンの化粧水を調製した。

以下、「加水分解フコィダンの化粧水」と称する。

[0032] ぐ実施例 6 >官能効果の評価

実施例 5で調製した各化粧水について，パネラー 7名（36歳から 59歳）の手の甲に化粧水又は精製水を 1滴塗布し，使用感触の好み，肌の滑らかさ，しっとり感について評価を行った.評価は，使用感触が好き（1)、普通（0)、嫌い（一 1)、滑らかさやしつとり感の有り（1)、無し (0)で行レ、、それらの合計を集計した。

その結果を表 4に示す。

[0033] [表 4]

[0034] 高分子量フコィダンの化粧水は、加水分解フコィダンの化粧水に比べ使用感触が良ぐ滑らかさやしっとり感を与えることが確認された。

[0035] ぐ実施例 7 >保湿性の評価

実施例 1で調製した高分子量フコィダン水溶液について、パネラー 5名（26歳から 5 8歳の男性 3名及び女性 2名）による即時的な保湿性の評価を行った。すなわち、前腕内側部に高分子量フコィダン水溶液又は精製水を lOmg/cm²塗布し、 15分、 3 0分及び 45分後に皮表角層水分量測定装置（SKICON200： LB.S.Co.Ltd.)を用いて皮膚表面水分量を測定した。

その結果を表 5に示す。

[0036] [表 5] 式料名測定時間

精製水 f刀期匿 100. 0%

15分後 116. 2%

30分後 107. 4%

45分後 103. 3% 高分子量フコィダン水溶液 f刀期匿 100. 0%

15分後 164. 5%

30分後 152. 0%

45分後 147. 2%

[0037] 15、 30及び 45分後のいずれの場合にも高分子量フコィダン水溶液は精製水に比ベ保湿性を有することが示された。

[0038] <実施例 8 >ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定

特許文献 13に記載の方法に準じて、牛睾丸由来のヒアルロニダーゼ（Sigma,Type IV-S)を用いてコンパウンド 48Z80による不活性型ヒアル口ニダーゼの活性化段階の阻害活性を測定した。すなわち、実施例 2で得られた高分子量フコィダンのエタノール沈殿物と比較例 2の加水分解フコィダン (90°C， 1時間）のエタノール沈殿物 (カロ水分解フコィダン (90°C, 1時間））を、それぞれ濃度 0. lmol/L (リットル）の酢酸緩衝液（pH4. 0) 0. 2mlに溶力て試験管に取り、同緩衝液 0. 1mlに溶力たヒアルロニダーゼ（lOOunits)をカロえ、 37。Cで 20分間インキュベートした。

その後、同緩衝液 0. 2mlに溶力たコンパウンド 48/80 (0. lmg)をカロえ、さらに 37°Cで 20分間インキュベートした。

これに同緩衝液 0. 5mlに溶かしたヒアルロン酸ナトリウム塩（0. 4mg)を加えて 37 °Cで 40分間インキュベートした後、濃度 0. 4mol/L (リットル）の水酸化ナトリウム水溶液 0. 2mlをカ卩えて氷冷し、ほう酸溶液（四ホウ酸カリウム 4水和物 4. 5gを水に溶かし全量を 100mlとしたもの）（ρΗ9· 1) 0. 2mlを加えて 3分間煮沸した。

氷冷後， P—ジメチルァミノべンズアルデヒド試薬 6mlを加えて、 37°Cで 20分間インキュペートした後、 585nmにおける吸光度を測定した。

阻害率は以下の式により算出した。 50%阻害濃度（IC50)は、各濃度の阻害率から作成したヒアルロニダーゼの阻害曲線から求めた。 [0039] (数 1)

阻害率 = (A— B) /A X 100 (%)

[0040] A:対照（フコィダンの代わりに酢酸緩衝液を用いた）の吸光度

B：フコィダン溶液の吸光度

[0041] 測定結果を表 6に示す。

[0042] [表 6]

[0043] この結果から、高分子量フコィダンのヒアルロニダーゼ阻害活性は、加水分解フコィダンよりも 1. 6倍強いことが認められた。

[0044] <実施例 9 >保存安定性試験 (加速試験）

実施例 5で調製した高分子量フコィダンの化粧水について、温度 40°C、 2000Lux (ルクス）の照明下、 4週間保存し安定性を評価した。粘度は E型粘度計 (EHD型)を用レ、、コーン 3° 、回転数 20rpmで測定した。外観は目視により評価した。

その結果を表 7に示す。

[0045] [表 7]

[0046] 40°C、 4週間保存後も粘度の低下や外観の変化は認められず、保存安定性に優れていることが明らかとなった。

[0047] <実施例 10 > 保湿性の評価（2) (実施例 7とは別実験）

被験者の前腕内側部を石鹼により洗浄した。乾燥後、 21°C、相対湿度 50%でコンディショニングした後、直径 2cmの円を 1試験区につき 4つずつ（2試験区/腕）両腕に描き、円の内側に蒸留水、高分子量フコィダン水溶液 (実施例 1)、加水分解フコィダン水溶液（70°C， 1時間）、加水分解フコィダン水溶液（70°C， 2時間）、加水分解フコィダン水溶液（90°C, 1時間）のそれぞれのエタノール沈殿物を精製水に溶解して調製した 1重量％の水溶液を 10 μ Lずつ塗布した。処理後 200分間上記環境下で安静にし、 CORNEOMETER CM825(CK electronic GmbH)を用いて皮膚水分を計測し、 4区の平均値を算出した。精製水塗布区の数値を 1として、相対皮膚水分を計算した。

その結果を表 8に示す。

[表 8] 試料名相対皮膚水分

精製水 1 . 00

高分子量フコィダン 1 . 32

加水分解フコィダン（70°C、 1時間） 1 . 09

加水分解フコィダン（70°C、 2時間） 1 . 1 1

加水分解フコィダン（90°C、 1時間） 0. 99

[0049] 高分子量フコィダンは精製水、加水分解フコィダンに比べ、有意に高い保湿性を示した。

[0050] <実施例 11 > 保水性評価

精製水、高分子量フコィダン、加水分解フコィダン（70°C, 1時間、 70°C, 2時間 90 °C, 1時間）加水分解フコィダン水溶液（70°C， 2時間）、加水分解フコィダン水溶液（ 90°C, 1時間）のそれぞれのエタノール沈殿物を精製水に溶解して調整した 0· 5重量％水溶液を lO i Lずつろ紙に処理し、 21°C、相対湿度 50%の環境下で電子天秤により 1分ごとに重量を測定し、水分蒸発量を求めた。 10分後までの計測により水分蒸発速度を算出し、精製水の蒸発速度を 1としたときの相対蒸発速度を求めた。その結果を表 9に示す。

[0051] [表 9] 試料名相対水分蒸発速度

精製水 1 . 00

分子量フコィタン 0. 64

加水分解フコィダン（70 C、 1時間) 0. 65

加水分解フコィダン（70°C、 2時間） 0. 70

加水分解フコィダン（90°C、 1時間） 0. 89 [0052] く実施例 12 > ヘアトリートメント溶液の調製

実施例 1で調製した高分子量フコィダン水溶液（乾燥残渣の重量： 1. 2%)、実施例 2で調製した加水分解フコィダン水溶液（90°C， 1時間）、精製水、エタノールを用いてへアトリートメント溶液を調製した。

各へアトリートメント溶液の組成を表 10に示す。

[0053] [表 10]

注:表中の数値は、フコィダン水溶液、精製水及びエタノールの重量比を表す。ヘアトリートメント溶液 Aにおいて、フコィダン水溶液は、高分子量フコィダン水溶液（実施例 1)を使用し、ヘアトリートメント溶液 Bにおいて、フコィダン水溶液は、加水分解フコィダン水溶液（90°C, 1時間）を用いた。

[0054] <実施例 13 > 損傷人毛を用いた官能評価

人毛黒髪（ビューラックス製， 10g)を市販のブリーチ剤で 5回処理して損傷人毛を調製した。洗浄、乾燥後、実施例 12のへアトリートメント溶液 A2mlをスプレー処理して乾燥させた。乾燥後、指先でのすべり、しっとり感、柔軟感をヘアトリートメント溶液 Bと比較した。その結果を表 11に示す。

なお、比較例 2に比べ優れている場合は〇、同等の場合は△、劣る場合は Xとした。

[0055] [表 11]

ぐ実施例 14 > 細胞賦活評価

ヒト表皮繊維芽細胞（NB1RGB株）を 5. 0 X 10³ cellsZwellで 96穴プレートにシーデイング (seeding)し、 DMEM培地（牛血清 1。/。）で 48時間前培養した。培地を実施例 1で調製した高分子量フコィダン水溶液（乾燥残渣の重量： 1. 2%)、実施例 2 で調製した加水分解フコィダン水溶液（70°C， 1時間）、加水分解フコィダン水溶液（ 70°C, 2時間）のそれぞれのエタノール沈殿物を所定濃度で含む DMEM培地に交換した後、さらに 48時間培養し、 WST—1アツセィに供した。陰性対照（DMEM培地（牛血清 1 %)フコィダン無添加）の値を 100%とした相対値で細胞賦活活性を示した。いずれも 2連で実施した。その結果を表 12に示す。

[表 12]

[0058] 表中の数値は、陰性対照（DMEM培地（牛血清 1%) )の値を 100%とした細胞賦活活性の相対値を示す。

[0059] <実施例 15 >フコィダンの構成成分

実施例 2で得られた高分子量フコィダン沈殿物をギ酸（135°C、 6時間）、引き続き 2 Mトリフルォロ酢酸（120°C、 6時間）にて加水分解を行い、 HPLC (カラム： Cosmosil Su gar-D,ナカライテスタ製、溶媒：ァセトニトリル： 10mMりん酸緩衝溶液 = 75:25、流速： l.OmL/min, RI検出器）で分析した。その結果、主な構成糖はフコースであり、グノレクロン酸も含有することがわかった。また、高分子量フコィダン沈殿物をロジソン酸法により分析して、硫酸基含量を、重水中に溶解して 60°Cで NMR (500MHz、日本電子製 )測定し、 1.3ppm付近のフコースのメチル基ピークと 2.2卯 mのァセチル基ピークの面積比からァセチル基含有比を求めた。フコースを 1.0とした場合のグノレクロン酸、及びァセチル基の含有比を表 13に示す。

[0060] [表 13] 構成分子比

フコ __スグルクロン酸ァセチル墓

1. 0 0. 11 0. 10 [0061] 硫酸基は沈殿に対し、 16.9重量 %含有していることがわ力た。

Claims

請求の範囲

[1] ォキナヮモズク属（Cladosiphon)のモズク藻体力も pH6. 0以上で熱水抽出するェ程と、

pH6. 5以上を維持して低分子化合物を除去する工程と、

最終的な pHを 6. 5以上に調整する工程とを含み、

重量平均分子量力， 000, 000〜2， 000， 000のフコィダンを得る、フコィダンの製造方法。

[2] ォキナヮモズク属（Cladosiphon)のモズク藻体力 ρΗ6· 0以上で熱水抽出するェ程と、

ΡΗ6. 5以上を維持して低分子化合物を除去する工程と、

最終的な pHを 6. 5以上に調整する工程とを含む製造方法から得られる重量平均分子量力 , 000, 000〜2, 000, 000のフコィダン。

[3] 重量平均分子量力 , 000, 000〜2, 000, 000であるフコィダン。

[4] 乾燥残渣の重量が 1. 0〜2. 0重量％である水溶液の C型粘度計による 20rpm、 2

5°〇での粘度が600〜1500111?&' 3でぁる請求項2または3に記載のフコィダン。

[5] 請求項 2〜4のいずれかに記載のフコィダンを含む、フコィダン含有組成物。

[6] 前記フコィダン含有組成物が化粧料、皮膚細胞賦活剤又は抗アレルギー剤である

、請求項 5に記載のフコィダン含有組成物。