CN108424475B - 去抗凝肝素衍生物 - Google Patents
去抗凝肝素衍生物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108424475B CN108424475B CN201810100469.0A CN201810100469A CN108424475B CN 108424475 B CN108424475 B CN 108424475B CN 201810100469 A CN201810100469 A CN 201810100469A CN 108424475 B CN108424475 B CN 108424475B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- anticoagulant heparin
- molecular weight
- weight
- heparin derivative
- average molecular
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
- A61K31/727—Heparin; Heparan
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及去抗凝肝素衍生物,其抗Xa因子小于等于70IU/mg,优选抗Xa因子小于等于60IU/mg,优选小于等于50IU/mg,优选小于等于40IU/mg,优选小于等于30IU/mg,优选小于等于20IU/mg,优选小于等于10IU/mg,并且其抗IIa因子小于等于175IU/mg,优选小于等于170IU/mg,优选小于等于160IU/mg,优选小于等于150IU/mg,优选小于等于140IU/mg,优选小于等于130IU/mg,优选小于等于120IU/mg,优选小于等于110IU/mg,优选小于等于100IU/mg,优选小于等于90IU/mg,优选小于等于80IU/mg,优选小于等于70IU/mg,优选小于等于60IU/mg,优选小于等于50IU/mg,优选小于等于40IU/mg,优选小于等于30IU/mg,优选小于等于20IU/mg,优选小于等于10IU/mg。
Description
技术领域
本发明涉及制备去抗凝肝素衍生物,以及其用于预防和/或治疗炎症性 肠病的用途。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一组发病非常广泛、无 法治愈的慢性炎性病症,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)和克罗恩 病(Crohn'sdisease,CD)。据报道,在西方国家IBD患病率最高达到0.8%, 在亚洲地区IBD的发病率和患病率均呈持续增长趋势并且增速迅猛,成为全 球广泛关注的疾病。预计在未来十年内很多国家的患病率增长幅度将超过 40%。IBD相关药物需求将有大幅度增长(Bernstein CN,et al.World Gastroenterology Organisation Global Guidelines InflammatoryBowel Disease: Update August 2015.Journal of Clinical Gastroenterology,2016,50(10):p. 803-818.)。在东方国家,IBD的发病以UC为主。在印度,UC/CD的发病率 比例是8-10:1(Bernstein,C.N.,et al.,World Gastroenterology Organization PracticeGuidelines for the diagnosis and management of IBD in 2010.Inflamm Bowel Dis,2010.16(1):p.112-24.)。目前UC的病因和发病机制尚不明确且无 法治愈(Kornbluth,A.and D.B.Sachar,Ulcerative colitis practice guidelines in adults:AmericanCollege Of Gastroenterology,Practice Parameters Committee. Am JGastroenterol,2010.105(3):p.501-23;quiz 524.)。
UC的治疗药物在整体动物模型和临床实验中已研究了40多年时间。 UC患者的传统治疗,一般采用巯基嘌呤类免疫抑制剂,皮质类固醇消炎药 等(Chen,Y.,et al.,PHD3Stabilizes the Tight Junction Protein Occludin and Protects IntestinalEpithelial Barrier Function.J Biol Chem,2015.290(33):p. 20580-9.Ordas,I.,etal.,Ulcerative colitis.Lancet,2012.380(9853):p. 1606-19.Zhang,M.,et al.,Theproinflammatory effect and molecular mechanism of IL-17in the intestinalepithelial cell line HT-29.J BUON,2015. 20(1):p.120-7.)。但是由于药物特异性较差,副作用较强,临床治疗仍然无 法得到令人满意的效果(Rosenberg,L.N.andM.A.Peppercorn,Efficacy and safety of drugs for ulcerative colitis.ExpertOpin Drug Saf,2010.9(4):p. 573-92.)。在药物治疗无效,或炎症进一步发展的情况下,一般只有采用手 术治疗对病变部位进行切除(Akiho,H.,et al.,Promising biologicaltherapies for ulcerative colitis:A review of the literature.World JGastrointest Pathophysiol,2015.6(4):p.219-27.)。
UC病人本身具有高凝的风险,常用肝素或低分子量肝素(Low Molecular WeightHeparins,LMWHs)来进行预防及治疗。
肝素是一类硫酸化、多分散、线性的糖胺聚糖(Glycosaminoglycans, GAGs),是最重要的抗凝药物之一。在临床上广泛应用于防治血栓栓塞性疾 病。此外,肝素及其衍生物具有广泛的生物学活性,包括协调细胞黏附、调 控细胞生长和增殖、发育过程、细胞表面结合脂蛋白脂肪酶和其它蛋白质、 新血管发生、病毒入侵和肿瘤转移等等。
LMWHs的抗炎等生物学活性也发挥治疗UC的作用,很多临床UC患 者使用LMWHs后症状得到缓解(Lean,Q.Y.,et al.,Heparins in ulcerative colitis:proposedmechanisms of action and potential reasons for inconsistent clinicaloutcomes.Expert Rev Clin Pharmacol,2015.8(6):p.795-811.)。乙酰肝 素酶是肝素类药物的重要靶点,抑制乙酰肝素酶的活性,防止肠黏膜的进一 步损伤是其发挥治疗作用机制之一(Waterman,M.,et al.,Heparanase upregulation by colonic epithelium ininflammatory bowel disease.Mod Pathol, 2007.20(1):p.8-14.)。但目前LMWHs在治疗UC上,存在着构效关系尚不 明确等问题。
探索利用LMWHs治疗溃疡性结肠炎(UC)已有20多年时间。一些病人 皮下注射LMWHs(如达肝素,那曲肝素)后症状得到明显缓解。另外一部分 研究考察了口服肝素对溃疡性结肠炎的治疗效果,70%-90%的临床病人得到 了完全缓解。然而,也有某些研究得到的结论是相矛盾的。例如,Elan在 2001年开发了Deligoparin(OP-2000)来作为UC的潜在治疗药物。虽然安全 性评价数据结果很好,但临床II期和III期实验结果却十分令人失望(Korzenik, J.,et al.,Multicenter,randomized,double-blind,placebo-controlledtrial of deligoparin(ultra low molecular weight heparin)for active ulcerativecolitis.Gastroenterology,2003.124(4):p.A67.)。导致这些矛盾的可能原因有很 多,譬如给药剂量不同,病情进展和严重程度不一,临床终点不一致等。
发明内容
本发明的目的是要提供一类具有预防和/或治疗炎症性肠病的去抗凝肝 素衍生物类药物。肝素类药物在临床上常用于伴有高凝状态的炎症性肠病病 人,一方面发挥肝素本身的抗凝血功能,另外肝素也具有抗炎效果,但抗凝 血活性的保留始终存在出血的风险,这些副作用制约了肝素在与凝血相关性 不强的炎症性疾病中的应用。
去抗凝肝素衍生物用于炎症性肠病的治疗还未见报道,目前主要有利用 高碘酸氧化法对肝素去抗凝的方法,有利用硅烷化试剂的化学方法以及利用 碱进行催化的方法对肝素进行去硫酸化修饰达到去抗凝效果。
本发明的发明人致力于肝素产业技术的创新研究,利用麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein,MBP)融合表达技术,实现了系列肝素酶 (Heparinase,分别为MBP-HepI、MBP-HepII、MBP-HepIII,可以分别参见 中国专利ZL200410038098.6、ZL201010259905.2,以及ZL201010259913.7) 的高活性、可溶性表达和工业化生产,系列肝素酶被列为中国药典标准酶。
在本发明中,首先对肝素进行修饰得到去抗凝肝素衍生物,然后利用肝 素酶降解去抗凝肝素衍生物得到经酶降解的低分子量和/或超低分子量去抗 凝肝素衍生物。
具体来说,在本发明中,本发明人尝试对市场上购买的肝素利用后述几 种不同的方法进行去抗凝处理,再利用肝素酶I进行可控降解。研究结果发 现低分子量和超低分子量的去抗凝肝素衍生物能明显提高炎症性肠病治疗 效果。相对于具有抗凝活性的各种肝素或(超)低分子量肝素而言,其经过处 理后的去抗凝肝素衍生物显示出良好的IBD治疗效果。
具体来说,本发明涉及以下内容:
1.一种去抗凝肝素衍生物,其抗Xa因子小于等于70IU/mg,优选抗 Xa因子小于等于60IU/mg,优选抗Xa因子小于等于50IU/mg,优选抗Xa 因子小于等于40IU/mg,优选抗Xa因子小于等于30IU/mg,优选抗Xa因 子小于等于20IU/mg,优选抗Xa因子小于等于10IU/mg,并且
其抗IIa因子小于等于175IU/mg,优选抗IIa因子小于等于170IU/mg, 优选抗IIa因子小于等于160IU/mg,优选抗IIa因子小于等于150IU/mg, 优选抗IIa因子小于等于140IU/mg,优选抗IIa因子小于等于130IU/mg, 优选抗IIa因子小于等于120IU/mg,优选抗IIa因子小于等于110IU/mg, 优选抗IIa因子小于等于100IU/mg,优选抗IIa因子小于等于90IU/mg,优 选抗IIa因子小于等于80IU/mg,优选抗IIa因子小于等于70IU/mg,优选 抗IIa因子小于等于60IU/mg,优选抗IIa因子小于等于50IU/mg,优选抗 IIa因子小于等于40IU/mg,优选抗IIa因子小于等于30IU/mg,优选抗IIa 因子小于等于20IU/mg,优选抗IIa因子小于等于10IU/mg。
2.根据项1所述的去抗凝肝素衍生物,其重均分子量为600~8000,优 选重均分子量为1000~7800,进一步优选重均分子量为1500~7500,进一步 优选重均分子量为2000~7000,其数均分子量为600~6000,进一步优选数均 分子量为1200~5800,进一步优选数均分子量为1500~5500,进一步优选数 均分子量为1800~5000。
3.根据项1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其2糖单元占全部糖成分 的含量在40重量%以上,进一步优选在45重量%以上,进一步优选在50 重量%以上,进一步优选在55重量%以上。
4.根据项1~3中任一项所述的去抗凝肝素衍生物,其4糖单元占全部 糖成分的含量为10~30重量%,进一步优选为15~25重量%。
5.根据项1~4中任一项所述的去抗凝肝素衍生物,其6糖单元占全部 糖成分的含量在15重量%以下,优选在12重量%以下,进一步优选在10 重量%以下,进一步优选在8重量%以下。
6.根据项1~5中任一项所述的去抗凝肝素衍生物,其重均分子量与数 均分子量之比(重均分子量/数均分子量)在1.4以上,优选在1.45以上,进一 步优选在1.50以上。
7.一种制备去抗凝肝素衍生物的方法,其包括:
对原料肝素进行去抗凝处理,得到去抗凝处理的产物,以及
随后利用酶对经去抗凝处理的产物进行酶解以获得去抗凝肝素衍生物。
8.根据项7所述的方法,其中,所述酶为肝素酶。
9.根据项8所述的方法,其中,所述肝素酶为肝素酶I。
10.根据项7~9中任一项所述的方法,其中,所述对原料肝素进行去抗 凝处理是利用高碘酸氧化法对原料肝素进行处理。
11.根据项7~10中任一项所述的方法,其中,所述去抗凝肝素衍生物 是项1~6中任一项所述的去抗凝肝素衍生物。
12.一种去抗凝肝素衍生物在用于制备治疗炎症性肠病,以及炎症性肠 病相关并发症及发病机理相似的疾病的药物中的用途,其中,炎症性肠病相 关并发症及发病机理相似的疾病包括但不限于肠易激综合征、关节炎和其他 肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、葡萄 膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎。
13.根据项12所述的用途,其中,所述去抗凝肝素衍生物是项1~6中 任一项所述的去抗凝肝素衍生物。
14.根据项12所述的用途,其中,所述去抗凝肝素衍生物是利用项7~ 项10中任一项所述的方法制备的去抗凝肝素衍生物。
附图说明
图1各组试验中的小鼠体重变化百分比图。
图2各组试验中结直肠组织病理切片HE染色结果。
图3各组试验中结直肠组织病理切片HE染色结果的组织学评分。
图4各组试验中的全段结直肠长度结果,其中(a)是结直肠的照片,(b) 是显示各组结直肠长度统计结果的柱状图。
图5(a)和(b)显示各组试验中的肠上皮细胞凋亡水平。
图6各组试验中的肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1表达水平。
具体实施方式
以下,对本文的实施方式进行具体说明。
<本发明的去抗凝肝素衍生物(以下也可以称为去抗凝肝素)>
本发明涉及的去抗凝肝素衍生物是对肝素或(超)低分子量肝素进行去抗 凝处理后得到的物质。
也可以说本发明的去抗凝肝素衍生物是不具有抗凝活性或抗凝活性低 的肝素或(超)低分子量肝素。下文将具体描述不具有抗凝活性或抗凝活性低 的含义。
通常来说肝素、低分子量肝素、戊糖都是通过加快抗凝血酶Ⅲ灭活凝血 因子的速度而起到抗凝作用,该类药物的主要作用是抗Xa和抗IIa因子活 性。通过对肝素类药物抗Xa活性与抗IIa活性的研究发现,抗Xa活性对分 子质量不敏感,抗IIa活性则依赖分子质量的大小。分子质量越大,抗IIa 活性越强。肝素对IIa因子灭活有赖于肝素-抗凝血酶-IIa因子三联复合物的 形成,此时肝素同时结合于抗凝血酶和因子IIa,要实现这种连接肝素至少 要含有18个糖单位,其中起“桥梁”作用需要13个单糖,另需5个单糖作为 识别片段。每个单糖平均分子质量为300Da,因此分子质量一定要达到5400 Da以上才具有抗IIa活性。普通肝素平均分子质量15000-19000Da,绝大 多数分子在5400Da以上,其抗Xa与抗IIa活性比值约为1。低分子肝素平 均分子质量为4000-5000Da,分子质量在5400Da以上的分子片段所占比例 较小,一般情况下其抗Xa:抗IIa活性约1.5:1~5:1。
本发明的去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子小于等于70IU/mg,优选抗Xa 因子小于等于60IU/mg,优选抗Xa因子小于等于50IU/mg,优选抗Xa因 子小于等于40IU/mg,优选抗Xa因子小于等于30IU/mg,优选抗Xa因子 小于等于20IU/mg,优选抗Xa因子小于等于10IU/mg。
本发明的去抗凝肝素衍生物的抗IIa因子小于等于175IU/mg,优选抗 IIa因子小于等于170IU/mg,优选抗IIa因子小于等于160IU/mg,优选抗 IIa因子小于等于150IU/mg,优选抗IIa因子小于等于140IU/mg,优选抗 IIa因子小于等于130IU/mg,优选抗IIa因子小于等于120IU/mg,优选抗 IIa因子小于等于110IU/mg,优选抗IIa因子小于等于100IU/mg,优选抗 IIa因子小于等于90IU/mg,优选抗IIa因子小于等于80IU/mg,优选抗IIa 因子小于等于70IU/mg,优选抗IIa因子小于等于60IU/mg,优选抗IIa因 子小于等于50IU/mg,优选抗IIa因子小于等于40IU/mg,优选抗IIa因子 小于等于30IU/mg,优选抗IIa因子小于等于20IU/mg,优选抗IIa因子小 于等于10IU/mg。
本发明所述的去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子和抗IIa因子的活性同时 满足上述要求。
在一个具体的实施方式中,本发明的去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子在 0~70IU/mg的范围,其抗IIa因子在0~175IU/mg的范围。
在一个具体的实施方式中,本发明的去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子在 0~60IU/mg的范围,其抗IIa因子在0~140IU/mg的范围。
在一个具体的实施方式中,本发明的去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子在0~50IU/mg的范围,其抗IIa因子在0~110IU/mg的范围。
在一个具体的实施方式中,本发明的去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子在 0~40IU/mg的范围,其抗IIa因子在0~80IU/mg的范围。
在一个具体的实施方式中,本发明的去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子在 0~30IU/mg的范围,其抗IIa因子在0~50IU/mg的范围。
在一个具体的实施方式中,本发明的去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子在 0~20IU/mg的范围,其抗IIa因子在0~30IU/mg的范围。
在一个具体的实施方式中,本发明的去抗凝肝素衍生物的抗Xa因子在 0~10IU/mg的范围,其抗IIa因子在0~10IU/mg的范围。
本发明的去抗凝肝素衍生物的重均分子量为1000~8000,其重均分子量 为600~8000,优选重均分子量为1000~7800,进一步优选重均分子量为 1500~7500,进一步优选重均分子量为2000~7000,其数均分子量为 600~6000,进一步优选数均分子量为1200~5800,进一步优选数均分子量为 1500~5500,进一步优选数均分子量为1800~5000。
例如,优选重均分子量为2000~7500,进一步优选为2500~7300,进一 步优选为2800~7100,其数均分子量为600~6000,优选数均分子量为 1500~5000,进一步优选为1800~4800,进一步优选为1900~4600。
本发明的去抗凝肝素衍生物的重均分子量与数均分子量之比(重均分子 量/数均分子量)在1.40以上,优选在1.41以上,进一步优选在1.42以上, 进一步优选在1.43以上,进一步优选在1.44以上,进一步优选在1.45以上, 进一步优选在1.46以上,进一步优选在1.47以上,进一步优选在1.48以上, 进一步优选在1.49以上,进一步优选在1.50以上。
本发明的去抗凝肝素衍生物的2糖单元占全部糖成分的含量在40重 量%以上,进一步优选在45重量%以上,进一步优选在50重量%以上,进 一步优选在55重量%以上。
本发明的去抗凝肝素衍生物的4糖单元占全部糖成分的含量为10~30重 量%,进一步优选为15~25重量%。
本发明的去抗凝肝素衍生物的6糖单元占全部糖成分的含量在15重 量%以下,优选在12重量%以下,进一步优选在10重量%以下,进一步优 选在8重量%以下。
本发明的去抗凝肝素衍生物的8糖单元占全部糖成分的含量在10重 量%以下,优选在7重量%以下,进一步优选在6重量%以下,进一步优选在5重量%以下,进一步优选在4.5重量%以下,进一步优选在4重量%以下。
本发明中的全部糖成分是指利用下述实施例中列举的方法检测时检测到全部糖成分,而2糖单元占全部糖成分的含量是指能够检测出来的全部2糖单元的合计在全部糖成分中所占的比例,4糖单元占全部糖成分的含量是指能够检测出来的全部4糖单元的合计在全部糖成分中所占的比例,6糖单元占全部糖成分的含量是指能够检测出来的全部6糖单元的合计在全部糖成分中所占的比例,8糖单元占全部糖成分的含量是指能够检测出来的全部8糖单元的合计在全部糖成分中所占的比例。
<本发明中使用的去除肝素抗凝活性的方法>
通过高碘酸氧化法能得到去除抗凝活性的肝素分子,并且其他生物学活性能很大程度保留,硫酸化程度与形式基本保持不变。高碘酸可以选择性的氧化含有未取代羟基或氨基的邻位碳原子,使得无硫酸化的糖醛酸C(2)-C(3)键断裂,肝素分子内的抗凝血酶结合五糖中的葡萄糖醛酸因而遭到破坏,失去抗凝活性;高碘酸氧化得到的聚醛类氧化肝素通过硼氢化物的还原以保持稳定(Islam,T.,et al.,Further evidence that periodatecleavage of heparin occurs primarily through the antithrombin bindingsite.Carbohydrate Research,2002. 337(21–23):p.2239-2243.)。经过过去二三十年的研究发现,不同去抗凝程度和不同分子量大小的氧化去抗凝肝素具有抗肿瘤转移、抗炎、抗疟等多种生物学活性,已被应用于急性心肌梗死、肿瘤转移、血管生成等领域的研究之 中(Cassinelli,G.and A.Naggi,Old and new applications of non-anticoagulantheparin.International Journal of Cardiology,2016.212,Supplement 1:p. S14-S21.)。部分药物已进入临床研究阶段,如分子量与肝素相近的 SST0001(Cassinelli,G.,et al.,Antitumor efficacy of the heparanase inhibitor SST0001alone and incombination with antiangiogenic agents in the treatment of human pediatricsarcoma models.Biochemical Pharmacology,2013.85(10):p. 1424-1432.),还有低分子量的Vasoflux,M402等(Zhou,H.,et al.,M402,a novel heparan sulfate mimetic,targets multiple pathways implicated in tumor progression and metastasis.PloSone,2011.6(6):p.e21106.Weitz,J.I.,et al., Vasoflux,a new anticoagulant with anovel mechanism of action.Circulation, 1999.99(5):p.682-689.)。在本发明中,采用高碘酸氧化法制备去抗凝肝素衍生物。
在本发明的具体的实施方式中,将底物肝素(例如,肝素钠)溶于水中,并加入高碘酸钠溶液,进行反应。反应一段时间后,加入乙二醇以中和过量的高碘酸钠,再添加硼氢化钠于反应。调节pH值后,经过滤,收集过滤样品。再利用透析袋等进行浓缩和除盐,最终得到去除抗凝活性的去抗凝肝素衍生物。
本发明中使用的经去抗凝处理后的底物肝素的浓度可以由本领域技术 人员来确定,没有特定地限制,优选为1~100g/L。本发明中使用的底物肝素 是大分子量的未分级的肝素,其分子量例如可以是分布在5000~30000,平 均分子量为20000。
<本发明中使用的对去抗凝肝素衍生物进行酶解的方法>
在生产本发明的去抗凝肝素衍生物的过程中使用了肝素酶,例如肝素酶I。现有技术中,肝素酶I的E.C.号为E.C.4.2.2.7。也可以采用购买的肝素酶I,例如购自Sigma公司或IBEX公司买到的肝素酶I。肝素酶也可以是通过 分子生物学方法构建的重组肝素酶I或者肝素酶I与任何融合伴侣形成的融 合蛋白。根据本发明一个优选的实施方案,肝素酶I是肝素酶I的融合蛋白, 尤其是包含MBP的肝素酶I的融合蛋白。
肝素酶I也可以是与任何融合伴侣形成的融合蛋白,只要具有肝素酶I 的活性即可。根据本文一个优选的实施方案,肝素酶I是肝素酶I和融合伴 侣形成的融合蛋白,尤其是麦芽糖结合蛋白(MBP)和肝素酶I的融合蛋白。 肝素酶I和MBP的融合蛋白在下文中有时被称为MBP-HepA(参见中国专利 ZL 200410038098.6,授权公告号CN1312183C)。
在生产本发明的去抗凝肝素衍生物时,肝素酶I与底物肝素(或去抗凝处 理后的底物肝素)进行反应的方式可以分批的、连续的或半连续的,本领域 普通技术人员可以根据生产的需要适当地选择。对于反应的时间、反应装置 而言,只要是可以得到目标的低分子量肝素即可,可以由本领域普通技术人 员适当确定。
在一个具体的实施方案中,在生产本发明的去抗凝肝素衍生物的方法 中,向反应器中加入经上文描述的方法得到的去抗凝底物肝素溶液,然后加 入肝素酶I,与去抗凝处理后的底物肝素进行反应。随着反应的进行,去抗 凝肝素底物逐渐被降解,每隔一段时间对反应液进行监测,在适当的时候终 止反应。将上述反应终止了的混合溶液用纤维素膜真空初滤装置进行初滤, 再利用超滤装置进行超滤得到次滤液。然后加入乙醇混合均匀后,离心弃上 清收集沉淀,然后往沉淀中加入丙酮洗涤并用旋转蒸发仪进行减压蒸干即得 到(超)低分子量肝素产品粉末。本领域技术人员可以理解上述方法仅仅为示 例性的,也可以采用其他方法获得通过酶反应降解后的(超)低分子量肝素。
肝素酶I的用量,本领域普通技术人员可以参考不同酶的活性根据生产 所需来适当确定,优选每种酶的用量为肝素酶I在每升反应液50IU~500IU 的范围,优选在100IU~250IU的范围。其中IU表示:在温度为30℃,pH7.4 条件下,每分钟产生1μmol 4,5不饱和末端产物的酶量。
用于生产本发明中使用的去抗凝肝素衍生物的底物肝素可以商购,也可 以从动物中直接提取,例如可以从猪小肠粘膜提取。肝素二糖单位主要为 L-艾杜糖醛酸和N-硫酸化的氨基葡萄糖通过α(1→4)糖苷键连接。
用于生产本发明的去抗凝肝素衍生物的底物可以购买自例如河北常山 生化药业股份有限公司的肝素、烟台东诚生化股份有限公司、深圳市海普瑞 药业股份有限公司、常州千红生化制药股份有限公司、美药星(南京)制药有 限公司等。
本发明中使用的经去抗凝处理后的底物肝素的浓度可以由本领域技术 人员来确定,没有特定地限制,优选为1~100g/L。
在进行本发明的生产方法之前,可以将经去抗凝处理后的底物肝素添加 到缓冲液中,配制到合适的浓度。所使用的缓冲液只要不损害肝素酶I的酶 活即可。在一个具体的生产方法中,采用的是20mM Tris、20mM CaCl2、 50mM NaCl,并用1mM盐酸调节pH为7左右,例如7.4~7.6的缓冲液。 在另一个具体的生产方法中,采用的是5.0mM CaCl2和200mMNaCl的去离 子水溶液中,然后用1M HCl溶液调节pH至7.0的缓冲溶液。
对肝素酶I与经去抗凝处理后的底物肝素进行反应时的温度没有具体限 定,只要是不会使肝素酶I失活的温度即可,例如可以设定为10~45℃,最 优选30℃。
对于肝素酶I与经去抗凝处理后的底物肝素进行反应的时间没有具体限 定,本领域技术人员可以根据所添加的肝素酶的酶活、底物的浓度和反应的 温度可以适当选择,在一个具体的方法中,肝素酶与底物反应的时间可以5 分钟~10小时,也可以为10分钟~4小时。
在肝素酶I与经去抗凝处理后的底物肝素进行反应的过程中,对反应的 溶液进行监测的方式可以根据反应体系来适当选择,在一个具体的方法中, 利用紫外分光光度计检测231nm处的吸光度的变化,随着反应的进行231nm 处的吸光度A231不断增加,从而通过吸光度的增加来确定反应进行的程度。
在反应的过程中,当按照上述方法测定反应进行到所期望的程度时,可 以终止反应,以进一步分离以获得超低分子量肝素或低分子量肝素。其中对 于终止反应的方法,本领域技术人员可以根据其掌握的知识来选择,例如加 入终止反应的试剂,或提高温度以使酶失活。在一个具体的实施方式中,终 止反应时加盐酸调节pH值至2.0后停留3分钟,再用2.0M的NaOH将pH 值调回7.0。从不添加其它的杂质的观点来看,优选提高反应体系的温度使 酶失活从而终止反应。在一个具体的实施方式中,将整个反应体系放置在 100℃水浴中10分钟,从而使酶降解底物的反应终止。
<本发明中去抗凝肝素衍生物的用途>
本发明涉及的去抗凝肝素衍生物可用于治疗炎症性肠病,例如可以用于 治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病。
本发明涉及去抗凝肝素衍生物在用于制备治疗炎症性肠病,以及炎症性 肠病相关并发症及发病机理相似的疾病的药物中的用途,其中,炎症性肠病 相关并发症及发病机理相似的疾病包括但不限于肠易激综合征、关节炎和其 他肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、葡 萄膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎。
利用本发明的去抗凝肝素衍生物给药诱导了结肠炎的小鼠模型之后,其 可以有效地缓解结肠炎发病过程中肠痉挛引发的结肠缩短,并且小鼠的结肠 上皮组织完整,结构清晰,上皮细胞排列整齐,腺体完整,部分腺体增生, 粘膜下层未见异常。
利用本发明的去抗凝肝素衍生物处理DSS诱导的肠上皮细胞凋亡模型 之后,其可以明显降低细胞凋亡水平,说明其对DSS诱导的细胞凋亡的缓 解效果。
利用本发明的去抗凝肝素衍生物能够有效地修复结肠炎发生时肠上皮 细胞中紧密连接蛋白ZO-1表达降低,起到了对DSS诱导的细胞膜通透性增 加的缓解作用,从而达到保护肠上皮细胞结构完整性,改善肠上皮屏障功能 的效果。
如上所述,由于本发明的去抗凝肝素衍生物能够有效地减少炎性细胞浸 润,并且能够有效减弱炎症引起的脾脏增大、结肠缩短,对于肠道炎症明显 减轻。因此本发明的去抗凝肝素衍生物除了可以治疗炎症性肠病之外,还可 以用于治疗与炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病,其中,炎症性 肠病相关并发症及发病机理相似的疾病包括但不限于肠易激综合征、关节炎 和其他肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、 葡萄膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎。
此外,由于去抗凝肝素衍生物可以降低蛋白ZO-1表达,因此本发明的 去抗凝肝素衍生物还可以用于治疗与蛋白ZO-1异常表达相关的疾病。此外, 本发明涉及的去抗凝肝素衍生物可以显著降低利用DSS诱导的溃疡性结肠 炎小鼠肠上皮细胞的凋亡率,表明其DSS诱导的结肠上皮细胞凋亡的缓解 效果,显示其可以用于治疗炎症性肠病。
实施例
1.抗Xa、IIa因子活性检测
肝素的抗凝活性需要通过体外试验测定其加速抗凝血酶(以下简称ATIII) 抑制Xa因子(以下简称抗Xa因子)和IIa因子(以下简称抗IIa因子)的活性来 决定。本发明中采用的抗Xa和抗IIa因子活性检测方法可参照欧洲药典。 抗Xa和抗IIa的国际单位(International Unit,IU)是指确定量的肝素或低分子 肝素国际标准品所含的活性。待测肝素供试品的抗凝活性是通过与国际标 准品相应活性进行对比计算得到的。
(1)溶液配制:
Tris-HCl缓冲液(pH7.4):取Tris 6.08g和NaCl 8.77g,加水500mL使 之溶解,加牛血清蛋白10g,用HCl调节pH值至7.4,加水稀释至1000 mL。
Tris-EDTA缓冲液(pH8.4):取Tris 3.03g、NaCl 5.12g和EDTA·2Na 1.4 g,加水250mL使之溶解,用HCl调节pH值至8.4,加水稀释至500mL。 肝素标准品及供试样品溶液:肝素活性标准品购自EDQM(European Directorate for the Quality of Medicines)的heparin low-molecular-mass for assay BRP(Biological Reference Preparation)(H0185000,for detection of anti-factor Xa activity and anti-factor IIaactivity)。用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)分别将标准 品(S)和供试品(T)稀释成4个不同浓度的溶液,各剂量间的剂距比控制在 1:0.7~1:0.6。该浓度应在剂量对数~反应的线性范围内,检测抗Xa因子时一 般为每毫升0.025IU~0.2IU,检测抗IIa因子时一般为每毫升0.015IU~0.075 IU。
ATIII溶液:ATIII购自Chromogenix公司(Sweden)。检测抗Xa因子时 以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制成1IU/mL的溶液;检测抗IIa因子时以 Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制成0.5IU/mL的溶液。
发色底物溶液:检测抗Xa因子时用发色底物 S-2765(N-α-benzyloxycarbonyl
-D-arginyl-L-glycyl-L-arginine-p-nitroaniline-dihydrochloride),购自Chromogenix公司(Sweden)。检测抗IIa因子时用发色底物 S-2238(H-D-phenylalanyl-L-pipecolyl-arginine-p-nitroaniline-dihydrochloride) ,购自Chromogenix公司(Sweden)。两种发色底物均用去离子水制成0.003 M的溶液储存,临用前用Tris-EDTA缓冲液(pH8.4)稀释至0.0005M。
抗Xa因子溶液:用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制,调试浓度,使之在用 0.9%NaCl替代(超)低分子量肝素的抗Xa实验中,在405nm处的吸光度值 处于0.6~0.7之间。
抗IIa因子溶液:用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)溶解并稀释成5IU/mL的溶 液。
测定方法:
取1.5mL离心管16支,分别标记T1,T2,T3,T4及S1,S2,S3,S4。 各浓度平行做两管。每管分别加入4种浓度的供试品(T)或标准品(S)稀释液 50μl,以及50μl AT III溶液,混匀,注意不要有气泡。按S1,S2,S3,S4, T1,T2,T3,T4,T1,T2,T3,T4,S1,S2,S3,S4顺序排列,37℃水浴平 衡1分钟后每管中加入100μl抗Xa(或抗IIa)因子溶液,37℃准确孵育1min 后加入发色底物溶液250μl,混合,37℃水浴保温4分钟立即各加30%的 醋酸溶液375μl终止反应。用1cm光程的半微量比色皿,以Tris-HCl缓冲 液(pH7.4)为空白,测定405nm处的吸光度。以Tris-HCl缓冲液(pH7.4)代替 供试品溶液(平行做两管)同法操作作为空白对照管,在16管开始和结尾时, 分别测定空白对照管的吸光度。两者吸光度不得有显著性差异。以吸光度为 纵坐标,标准品溶液(或供试品溶液)为浓度对数值为横坐标做线性回归,按 生物检定统计法中的量反应平行线原理4×4法实验设计,计算效价及实验误 差。平均信限率(FL%)不得大于15%。
2.分子量及其分布测定方法。
采用凝胶排阻高效液相色谱法测定低分子量肝素的重均分子量(Mw), 数均分子量(Mn)和分布系数(P)。色谱柱为TSK-GEL G2000SWXL(TOSOH, 日本),控制流速为0.5mL/min,柱温35℃,进样体积为25μL。采用 WATERS(1525,美国)色谱系统,紫外检测器和示差检测器以先后次序串联 连接于色谱柱的出口,紫外检测器波长为234nm。分子量及其分布测定方 法可以参考Wu,Jingjun等人"Controllable production of low molecular weightheparins by combinations of heparinase I/II/III."Carbohydrate polymers 101(2014):484-492中所记载的方法。
3.寡糖分析结果
本发明涉及的去抗凝肝素衍生物的寡糖分析采用亲水相互作用色谱 (HILIC)与电喷雾质谱联用(ESI-MS)方法。测试步骤如下:称取一定质量的 下述实施例中制备的待测样品的粉末,配制成浓度1μg/μL的待测样品溶液。 HILIC液相条件如下:上样量:10μL,流动相:A相:5mM醋酸铵水溶液, B相:5mM醋酸铵溶液,98%乙腈溶液;流速:0.15mL/min;洗脱梯度: 0-5min,90%B;5-45min,90-65%B;45-55min,65%B;55-60min, 65-20%B;60-80min,20%B;80-80.01min,20-90%B。ESI-MS质谱参数 如下:负离子模式喷雾电压:4.2KV;鞘流气流速:20arb;辅助气流速:5 arb;毛细管电压:-40V;镜筒透镜电压:-50V;毛细管温度:275℃;扫 描质量范围:200~2000。
得到色谱图后根据出峰质荷比(m/z)与理论计算值比对进行各峰归属, 并以特定峰面积占所有解得寡糖峰面积的比作为该寡糖的相对百分含量。
实施例1
将20g精品肝素(购自常山生化药业股份有限公司,产品名称:肝素钠) 溶于0.6L去离子水,在0.6L精品肝素(33g/L)中添加同等体积的0.2M高 碘酸钠溶液(现配),300rpm、4℃避光反应22小时。加入80mL乙二醇中和 过量高碘酸钠,再添加28g硼氢化钠于4℃反应16小时。用HCl调节pH 至7.0。经0.22μm滤膜抽滤,收集过滤样品。再利用透析袋除盐或者通过 Millipore超滤装置加1K滤膜进行超滤浓缩和除盐,直至滤出液经0.1M AgNO3检验无颜色变化即认为除盐完成。样品于-80℃冷冻后置于冻干机中 冻干,然后用研钵或小型粉碎机粉碎成粉末保存,得到去抗凝肝素衍生物(命 名为NAHP)。利用上述方法检测得到的去抗凝肝素衍生物的抗凝活性,结 果显示抗Xa为5.8IU/mg,抗IIa为5.8IU/mg。并利用上述方法测定了该去 抗凝肝素衍生物的分子量及其分布,结果如下表1所示。
另外,表1中显示的P值表示该分子的分散度,是利用重均分子量Mw 除以数均分子量Mn之后得出的数值。
实施例2
将实施例1制备的去抗凝肝素溶于反应缓冲液,每隔0.5~1h向该溶液 添加按照ZL200410038098.6方法制备的肝素酶I,每次添加20IU肝素酶I, 使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液231nm的光吸 收A231(使用pH7.4的缓冲液对仪器进行校准调零,为了检测结果的准确性, 当紫外分光光度计读数A231大于0.6时,将溶液稀释一定倍数,使读数在 0.2~0.6来测定)。当检测到A231达到46时,使反应结束,此时添加的总肝 素酶I的酶活达到约220-250IU。结束的方法为在100℃沸水浴中对反应溶 液中的酶灭活5~10min,然后取出反应体系冷却至室温,向反应溶液中添加 6倍体积的无水乙醇,在室温下搅拌10min,然后在室温下以4000r/min的速 度离心15min,收集沉淀,加入质量是沉淀2~3倍的去离子水溶解,使用 0.22μm的膜过滤,收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块,然 后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干,然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉 末,得到低分子量去抗凝肝素(也命名为:LNAHP)。利用上述方法检测得到 的去抗凝肝素的抗凝活性,结果显示抗Xa为3.2IU/mg,抗IIa为4.0IU/mg。 并利用上述方法测定了该去抗凝肝素衍生物的分子量及其分布,结果如下表 1或2所示。利用上述方法测定了该去抗凝肝素衍生物的寡糖分布,其结果 如表4所示。
实施例3
将实施例1制备的去抗凝肝素溶于反应缓冲液,每隔0.5~1h向该溶液 添加按照ZL200410038098.6方法制备的肝素酶I,每次添加20IU肝素酶I, 使用光程差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液231nm的光吸 收A231(使用pH7.4的缓冲液对仪器进行校准调零,为了检测结果的准确性, 当紫外分光光度计读数A231大于0.6时,将溶液稀释一定倍数,使读数在 0.2~0.6来测定)。当检测到A231达到106时,使反应结束,此时添加的总肝素酶I的酶活达到约340-380IU。结束的方法为在100℃沸水浴中对反应 溶液中的酶灭活5~10min,然后取出反应体系冷却至室温,向反应溶液中添 加6倍体积的无水乙醇,在室温下搅拌10min,然后在室温下以4000r/min 的速度离心15min,收集沉淀,加入质量是沉淀2~3倍的去离子水溶解,使 用0.22μm的膜过滤,收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成坚实的冰块, 然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干,然后用研钵或者小型粉碎机粉碎成粉末,得到超低分子量去抗凝肝素(也命名为:ULNAHP)。利用上述方法检 测得到的去抗凝肝素的抗凝活性,结果显示抗Xa为3.7IU/mg,抗IIa为5.2 IU/mg。并利用上述方法测定了该去抗凝肝素衍生物的分子量及其分布,结 果如下表1或2所示。利用上述方法测定了该去抗凝肝素衍生物的寡糖分布, 其结果如表4所示。
对比例1
将精品肝素溶于反应缓冲液,每隔0.5~1h向该溶液添加按照 ZL200410038098.6方法制备的肝素酶I,每次添加20IU肝素酶I,使用光程 差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液231nm的光吸收A231(使 用pH7.4的缓冲液对仪器进行校准调零,为了检测结果的准确性,当紫外分 光光度计读数A231大于0.6时,将溶液稀释一定倍数,使读数在0.2~0.6来 测定)。当检测到A231达到45时,使反应结束。结束的方法为在100℃沸 水浴中对反应溶液中的酶灭活5~10min,然后取出反应体系冷却至室温,向 反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇,在室温下搅拌10min,然后在室温下 以4000r/min的速度离心15min,收集沉淀,加入质量是沉淀2~3倍的去离 子水溶解,使用0.22μm的膜过滤,收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成 坚实的冰块,然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干,然后用研钵或者小型 粉碎机粉碎成粉末。将得到的粉末20g溶于0.6L去离子水,在其中添加同 等体积的0.2M高碘酸钠溶液(现配),300rpm、4℃避光反应22小时。加入 80mL乙二醇中和过量高碘酸钠,再添加28g硼氢化钠于4℃反应16小时。 用HCl调节pH至7.0。经0.22μm滤膜抽滤,收集过滤样品。再利用透析袋 除盐或者通过Millipore超滤装置加1K滤膜进行超滤浓缩和除盐,直至滤出 液经0.1M AgNO3检验无颜色变化即认为除盐完成。样品于-80℃冷冻后置于冻干机中冻干,然后用研钵或小型粉碎机粉碎成粉末保存,得到去抗凝肝素 (命名为NAHep-1)。利用上述方法检测得到的去抗凝肝素的抗凝活性,结果 显示抗Xa为2IU/mg,抗IIa为15.8IU/mg。并利用上述方法测定了该肝素 衍生物的分子量及其分布,结果如下表1或2所示。利用上述方法测定了该 肝素衍生物的寡糖分布,其结果如表4所示。
对比例2
将精品肝素溶于反应缓冲液,每隔0.5~1h向该溶液添加按照 ZL200410038098.6方法制备的肝素酶I,每次添加20IU肝素酶I,使用光程 差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液231nm的光吸收A231(使 用pH7.4的缓冲液对仪器进行校准调零,为了检测结果的准确性,当紫外分 光光度计读数A231大于0.6时,将溶液稀释一定倍数,使读数在0.2~0.6来 测定)。当检测到A231达到98时,使反应结束。结束的方法为在100℃沸 水浴中对反应溶液中的酶灭活5~10min,然后取出反应体系冷却至室温,向 反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇,在室温下搅拌10min,然后在室温下 以4000r/min的速度离心15min,收集沉淀,加入质量是沉淀2~3倍的去离 子水溶解,使用0.22μm的膜过滤,收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成 坚实的冰块,然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干,然后用研钵或者小型 粉碎机粉碎成粉末。将得到的粉末20g溶于0.6L去离子水,在其中添加同 等体积的0.2M高碘酸钠溶液(现配),300rpm、4℃避光反应22小时。加入 80mL乙二醇中和过量高碘酸钠,再添加28g硼氢化钠于4℃反应16小时。 用HCl调节pH至7.0。经0.22μm滤膜抽滤,收集过滤样品。再利用透析袋 除盐或者通过Millipore超滤装置加1K滤膜进行超滤浓缩和除盐,直至滤出 液经0.1M AgNO3检验无颜色变化即认为除盐完成。样品于-80℃冷冻后置于冻干机中冻干,然后用研钵或小型粉碎机粉碎成粉末保存,得到去抗凝肝素(命名为NAHep-2)。利用上述方法检测得到的去抗凝肝素的抗凝活性,结果 显示抗Xa为1.8IU/mg,抗IIa为8.8IU/mg。并利用上述方法测定了该肝素 衍生物的分子量及其分布,结果如下表1或2所示。利用上述方法测定了该 肝素衍生物的寡糖分布,其结果如表4所示。
对比例3
从河北常山生化购买未分级肝素,该肝素的重均分子量Mw为17223(命 名为HP)。利用上述方法检测抗凝活性,结果显示抗Xa为187.3IU/mg,抗 IIa为197.2IU/mg。并利用上述方法测定了其分子量及其分布,结果如下表 1所示。
对比例4
从药店购买美沙拉秦缓释颗粒(5-Amino Salicylic Acid,5-ASA)。适应症 为:溃疡性结肠炎,用于溃疡性结肠炎的急性发作,防止复发;克罗恩病, 用于频繁发病的克罗恩病病人,预防急性发作。
对比例5
将精品肝素溶于反应缓冲液,每隔0.5~1h向该溶液添加按照 ZL200410038098.6方法制备的肝素酶I,每次添加20IU肝素酶I,使用光程 差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液231nm的光吸收A231(使 用pH7.4的缓冲液对仪器进行校准调零,为了检测结果的准确性,当紫外分 光光度计读数A231大于0.6时,将溶液稀释一定倍数,使读数在0.2~0.6来 测定)。当检测到A231达到45时,使反应结束。结束的方法为在100℃沸 水浴中对反应溶液中的酶灭活5~10min,然后取出反应体系冷却至室温,向 反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇,在室温下搅拌10min,然后在室温下 以4000r/min的速度离心15min,收集沉淀,加入质量是沉淀2~3倍的去离 子水溶解,使用0.22μm的膜过滤,收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成 坚实的冰块,然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干,然后用研钵或者小型 粉碎机粉碎成粉末,得到低分子肝素(命名为I-45)。利用上述方法检测得到 的低分子肝素的抗凝活性,结果显示抗Xa为99IU/mg,抗IIa为43.3IU/mg。 并利用上述方法测定了该低分子肝素的分子量及其分布,结果如下表1或2 所示。利用上述方法测定了该低分子肝素的寡糖分布,其结果如表4所示。
对比例6
将精品肝素溶于反应缓冲液,每隔0.5~1h向该溶液添加按照 ZL200410038098.6方法制备的肝素酶I,每次添加20IU肝素酶I,使用光程 差为1cm的石英比色皿和紫外分光光度计监测溶液231nm的光吸收A231(使 用pH7.4的缓冲液对仪器进行校准调零,为了检测结果的准确性,当紫外分 光光度计读数A231大于0.6时,将溶液稀释一定倍数,使读数在0.2~0.6来 测定)。当检测到A231达到98时,使反应结束。结束的方法为在100℃沸 水浴中对反应溶液中的酶灭活5~10min,然后取出反应体系冷却至室温,向 反应溶液中添加6倍体积的无水乙醇,在室温下搅拌10min,然后在室温下 以4000r/min的速度离心15min,收集沉淀,加入质量是沉淀2~3倍的去离 子水溶解,使用0.22μm的膜过滤,收集透过液并放置在-80℃低温冰箱冻成 坚实的冰块,然后送入冻干机(冷阱温度为-50℃)冻干,然后用研钵或者小型 粉碎机粉碎成粉末,得到低分子肝素(命名为I-98)。利用上述方法检测得到 的低分子肝素的抗凝活性,结果显示抗Xa为42.4IU/mg,抗IIa为21.4IU/mg。 并利用上述方法测定了该低分子肝素的分子量及其分布,结果如下表1或2 所示。
表1实施例和对比例中的各样品的分子量分布
表2实施例和对比例中的各样品的分子量分布
表3实施例和比较例中各样品的抗Xa和抗IIa结果
实施例 | 样品 | 抗Xa(IU/mg) | 抗IIa(IU/mg) |
实施例1 | NAHP | 5.8 | 5.8 |
实施例2 | LNAHP | 3.2 | 4.0 |
实施例3 | ULNAHP | 3.7 | 5.2 |
对比例1 | NAHep-1 | 2 | 15.8 |
对比例2 | NAHep-2 | 1.8 | 8.8 |
对比例3 | HP | 187.3 | 197.2 |
对比例5 | I-45 | 99 | 43.3 |
对比例6 | I-98 | 42.4 | 21.4 |
表4实施例和比较例中的各样品的寡糖含量
实验例1硫酸葡聚糖钠诱导小鼠结肠炎的试验数据
2.5-3%硫酸葡聚糖钠盐(DSS,Mw:36,000-50,000,MP biomedicals,LLC) 溶于C57BL/6J品系小鼠的饮用水中,同时设置DSS造模组、健康对照组以 及药物治疗组。健康对照组不做任何处理,DSS造模组持续自由饮用含 2.5-3%的DSS饮用水直至实验结束,药物治疗组采用实施例1、2、3得到 的去抗凝肝素,以及对比例3和4的样品用生理盐水溶解,从出现症状起给 予灌胃给药,给药剂量为30mg/kg/天,持续至实验结束。
小鼠体重变化如图1所示,在诱导第三天开始出现体重下降、稀便和脓 血便等症状。从出现症状开始给予不同药物治疗,其中(超)低分子去抗凝肝 素治疗组能显著减缓DSS诱导的体重降低。第七天结束实验,处死小鼠后 眼眶取血,取脾脏称重,从盲肠端到肛门处剪取全段结直肠拍照测量长度, 留近端1/3-1/2冻存,另外部分剪开,PBS洗净并卷好置于石蜡包埋用塑料 夹中,浸没入4%多聚甲醛中固定。
结直肠组织病理切片HE染色如图2所示,结果表明经过DSS诱导之后 结肠上皮糜烂,腺体结构严重破坏,黏膜和黏膜下炎性细胞浸润增多。在给 予去抗凝肝素治疗后,结肠上皮得到一定程度保护,腺体结构相对完整。其 中,给予(超)低分子去抗凝肝素治疗效果最优。
结肠病理组织切片:
(一)常规石蜡切片的制备:
(1)取材与固定:切取组织时应使用锋利的刀、剪,将结肠组织用剪刀剖 开,用灭菌的PBS溶液洗净,截取约1.5-2.0cm远端结肠并从肛门侧向近端 卷好放入蜡块包埋夹。结直肠组织块用10%福尔马林溶液固定24~48h。
(2)包埋:先经梯度乙醇脱水后用二甲苯透明,然后入溶融的石蜡中浸透 每次30min,共3次;再包埋。
(3)切片:包埋好的石蜡块即可进行切片;切片的厚度为5μm左右。
(二)苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色方法:
(1)脱蜡:主要用二甲苯脱蜡。
(2)梯度乙醇水化。
(3)自来水冲洗。
(4)苏木精染色:水化后的切片放入苏木精染液中浸5~20min,染细胞核。 自来水冲洗3~5min。
(5)1%盐酸乙醇分化5~30s。自来水冲洗1~3min。
(6)弱碱性水溶液返蓝30s~1min。自来水充分冲洗5~10分钟。
(7)伊红染色:充分水化后的切片直接入伊红染色液中,染细胞质 5~15min左右。
(8)梯度乙醇脱水。
(9)二甲苯透明。
(10)中性树胶封片。显微镜下观察组织结构的变化。
结直肠HE染色组织学变化。NC组(正常组):结肠上皮组织完整,结构 清晰,上皮细胞排列整齐,腺体完整;DSS造模组:结肠粘膜上皮细胞萎缩、 坏死、脱落,腺体异常,腺体杯状细胞消失,炎症细胞广泛浸润,基底膜断 裂或消失,腺上皮与粘膜肌层间隙增大,粘膜下层毛细血管增生,并扩张出 血;HP治疗组:结肠粘膜上皮细胞萎缩、坏死、脱落,腺体不完整,可见 炎症细胞浸润,基底膜增厚,未见断裂,腺上皮与粘膜肌层间隙增大,粘膜 下层毛细血管增生,并扩张出血;NAHP治疗组:结肠粘膜上皮见部分脱落, 腺体轻度增生,少数腺体结构不完整,可见少量炎症细胞浸润,粘膜下层未 见异常;ULNAHP治疗组和LNAHP治疗组:结肠上皮组织完整,结构清晰, 上皮细胞排列整齐,腺体完整,部分腺体增生,粘膜下层未见异常;5-ASA(美 沙拉秦)治疗组(阳性对照治疗组):结肠粘膜上皮细胞坏死、脱落,腺体异常, 排列不整齐,杯状细胞增生或坏死,炎症细胞浸润,病变未累及粘膜下层。
表5组织损伤评分标准
按照上表5中的评分标准对图2中的照片进行组织学评分,结果如图3 所示。可以看出,NAHP治疗组的评分明显低于DSS造模组,而ULNAHP 治疗组和LNAHP治疗组的效果更优于NAHP治疗组,评分均显著优于 5-ASA治疗组。
溃疡性结肠炎诱导成功后,小鼠肠道肌肉痉挛收缩,导致全结直肠长度 缩短。连续7天给予小鼠3%DSS或同时给予药物治疗后,颈椎脱臼法处死 动物,取全结直肠,测量长度。各组全段结肠长度如图4所示,除未分级肝 素外,其余肝素类药物都能一定程度缓解结肠缩短。其中,NAHP治疗组, 酶法降解的ULNAHP治疗组与LNAHP治疗组较5-ASA治疗组效果更佳。 酶解低分子和超低分子肝素治疗组效果优于NAHP治疗组。
实验例2肝素衍生物缓解硫酸葡聚糖钠诱导的人正常结肠上皮细胞NCM460细胞凋亡的试验数据。
细胞凋亡在UC的发生发展中起到重要作用。在结肠炎病理条件下,上 皮细胞沿隐窝绒毛轴增殖一分化一凋亡的正常顺序可能被破坏。UC炎症活 动区域的粘膜上皮细胞凋亡速率明显增加,可能是UC上皮屏障功能的破坏 的另一大重要原因。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,这些细胞膜表面 的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在 细胞膜外表面。Annexin V作为一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,对PS有高 度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种 细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在 其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此结合碘化丙啶(PI)染细胞核可以 区分凋亡细胞和坏死细胞。
在本实验中应用3%硫酸葡聚糖钠盐(DSS)诱导人正常结肠上皮细胞 NCM460(购自ATCC(Rockefeller,MD,USA))凋亡,来模拟DSS诱导的溃疡 性结肠炎小鼠肠上皮细胞凋亡过程。在给予细胞2mg/ml的不同去抗凝肝素 衍生物处理48小时后,通过FITC-Annexin/PI染色并进行流式细胞仪分选检 测NCM460细胞凋亡情况,探讨和评估各肝素衍生物缓解结肠上皮细胞凋 亡效果。如图5所示,(超)低分子去抗凝肝素衍生物治疗组(ULNAHP组和LNAHP组)中的肠上皮细胞凋亡水平明显低于DSS诱导凋亡组,有效证明 了ULNAHP和LNAHP对DSS诱导的细胞凋亡作用的缓解效果,其保护效 果优于5-ASA组和NAHP组。
实验例3肝素衍生物缓解硫酸葡聚糖钠诱导的人正常结肠上皮细胞NCM460 细胞膜通透性异常的试验数据。
上皮细胞间紧密连接是维持粘膜上皮机械屏障和通透性的重要结构。 ZO-1蛋白是细胞紧密连接蛋白的重要组成蛋白之一,不但参与维持和调节 上皮屏障功能,还参与细胞物质转运和维持上皮极性等重要过程。在本实验 中应用3%硫酸葡聚糖钠盐(DSS)诱导人正常结肠上皮细胞NCM460(购自 ATCC(Rockefeller,MD,USA))的细胞膜通透性增大,来模拟DSS诱导的溃 疡性结肠炎小鼠肠上皮细胞通透性增大的细胞破坏作用。在给予细胞2mg/ml的实施例1、2、3的去抗凝肝素衍生物、以及对比例1、2、3、5、6 的物质处理48小时后,通过蛋白质印迹法检测NCM460细胞中ZO-1蛋白 的表达情况,探讨和评估各肝素衍生物对通透性增大的结肠上皮细胞的保护 作用。如图6所示,DSS诱导条件下,相比正常细胞(NC组)ZO-1水平明显 降低,HP处理组无效,NAHP组能缓解ZO-1水平的降低,而ULNAHP和 LNAHP去抗凝肝素衍生物处理组中ZO-1蛋白表达水平均明显高于DSS诱 导组细胞ZO-1蛋白的表达水平,但通过先酶解后去抗凝修饰得到的 NAHep-1(对比例1)和NAHep-2(对比例2),以及仅酶解低分子肝素(对比例5、 6)并不能起到缓解ZO-1降低的效果。该实验有效证明了先去抗凝修饰再酶 解得到的去抗凝肝素衍生物对DSS诱导的细胞膜通透性异常的缓解效果。
Claims (22)
1.一种去抗凝肝素衍生物,其抗Xa因子小于等于20 IU/mg,并且其抗IIa因子小于等于20 IU/mg,重均分子量为600~8000,数均分子量为600~6000,2糖单元占全部糖成分的含量在40重量%以上,4糖单元占全部糖成分的含量为10~30重量%,6糖单元占全部糖成分的含量在15重量%以下。
2.根据权利要求1所述的去抗凝肝素衍生物,其抗Xa因子小于等于10IU/mg,抗IIa因子小于等于10 IU/mg。
3.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其重均分子量为1000~7800。
4.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其重均分子量是1500~7500。
5.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其重均分子量是2000~7000。
6.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其数均分子量是1200~5800。
7.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其数均分子量是1500~5500。
8.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其数均分子量是1800~5000。
9.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其2糖单元占全部糖成分的含量在45重量%以上。
10.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其2糖单元占全部糖成分的含量在50重量%以上。
11.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其2糖单元占全部糖成分的含量在55重量%以上。
12.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其4糖单元占全部糖成分的含量为15~25重量%。
13.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其6糖单元占全部糖成分的含量在12重量%以下。
14.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其6糖单元占全部糖成分的含量在10重量%以下。
15.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其6糖单元占全部糖成分的含量在8重量%以下。
16.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其重均分子量与数均分子量之比,即重均分子量/数均分子量在1.4以上。
17.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其重均分子量与数均分子量之比,即重均分子量/数均分子量在1.45以上。
18.根据权利要求1或2所述的去抗凝肝素衍生物,其重均分子量与数均分子量之比,即重均分子量/数均分子量在1.50以上。
19.一种制备去抗凝肝素衍生物的方法,其包括:
利用高碘酸氧化法对原料肝素进行去抗凝处理,得到去抗凝处理的产物,以及
随后利用肝素酶I对经去抗凝处理的产物进行酶解以获得去抗凝肝素衍生物。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,所述去抗凝肝素衍生物是权利要求1~18中任一项所述的去抗凝肝素衍生物。
21.一种去抗凝肝素衍生物在用于制备治疗炎症性肠病,以及炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病的药物中的用途,其中,炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病包括:肠易激综合征、关节炎和其他肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎,其中,所述去抗凝肝素衍生物是权利要求1~18中任一项所述的去抗凝肝素衍生物。
22.根据权利要求21所述的用途,其中,所述去抗凝肝素衍生物是利用权利要求19或20所述的方法制备的去抗凝肝素衍生物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/CN2018/075359 WO2018149320A1 (zh) | 2017-02-15 | 2018-02-06 | 去抗凝肝素衍生物及其用于炎症性肠病的治疗 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710081789 | 2017-02-15 | ||
CN2017100817891 | 2017-02-15 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108424475A CN108424475A (zh) | 2018-08-21 |
CN108424475B true CN108424475B (zh) | 2019-08-23 |
Family
ID=63155665
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710815567.8A Active CN108424474B (zh) | 2017-02-15 | 2017-09-12 | 去抗凝肝素衍生物及其用于炎症性肠病的治疗 |
CN201810100469.0A Active CN108424475B (zh) | 2017-02-15 | 2018-02-01 | 去抗凝肝素衍生物 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710815567.8A Active CN108424474B (zh) | 2017-02-15 | 2017-09-12 | 去抗凝肝素衍生物及其用于炎症性肠病的治疗 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN108424474B (zh) |
WO (1) | WO2018149320A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116200437A (zh) * | 2021-11-30 | 2023-06-02 | 清华大学 | 一种用于治疗炎症性肠病的口服多糖及其制备方法 |
CN114591451A (zh) * | 2022-02-25 | 2022-06-07 | 苏州大学 | 一种部分抗凝肝素衍生物及其制备方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104144950A (zh) * | 2011-12-19 | 2014-11-12 | 迪乐方有限责任公司 | 含有重复的二糖单元的非抗凝的葡糖胺聚糖及其医药用途 |
CN108117615A (zh) * | 2016-11-29 | 2018-06-05 | 清华大学 | 低分子量肝素以及肝素用于制备肺纤维化的用途 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2614026B1 (fr) * | 1987-04-16 | 1992-04-17 | Sanofi Sa | Heparines de bas poids moleculaire, a structure reguliere, leur preparation et leurs applications biologiques |
US5744457A (en) * | 1995-03-31 | 1998-04-28 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
AU782661B2 (en) * | 1999-06-30 | 2005-08-18 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Heparin compositions that inhibit clot associated coagulation factors |
IT1316986B1 (it) * | 2000-01-25 | 2003-05-26 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Derivati glicosamminoglicani parzialmente desolfatati nonanticoagulanti ad attivita' antiangiogenica. |
CA2457719C (en) * | 2001-09-12 | 2012-01-03 | Benito Casu | Derivatives of partially desulphated glycosaminoglycans as heparanase inhibitors, endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect |
WO2009007224A1 (en) * | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Low molecular weight heparin derivatives having neuroprotective activity |
KR101561860B1 (ko) * | 2007-11-02 | 2015-10-20 | 모멘타 파머슈티컬스 인코포레이티드 | 비항응고성 다당류 조성물 |
CN101294177B (zh) * | 2008-05-26 | 2012-07-18 | 清华大学 | 一种制备低分子量肝素的方法 |
CN103173506B (zh) * | 2011-10-09 | 2016-06-08 | 清华大学 | 控制生产低分子量肝素的方法 |
WO2013095215A1 (en) * | 2011-12-19 | 2013-06-27 | Dilaforette Ab | Low anticoagulant heparins |
GB2515315A (en) * | 2013-06-19 | 2014-12-24 | Dilafor Ab | New Processes |
-
2017
- 2017-09-12 CN CN201710815567.8A patent/CN108424474B/zh active Active
-
2018
- 2018-02-01 CN CN201810100469.0A patent/CN108424475B/zh active Active
- 2018-02-06 WO PCT/CN2018/075359 patent/WO2018149320A1/zh active Application Filing
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104144950A (zh) * | 2011-12-19 | 2014-11-12 | 迪乐方有限责任公司 | 含有重复的二糖单元的非抗凝的葡糖胺聚糖及其医药用途 |
CN108117615A (zh) * | 2016-11-29 | 2018-06-05 | 清华大学 | 低分子量肝素以及肝素用于制备肺纤维化的用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108424474B (zh) | 2023-07-25 |
WO2018149320A1 (zh) | 2018-08-23 |
CN108424474A (zh) | 2018-08-21 |
CN108424475A (zh) | 2018-08-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Li et al. | Oversulfated chondroitin sulfate interaction with heparin-binding proteins: new insights into adverse reactions from contaminated heparins | |
Gui et al. | Chemical characteristics and antithrombotic effect of chondroitin sulfates from sturgeon skull and sturgeon backbone | |
Zhang et al. | Structure-activity relationship of the pro-and anticoagulant effects of Fucus vesiculosus fucoidan | |
Gomes et al. | Unique extracellular matrix heparan sulfate from the bivalve Nodipecten nodosus (Linnaeus, 1758) safely inhibits arterial thrombosis after photochemically induced endothelial lesion | |
Peterson et al. | Design of biologically active heparan sulfate and heparin using an enzyme-based approach | |
EP0166324A2 (en) | Process for the selective precipitation of low-density lipoproteins | |
PT94359A (pt) | Processo para a preparacao de polissacaridos sulfatados derivados de fucanos de algas castanhas com accao anticoagulante e anticomplementar | |
US20080249298A1 (en) | use of heparinoid derivatives for the treatment and diagnosis of disorders which can be treated with heparinoids | |
Mathieu et al. | Rheologic behavior of osteoarthritic synovial fluid after addition of hyaluronic acid: a pilot study | |
NZ214094A (en) | Xylan sulphates of low molecular weight, process for their preparation and medicaments containing them | |
KR20070006749A (ko) | 올리고사카라이드, 이의 제조 방법 및 용도, 및 이를함유하는 약학 조성물 | |
CN108424475B (zh) | 去抗凝肝素衍生物 | |
JP6741277B2 (ja) | 硫酸化ヘパリン由来オリゴ糖及びその調製法と施用 | |
JPH03243601A (ja) | 血液凝固の制御能をもつムコ多糖組成物およびその製造方法 | |
Lean et al. | Heparins in ulcerative colitis: proposed mechanisms of action and potential reasons for inconsistent clinical outcomes | |
WO2013131406A1 (zh) | 解聚海参糖胺聚糖在制备防治血栓栓塞疾病药物中的应用 | |
Li et al. | Preparation and antithrombotic activity identification of Perinereis aibuhitensis extract: A high temperature and wide pH range stable biological agent | |
Andermann et al. | The influence of the route of administration on the bioavailability of an endogenous macromolecule: chondroitin sulphate (CSA) | |
NO148960B (no) | Fremgangsmaate ved in vitro-bestemmelse av den biologiske aktiviteten til faktor xa-inhibitor i blodplasma | |
Matthíasson et al. | The haemorrhagic effect of low molecular weight heparins, dermatan sulphate and hirudin | |
Messmore et al. | Heparin to pentasaccharide and beyond: the end is not in sight | |
JP4633223B2 (ja) | 血管内皮細胞増殖因子依存性血管内皮細胞増殖の抑制剤 | |
CN108117615B (zh) | 低分子量肝素以及肝素用于制备治疗肺纤维化药物的用途 | |
Nachtmann et al. | Heparin sodium | |
Jaques | Endogenous heparin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |