CN108553481B - 一种具有促进伤口愈合作用的糖类组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有促进伤口愈合作用的糖类组合物及其应用，所述的糖类组合物含有羧甲基壳聚糖、白芨多糖、岩藻聚糖硫酸酯、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质酸寡糖和古罗糖醛酸寡糖中的至少五种糖类。所述糖类组合物能显著增加VEGFA、FGF2和VE‑cadherin蛋白mRNA表达，显著促进VEGF的分泌以及皮肤成纤维细胞（HSF）和人永生化角质细胞（HaCaT）的增殖，具有明显的促进伤口愈合作用。本发明所需原料易得，组合方法简单，具有成本低，易产业化及应用范围广等优点。

Description

一种具有促进伤口愈合作用的糖类组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有促进伤口愈合作用的糖类组合物及其应用。
背景技术
目前，对于糖基医用材料用于创伤愈合的研究较多，具有相关活性的多糖也有很多，例如，作为具有水溶性的壳聚糖衍生物羧甲基壳聚糖，与壳聚糖相比羧甲基壳聚糖具有更好的抗菌活性(Anitha A,et al.Carbohydrate Polymers,2009,78(4):672-677)，有文献报道羧甲基壳聚糖能在浓度为0.5mg/mL左右促进HUVECs增殖(Jiang Z,etal.Carbohydrate Polymers,2015,129:1-8)。其他研究表明羧甲基壳聚糖具有止血作用(Janvikul W,et al.Journal of Applied Polymer Science,2006,102(1):445-551)；促进正常皮肤成纤维细胞增殖并抑制瘢痕瘤成纤维细胞增殖(约0.5mg/mL)(Chen X G,etal.Biomaterials,2002,23(23):4609-4614)。白芨多糖能够诱导内皮细胞增殖以及VEGF分泌(Wang C,et al.Biotechnology Letters,2006,28(8):539-543)。岩藻聚糖硫酸酯(Fucoidan)，是一种提取自褐藻的富含硫酸根的多糖，虽然Fucoidan在高浓度下具有显著抗凝活性，但是有文献研究表明墨角藻来源的Fucoidan在低浓度下能促进凝血(Zhang Z,et al.Carbohydrate Polymers,2015,115:677-685)。硫酸软骨素A能够促进上颚成纤维细胞增殖(Zou X H,et al.Journal of Dental Research,2004,83(11):880-885)。硫酸乙酰肝素能与各种生长因子和细胞因子结合(Lyon M,et al.Matrix Biology,1998,17(7):484-493)。小分子量的透明质酸片段能诱导血管生成，并与原代人内皮细胞上的RHAMM受体结合以促进其增殖(Luong-Van E,et al.Biomaterials,2007,28(12):2127-2136；Lokeshwar V B.et al，JBC,2000,275(36):27641-27649；Savani R C,et al.JBC,2001,276(39):36770-36778)。古罗糖醛酸寡糖能够适当抑制炎症反应，这将有利于感染伤口或慢性伤口的愈合(Bhowmick S,et al.Biomaterials,2016,88:83-96)。
伤口愈合是一个复杂的交互式过程，需要很多细胞因子参与，例如内皮细胞生长需要的内皮细胞生长因子VEGF、成纤维细胞生长需要的FGF2、与细胞连接迁移密切相关的因子VE-cadherin，以及化学物质和皮肤相关细胞的参与(Alonso R F.DoctorateDissertation.University of Leon)，大量的血管内皮细胞、成纤维细胞、角质细胞和巨噬细胞等均会参与皮肤创伤愈合，通过人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人皮肤成纤维细胞(HSF)和人永生化表皮细胞(HaCaT)和RAW264.7的增殖实验能够反映药物对于伤口愈合的作用。因此通过体外细胞模型快速筛选出具有促进伤口愈合潜力的糖类组合物，并研究其作用机制，对于寻找合理的促愈措施具有重要的意义。然而，每一种多糖或寡糖的生物活性是有限的。
发明内容
本发明的目的是提供了一种具有促进伤口愈合作用的糖类组合物及其应用，本发明通过均匀设计法进行多种活性糖类化合物联用，从促进伤口愈合的不同角度或方面来加快各多糖或寡糖促进伤口愈合过程。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种具有促进伤口愈合作用的糖类组合物，所述糖类组合物含有羧甲基壳聚糖、白芨多糖、岩藻聚糖硫酸酯、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质酸寡糖和古罗糖醛酸寡糖中的至少五种糖类。
进一步的：所述糖类组合物中糖类的含量为：以重量份计，羧甲基壳聚糖500-2000份，白芨多糖40-120份，岩藻聚糖硫酸酯0-2份，硫酸软骨素500-2000份，硫酸乙酰肝素0.1-0.2份，透明质酸寡糖0-20份，古洛糖醛酸寡糖0-2000份。
进一步的：所述糖类组合物的组分为：羧甲基壳聚糖2000份、白芨多糖120份、岩藻聚糖硫酸酯1份、硫酸软骨素500份和硫酸乙酰肝素1份。
进一步的：所述羧甲基壳聚糖的制备过程如下：将壳聚糖悬浮于异丙醇溶液中并加入10M氢氧化钠，再逐滴滴加溶于异丙醇中的氯乙酸，然后加入乙醇终止反应，过滤洗涤并透析后冻干，得到羧甲基壳聚糖。
进一步的：所述白芨多糖的制备过程如下：将白芨粉碎后用热水提取，过滤，透析，向透析后的溶液中加入乙醇，得到的沉淀经水溶后冻干，并经大孔树脂纯化得到白芨多糖。
进一步的：所述岩藻聚糖硫酸酯的制备过程如下：将泡叶藻经乙醇脱脂，热水提取，乙醇醇沉，并用氯化钙进一步纯化，透析、冻干后得到岩藻聚糖硫酸酯。
进一步的：所述硫酸乙酰肝素的制备过程如下：向匀浆后的新鲜猪肺中加入Tris-HCl缓冲溶液和胰酶，反应后于中性条件下分别加入EDTA·2Na、半胱氨酸和木瓜蛋白酶，反应结束后乙醇醇沉并透析冻干得到粗多糖，经QFF阴离子交换柱进行分离纯化得到硫酸乙酰肝素。
进一步的：所述透明质酸寡糖的制备过程如下：大分子量透明质酸溶解在乙酸-乙酸钠缓冲液中，加入透明质酸酶水解，水解结束后沸水浴加热，离心，上清液减压浓缩后冷冻干燥，得透明质酸寡糖。
本发明还提供了所述的糖类组合物在制备用于促进伤口愈合的制剂中的应用。
进一步的：所述糖类组合物作用后的人脐静脉内皮细胞的VEGFA、FGF2和VE-cadherin表达量均显著增加，细胞VEGF分泌量显著增加，显著促进HaCaT的增殖。
与现有技术相比，本发明的优点和有益技术效果是：本发明通过人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖和迁移实验进行初步药效评价，并且通过人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖和迁移实验筛选出所述糖类组合物的最佳配方。进一步通过荧光定量PCR实验评价所述糖类组合物最佳配方组对VEGFA、FGF2和VE-cadherin mRNA含量的影响，以及通过VEGF165ELISA试剂盒测定最佳配方组对VEGF的分泌的影响，并评价最佳配方组对人皮肤成纤维细胞(HSF)、人永生化角质细胞(HaCaT)和RAW264.7的增殖的影响。本发明的技术方案为研究开发具有潜在促进伤口愈合活性的制剂提供了基础。而且本发明的糖类组合物原料易得，制备方便，具有明显促进伤口愈合作用，产业化应用前景广阔。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其它优点和特点将变得更加清晰。
附图说明
图1是7种糖类促进HUVEC增殖实验结果。
图2是糖类组合物促进HUVEC的增殖结果(#p<0.001)。
图3是糖类组合物促进HUVEC迁移情况代表性照片，其中第一行：0小时后；第二行：48小时后。
图4是糖类组合物的HUVEC迁移率(*p<0.05，***p<0.001)。
图5是糖类组合物4号对VEGF-A，FGF2及VE-cadherin mRNA表达量影响(***p<0.001)。
图6是糖类组合物4号对VEGF分泌量影响(*p<0.05)。
图7是糖类组合物4号促进HSF(A)、HaCaT(B)和RAW264.7(C)增殖结果(a、b、c分别代表24小时、36小时、48小时，*p<0.05，**p<0.01)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。
实施例1
本发明的糖类组合物包括羧甲基壳聚糖、白芨多糖、岩藻聚糖硫酸酯、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质酸寡糖和古罗糖醛酸寡糖中的至少五种，上述7种糖类可以选用本发明所述制备方法制得，也可以选用市售商品。
所述羧甲基壳聚糖的制备过程如下：将壳聚糖溶于氢氧化钠和异丙醇溶液中，再逐滴加入溶于异丙醇中的氯乙酸，然后加入乙醇终止反应，过滤洗涤并透析后冻干，得到羧甲基壳聚糖。
所述白芨多糖的制备过程如下：将白芨粉碎后用热水提取，过滤，透析，向透析后的溶液中加入乙醇，得到的沉淀经水溶后冻干，并经大孔树脂纯化得到白芨多糖。
所述岩藻聚糖硫酸酯的制备过程如下：将泡叶藻经乙醇脱脂，热水提取，乙醇醇沉，并用氯化钙进一步纯化，透析、冻干后得到岩藻聚糖硫酸酯。
所述硫酸乙酰肝素的制备过程如下：向匀浆后的新鲜猪肺中加入Tris-HCl缓冲溶液和胰酶，反应后于中性条件下分别加入EDTA·2Na、半胱氨酸和木瓜蛋白酶，反应结束后乙醇醇沉并透析冻干得到粗多糖，经QFF阴离子交换柱进行分离纯化得到硫酸乙酰肝素。
所述硫酸软骨素的制备过程如下：来源于鲨鱼，经大孔树脂吸附纯化冻干得到。
所述透明质酸寡糖的制备过程如下：大分子量透明质酸溶解在乙酸-乙酸钠缓冲液中，加入透明质酸酶水解，水解结束后沸水浴加热，离心，上清液减压浓缩后冷冻干燥，得透明质酸寡糖(dp2～20)。
所述古罗糖醛酸寡糖的制备过程如下：多聚古罗糖醛酸溶解在0.2M盐酸溶液中，100℃加热水解，水解液用氢氧化钠中和，浓缩后通过Sephadex G10凝胶色谱柱脱盐，收集合并寡糖组分，减压浓缩后冷冻干燥，得古罗糖醛酸寡糖(dp2～10)。
根据原料组成，分别将羧甲基壳聚糖(CMCT)、白芨多糖(BSP)、岩藻聚糖硫酸酯(FvF)、硫酸软骨素A(CSA)、硫酸乙酰肝素(HS)、透明质酸寡糖(OHA)、古罗糖醛酸寡糖(OG)按照均匀试验设计方法U12*(1210)优化组分配比，试验设计如表1所示，总共有12种组合。
表1不同糖类组合物优化均匀设计表
Figure BDA0001673620800000051
实施例2：糖类化合物对HUVEC细胞增殖的影响实验
将糖类化合物以一定剂量进行人脐静脉内皮细胞(HUVEC，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)增殖活性测定：将细胞培养好后用0.25％胰酶消化后，进行细胞计数，将细胞按照2×104个/孔的数量加入到96孔板中(180μL/孔)，培养6小时后，吸走培养液，换成溶于细胞培养液的糖类组合物(180μL/孔)，同等体积细胞培养液作为对照，培养24小时，之后在避光的条件下加入MTT溶液(PBS溶解，5mg/mL)20μL/孔，继续培养4小时后完全吸出孔中的溶液，加入150μL的DMSO，在37℃摇床中孵育10min，接着用酶标仪在490nm下测定吸光值A，并计算细胞的存活率(％)＝(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值。
统计学分析：所有实验测定3份或3次及其以上，实验结果用平均值±标准差表示(mean±SD)，使用GraphPad prism 5软件进行数据分析，根据实际情况采用Student’s t-检验或者单因素方差分析(ANOVA)结合图基多重比较检验比较各组间是否具有统计学意义。
实验结果如下：分别将这7种糖类化合物在一定浓度下(其中HS:0.2μg/mL；CSA:2mg/mL；OHA:20μg/mL；CMCT:2mg/mL；FvF:2μg/mL；BSP:120μg/mL；OG:1mg/mL)作用于HUVEC细胞24小时后，与空白对照组进行比较并计算存活率，发现7种糖类化合物作用后的细胞活力基本保持在80％以上(图1所示)，说明这7种糖类化合物在一定浓度下对HUVEC不具有毒性，说明实验采用原料和细胞合理。
实施例3：12种糖类组合物对HUVEC细胞增殖的影响实验
12种糖类组合物促进HUVEC细胞增殖活性测定：将细胞培养好后用0.25％胰酶消化后，进行细胞计数，将细胞按照2×104个/孔的数量加入到96孔板中(180μL/孔)，培养6小时后，吸走培养液，换成溶于细胞培养液的糖类组合物(180μL/孔)，同等体积细胞培养液作为对照，培养24小时，之后在避光的条件下加入MTT溶液(PBS溶解，5mg/mL)20μL/孔，继续培养4小时后完全吸出孔中的溶液，加入150μL的DMSO，在37℃摇床中孵育10分钟，接着用酶标仪在490nm下测定吸光值A，并计算细胞存活率(％)＝(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值。
HUVEC的划痕实验：将细胞培养后用0.25％胰酶消化后，进行细胞计数，将细胞接种于24孔板中(60000个/孔，500μL/孔)，先用含有10％FBS的DMEM高糖培养液培养24小时，之后换成含有2％FBS的DMEM高糖培养基培养24小时进行饥饿培养，用200μL的枪头在24孔板的每孔底部中间直径处划痕，刮去一道底部的细胞，并用含2％FBS的DMEM高糖培养液洗涤3次以洗去划痕后残留下的细胞，接着每孔加入溶解于含2％FBS的DMEM高糖培养液的待测样品(500μL/孔)，并以只含2％FBS的DMEM高糖培养液作为对照组，对照组及所有样品均设置4个复孔。然后马上用倒置显微镜进行拍照，记录细胞在样品记录前的划痕状态。拍照后将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养，培养24小时后再次拍照，记录样品作用于细胞后的划痕状态，并与对照组进行比较。采用ImageJ软件计算划痕宽度，通过划痕宽度的变化来分析细胞伤口愈合的能力，将细胞迁移前的划痕宽度记为L0，不同样品及空白对照作用后的划痕宽度记为Ln，细胞迁移率即为：迁移率％＝Ln/L0×100％。
统计学分析：所有实验测定3份或3次及其以上，实验结果用平均值±标准差表示(mean±SD)，使用GraphPad prism 5软件进行数据分析，根据实际情况采用Student’s t-检验或者单因素方差分析(ANOVA)比较各组间是否具有统计学意义。
实验结果如下：
糖类组合物促进HUVEC增殖实验的结果：采用MTT法对这12种糖类组合物作用后HUVEC细胞存活率进行测定，分析其结果发现(图2所示)，大部分样品(除1、2号)均能显著促进HUVEC增殖，另外，1号和2号样品也未发现抑制HUVEC增长的作用，说明样品中各成分可能通过协同效应发挥作用。
HUVEC划痕实验的结果：采用细胞划痕法建立体外伤口愈合模型，并测定样品对HUVEC的迁移能力的影响，计算出迁移距离，与对照组比较发现4、8号均能显著促进HUVEC的迁移。结合HUVEC增殖实验，糖类组合物4号具有最大促进伤口愈合的潜力。4号样品组成为：CMCT,2mg/mL；BSP,120μg/mL；Fucoidan,1μg/mL；CSA,0.5mg/mL；HS,1μg/mL；OHA,0μg/mL；OG,0mg/mL，各成分的用量可能与其它成分配比有关，并通过协同作用发挥效果。
实施例4：糖类组合物4号对相关细胞因子mRNA表达量的影响
HUVEC总RNA提取：将细胞铺于6孔板中，经糖类组合物4号以及对照(培养液)作用后将细胞培养液弃掉，培养板上的细胞用预冷的PBS洗两遍，每孔加入1mL的Trizol试剂，按照其说明书的步骤进行总RNA提取。RNA反转录之前测定其浓度和纯度，之后分装备用。
将RNA样品稀释至500ng/μL,按照RNA反转录试剂盒的操作步骤进行处理，最后于PCR仪中运行程序：将反应后得到的cDNA储存于-80℃备用。
实时荧光定量PCR反应：将糖类组合物4号和对照的cDNA通过实时荧光定量PCR进行定量，使用SYBE GreenⅠ为荧光染料。实验所用引物如表2所示，目的基因分子的相对含量通过2-ΔΔCT法进行计算。
表2实时荧光定量PCR的引物列表
Figure BDA0001673620800000081
统计学分析：所有实验测定3份或3次及其以上，实验结果用平均值±标准差表示(mean±SD)，使用GraphPad prism 5软件进行数据分析，根据实际情况采用Student’s t-检验或者单因素方差分析(ANOVA)结合图基多重比较检验比较各组间是否具有统计学意义。
结果如下：
糖类组合物4号对相关因子mRNA表达量的影响：结合HUVEC增殖和迁移活性结果，本发明筛选出了糖类组合物4号，并将其用于后续实验研究。为了探究糖类组合物4号对VEGFA、FGF2和VE-cadherin mRNA表达量的促进作用，采用荧光定量RT-PCR的方法对这些目的基因的mRNA进行定量。根据总RNA浓度均各自稀释为500ng/μL后，经反转录成cDNA，进行荧光定量RT-PCR实验。各相关基因的荧光定量PCR结果如图所示(图5)，经糖类组合物4号作用后的HUVEC其VEGFA、FGF2和VE-cadherin表达量均显著增加。
实施例5：对VEGF表达量的影响
将细胞种于96孔板中(1×104个/孔)，6小时后将培养液(HUVEC完全培养液)换成含4号样品的培养液和不含样品的培养液(Control)，培养24小时后，将细胞上清液取出离心(1000×g，10min)备用。按照VEGF165ELISA试剂盒步骤测定各样品与空白组VEGF分泌量。
统计学分析：实验测定3次，实验结果用平均值±标准差表示(mean±SD)，使用GraphPad prism 5软件进行数据分析，采用Student’s t-检验比较组间是否具有统计学意义。
结果如下：
VEGF作为与细胞周期调控最重要的因子之一，其能促进内皮细胞的生长。为了进一步研究糖类组合物4号的作用机制，我们用VEGF165ELISA试剂盒检测其对VEGF分泌量的影响，经样品作用后，HUVEC细胞分泌VEGF的量通过标准曲线(y＝0.0017+0.0044，R2＝0.9984)计算，由图6可知，经糖类组合物4号作用后的细胞VEGF分泌量显著增加。其促进HUVEC增殖和迁移可能是通过两方面共同作用，即既促进相关因子mRNA的转录表达而发挥作用，也能促进VEGF的分泌。
实施例6：采用CCK8试剂盒测定糖类组合物4号对HSF、HaCaT和RAW264.7细胞增殖的影响
将细胞培养好后用0.25％胰酶消化后，进行细胞计数，将细胞按照HSF细胞5000个/孔(中国科学院昆明细胞库)、HaCaT细胞2000个/孔(中国科学院昆明细胞库)、RAW264.7细胞5000个/孔(美国ATCC细胞库)的数量加入到96孔板中(200μL/孔)，培养6小时后，吸走培养液，换成溶于相应培养液的糖类组合物4号(200μL/孔)，同等体积细胞培养液作为对照，培养一定时间，之后在避光的条件下加入CCK8溶液20μL/孔，继续培养4小时后用酶标仪在450nm下测定吸光值A。
将对照孔的细胞活力记为100％，计算细胞(HSF、HaCaT、RAW264.7)的增殖，细胞的增殖率(％)＝(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值。
统计学分析：实验设定12个复孔，重复3次，实验结果用平均值±标准差表示(mean±SD)，使用GraphPad prism 5软件进行数据分析，采用Student’s t-检验比较组间是否具有统计学意义。
结果如下：
皮肤成纤维细胞和角质细胞都是参与伤口愈合过程的重要细胞，巨噬细胞对清除伤口微生物具有重要作用。糖类组合物4号能够显著促进HaCaT的增殖，同时其对HSF和RAW264.7细胞没有毒性。说明如果将这种组合物用于皮肤伤口处，皮肤相关细胞能够正常增殖和迁移，并且其可能加速表皮层的形成。
本发明的糖类组合物原料易得，制备方便，具有明显促进伤口愈合作用，产业化应用前景广阔。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例中所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种具有促进伤口愈合作用的糖类组合物，其特征在于：所述糖类组合物的组分为：以重量份计，羧甲基壳聚糖500-2000份，白芨多糖40-120份，岩藻聚糖硫酸酯1份，硫酸软骨素500-2000份，硫酸乙酰肝素0.1-0.2份。
2.根据权利要求1所述的具有促进伤口愈合作用的糖类组合物，其特征在于：所述糖类组合物的组分为：羧甲基壳聚糖2000份、白芨多糖120份、岩藻聚糖硫酸酯1份、硫酸软骨素500份和硫酸乙酰肝素0.1份。
3.根据权利要求1所述的具有促进伤口愈合作用的糖类组合物，其特征在于：所述羧甲基壳聚糖的制备过程如下：将壳聚糖悬浮于异丙醇溶液中并加入10 M氢氧化钠，再逐滴滴加溶于异丙醇中的氯乙酸，然后加入乙醇终止反应，过滤洗涤并透析后冻干，得到羧甲基壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的具有促进伤口愈合作用的糖类组合物，其特征在于：所述白芨多糖的制备过程如下：将白芨粉碎后用热水提取，过滤，透析，向透析后的溶液中加入乙醇，得到的沉淀经水溶后冻干，并经大孔树脂纯化得到白芨多糖。
5.根据权利要求1所述的具有促进伤口愈合作用的糖类组合物，其特征在于：所述岩藻聚糖硫酸酯的制备过程如下：将泡叶藻经乙醇脱脂，热水提取，乙醇醇沉，并用氯化钙进一步纯化，透析、冻干后得到岩藻聚糖硫酸酯。
6.根据权利要求1所述的具有促进伤口愈合作用的糖类组合物，其特征在于：所述硫酸乙酰肝素的制备过程如下：向匀浆后的新鲜猪肺中加入Tris-HCl缓冲溶液和胰酶，反应后于中性条件下分别加入EDTA•2Na、半胱氨酸和木瓜蛋白酶，反应结束后乙醇醇沉并透析冻干得到粗多糖，经QFF阴离子交换柱进行分离纯化得到硫酸乙酰肝素。
7.权利要求1-6任一项所述的糖类组合物在制备用于促进伤口愈合的制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的糖类组合物在制备用于促进伤口愈合的制剂中的应用，其特征在于：所述糖类组合物作用后的人脐静脉内皮细胞的VEGFA、FGF2和VE-cadherin表达量均显著增加，细胞VEGF分泌量显著增加，显著促进人永生化角质细胞的增殖。
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