ES2610969T3

ES2610969T3 - Polisacáridos a partir de Prasinococcales

Info

Publication number: ES2610969T3
Application number: ES13730626.2T
Authority: ES
Inventors: Charles Daniel Bavington; Claire Moss
Original assignee: Glycomar Ltd
Current assignee: Glycomar Ltd
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2017-05-04
Anticipated expiration: 2033-05-13
Also published as: WO2013167911A1; GB201208325D0; CN104470530B; CN104470530A; AU2013257798B2; US20150119355A1; CA2870344C; US20170000833A1; EP2846813B1; EP2846813A1; US10034906B2; CA2870344A1; US9453082B2; JP6270822B2; AU2013257798A1; JP2015517587A; IL235144B; IL235144A0

Abstract

Un polisacárido que forma gel obtenible a partir de células de microalgas del orden Prasinococcales donde el polisacárido que forma gel es un heteropolímero sulfatado de peso molecular de al menos 670kDa que comprende unidades de glucosa, galactosa, arabinosa y ácido urónico para uso en el tratamiento de trastornos del sistema inmune.

Description

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Preparación de un polisacárido

En realizaciones, un polisacárido para uso en la invención o derivados de tal polisacárido puede ser un polisacárido aislado a partir de una fracción celular o secretada de un cultivo de Prasinococcus capsulatus o una cepa relacionada con P. capsulatus. En realizaciones el polisacárido para uso en la invención o al menos un derivado de tal polisacárido se puede aislar a partir de la fracción celular de un cultivo de Prasinococcus capsulatus o una cepa relacionada con P. capsulatus.

En realizaciones el polisacárido para uso en la invención o al menos un derivado de tal polisacárido se puede aislar a partir de la fracción secretada de un cultivo de Prasinococcus capsulatus o una cepa relacionada con P. capsulatus.

En realizaciones, un cultivo de Prasinococcus capsulatus puede ser la cepa de algas de Prasinococcus capsulatus CCMP1194. Esta cepa de algas está disponible públicamente. El cultivo se puede crecer adecuadamente en un medio de cultivo de algas como se conocería en la técnica donde las modificaciones del nitrógeno, vitamina, sílice o trazas de metales proporcionados en el medio de algas pueden hacerse como sería conocido por un experto en la técnica. El medio de cultivo de algas se puede usar con una base de agua de mar o usando un agua de mar sintética.

En realizaciones un medio de crecimiento f/2 se puede usar con la siguiente composición:

Soluciones madre:

Elementos de rastreo:: g/Litro Mezcla de vitaminas g/Litro

Na2EDTA·2H2O: 4,16 Vitamina B12 0,0005

(cianocobalamina)

FeCl3·6H2O: 3,15 Tiamina HCl (Vitamina B1) 0,1

CuSO4·5H2O: 0,01 Biotina 0,0005

ZnSO4·7H2O: 0,022

CoCl2·6H2O: 0,01

MnCl2·4H2O: 0,18

Na2MoO4·2H2O: 0,006

Tal medio de cultivo es discutido por Sieburth y colaboradores, Widespread occurrence of the oceanic ultraplankter, Prasinococcus capsulatus (prasinophyceae), the diagnostic “golgi-deccapore complex” and the Nelsy described polysaccharide “capsulan”. J. Phycol. 35, 1032-1043 (1999) y Guillard R. y Ryther J. 1962 Studies of marine plnktonic diatoms. Can. J. Microbiol. 8: 229-239.

El medio adecuado puede hacerse añadiendo lo siguiente a 950 mls de agua de mar filtrada (salinidad 29-32 ppt).

Medio: g/Litro

NaNO3 0,075

NaH2PO4·2H2O 0,00565 Solución madre de los elementos de rastreo 1 mL Solución madre de la mezcla de vitaminas 1 mL Típicamente el pH puede ajustarse a 8,0 (2 ml de Tris-HCl 1M a pH 8 por litro de medio) y el medio se lleva a 1 litro

con agua de mar. El medio puede esterilizarse en un autoclave (p.ej., 121ºC, 15 mins) y almacenarse a 2-8ºC. Se pueden usar variaciones para el cultivo de P. capsulatus donde se usa el 80% de NaH2PO4·2H2O indicado

anteriormente, más 100 mg de glicerofosfato de sodio / litro y donde se incluye dos veces la concentración de NaNO3 para aumentar la biomasa. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para producir el

polisacárido para uso en la invención o un derivado del polisacárido donde el método comprende las etapas: cultivo de microalgas, adecuadamente un cultivo de Prasinococcus capsulatus, en particular la cepa de algas de Prasinococcus capsulatus CCMP1194,

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separación de la biomasa de microalgas del medio de cultivo,

concentración y desalación del medio de cultivo y

secado del medio de cultivo.

Adecuadamente, la separación de la biomasa de las microalgas del medio puede ser por centrifugación. En realizaciones alternativas la separación puede ser realizada adecuadamente por filtración, floculación, o filtración de flujo tangencial. Adecuadamente la concentración puede ser por filtración de flujo tangencial. Esto puede ser usando una membrana de 100kDa. Esto puede permitir la desalación del medio si también se lleva a cabo la diafiltración.

Adecuadamente, la separación del polisacárido del medio se puede proporcionar por precipitación,

diálisis,

filtración de flujo tangencial y/o

cromatografía de intercambio iónico.

En realizaciones, la separación se proporciona por cromatografía de intercambio iónico y concentración por filtración de flujo tangencial.

Después de la separación la fracción del medio puede secarse. El secado se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, liofilización y secado por calor, secado en estantes usando presión atmosférica reducida o vacío para secar a temperatura ambiente (20 grados centígrados), secado por pulverización, secado rotativo, o secado por centrifugación.

Adecuadamente el secado puede ser secado por pulverización de un medio concentrado y desalado.

Las células (sedimentos celulares) se pueden procesar también para extraer el polisacárido diana, por ejemplo el paso de extracción puede ser un paso de extracción con agua caliente o un paso de digestión enzimática u otro protocolo de extracción adecuado.

La extracción se puede llevar a cabo usando por ejemplo, interrupción a presión, molienda en un molino de bolas, sonicación, o mezclado (alta velocidad o Waring).

Un método preferido puede proporcionar un derivado (s) del polisacárido donde los derivados se preparan por despolimerización del polisacárido nativo por un método de radicales libres o fotoquímico, seguido de fraccionamiento usando cromatografía de exclusión de tamaño o cromatografía de flujo tangencial para producir fracciones de oligosacáridos de peso molecular definido.

Tratamiento

Un polisacárido, un derivado del mismo o una composición que contiene el polisacárido o un derivado del mismo pueden usarse para el tratamiento de un número de afecciones médicas. El tratamiento incluye cualquier régimen que pueda beneficiar a un animal humano o no humano. El tratamiento puede ser con respecto a una afección existente o puede ser profiláctico (tratamiento preventivo). El tratamiento puede incluir efectos curativos, de alivio o profilácticos.

Adecuadamente un polisacárido, un derivado del mismo o una composición que contiene el polisacárido o un derivado del mismo pueden proporcionarse como una tableta o cápsula. Adecuadamente, un polisacárido, un derivado del mismo o una composición que contiene el polisacárido o un derivado del mismo pueden administrarse en una formulación de liberación sostenida. Adecuadamente el polisacárido, un derivado del mismo o una composición que contiene el polisacárido o un derivado del mismo pueden proporcionarse como un suplemento dietético a un animal, incluyendo seres humanos, que proporcionará un beneficio protector al animal y/o se usará terapéuticamente para modular la respuesta inmune, en particular para modular la respuesta inflamatoria, del animal en particular un ser humano.

Administración

La invención proporciona un polisacárido para uso o un derivado de la presente invención, o una composición que contiene el mismo, para uso como un medicamento. El medicamento puede ser para uso humano o uso veterinario. Adecuadamente en uso veterinario el paciente animal puede ser un animal terrestre, más adecuadamente animales de compañía o de rendimiento. Adecuadamente un paciente puede ser un ser humano. Adecuadamente, un derivado del polisacárido o una composición que contiene el polisacárido o un derivado del mismo pueden aplicarse tópicamente al paciente, p.ej., aplicarse en la piel.

El producto de la presente invención se puede administrar por vía oral, tópica, rectal o parenteral, nasal o pulmonar (por inhalación). Típicamente, el médico determinará la dosis real que será la más adecuada para un paciente

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enzima alcalasa 2,5L DX (Novozyme) a una concentración de 1 vol de enzima a 100 vols de muestra, y se incubaron durante una noche a 60ºC con agitación. La muestra se separó, se centrifugó a 10.000g para sedimentar los restos celulares y el sobrenadante se eliminó. El sobrenadante se dializó frente al agua usando una membrana MWCO 8kDa usando 10 lotes de volúmenes de agua con 4 cambios durante 36 horas. El sobrenadante desalado puede congelarse o secarse por pulverización para generar la muestra de polisacárido. Además MWCO que usan cualquier técnica apropiada se pueden usar para aislar el polisacárido diana, pero específicamente la separación por centrifugación que usa MWCO Vivaspin 300kDa (Sartorius) se usó para generar una fracción de alto MW.

Ejemplo 4 – Despolimerización y purificación del oligosacáridos.

El polisacárido diana de alto peso molecular se puede despolimerizar en fragmentos más pequeños usando técnicas tales como la digestión enzimática o la hidrólisis ácida. Específicamente se puede despolimerizar por la introducción de peróxido de hidrógeno en una solución caliente del polisacárido, para generar radicales libres, que atacan los enlaces glicosídicos (Rota C y colaboradores. 2005 Free radical generation during chemical depolymerization of heparin. Anal. Biochem. 344(2): 193-203. y Peti AC y colaboradores 2006 Free-radical depolymerization with metallic catalysts of an exopolysaccharide produced by a bacterium isolated from a deep-sea hydrothermal vent polychaete annelid. Carbohydrate Polymers 64: 597-602). Las variables clave son la relación peroxide de hidrógeno a polisacárido, temperatura y control de pH. La muestra de polisacárido sólido se añadió al agua a aproximadamente 2 mg/ml, se disolvió y se calentó a 60ºC en un baño de agua con agitación. La solución de sales de cobre se añadió para dar una concentración 0,01M. La muestra se ajustó a pH 7,5 usando un controlador de pH conectado a una bomba que contiene hidróxido de sodio. En este punto la reacción empieza bombeando el peróxido de hidrógeno en el recipiente a un caudal constante, p.ej., de 0,5 ml/min, con el controlador de pH ajustado para mantener el pH a 7 girando la bomba de hidróxido de sodio cuando sea necesario. Una vez que la reacción se llevó a cabo durante el periodo deseado las bombas se pararon y el pH se bajó usando ácido acético 20% (5 microL/ml de reacción), chelex 100 (Sigma) se añadió a 60 mg/ml de reacción y la reacción se mezcla en un agitador rotatorio hasta que esté clara. La reacción entera se separó del chelex y se almacenó a -20ºC. Los productos se purificaron a partir de la reacción mediante el intercambio de cualquier resto de iones de cobre con iones de sodio usando cromatografía de intercambio aniónico Q-sepharose (GE) seguido por desalación/separación por cromatografía de exclusión de tamaño por Superdex 30 (GE) usando columnas preempaquetadas y un sistema Buchi Sepacore con detectores para A214, A280 y conductividad. La columna Q-sepharose se equilibró con la fase móvil Tris-HCl 50 mM pH 7,5, cloruro de sodio 50 mM, seguido de la carga de la reacción de despolimerización, y lavado durante 20-30 minutos adicionales con fase móvil todo a 10 ml/min. Después el polisacárido unido se eluyó con una solución de cloruro de sodio 5M y se recogió. El eluido se añadió en lotes de 5ml a una columna preempaquetada de exclusión de tamaño Superdex 30 a 1 ml/min con agua como fase móvil. La separación se llevó a cabo durante 120 minutos, con fracciones recogidas de 3 ml usando un colector de fracciones Pharmacia. Se identificaron las fracciones de polisacárido de diferentes intervalos de peso molecular, se combinaron y se liofilizaron. Específicamente se recogieron normalmente dos intervalos de tamaño que representan derivados de 2-10kDa y 20-60kDa pero otros tamaños se pueden recoger. Las soluciones madre de los derivados se inyectaron en una columna de HPLC de exclusión de tamaño (Biosep4000, YMC Diol300 o YMC Diol120) para confirmar el peso molecular aproximado (véase más adelante).

Ejemplo 5 – Determinación del peso molecular aproximado

El peso molecular del polisacárido o derivado del polisacárido se estimó por cromatografía de exclusión de tamaño usando un HPLC Waters Alliance (2695) con detección del índice de refracción (Waters 2410) y del fotodiodo de matriz (210-380 nm) (Waters 996). Las columnas de exclusión de tamaño YMC300-Diol o Biosep4000 se equilibraron a 30-37ºC con la fase móvil Tris-HCl 50mM pH7, EDTA 1mM, y NaCl 0,9% filtrada en 0,2 micras. Las columnas se equilibraron usando estándares de dextrano (Fluka: 12, 27, 50, 80, 270, 670kDa), por inyección de 20 microL en la fase móvil, funcionando a 0,5 o 1 ml/min (YMC300 o Biosep4000) con separaciones isocráticas de 10 o 15 minutos. La curva estándar se generó usando la fórmula Kav = (tiempo de retención – V0)/(Vt-V0), y representando Kav frente al peso molecular. Las muestras se inyectaron a 20 microL de una solución de 0,1 mg/ml en la fase móvil y funcionaron según las normas. Los datos se integraron manualmente con el software Millennium de Waters, con o sin la resta de la línea base del blanco. Los tiempos de retención de la muestra se compararon con aquellos generados por la curva estándar para calcular el peso molecular aproximado usando la fórmula anterior.

Además, el peso molecular del polisacárido nativo de P. capsulatus se puede estimar por técnicas de equilibrio de sedimentación. Específicamente se usó el equilibrio de sedimentación usando una centrífuga analítica Beckman XL-I (AUC) equipada con óptica de absorción de barrido. Las muestras se resuspendieron a 0,5 mg/ml en cloruro de sodio 0,1M en agua. Un experimento de velocidad de sedimentación se realizó para evaluar la confirmación de la muestra y la heterogeneidad, y evaluar los parámetros necesarios para el subsiguiente equilibrio de sedimentación. El equilibrio de sedimentación se realizó a una velocidad de rotor de 1.400rpm y una columna de 1mm.

Ejemplo 6 – Determinación del contenido aproximado de sulfato.

Diversos métodos se pueden usar para determinar el contenido de sulfato del polisacárido o derivados de polisacárido diana. Específicamente la determinación del sulfato se realizó en base al método de Terho & Hartiala K (Method for the determination of sulphate contento f glycosaminoglycans. Analytical Biochemistry (1971) 41 (2):471

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476). 25 µl de muestra de 1mg/ml o control (Condroitina Sigma C4384 o heparina Sigma H3393) en agua se puso en un vial de reacción. Se añadió HCl 1M para dar una concentración final de HCl 0,5-1M y los viales se calentaron a 100ºC durante 2 horas. La muestra hidrolizada se evaporó por rotación usando un Speed Vac (Jouan RC10/10 con una trampa refrigerada RCT60) bajo vacío a 60-65ºC hasta sequedad (normalmente 1-2 horas). El hidrolizado seco se disolvió en 250 microL de agua (0,1mg/ml).

Los estándares se prepararon a partir de ácido sulfúrico 1mM para dar concentraciones en el ensayo de 0,048, 0,096, 0,192, 0,288, 0,384, 0,432, 0,48 µg de sulfato. Se pipetearon 100 microL de cada muestra, estándar, control o blanco (solo agua) en un eppendorf, al que se añadió 400 microL de etanol y se mezclaron exhaustivamente. 125 microL de esta mezcla se añadieron por triplicado a pocillos de una placa de ensayo de 96 pocillos, 50 µL de tampón de BaCl2 (recién preparado con ácido acético 0,2M, cloruro de bario 0,1mM, hidrógeno carbonato de sodio 1,6mM todo en etanol absoluto) se añadió a cada pocillo, seguido de 75 µL de solución de rodizonato de sodio (recién preparado con 0,05mg/ml, 1 mg/ml de ácido L-ascórbico en etanol absoluto). La placa se agitó a una velocidad media durante 30 segundos, se incubó en la oscuridad durante 10 minutos y se agitó otra vez. La intensidad del color se midió en un lector de microplacas de absorbancia a 520 nm usando el software Gen5. La absorbancia se calculó restando la absorbancia media para cada muestra, estándar o control de la absorbancia media del blanco. La curva estándar se generó representando la absorbancia del blanco frente a la concentración de sulfato para cada estándar de ácido sulfúrico, y se interpoló el contenido de sulfato de las muestras y los controles. Este valor se corrige para diluciones y volúmenes para dar % de sulfato = ((MediaΔA520x40)/50)x100.

La determinación del sulfato se realizó también por espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES). 10 mg de polisacárido se resuspendieron en 1 ml de agua y después se extrajeron en ácido nítrico:ácido clorhídrico (agua regia). Las muestras se nebulizaron y el aerosol producido se transportó a una antorcha de plasma donde ocurrió la excitación. Los espectros característicos de la línea atómica para el azufre se produjeron por un plasma de radio frecuencia acoplado inductivamente. Los espectros se dispersaron mediante un espectrofotómetro de rejilla y las intensidades de las líneas se monitorizaron mediante tubos fotomultiplicadores. Las fotocorrientes de los tubos fotomultiplicadores se procesaron y el contenido de azufre se calculó en base a los estándares de azufre (calibración multipunto) y se convirtió al valor del sulfato por fórmula matemática.

Ejemplo 7 – Determinación de la composición del monosacárido.

La composición del monosacárido se puede determinar usando un número de métodos diferentes. Específicamente, la composición del monosacárido se determinó por metanolísis y derivatización con trimetilsilano (TMS) seguido del análisis de la composición usando un equipo Shimadzu GC-2014 con detección de ionización de llama (GC-FID). Los viales de reacción se limpiaron con calor en un horno durante 6 horas a 450ºC. 100 microg de la muestra (como unos 10 mg/ml de solución) se transfirieron a un vial y 5 nmol del estándar interno escilo-inositol se añadieron a cada muestra. Un vial que contiene 5 nmol de cada estándar de monosacárido se preparó también conteniendo esciloinositol (I8132 Sigma), arabinosa (A3131 Sigma), xilosa (X-1500 Sigma), manosa (M6020 Sigma), fucosa (F2252 Sigma), ramnosa (R3875 Sigma), galactosa (G0750 Sigma), glucosa, glucosamina (G4875), galactosamina (G0500), ácido glucurónico (G5269), galacturónico (48280 Fluka), ácido siálico (todas preparadas como las soluciones madres 100mM). Todos los viales se secaron en un Speed-vac (Joun RC10/10 con una trampa refrigerada RCT60) bajo vacío a 60-65ºC hasta sequedad (normalmente 1-2 horas). Se añadieron 40 microL de metanol puro, las muestras se secaron otra vez como se indicó anteriormente y después se resuspendieron en 100 microL de HCl metanólico 0,5M. Los viales se calentaron a 85ºC en un bloque de calor durante 4 horas. Después de enfriar se añadieron 20 microL de piridina pura para neutralizar el HCl y después se añadieron 20 microL de anhídrido acético puro para re-N-acetilar cualquier amina primaria libre (durante 30 minutos a temperatura ambiente). Después los viales se secaron otra vez (speed vac como se indicó anteriormente), se añadieron 40 microL de metanol puro para lavar, los viales se re secaron (10 minutos en el speed vac como se indicó anteriormente). Después se añadieron 40 microL del reactivo de TMS puro y se mezcló exhaustivamente para resuspender la muestra. Los viales se sellaron y se dejaron durante al menos 10 minutos antes de inyectar 1 microL en el Shimadzu GC-2014 con detección de ionización de llama (inyección sin división a 300ºC). La columna fue ZB5-ms, 30 m x 0,25 mm i.d. x 0,25 µm de espesor de película. Se analizaron los cromatogramas generados. El área cortada se ajustó manualmente para cada muestra hasta que se identificaron 20-30 picos. Las áreas de los picos y los tiempos de retención se correlacionaron con los estándares del monosacárido.

Cada pico se calculó:

Relación = área del pico/área del pico del estándar interno;

Relación estándar = área del estándar/área del estándar interno para cada estándar;

nmoles = (5nmoles/relación estándar) x relación muestra;

% de cada monosacárido presente en la muestra original = nmoles/total nmoles x 100.

La composición del monosacárido del polisacárido de P. capsulatus también se determinó por hidrólisis con ácido trifluoroacético (TFA) seguido de cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Las muestras del polisacárido de P. capsulatus y derivados se

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resuspendieron a aproximadamente 10 mg/ml en TFA 2M. Se incubaron a 120ºC durante 1 hora en un bloque de calor, con agitación vigorosa después de 30 minutos. Después se centrifugaron y se recuperó el sobrenadante. El sedimento se lavó con 0,5 ml de agua, se volvió a centrifugar y el lavado se combinó con el sobrenadante original. La solución recuperada se secó a vacío para eliminar el TFA y el residuo seco se resuspendió en 1 ml de agua. Una dilución 1/10 de la muestra se inyectó en una columna Dionex PA1 junto con unas series de dilución de monosacáridos, disacáridos y ácidos urónicos estándar. (Esta mezcla contenía fucosa, ramnosa, arabinosa, galactosa, glucosa, xilosa, manosa, ribosa, celobiosa, maltosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico). Las muestras se separaron por gradiente y se resolvieron con PAD. La recuperación de los monosacáridos se calculó por comparación con los estándares.

10 microL de hidrolizados con TFA (nominalmente 100-160 microg de polisacárido) se cargaron también en 2 hojas de papel Whatman número 20. También se cargó la mezcla de estándares de monosacárido –ribosa, ramnosa, xilosa, fucosa, arabinosa, manosa, glucosa, galactosa, ácido galacturónico-. La cromatografía en papel se realizó mediante la ejecución de una hoja en la fase móvil butanol/ácido acético/agua 12:3:5 durante 30 horas, y la otra en la fase móvil acetato de etilo/piridina/agua 8:2:1 durante 3 días con separación por carga. Las láminas se tiñeron con hidrógeno ftalato de anilina para visualizar los monosacáridos.

Ejemplo 8 – Determinación de la citotoxicidad.

Se pueden usar varios ensayos de cribado basados en células diferentes para determinar la citotoxicidad del material diana. Específicamente la citotoxicidad se examina midiendo los efectos del polisacárido o derivados del polisacárido sobre la actividad metabólica de una línea celular BHK (fibroblastos de riñón de hámster ECACC 85011433). El 90% de células confluentes se recogieron y se colocaron en una microplaca blanca de 96 pocillos a 1x104 célula/pocillo en 100 microL de medio de cultivo recién preparado (Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 10% de Suero Fetal de Ternera, 5% Caldo de Fosfato de Triptosa, L-Glutamina 2mM). Se dejaron durante 1 hora a 37ºC y 5% de CO2 para permitir una adhesión al pocillo >80%. 1,1 µL de muestra de polisacárido 1mg/ml en una solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), solo control de HBSS, control de fucoidan (1mg/ml en HBSS), controles de doxorubicina (10 µg/ml, 1 µg/ml en HBSS) se añadieron por triplicado a los pocillos y la placa se incubó durante 16-18 horas a 37ºC y 5% de CO2. Se deja que la placa adquiera la temperatura ambiente durante 30 minutos antes de adiciones de 100 µL del reactivo CellTiter-Glo (Promega). La placa se mezcla durante 2 minutos en un agitador de placas y después se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. La luminiscencia resultante para cada pocillo se mide en un lector de placas (BioTek, Synergy 3) usando el software Gen5. Se calcula la luminiscencia media para cada muestra o control. El pocillo del control de HBSS se designa como el 100% de la actividad metabólica y los valores de luminiscencia de la muestra se calculan frente a este % de actividad = (pocillo de ensayo)/(pocillo de control)*100. Los controles de fucoidan y doxorubicina deben estar dentro de los valores establecidos.

Ejemplo 9 – Efectos sobre la actividad de la elastasa de los neutrófilos.

Diferentes protocolos son posibles para la medida del efecto del polisacárido sobre la actividad enzimática de la elastasa de los neutrófilos. Específicamente la actividad de la elastasa se midió por incubación del polisacárido con neutrófilos humanos estimulados recién aislados seguido por reacción de la enzima liberada con un sustrato marcado y la medición colorimétrica en un lector de placas. Los neutrófilos humanos recién aislados se resuspendieron en HBSS (sin Ca y Mg) y las células se contaron en un hemocitómetro. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en HBSS para dar una concentración de 2,5x106 células/ml. 22µL de muestra, controles o HBSS se añadieron a un microtubo seguido de: 25 µL de citocalasina B (a 40 mg/ml en HBSS para dar una concentración final de 5 mg/ml); 25 µL de TNF α (a 80 ng/ml en HBSS para dar una concentración final de 10 ng/ml, con 25 µL de HBSS usados en lugar de TNF α para un control no estimulado); 150 µL de suspensión de neutrófilos (o para un grupo de control solo de medios añadir 150 µL de HBSS en lugar de células). Los contenidos se mezclaron suavemente y los tubos se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Después de la incubación se añadieron 25 µL de fMLP (a 1 µg/ml en HBSS para dar una concentración final de 100 ng/ml), o HBSS al grupo de control no estimulado. Los tubos se incubaron durante 45 minutos adicionales a 37ºC. Los tubos se centrifugaron a 500rpm durante 5 minutos en un biofuge de Heraeus para sedimentar las células y se transfirieron 25 µL de sobrenadante a pocillos por triplicado en una microplaca negra de 96 pocillos. Se añadió a cada pocillo 150 µL de Tris HCl pH 7,5 y 20 µL de sustrato 1 de elastasa de neutrófilos (0,5 mg/ml en Tris HCl pH 7,5), excepto para un pocillo en blanco que no contiene sustrato. La placa se transfirió a un lector de placas precalentado (37ºC) (BioTek Powerwave HT) y las lecturas se tomaron a 405 nm cada 5 minutos durante 1 hora usando el software Gen5. Vmax se calculó sobre 4 puntos de datos entre 10 minutos y 1 hora. Vmax media se calculó para cada muestra, control o blanco. El pocillo control (sustrato con células estimuladas, pero sin muestras de ensayo) Vmax se designó como el 100% y las muestras y controles se calcularon frente a éste para generar el % de actividad de la elastasa: % actividad = (Vmax del pocillo de ensayo/Vmax del pocillo control)*100.

Ejemplo 10 – Efectos sobre la liberación y expresión genética de citoquinas de queratinocitos.

Los efectos de polisacáridos y derivados de polisacárido en las células de queratinocitos pueden evaluarse usando un intervalo de líneas celulares diferentes o células primarias, en varios medios de crecimiento diferentes con o sin estímulos pro inflamatorios. La liberación de la citoquina resultante se puede evaluar por diferentes métodos tales

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