JP5946253B2 - 弾性線維形成促進剤 - Google Patents
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例えば海藻であれば、限定はされないが、典型的には、ガゴメコンブを粉砕機などで細断したものを、水、あるいは有機溶媒を単独あるいは組み合わせて得られる溶媒を用いて抽出、溶解または懸濁することにより得ることができる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−ブタノール等のアルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシドなどを挙げることができる。
基剤又は担体としては、流動パラフィン、スクワラン、ゲル化炭化水素(プラスチベースなど)、オゾケライト、α−オレフィンオリゴマー、軽質流動パラフィンのような炭化水素;メチルポリシロキサン、架橋型メチルポリシロキサン、高重合メチルポリシロキサン、環状シリコーン、アルキル変性シリコーン、架橋型アルキル変性シリコーン、アミノ変性シリコーン、ポリエーテル変性シリコーン、ポリグリセリン変性シリコーン、架橋型ポリエーテル変性シリコーン、架橋型アルキルポリエーテル変性シリコーン、シリコーン・アルキル鎖共変性ポリエーテル変性シリコーン、シリコーン・アルキル鎖共変性ポリグリセリン変性シリコーン、ポリエーテル変性分岐シリコーン、ポリグリセリン変性分岐シリコーン、アクリルシリコン、フェニル変性シリコーン、シリコーンレジンのようなシリコーン油;エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体;ポリビニルピロリドン;カラギーナン;ポリビニルブチラート;ポリエチレングリコール;ジオキサン;ブチレングリコールアジピン酸ポリエステル;ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸セチル、イソノナン酸イソノニル、テトラ2−エチルヘキサン酸ペンタエリスリットのようなエステル類;デキストリン、マルトデキストリンのような多糖類;エタノール、イソプロパノールのような低級アルコール;エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、ジプロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールモノプロピルエーテルのようなグリコールエーテル;ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、グリセリン、イソプレングリコールなどの多価アルコール;水などの水系基剤などが挙げられる。
キレート剤としては、EDTA・2ナトリウム塩、EDTA・カルシウム・2ナトリウム塩などが挙げられる。
本発明の外用組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の有効成分を含むことができる。有効成分の具体例としては、例えば、保湿成分、抗炎症成分、抗菌成分、ビタミン類、ペプチド又はその誘導体、アミノ酸又はその誘導体、細胞賦活化成分、老化防止成分、血行促進成分などが挙げられる。
ガゴメコンブ500gをカッターミルで細断し、洗浄及び/又は脱色するために10リットルの80%エタノール中に懸濁して、3時間攪拌した後、ろ紙でろ過し、残渣を得た。残渣に50リットルの精製水を添加し、95℃で10時間処理後に、処理液を室温まで冷却し、最終濃度が30%になるようにエタノールを添加した。この処理液を室温で約24時間静置し、遠心分離によって固液分離を行った。得られた上清に0.5N塩酸を添加して低温に24時間静置し、生じた沈殿を遠心分離で除去し、得られた上清に0.5N水酸化ナトリウムを加えてpHを中性付近に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥して低分子フコイダンを得た。
分子量の測定方法としては、GPC法により、フコイダン抽出液を25mM Tris-HCl緩衝液(150mM NaCl含有、pH7.5)に溶解し、1mg/mLの被験溶液を調製し、HPLCカラム Superdex peptide 10/300 GL(10mm I.D.×30cm,流量:0.4ml/min、カラム温度40℃、注入量100μl、GEヘルスケア社製)およびSuperdex 200 10/300 GL(10mm I.D.×30cm,流速:0.4ml/minカラム温度40℃、注入量100μl、GEヘルスケア社製)を同じ緩衝液で平衡化し、このカラムに被験溶液を100μL注入する。そして、溶出時間から重量平均分子量1800〜12000の範囲内であることを確認した。
市販のフコイダン(タカラバイオ社製、商品名:TaKaRa海藻エキス、エタノール抽出)をそのまま利用した。
無血清下での実験
24ウエルプレートの底にMicroscope Cover Glass(Fisherbrandから購入)を置き、その上にヒト皮膚線維芽細胞を1ウエルあたり7.5×104個播種し、継代用培地(DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,Invitrogenから購入)、10%ウシ胎仔血清(FBS、JRH Bioscienceから購入)、2mMのグルタミン、100units/mLのペニシリン、100g/mLのストレプトマイシン)にて37℃、5%CO2で培養した。さらに、血清を含まない弾性線維形成培地、すなわち、DMEM/F12、2mMのグルタミン、100units/mLのペニシリン、100g/mLのストレプトマイシンを用い、ヒト線維芽細胞を1ウエルあたり7.5×104個播種し、この無血清培地に、製造例1または比較製造例で得た低分子フコイダンまたは高分子フコイダンを0.0001%加えて、あるいは加えないで、37℃、5%CO2で4週間培養した。4週間の培養後、弾性線維の蛍光免疫染色を行なった。詳細には、1mLのPBSを用いて3回洗浄した後、100%メタノールを用い、−20℃で20分間固定した。更にPBSを用いて洗浄した後、2%BSAを含むPBSを用い、室温で1時間ブロッキングした後、1次抗体として抗エラスチンポリクローナル抗体(Elastin Products Companyから購入)を用い、2次抗体としてAlexa488−抗ウサギIgG抗体(Invitrogenから購入)を用いた。1次抗体と室温で1時間以上インキュベートした後、PBSで洗浄し、上記の2次抗体と室温で1時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で10分間固定し、再びPBSで洗浄した後、Hoechst33258(Dojindoから購入)を用いて室温で5分間反応させ、再びPBSで洗浄した後、Aqua Poly/Mount(Poluscienceから購入)にてスライドガラス上にサンプルをマウントした。観察は蛍光顕微鏡DMIRE2(LEICA)IX71(Olympus)を用いて行った。その結果を図1に示す。
化粧料組成物
以下の化粧品組成物を調製する。処方例中の数値の単位は「重量%」である。
以下の低分子フコイダンとは、ガゴメ由来の重量平均分子量700〜30000のものである。
内服組成物
以下の食品組成物の処方例において、フコイダンの重量は乾燥重量である。
食品組成物の全処方において、フコイダンとしては、エタノール抽出物を行う。
Claims (12)
- 重量平均分子量が1800〜12000である低分子フコイダンを有効成分として含有する弾性線維形成促進剤。
- 前記低分子フコイダンが、海藻類又は有棘動物類に由来する、請求項1記載の弾性線維形成促進剤。
- 前記低分子フコイダンが、イソガワラ目、アミジグサ目、ナガマツモ目、カヤモノリ目、ムチモ目、ケヤリモ目、ウルシグサ目、コンブ目、イシゲ目、ヒバマタ目、シオミドロ目、ウイキョウモ目、ウスバオオギ目、クロガシラ目、チロプテリス目、アスコセイラ目、ヒバマタ目、およびドゥルビアエラ目に属する群より選択される褐藻類の少なくとも1種に由来する、請求項1又は2に記載の弾性線維形成促進剤。
- 前記低分子フコイダンが、ガゴメコンブ、マコンブ、ホソメコンブ、ミツイシコンブ、チジミコンブ、ヒメコンブ、トロロコンブ、ヒバマタ、モズク、オキナワモズク、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、レッソニア ニグレセンス、アスコフィラム ノドッサム、ジャイアントケルプ、ナガマツモ、クロモ、イシモズク、フトモズク、エゾイシゲ、オオバモク、アカモク、ウガノモク、フジスジモク、ウミトラノオ、アミジグサ、及びエゾハヤズからなる群より選択される褐藻類の少なくとも1種に由来する、請求項1〜3のいずれか1項記載の弾性線維形成促進剤。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の弾性線維形成促進剤を含有する、弾性線維形成促進用組成物。
- 低分子フコイダンを、全量に対して、0.000001〜99重量%含む、請求項5記載の弾性線維形成促進用組成物。
- 化粧料である、請求項5または6記載の弾性線維形成促進用組成物。
- 食品である、請求項5または6記載の弾性線維形成促進用組成物。
- さらに、DANCE発現増強因子を含む、請求項5〜8のいずれか1項記載の弾性線維形成促進用組成物。
- 前記DANCE発現増強因子として、ナンテンカズラエキス、シカクマメエキス、フィチン酸又はその生理学的に許容される塩、あるいはL−ヒドロキシプロリン又はその生理学的に許容される塩を含む、請求項9に記載の弾性線維形成促進用組成物。
- 重量平均分子量が1800〜12000である低分子フコイダンを有効成分として含有する人工弾性線維形成促進剤。
- 重量平均分子量が1800〜12000である低分子フコイダンを用いて、インビトロで弾性線維を形成させる方法。
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