CN115177975B - 一种通过超分子工艺从药用层孔菌中提取多糖类、多酚类及三萜类成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过超分子工艺从药用层孔菌中提取多糖类、多酚类及三萜类成分的方法，具体包括下列步骤：(1)药用层孔菌清水洗净，冷冻干燥，粉碎，过筛；(2)甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES溶剂的制备；(3)将药用层孔菌粉末加入到已配制NADES溶剂中，超声强化处理得到提取液；(4)提取液静置24h，随后离心筛选得上层清液；(5)对上层清液进行高效液相色谱分析，得出多糖类、多酚类、三萜类的提取产率；(6)对得到的上层清液进行过滤、浓缩得到浓缩提取物；超分子NADES溶剂不易挥发，生物相容性好，原子利用率100％，提取后无需分离，起到协同增效的作用。提取液经浓缩后可用作新型化妆品原料，具有抑菌、抗氧化、舒缓炎症等功效。

Description

一种通过超分子工艺从药用层孔菌中提取多糖类、多酚类及 三萜类成分的方法
技术领域
本发明属于天然低共熔溶剂(NADES)技术在植物活性成分提取领域的应用，具体涉及一种从药用层孔菌中提取多糖类、多酚类及三萜类成分的制备方法。
背景技术
药用层孔菌，民间也有人称此菌为苦白蹄、木茯苓，是多孔菌目、拟层孔菌属的一种大型药用真菌。该真菌子实体呈马蹄形或圆锥形，较大，菌肉为白色或类白色，较软，味苦。药用层孔菌的主要分布地区在西欧、北美、西伯利亚，但在亚洲地区的分布则比较少。它主要生长在落叶松的树干上，是新疆维吾尔医常用的一种药材，主要用于治疗腹痛、感冒、肺结核患者盗汗以及慢性气管炎；在苏联民间，曾用药用层孔菌治疗胃病；而在欧洲和日本,药用层孔菌除了这些作用，还被用于治疗癌症、毒蛇咬伤等；也有的地方将它作为茶来饮用。
药用层孔菌提取物富含多糖类、多酚类、三萜类等多种活性成分，拥有很强的抗炎、抗菌、抗氧化的功效，被广泛地应用于化妆品领域。药用层孔菌提取物具有较好的抗炎抑菌效果即源于其多糖类成分，能够抑制白细胞从毛细血管到部位的迁移，抑制了炎症反应和痤疮杆菌，起到祛痘抗敏的效果。通过提升肌肤屏障，抗击光辐射和氧化自由基。药用层孔菌提取物的多酚成分具有保湿、平滑、软化、舒缓和收敛作用。可以抑制皮肤中胶原酶和弹性蛋白酶的活性，减少胶原蛋白和弹性蛋白的水解，防止肌肤水分流失。此外，它们可以舒缓刺激并减少皮肤发红，加速表皮的自然再生，稳定毛细血管，改善皮肤的微循环和弹性，并防止有害的外部因素，包括紫外线辐射。三萜类能收缩毛孔，减少皮脂过度分泌，防止毛孔堵塞，又具有保湿作用，可以预防闭口、痤疮，紧致皮肤，尤其适合油性皮肤。
从药用层孔菌中提取这些活性成分既要保持高的提取率，也要防止活性成分失活，同时考虑工业大规模生产对生产成本、环境保护等的要求，选择合适的提取方法、提取工艺及提取溶剂尤为重要。
目前针对药用层孔菌活性成分的提取方法有很多种。根据提取时所使用的溶剂不同，提取方法可大致分为一下几类：水提法、有机溶剂提取法、离子液体提取法。水提法由来已久，应用范围很广，常被用于提取易溶或能溶于水的活性物质。该法工艺简单、无毒无害且成本较低，但提取时间过长且得到的提取液成分复杂，分离纯化难度较大。有机溶剂提取法相较于前者，选择性和针对性更高，对于某些活性成分的提取有一个比较好的效果，比如木质素、生物碱等等。但是有机溶剂在提取植物中的活性物质时，需要通过溶解细胞膜中脂质来增大细胞膜的穿透性，未能完全破坏植物组织，提取能力有限；且其潜在的毒性和后续的不易分离限制了进一步的大规模应用。离子液体自1914年被发现以来，因其具有不易燃、不挥发、较高的稳定性和设计性，被广泛应用在能源储存及转化、催化反应和分离萃取等领域。由于离子液体具有可设计性和调控性，可以成功提取前两种方法难以提取的生物活性成分。这种提取法对于提取复杂结构的活性成分有着独特的优势。离子液体通过溶解植物细胞壁中的木质素，从而使细胞内部的有效成分流出，达到高效破壁的效果：并且离子液体还可以与活性成分形成超分子作用力，便于活性成分的提取和防止活性成分失活，具有很好的生物相容性。然而离子液体造价高，使用后纯化处理步骤繁琐，对人体毒副作用大，这些缺点限制了离子液体的广泛使用。
在提取时通常结合外场强化提取法来提高提取效率。根据物理作用的形式不同可细分为超声波辅助提取、溶剂辅助提取等。超声波辅助提取法主要是利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散并溶解进入溶剂中；在减少提取时间的同时可以保持被活性成分的结构和生物活性不发生变化，是一种可高效价廉无污染获取生物活性物质的提取方法。超声波辅助提取法常常是在低温下进行，可以有效保护活性成分结构的完整性，保证提取的质量。微波提取与超声辅助提取的根本区别在于，微波提取是高频电磁波穿透细胞壁到达内部，利用热能破坏细胞，在细胞内部产生热应力，迫使细胞液溢出，经过传质作用，有效成分将溶于提取剂，最后可通过多种手段如离心、过滤或萃取得到目标物。这种方法主要利用的是热聚效应，因此某些不耐高温的活性成分不宜用微波辅助提取。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种从药用层孔菌中提取多糖类、多酚类及三萜类成分的制备方法。该方法利用完全绿色，原子经济性100％，制备工艺简单，成本低廉的天然深共熔溶剂(NADES)耦合超声辅助提取的方式达到一种高效破壁、高效稳定提取、维持产物活性的效果。相比于离子液体，NADES制备方法简便经济，生物相容性好，符合绿色化学的理念。 NADES归属于超分子化合物中的一类，是由两种或两种以上分子依靠分子间相互作用(氢键、范德华力、静电引力等等)结合在一起，保持一定的完整性且具有明确的微观结构和宏观特性。
本发明选择了甜菜碱作为NADES中的氢键供体。甜菜碱被认为是可生物降解的、廉价的、可再生的和无毒的天然成分，广泛存在于微生物、植物和动物中，尤其是甜菜、螃蟹和虾中。它也是一种渗透剂，在大多数活生物体的细胞中起着重要作用，其保湿性能要优于其他的保湿剂，如透明质酸钠，因此，甜菜碱被认作是温和安全的皮肤保湿调理剂。利用甜菜碱基NADES既可以达到高效提取药用层孔菌活性成分的效果，还可以不用分离，在后续皮肤保湿调理等应用中起到协同增效的作用。
本发明从许多的NADES氢键受体筛选出了甘油葡萄苷(GG)。GG是一类由甘油分子与葡萄糖分子以糖苷键结合的物质，其通过糖苷键将一个D-吡喃葡萄糖和甘油2号位的羟基偶联。葡萄糖分子的构型结合甘油分子的位置分为多种，目前已经鉴定出六种，但作为天然渗透压抵抗分子的是GG。它是微生物在胁迫条件下合成的一种渗透保护物质，同时还是一种大分子稳定剂，可用于蛋白质药物等的长期保存；更是一种良好的化妆品添加剂，具有保湿，抗氧化和抗衰老等功效；更有研究发现GG还具有治疗过敏性呼吸系统疾病等多种人体保健功效。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案实现：
步骤(1)、药用层孔菌清水洗净，-80℃下冷冻干燥3h，粉碎，80目过筛；
步骤(2)、甜菜碱、甘油葡糖苷以摩尔比1:2投入反应器，60℃下搅拌加热3h，得到粘稠液体。向粘稠液体中加入一定量的超纯水配制得到含水量30％的甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES溶剂。
步骤(3)、将药用层孔菌粉末加入到超分子NADES溶剂中，重量体积比为 50mL:1g。在温度25℃，超声功率100W条件下强化处理1h得到提取液。
步骤(4)、将提取液静置24h，随后进行离心筛选得到上层清液，离心参数为8000r/min，离心10min。
步骤(5)、对上层清液进行高效液相色谱分析，得出多糖类、多酚类、三萜类的提取产率。
步骤(6)、对得到的上层清液进行过滤、浓缩得到浓缩提取物。
本发明用制备出的的甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES溶剂耦合超声辅助进行提取，得到的多糖提取率高达27.58mg/mL，多酚提取率高达24.03ug/mL，三萜提取率高达41.35mg/mL。
上述所制备得到的浓缩提取物，主要成分为甜菜碱甘油葡糖苷NADES、多糖类、多酚类、三萜类，可以作为一种新型化妆品原料添加到面霜、精华、乳液及爽肤水等化妆品中，发挥保湿、抗氧化及舒缓炎症的护肤功效。
本发明与现有的技术相比具有如下的有益效果：
1、甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES溶剂生物相容性好，绿色经济，底物普适性强，可以作为药用层孔菌活性成分的提取剂。通过耦合超声辅助的方式进行提取，可以提高多糖类、多酚类、三萜类的产率。同时甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES无需分离，可作为护肤产品中的一种功效成分，协同多糖类、多酚类、三萜类发挥保湿、抗氧化、舒缓炎症等功效。且经体外实验数据证明，该超分子NADES溶剂在提取过程中不会破坏药用层孔菌活性成分的活性。
2、本发明工艺简单，绿色经济，提取效率较传统提取溶剂、离子液体高。通过SEM分析可得经过超分子溶剂处理后的植物原料组织明显被破坏，硬纤维表面呈多处凹槽或空隙。这说明甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES溶剂会加速溶解植物细胞的细胞壁，促使活性成分流出，在不破坏植物活性成分结构的情况下，进而会与目标活性成分形成一种新的多元的超分子结构体系，进而实现活性成分的高效萃取。
附图说明
图1为为药用层孔菌原料不同溶剂提取前后SEM分析图；
图2为受试区及对照区VISIA-CR右脸脸颊测试结果图；
图3为受试者03使用3％药用层孔菌提取物(普通提取)3天内毛孔变化情况；
图4为受试者29使用3％超分子NADES药用层孔菌提取物3天内毛孔变化情况；
图5为角质细胞相对存活率趋势图；
图6为TNF-α含量图；
图7为样品对TNF-α的相对抑制率对比图；
图8为两个样品对ABTS+清除的对比图；
图9为两个样品对羟基自由基清除的对比图；
图10两个样品对超氧阴离子清除的对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的实现进行详细的描述。
1：药用层孔菌预处理
药用层孔菌清水洗净，-80℃下冷冻干燥3h，粉碎，80目过筛；
2：超分子NADES溶剂的制备
甜菜碱、甘油葡糖苷以摩尔比1:2投入反应器，60℃下搅拌加热3h，得到粘稠液体。向粘稠液体中加入一定量的超纯水配制得到含水量30％的甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES溶剂。
3：多糖类、多酚类、三萜类的产率分析
为了表征甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES溶剂的提取效率，本发明做了以下工作，利用高效液相色谱法对提取得到的活性成分含量进行了分析，结果表示得到的多糖提取率高达27.58mg/mL，多酚提取率高达24.03ug/mL，三萜提取率高达41.35mg/mL。
测试1：药用层孔菌原料不同溶剂处理前后SEM分析
附图图1为药用层孔菌原料不同溶剂提取前后SEM分析图，
(a)层孔菌(未处理)；(b)层孔菌(水提取处理)；
(c)层孔菌(乙醇提取处理)；(d)层孔菌(超分子提取处理)
电镜扫描结果显示未经提取处理的药用层孔菌药材表面有大量颗粒物在表面，呈散状不规整，硬纤维完整如图1(a)；经水和乙醇处理的层孔菌药材发生一些物理结构上的轻微变化，硬纤维较完整，基本无破坏，如图图1(b-c)；采用甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES处理后的层孔菌药材表面组织明显被破坏，硬纤维表面呈多处凹槽或空隙，如图1(d)，说明超分子NADES提取过程中可以有效破坏细胞壁，促进细胞内活性成分溶出，提取效率更高，有效成分得率更高。
测试2：人体皮肤斑贴实验
检测目的：检测化妆品产品对人体皮肤潜在的不良反应。
检测依据：《化妆品安全技术规范》(2015年版)，第七章2。
材料和方法如下所示：
表1样品基本信息
斑试方法：选用合格的斑试器材，以封闭式斑贴试验方法，将受试物 0.020～0.025mL置于斑试器材内，外用低致敏胶带贴敷于受试者前臂曲侧，24 小时后去除受试物，分别于去除后0.5、24、48小时观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)中皮肤反应分级标准记录其结果。
检测结果如表2所示：
表2化妆品人体皮肤斑贴试验结果汇总
检测结论：本次3％药用层孔菌提取物(普通提取)斑贴试验，48小时后31 名受试者中0例出现皮肤不良反应。本次3％超分子NADES药用层孔菌提取物斑贴试验，48小时后31名受试者中0例出现皮肤不良反应。
测试3：人体控油收缩毛孔测试
检测目的：验证3％药用层孔菌提取物(普通提取)和3％超分子NADES药用层孔菌提取物的收缩毛孔功效。
检测方案：以临床医学为理论基础，由特定人群组成受试群体，通过无创性皮肤学测试仪器测定受试人群使用化妆品(以及化妆品功效成分)后变化。
皮肤毛孔参数：利用图像拍摄系统拍摄标准图像，基于光谱分析原理得到量化的毛孔参数值。
Sebumeter SM815(德国Courage+Khazakaelec-tronic Gmb H)基于特殊胶带的光度计原理，亚光胶带吸收皮肤上油脂越多，透光量越大，间接测定皮肤表面油脂含量。数值越低，控油效果越好。
附图图2为受试区及对照区VISIA-CR右脸脸颊测试结果图，
(a)毛孔面积；(b)毛孔数量；(c)油脂数据
皮肤探头测量仪及VISIA-CR测试结果：由图2(a)可得受试区毛孔面积下降率均大于对照区毛孔面积下降率；由图2(b)可得受试区毛孔数量下降率均大于对照区毛孔数量下降率且对照区毛孔数量在30min后有所上升，1h 后毛孔数量显著上升；由图2(c)可得受试区油脂有所下降，对照区油脂有所上升。
VISIA-CR照片结果如图3、4所示：10min、30min、1h、2h、3D后受试者03同一区域毛孔面积分别上升-7.76％、-0.70％、12.17％、50.86％、8.43％，毛孔数量分别上升了-9.68％、-0.40％、13.31％、54.44％、7.46％；10min、30min、 1h、2h、3D后受试者29同一区域毛孔面积分别下降14.02％、7.50％、12.05％、 14.55％、8.33％，毛孔数量分别下降了9.24％、3.88％、10.23％、11.89％、5.98％。
检测结论：本次测试受试样品(3％超分子NADES药用层孔菌提取物)和对照样品(3％药用层孔菌提取物(普通提取))各选择15名受试者连续使用3天，可知该产品具有以下功效：受试者在使用对照样品10min后右脸毛孔面积下降具有显著差异，1h、2h、3D后毛孔面积和数量增加；皮肤油脂上升12.94％且具备显著性差异；受试者在使用受试样品10min、30min、1h、2h后右脸脸颊毛孔面积和数量有显著差异，且在10min、30min时面积和数量有极度显著差异；皮肤油脂下降11.92％具备显著性差异；说明：3％超分子NADES 药用层孔菌提取物有控油及显著的短效收缩毛孔功效。
测试4：角质细胞毒性检测
检测目的：检测样品对角质细胞毒性的影响。
检测依据：SN/T 2328-2009化妆品急性毒性的角质细胞试验
检测结果：样品在角质细胞上开展细胞毒性检测试验，以MTT模型进行检测，细胞相对存活率趋势见图5所示：
检测结论：超分子NADES药用层孔菌提取物在1.25mg/ml范围内时，细胞相对存活率均在90％以上，则安全浓度范围为1.25mg/ml以内。超分子NADES 药用层孔菌提取物的IC50＝3.29mg/ml。
测试5：巨噬细胞炎症因子抑制试验
检测目的：LPS诱导RAW 264.7，是研究炎症因子的经典细胞模型，通过比较造模对照与受试物给药后RAW264.7分泌TNF-α含量的差异，评价受试物抑制TNF-α分泌的作用。
检测依据：T/SHRH 033-2020化妆品舒缓功效测试-体外TNF-α炎症因子含量测定脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7测试方法
检测结果：样品设置1个浓度，以地塞米松作为对照，在RAW 264.7细胞上开展TNF-α含量检测，组间TNF-α含量如图6所示，相对抑制率对比如 7所示。
检测结论：与阴性对照相比，模型组TNF-α含量上升且具有极显著性差异，证明实验造模成功。与造模对照相比，阳性对照TNF-α含量降低且具有极显著性差异，证明实验有效。
超分子NADES药用层孔菌提取物的浓度为0.313％时，TNF-α含量由模型组的3595.58pg/mL下降到3411.96pg/mL且具有显著性差异，有一定舒缓功效。
药用层孔菌提取物(普通提取)的浓度为0.313％时，TNF-α含量由模型组的3595.58pg/mL下降到3445.72pg/mL，无舒缓功效。
以超分子NADES药用层孔菌提取物浓度为0.313％时相对抑制率为100％，则药用层孔菌提取物(普通提取)的浓度为0.313％时相对抑制率为82％。测试6：ABTS自由基清除测试
检测目的：检测待测样品的抗氧化(清除自由基)能力。
检测步骤：根据样品特性及建议添加量设置合适的质量浓度梯度，并以去 PBS缓冲液作溶剂分别配制样液待测。设立样品管(AS)、样品本底(Ab)、样品空白管(A0)，每一样品的每个受试浓度的样品管(AS)需设立3支平行管，同时样品空白管(A0)也需设立3支平行管。在样品管(AS)和样品本底 (Ab)中各加入0.2mL相同浓度的样品溶液，样品空白管(A0)则加入0.2mL PBS缓冲液。在样品管(AS)和样品空白管(A0)中各加入0.8mL ABTS+工作液，样品本底(Ab)则加入0.8mL PBS缓冲液。避光反应6min。将各反应管溶液移入1cm比色皿中，在734nm处测定吸光值。
ABTS+自由基清除率(％)
检测结果如下所示：
表3不同浓度样品对ABTS+自由基的清除率
*表中数据为均值±相对偏差。
*统计方法：采用t检验方法进行分析，检验水准α＝0.05；p＞0.05，表示无统计学差异；0.01＜p＜ 0.05，有显著性差异；p＜0.01，非常有显著性差异；p＜0.001，极显著性差异。
检测结论：随着药用层孔菌提取物浓度的增加，ABTS+自由基清除率逐渐升高。当提取物浓度很低时，超分子NADES药用层孔菌提取物ABTS+自由基清除率较高。当提取物浓度升高时，药用层孔菌提取物(普通提取)ABTS+自由基清除率较高。综合来看两种样品的ABTS+自由基清除率相差不大，但考虑实际应用浓度，超分子NADES药用层孔菌提取物更有优势。
测试7：羟自由基清除测试
检测目的：检测待测样品的抗氧化(清除自由基)能力。
检测步骤:试管中加入5mmol/L邻二氮菲乙醇溶液1mL，pH 7.4的0.2 mol/L磷酸缓冲液2mL和样品溶剂1mL，充分混匀后加入5mmol/L硫酸亚铁溶液1mL，再加入1mL 0.1％H2O2，最后置37℃下水浴加热1h，在波长536 nm处测定其吸光度得A损。未损伤管：以1mL三级水代替损伤管中1mL 0.1％的H2O2；样品管：1mL样品溶液代替损伤管中1mL样品溶剂。
·OH-自由基清除率(％)
检测结果如下：
表4不同浓度样品对·OH-自由基的清除率
*表中数据为均值±相对偏差。
*统计方法：采用t检验方法进行分析，检验水准α＝0.05；p＞0.05，表示无统计学差异；0.01＜p＜0.05，有显著性差异；p＜0.01，非常有显著性差异；p＜0.001，极显著性差异。
检测结论：随着超分子NADES药用层孔菌提取物浓度的增加，·OH-自由基清除率逐渐升高。而药用层孔菌提取物(普通提取)的清除规律与之恰恰相反。综合来看在测定浓度范围内，超分子NADES药用层孔菌提取物·OH-自由基清除率远远高于药用层孔菌提取物(普通提取)，超分子NADES药用层孔菌提取物对于清除·OH-自由基更有优势。
测试8：超氧阴离子自由基清除测试
检测目的：检测待测样品的抗氧化(清除自由基)能力。
检测步骤:设立样品管(AS)、样品本底(Ab)、样品空白管(A0)，每一样品的每个受试浓度的样品管(AS)需设立3支平行管。在每个反应管中各加入0.45mL 0.05M Tris-HCl缓冲液和0.25mL三级水，然后37℃水浴20min；在样品管(AS)和样品空白管(A0)中各加入0.05mL邻苯三酚溶液，样品本底(Ab)则加入0.05mL 0.01M HCl溶液，快速摇匀混合后，于25℃水浴反应8min；最后在每个反应管中各加入0.15mL 0.2M HCl溶液。混匀，于300 nm处测吸光值。
·O2-自由基清除率(％)
检测结果如下所示：
表5不同浓度样品对·O2-自由基的清除率
*表中数据为均值±相对偏差。
*统计方法：采用t检验方法进行分析，检验水准α＝0.05；p＞0.05，表示无统计学差异；0.01＜p＜0.05，有显著性差异；p＜0.01，非常有显著性差异；p＜0.001，极显著性差异。
检测结论：随着超分子NADES药用层孔菌提取物浓度的增加，·O2-自由基自由基清除率逐渐升高，最高可达84.37％。而药用层孔菌提取物(普通提取) 的·O2-自由基清除率一直保持在一个较低的范围。综合来看在测定浓度范围内，超分子NADES药用层孔菌提取物·OH-自由基清除率远远高于药用层孔菌提取物(普通提取)，超分子NADES药用层孔菌提取物对于清除·O2-自由基更有优势。
测试9：DPPH自由基清除测试
检测目的：检测待测样品对DPPH自由基的清除率。
检测步骤：参考T/SHRH 006-2018《化妆品-自由基(DPPH)清除实验方法》中的5.实验方法。
检测结果如下：
表6样品对DPPH自由基的清除
*表中数据为均值±相对偏差。
*统计方法：采用t检验方法进行分析，检验水准α＝0.05；p＞0.05，表示无统计学差异；0.01＜p＜0.05，有显著性差异；p＜0.01，非常有显著性差异；p＜0.001，极显著性差异。
检测结论：两个样品均无DPPH自由基清除能力。
测试10：总还原能力测定
检测目的：检测待测样品的抗氧化(清除自由基)能力。
检测步骤：设立样品管(A1)、样品本底管(A2)、样品空白管(A3)和溶剂本底管(A4)，每一样品的每个受试浓度的样品管(A1)需设立3支平行管。在样品管(A1)中加入50μL的样品溶液，250μLpH6.5的PBS缓冲液和250μL的0.1％铁氰化钾溶液，混匀，置50℃水浴槽保温20min后，迅速冷却至室温，加入250μL的10％三氯乙酸溶液，可能会离心，再加入1 mL超纯水和400μL 0.1％氯化铁溶液，混匀，放置室温10min后在波长700 nm处测定吸光值。其中，样品本底管(A2)以超纯水代替铁氰化钾、三氯乙酸和氯化铁，样品空白管(A3)以PBS缓冲液代替样品，溶剂本底管(A4)在样品本底管(A2)的基础上，再以PBS缓冲液代替样品。
以VC的亚铁离子还原量为100％还原，计算相对还原率，检测结果如下：
表7样品相对于VC的还原率
*表中数据为均值±相对偏差。
*统计方法：采用t检验方法进行分析，检验水准α＝0.05；p＞0.05，表示无统计学差异；0.01＜p＜0.05，有显著性差异；p＜0.01，非常有显著性差异；p＜0.001，极显著性差异。
检测结论：随着药用层孔菌提取物浓度的增加，相对还原率逐渐升高。在测定浓度范围内，超分子NADES药用层孔菌提取物相对还原率普遍高于药用层孔菌提取物(普通提取)，超分子NADES药用层孔菌提取物更有优势。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (4)

1.一种通过超分子工艺从药用层孔菌中提取多糖类、多酚类及三萜类成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)药用层孔菌清水洗净，冷冻干燥，粉碎，过筛；
(2)甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES溶剂的制备；
(3)将药用层孔菌粉末加入到超分子NADES溶剂中，超声强化处理得到提取液；
(4)提取液静置24h，随后离心筛选得上层清液；
(5)对上层清液进行高效液相色谱分析，得出多糖类、多酚类、三萜类的提取产率；
(6)对得到的上层清液进行过滤、浓缩得到浓缩提取物；
步骤(2)中，甜菜碱、甘油葡糖苷以摩尔比1:2投入反应器，60-120℃下搅拌加热3-12h，得到粘稠液体；向粘稠液体中加入一定量的超纯水配制得到含水量30％的甜菜碱甘油葡糖苷超分子NADES溶剂。
2.根据权利要求1所述的一种通过超分子工艺从药用层孔菌中提取多糖类、多酚类及三萜类成分的方法，其特征在于，步骤(1)中，冷冻干燥时间为3-12h，粉碎得到的药用层孔菌粉末需进行80目的过筛操作。
3.根据权利要求1所述的一种通过超分子工艺从药用层孔菌中提取多糖类、多酚类及三萜类成分的方法，其特征在于，步骤(3)中，提取时使超分子NADES溶剂与药用层孔菌粉末的重量体积比为10-50mL:1g，在温度25℃，超声功率100W条件下处理1h。
4.根据权利要求1所述的一种通过超分子工艺从药用层孔菌中提取多糖类、多酚类及三萜类成分的方法，其特征在于，步骤(4)中，离心参数为5000-10000r/min，离心10-30min。
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