CN109771449A - 一种具有促进伤口愈合作用的羊栖菜多糖及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种具有促进伤口愈合作用的羊栖菜多糖及其应用，所述羊栖菜多糖的糖含量为68‑83.5％，蛋白质含量为1.5‑12.3％，糖醛酸含量为6.4‑22％，上述羊栖菜多糖的应用是指在制备具有促进伤口愈合作用的药品和功能性化妆品中的应用，该能够促进人角质形成细胞的增殖，这对皮肤创伤产生后皮肤屏障功能的重建具有重要的作用，能够促进人角质形成细胞的迁移，具有加快再上皮化过程，促进皮肤创面愈合的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种具有促进伤口愈合作用的羊栖菜多糖及其应用。
背景技术
创面损伤过大、下肢静脉曲张，糖尿病，褥疮等多种原因均可能造成慢性难愈合创面。创面愈合是在表皮角质形成细胞、成纤维细胞等多种细胞及细胞因子共同参与下完成的复杂病理生理过程，主要涉及炎症反应、肉芽组织形成、再上皮化及伤口闭合后塑形这三个过程。其中，再上皮化过程是创面愈合的关键环节，对表皮屏障功能的恢复起着至关重要的作用。
再上皮化过程是指创缘处的角质形成细胞向创面中心迁移，然后增殖并分化，覆盖创面，重新形成完整的皮肤屏障的过程。因此，角质形成细胞的增殖与迁移在再上皮化过程中起关键作用。
来源于中草药的植物多糖，在调节免疫、抗炎、抗肿瘤、降血糖、保护心血管等方面都有良好的作用，已有多种应用于临床。近年来研究发现，部分植物多糖具有促进伤口愈合的作用(黄芩多糖、白芨多糖)，同时，由于其易吸收，无毒副作用等特点，在伤口愈合过程中的研究受到了广泛关注。
在《神农本草经》、《本草纲目》中均记载了羊栖菜的食疗性质和药用价值。羊栖菜多糖是从全藻羊栖菜中提取得到的一种水溶性多糖，具有多种生物活性，如调节免疫，降血糖，降血脂，延缓衰老等，但对于羊栖菜多糖在皮肤伤口愈合方面的研究与应用却鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种羊栖菜多糖及其应用，该羊栖菜多糖具有促进伤口愈合作用。
一种具有促进伤口愈合作用的羊栖菜多糖，其特征在于所述羊栖菜多糖的糖含量为 68-83.5％，蛋白质含量为1.5-12.3％，糖醛酸含量为6.4-22％。
本发明进一步设置，所述羊栖菜多糖的糖含量为69.73％，蛋白质含量为1.71％，糖醛酸含量为7.27％。
所述的羊栖菜多糖对HaCaT细胞增殖具有明显的促进作用，对皮肤创伤产生后皮肤屏障功能的重建具有重要的作用，羊栖菜多糖具有促进角质形成细胞迁移的作用。
根据权利要求1中所述的一种具有促进伤口愈合作用的羊栖菜多糖，其特征在于：其特征在于所述的羊栖菜多糖的应用是指在制备具有促进伤口愈合作用的药品和功能性化妆品中的应用
按照权利要求1所述的一种羊栖菜多糖的制备方法，其特征在于包括以下方法：
(1)50-60℃烘干羊栖菜，粉碎成粉，过50-100目筛网；
(2)称取步骤(1)中得到的羊栖菜藻粉15g与95％乙醇充分混合，65-80℃回流脱脂3 次，每次2h，充分脱去羊栖菜粉末中的脂质和色素；
(3)回收步骤(2)中脱脂后的藻粉，按照料液比1∶10(m∶v)加入蒸馏水，充分搅拌混合浸泡12h后，两层大小为230目纱布过滤，收集第一次滤液，滤渣中加入同比例蒸馏水继续搅拌充分混合，接下来每2h收集滤液，重复3次；
(4)合并滤液，50-55℃减压浓缩浓缩至1L左右，加入95％乙醇至酒精浓度为80％，4℃醇沉过夜；
(5)醇沉混合液于4000rpm离心10min，收集沉淀，真空冷冻干燥，得到羊栖菜多糖。
本发明具有如下有益效果：羊栖菜多糖能够促进人角质形成细胞的增殖，这对皮肤创伤产生后皮肤屏障功能的重建具有重要的作用，羊栖菜多糖能够促进人角质形成细胞的迁移，具有加快再上皮化过程，促进皮肤创面愈合的作用，可加速伤口愈合的再上皮化过程的进程，具有促进伤口愈合的功效。
附图说明：
图1为CCK8法检测羊栖菜多糖对HaCaT细胞增殖的影响。
图2为BrdU掺入法检测羊栖菜多糖对HaCaT细胞增殖的影响。
图3为细胞划痕实验检测羊栖菜多糖对HaCaT细胞迁移的影响，在划痕0h，24h，48h细胞迁移情况
图4为细胞划痕实验检测羊栖菜多糖对HaCaT细胞迁移的影响，实验组与对照组创面愈合比例比较。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
(一)冷水浸提制备羊栖菜多糖粗提物
(1)50℃烘干羊栖菜，粉碎成粉，过100目筛网；
(2)称取步骤(1)中得到的羊栖菜藻粉15g与95％乙醇充分混合，70℃回流脱脂3次，每次2h，充分脱去羊栖菜粉末中的脂质和色素；
(3)回收步骤(2)中脱脂后的藻粉，按照料液比1∶10(m∶v)加入蒸馏水，充分搅拌混合浸泡12h后，两层纱布过滤，收集第一次滤液，滤渣中加入同比例蒸馏水继续搅拌充分混合，接下来每2h收集滤液，重复3次；
(4)合并滤液，50℃减压浓缩浓缩至1L左右，加入95％乙醇至酒精浓度为80％，4℃醇沉过夜；
(5)醇沉混合液于4000rpm离心10min，收集沉淀，真空冷冻干燥，得到羊栖菜多糖。
通过以上方法制备的羊栖菜多糖其糖含量为69.73％，蛋白质含量为1.71％，糖醛酸含量为7.27％。
(二)羊栖菜多糖对角质形成细胞增殖与迁移的影响
人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)是由成人表皮细胞自发转化而来的具有永生性的细胞系，因与角质形成细胞具有相似的增殖与分化特性，被广泛应用于皮肤修复愈合、皮肤老化、银屑病等研究。
1.检测羊栖菜多糖对角质形成细胞增殖的影响
1.1采用CCK8法检测羊栖菜多糖对角质形成细胞增殖的影响
将HaCaT细胞以6×104cells/ml的密度，100μl/孔接种于96孔板，于孵箱中培养24h 后，加入不同浓度的羊栖菜多糖(2.5，5，10，20μg/ml)孵育24h；吸弃96孔板内的液体，每孔加入100μl稀释后的CCK8工作液；将96孔板置于培养箱内孵育30min；用酶标仪在450nm处检测吸光度。
1.2采用BrdU法检测羊栖菜多糖对角质形成细胞增殖的影响
将HaCaT细胞以6×104cells/ml的密度，100μl/孔接种于96孔板，于孵箱中培养24h 后，加入不同浓度的羊栖菜多糖(2.5，5，10，20μg/ml)孵育24h；依照CellProliferation ELISA Brdu试剂盒说明书进行检测，在370nm处检测样品的吸光度。
为探究羊栖菜多糖对人角质形成细胞增殖的影响，实验分别采用了MTT法和BrdU法检测细胞增殖情况。
如附图1中MTT结果显示，羊栖菜多糖对HaCaT细胞增殖具有明显的促进作用，通过t 检验，羊栖菜多糖浓度为2.5μg/ml组与对照组无显著性差异(P＞0.05)，其余各浓度组与对照均有显著差异(P＜0.01)；羊栖菜多糖浓度为20μg/ml组细胞相对数量是对照组的1.23倍。
BrdU法检测结果如附图2所示，其结果与CCK8法结果类似，即羊栖菜多糖处理组细胞增殖能力显著强于对照组细胞(P＜0.01)。
以上两个实验结果表明，羊栖菜多糖能够促进人角质形成细胞的增殖，对皮肤创伤产生后皮肤屏障功能的重建具有重要的作用。
2.细胞划痕实验检测羊栖菜多糖对角质形成细胞迁移的影响
细胞划痕实验是一种操作简单的研究细胞迁移的体外实验方法，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，是研究创伤愈合的常用检测方法之一。具体操作如下：
HaCaT细胞以2×105cells/well接种于6孔细胞培养板，待细胞单层铺满孔底后，用 10μl灭菌枪头，垂直于细胞平面划线；吸弃培养基后，加入PBS轻柔洗涤3次；实验组加入浓度为20μg/ml的羊栖菜多糖，对照组加入培养基；在显微镜下拍摄初始状态和24h、 48h后细胞生长状况，用软件Image J计算划痕损伤面积愈合率。
通过细胞划痕实验检测了羊栖菜多糖对角质形成细胞迁移的影响。结果如附图3，在划痕后不同时间点(24h，48h)，实验组创面愈合率均高于对照组。其中在划痕后48h，实验组比对照组创面愈合率快26.5％，且具有显著性差异(P＜0.01)。结果表明，羊栖菜多糖具有促进角质形成细胞迁移的作用。
伤口即皮肤上皮完整性的破坏，在创面形成后伤口愈合过程便立即被启动，创面再上皮化是伤口愈合的关键环节，取决于角质形成细胞的增殖与迁移能力。通过以上实验发现，本发明中的羊栖菜多糖能够促进人角质形成细胞的增殖，这对皮肤创伤产生后皮肤屏障功能的重建具有重要的作用；同时，本发明中的羊栖菜多糖能够促进人角质形成细胞的迁移，而角质形成细胞的移行在再上皮化过程中起关键作用。因此，本发明中的羊栖菜多糖能够加速再上皮化过程的进程，具有促进伤口愈合的功效，可应用于制备具有促进伤口愈合作用的药品和功能性化妆品。
Claims (5)
1.一种具有促进伤口愈合作用的羊栖菜多糖，其特征在于所述羊栖菜多糖的糖含量为68-83.5％，蛋白质含量为1.5-12.3％，糖醛酸含量为6.4-22％。
2.一种具有促进伤口愈合作用的羊栖菜多糖，其特征在于所述羊栖菜多糖的糖含量为69.73％，蛋白质含量为1.71％，糖醛酸含量为7.27％。
3.根据权利要求1或2中所述的一种具有促进伤口愈合作用的羊栖菜多糖，其特征在于：所述的羊栖菜多糖对HaCaT细胞增殖具有明显的促进作用，对皮肤创伤产生后皮肤屏障功能的重建具有重要的作用，羊栖菜多糖具有促进角质形成细胞迁移的作用。
4.根据权利要求1或2中所述的一种具有促进伤口愈合作用的羊栖菜多糖，其特征在于：其特征在于所述的羊栖菜多糖的应用是指在制备具有促进伤口愈合作用的药品和功能性化妆品中的应用。
5.按照权利要求1所述的一种羊栖菜多糖的制备方法，其特征在于包括以下方法：
(1)50-60℃烘干羊栖菜，粉碎成粉，过50-100目筛网；
(2)称取步骤(1)中得到的羊栖菜藻粉15g与95％乙醇充分混合，65-80℃回流脱脂3次，每次2h，充分脱去羊栖菜粉末中的脂质和色素；
(3)回收步骤(2)中脱脂后的藻粉，按照料液比1∶10(m∶v)加入蒸馏水，充分搅拌混合浸泡12h后，两层大小为230目纱布过滤，收集第一次滤液，滤渣中加入同比例蒸馏水继续搅拌充分混合，接下来每2h收集滤液，重复3次；
(4)合并滤液，50-55℃减压浓缩浓缩至1L左右，加入95％乙醇至酒精浓度为80％，4℃醇沉过夜；
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