肝素属细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中蛋白质聚糖成分。除了有抗凝活性外,对ECM产生细胞(肾小求系膜细胞,3T3成纤维母细胞)和潜在ECM产生细胞(血管平滑肌细胞)均有明显抑制增生和调节ECM合成的生物学效应;肝星状细胞(HSC)是肝脏最重要的ECM产生细胞,从理论上推测,肝素对血清所致的大鼠HSC增生有明显抑制作用,且抑制HSC表达α-SMA及Ⅰ、Ⅳ型前胶原蛋白的合成。然而,肝素的强抗凝活性限制了其在已有出血倾向的肝病中的应用前景,低抗凝肝素对HSC是否具有和肝素类似的生物学效应以及对早期肝纤维化的形成是否具有干预作用,已引起本领域研究者的关注。
低抗凝肝素可由肝素及低分子肝素经亲和层析或离子交换层析获得,其分子长度不一,MW约5000,分子结构如下:
2-硫酸艾杜糖酸 N,6-硫酸葡萄糖胺
以上二糖重复排列为基本结构形成糖胺多糖,其中可插入其它己糖如葡萄糖酸等。但是不含或含少量由N,6-硫酸葡萄糖胺-葡萄糖酸-N,3,6-硫酸葡萄糖胺-2-硫酸艾杜糖酸-N,6-硫酸葡萄糖胺等五糖组成的抗凝血酶高亲和活性单元。
本发明的目的是提供低抗凝肝素及其衍生物的新用途,即在制备防治肝纤维化药物中的应用。
本发明采用低抗凝肝素及其衍生物进行动物体内实验,测得肝组织内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及纤连蛋白(FN)的变化,肝组织羟脯氨酸含量的变化和血清谷丙转氨酶(ALT)、血清白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)的变化,结果证实低抗凝肝素对早期肝纤维化有明显干预作用,而且无明显加重肝功能异常的副作用。
一、体内实验:清洁级雄性S-D大鼠(由上海医科大学实验动物部提供)随机分为五组:正常对照组(NC组,n=8)、四氯化碳模型组(CM组,n=8)、低抗凝肝素+四氯化碳组(LCM组,n=14)、猪血清模型组(PSM组,n=8)及低抗凝肝素+猪血清模型组(LPSM组,n=10),NC组大鼠腹腔注射生理盐水0.25ml/100g体重,1次/天,正常饮食;CM组大鼠腹部皮下注射60%CCl4橄榄油溶液0.3ml/100g体重,2次/周,腹腔注射生理盐水0.25ml/100g体重,1次/天,纯玉米粉喂养,饮用5%酒精消毒水;LCM组大鼠腹腔注射低抗凝肝素0.25ml(2.5mg)/100g体重,1次/天,CCl4的处理及饮食同上。PSM组大鼠腹腔注射猪血清0.25ml/100g体重,2次/周,正常饮食;LPSM组大鼠腹腔注射低抗凝肝素0.25ml(2.5mg)/100g体重,1次/天,猪血清的用法、用量及饮食同上。实验为期10周。实验结束后,大鼠在乙醚麻醉下眼球后静脉采血,用于肝功能指标(血清ALT、ALB及GLO)的生化测定。继而处死,准确称取0.5g肝组织两份,液氮冷冻后-70℃保存,用于羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量的测定;部分肝组织置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定48小时后常规酒精脱水、二甲苯透明、56℃石蜡包埋,4μm连续切片,56℃烤片过夜,保存,用于ABC免疫组织化学染色(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN)。染色结果在Axioplan-2数码图象分析仪(Zeiss)进行图象分析作相对定量。
二、实验结果
1.肝组织内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN的变化
各肝组织内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN相对含量(阳性染色占视野的面积与阳性染色的平均灰度的乘积)的变化如表1所示。与NC组相比,CM和PSM组大鼠肝组织内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN明显增加(P<0.001)。与相应模型组相比,低抗凝肝素各干预组大鼠肝组织内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN均明显减少(P<0.001)。
表1为各组大鼠肝组织内Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN相对含量(
x±s))组别 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原 Ⅳ型胶原 FNNC组 320.21±175.27 565.34±238.59 326.64±180.37 763.00±204.47CM组 2026.18±409.02* 1874.34±279.92* 611.54±161.07* 1204.45±232.38*LCM组 334.07±91.31▲ 562.56±214.26▲ 206.56±126.79▲ 778.31±196.56▲PSM组 1230.90±338.34* 1657.04±322.68* 738.09±326.90* 1722.30±404.03*LPSM组 344.49±86.18▲ 587.27±316.65▲ 395.18±170.60▲ 928.93±159.34▲
t检验,与NC组相比,*P<0.001;与其相应的模型组相比,▲P<0.001。
2.肝组织羟脯氨酸含量的变化
各组肝组织羟脯氨酸含量(
x±s)的测定结果如表2所示。与NC组相比,CM和PSM组大鼠肝组织内羟脯氨酸含量明显升高(P<0.001)。与其相应的模型组相比,低抗凝肝素各干预组大鼠肝组织内羟脯氨酸合量均明显降低(P<0.05)。
表2为各组大鼠肝组织内Hyp(
x±s)的测定结果组别 Hyp(mg/g新鲜肝组织)NC组 0.125±0.013CM组 0.265±0.044*LCM组 0.178±0.041▲PSM组 0.253±0.042*LPSM组 0.171±0.034▲
t检验,与NC组相比,*P<0.001;与CM组相比,▲P<0.001;与PSM组相比,*P<0.001。
3.血清ALT、ALB及GLO的变化
各组大鼠血清ALT、ALB及GLO的测定结果如表3所示。和NC组相比,CM组大鼠血清ALT水平明显升高(P<0.05),ALB及GLO水平明显降低(P<0.05)。和CM组相比,LCM组大鼠除了血清GLO水平升高(P<0.05)以外,血清ALT略有下降、血清ALB略有升高,但均无统计学意义(P>0.05)。和NC组相比,PSM组大鼠血清三种指标均无明显变化(P>0.05)。与PSM组相比,除了血清ALT明显降低以外(P<0.05),LPSM组大鼠血清其它指标无显著性变化(P>0.05)。
表3为各组大鼠血清ALT、ALB及GLO的测定结果
组别 ALT(U/L) ALB(G/L) GLO(G/L)NC组 40.63±6.70 38.84±2.11 35.53±4.33CM组 137.20±52.84* 35.64±2.06* 27.66±1.57**LCM组 93.21±39.88△ 33.00±2.80△ 31.35±3.53◆PSM组 42.75±7.96△ 38.04±1.07△ 34.58±2.57△LPSM组 33.9±5.24▲ 37.62±2.79△ 32.50±2.69△
t检验,与NC组相比,*P<0.05;与NC组相比,**P<0.01;与CM组相比,◆p<0.05;与PSM组相比,▲P<0.05。与其对照组或相应的模型组相比,△P<0.05。
实验结果证实:低抗凝肝素对四氯化碳和猪血清所致的早期肝纤维化有明显干预作用;同时在这一过程中,虽然它们无明显改善肝功能的作用,但也无明显加重肝功能异常的副作用。
本发明对低抗凝肝素及其衍生物发掘了新的防治慢性肝病肝纤维化的医疗用途,本发明的物质原料可作成注射制剂、缓释剂等使用方便,效果好。