PT94359A

PT94359A - Processo para a preparacao de polissacaridos sulfatados derivados de fucanos de algas castanhas com accao anticoagulante e anticomplementar

Info

Publication number: PT94359A
Application number: PT94359A
Authority: PT
Inventors: Sylvia Colliec; Jacqueline Bretaudiere; Patrick Durand; Anne-Marie Fisher; Jacqueline Jozefonvicz; Bernard Kloareg; Catherine Vidal
Original assignee: Inst Francais Rech Pour L Expl
Priority date: 1989-06-14
Filing date: 1990-06-12
Publication date: 1991-02-08
Also published as: JP3042543B2; ES2152998T3; US5321133A; EP0403377B1; IE902153A1; ATE196089T1; FR2648463B1; AU5841090A; WO1990015823A1; FR2648463A1; EP0676207B1; DE69033626T2; IE902153L; JPH04506089A; CN1051564A; DE69023957T2; EP0403377A1; ATE131176T1; DD296937A5; EP0676207A3

Description

IFREMER - INSTITUT FRANÇAIS DE RECHERCHE POUR L'EXPLORATION "Processo para a preparação de polissacaridos sulfatados derivados de fucanos de algas castanhas com acção anticoagulante e anticomplementar" A presente invenção diz respeito a novos polissacaridos sulfatados . obtidos por lise de fucanos extraídos de feoflceas (algas castanhas), ao processo para a sua obtenção, bem como a um novo agente anticoagulante e antitrombôtico e a um novo agente anticomplementar. 0 efeito anticoagulante define-se como a inibição da formação de trombina activa no plasma enquanto que o efeito antitrom-bõtico se define como a inibição da formação de trombus e/ou do seu desenvolvimento. 0 medicamento anticoagulante que mais se utiliza actual-mente e a heparina, que consiste num polissacarido sulfatado constituído por grupos glucosamina e ácido glucorónico ligados na sequência 1-4, nas quais os grupos sulfato se encontram presentes sobre a função amina da glucosamina e/ou sobre as funções álcool da glucosamina e do ácido urónico. A heparina actua sobre a coagulação potencializando a acção anticoagulante de dois inibidores plasmãti-cos. 0 primeiro, que ê a antitrombina III (AT III), actua por sua vez, sobre a trombina (também conhecida sob a designação de factor lia) e sobre o factor X activado (ou factor Xa); o segundo, designado segundo cofactor da heparina (HC II), actua sobre o factor lia e não sobre o factor Xa.

Também no que diz respeito â prevenção de tromboses utiliza-se cada vez mais heparinas de baixo peso molecular obtidas por despolimerização. A acção destas heparinas sobre a coagulação global ê pouco intensa; estas heparinas não actuam por exemplo, in vitro, sobre o tempo de cefalina-caulino (TCK), que explora de um modo global a coagulação plasmática pela via endógena, quer dizer o conjunto dos factores plasmãticos com excepção do factor VII e dos factores plaquetãrios; em compensação, estas heparinas permitem, in vivo, a prevenção de tromboses experimentais. Tem-se demonstrado que as mesmas potencializam a activi-dade inibidora do AT III face ao factor Xa e que são pouco activas face ao factor lia. Contudo, parece-nos cada vez mais provável que as mesmas exercem essencialmente a sua acção na prevenção de tromboses devido â sua pouco intensa activídade anti-IIa residual. A heparina ê também conhecida pelas suas propriedades anticomplementares. 0 sistema de complemento ê um conjunto de proteínas plasmãticas ou de membrana que actuam de um modo essencial nos mecanismos de defesa imunitária. Intervém na defesa do organismo (destruição de agentes infecciosos, eliminação de imuno complexos) e nos processos patológicos inflamatórios. No sangue ê ainda responsável pela himõlise ou lise de glóbulos vermelhos.

As proteínas do complemento encontram-se sob uma forma inactiva no soro. A sua activação processa-se segundo uma determinada ordem de acordo com duas sequências, a via alterna e a via clássica. A activação da via alterna baseia-se num meca- 3 ' / 4' nismo não específico de reconhecimento da superfície do alvo (bactéria, vírus, parasita, célula tumoral). A activação da via clássica baseia-se num reconhecimento específico do alvo por um anticorpo. Na via alterna, a fase inicial ê estimulada pela fixação dum produto de cisão de C3, o C3b e a libertação de C3a, a anafilatoxina responsável pelas reacções inflamatórias. A C3b fixa-se assim pela ligação covalente com os grupos hidroxi.e aminados da superfície. Uma vez realizada a ligação pode fixar--se o factor B e após activação deste ultimo pelo factor D forma-se a C3 convertase alterna. Na via clássica, a fase inicial ê estimulada pela activação de Cl a qual se efectua principalmente ao nível dum complexo antigénio-anticorpo. Após a activação de Cl, os compostos C4 e C2 são por sua vez activados e vão formar sobre a superfície um complexo enzimãtico, a C3 convertase clássica. A activação de C4 é análoga â de C3 com libertação de C4b e C4a. A C4b fixa-se de um modo covalente com o mesmo tipo de grupos químicos com que se fixa a C3b. A heparina actua como inibidor da activação do complemento pela sua interacção com as C3 convertases. Demonstrou-se que esta actividade anticomplementar da heparina ê totalmente independente da sua actividade antitrombõtica e que a mesma está ligada ã presença sobre a função amina do grupo sulfato ou acetilo, contraria-mente à actividade anticoagulante que não se observa se o subs-tituinte da função amina não for um grupo sulfato. Parece-nos também que a presença de um grupo sulfato sobre uma das funções álcool do ácido urõnico tem um papel importante na actividade anticcmpleraentar. Kazatchine et al.;"J. Clin · Invest."; 67; 1981J.

Conhecem-se também outros polissacaridos devido ãs suas

propriedades anticoagulantes e/ou antitrombéticas; exemplo destes polissacaridos são os dermatanos sulfatados, cuja activi-dade anticoagulante comparada â da heparina, ê pouco intensa mas cuja actividade antitrombôtica é equivalente. Estes polissacaridos actuam inibindo a trombina mediante a potenciação do efeito inibidor do cofactor ECIT; em compensação estes compostos não actuam por intermédio do cofactor ΑΤΊΙΙ, e não exercem acção sobre o factor Xa. 0 pentosano-polissulfato muito utilizado na prevenção de tromboses, actua também catalisando a inibição da trombina pelo KC'II.

Em compensação estes polissacaridos não exibem actividade anticomplementar comparaãvel â da heparina; Kazatchine et al. demonstraram, na publicação citada antes, que o dermatano-sulfato em que a função amina da galactosamina estã acetilada mas em que as funções álcool do ácido urónico não estão sulfatadas ê, de acordo com as mesmas regras, catorze vezes menos activo que a heparina.

Os fucanos são polissacaridos sulfatados de peso molecular médio elevado (100 a 800 KDa), extraídos de talos de algas castanhas. São polímeros do 2-L-fucose-4-sulfato que podem conter igualmente D-xilose, D-galactose e ácidos uronicos. Os ácidos urõnicos dos fucanos não são sulfatados contrariamente aos da heparina. Por outro lado, os fucanos diferem da heparina e do dermatano-sulfato porque não contêm amino-açúcares.

Trabalhos realizados sobre fucanos impuros pernitiram separar, a partir dum mesmo extracto impuro, diversas sub-popula-ções de fucanos, que diferem umas das outras pelo seu peso mole- 5 cular médio por um lado e pelas suas propriedades físico-químicas por outro.

Estes trabalhos, utilizando processos não agressivos de fraccionamento, (precipitação fraccionada, filtração sobre gel, etc.) que não degradam o esqueleto polissacarídico das moléculas de fucanos, puseram em evidência a" existência de sub--populações naturais de fucanos.

As propriedades anti-coagulantes dos fucanos impuros demonstradas desde 1957 por Springer et al. e confirmadas depois desse período por numerosos autores £ Bernardi e Springer; " The Journal of Biological Chemistry"; 237.1; 1962; Mori et al., "Marine Algae in Pharmaceutical Science; 2_; 1982 J7.

Um estudo realizado pelos inventores sobre o mecanismo da acção dos fucanos impuros na coagulação, demonstrou que o fucano impuro aumenta o tempo de cefalina-caulino (TCK) e sobretudo o tempo de trombina (TT) (que explora a transformação de fibrinogénio em coagulo de fibrina sob a influência da trombina, ultima fase da coagulação). Este estudo mostra também que o fucano impuro actua quase exclusivamente sobre a trombina (factor lia) potencializando principalmente o efeito do inibidor HC..TI (na mesma concentração da heparina), e o da antitrombina III (em concentrações 30 vezes mais elevadas do que as da heparina).

Em compensação, o fucano não apresenta acção anti-Xa, contraria-mente â heparina.

Outros autores realizaram observações similares ^Church et al; "The Journal of Biological Chemistry"; 264.6 1989 J e estudaram igualmente as propriedades do fucano impuro. Estes autores demonstraram que os fucanos impuros catalisam pouco in- Λ ί tensamente a inibição da trombina pela AT .UI e intensamente a inibição da trombina pela HC.II-

Os fucanos poderão pois constituir uma nova categoria de medicamentos anticoagulantes originais, devido ao seu mecanismo de acção que difere do dos anticoagulantes conhecidos.

Com efeito, potenciam a actividade inibidora da HC IIe também a da AT III face â trombina, contrariamento ao dermatano-sulfato que potência exclusivamente a actividade inibidora da HC TL Em compensação, os fucanos como o dermatano-sulfato e contraria-mente â heparina, não actuam sobre a inibição do factor Xa; são inibidores exclusivos da trombina. Os inventores da presente invenção constataram também, que de um modo surpreendente os fucanos, embora não contenham, contrariamente â heparina, nem amino-açúcares nem ácidos urõnicos O-sulfatados, exibem a propriedade de inibir a activação do complemento.

Os inibidores da activação do complemento podem actuar na prevenção de fenómenos de rejeição de transplantes; a sua tLtilização tem sido também sugerida no tratamento de dialisados renais e de convalescentes de enfartes de miocãrdio. A actividade anticomplementar pode igualmente ser de grande utilidade na inibição da activação do complemento nos dispositivos de circulação extracorporal.

Embora ãs suas propriedades anticoagulantes sejam conhecidas hã alguns anos, os fucanos impuros não têm sido utilizados em terapêutica, por um lado por causa do seu teor em proteínas residuais relativamente elevado que provocam o risco de provocar fenómenos de imunização e por outro lado por causa da sua massa molecular elevada que tem por consequência uma má solubilidade, o que limita consideravelmente a sua utilização em concentrações elevadas.

Portanto, os estudos realizados até ao presente e respeitantes â acção anticoagulante dos fucanos, em especial os relativos à actividade anticoagulante de diversas sub-popula-ções de fucanos obtidas por fraccionamento do fucano impuro, sugeriram que a actividade anti-coagulante estava precisamente ligada à grande dimensão das moléculas de fucano. Certos investigadores chegaram à conclusão de que a actividade anti-coagu-lante estava relacionada com um peso molecular, elevado. £Usui et al; "Agr., Biol. Chem."., 44-8; 1980^.

Outros trabalhos poêm em evidência a existência de um limite inferior a 20 KDa abaixo da qual não tem sido observada nenhuma actividade anti-coagulante significativa. A patente de invenção inglesa 890207 descreve por exemplo a obtenção de 7 fracções diferentes cujo peso molecular se encontra entre 5 e 50.000, por precipitação fraccionada do fucano impuro com etanol. De acordo com esta patente, entre estas fracções, sõ aquelas cujo peso molecular ê superior a 20.000 apresentam uma actividade anti-coagulante interessante.

Nishino et al. £ "Carbohydrate Research"; 186; 1989; 119-129J estudaram as propriedades anti-coagulantes de fracçõe obtidas a partir de fucanos não degradados e puseram igualmente em evidência o limite de 20 KDA. Por outro lado, as fracções purificadas descritas nos trabalhos publicados apresentam um mecanismo de acção diferente do descrito para os fucanos impuros, porque se bem que com estes últimos, elas parecem ser mais activas sobre a trombina que sobre o factor Xa, a sua acção ma- nifesta-se essencialmente ao nível do mecanismo global da coagulação o que se traduz por um alongamento do tempo de cefalina--caulino (TCK); em compensação, não apresentam acção sobre o tempo de trombina, e parecem menos activas ao nível da última fase da coagulação.

Parece pois que as sub-populações polissacarídicas obtidas precisamente por fraccionamento não degradativo do fucano impuro, exibem uma acção sobre a coagulação variável de uma sub-população para outra, podendo ser parece-nos, diferente da observada no caso do fucano impuro; por outro lado, sobressai dos trabalhos realizados ate ao presente que as fracções de massa molecular inferior a 20 KDa, que seria particularmente vantajosa para a sua solubilidade, são praticamente inactivas sobre a coagulação.

Os presentes inventores emitiram a hipõtese de que fragmentando as longas cadeias polissacarídicas do fucano bruto, será possível obter fracções de baixo peso molecular; contudo a cisão do esqueleto sacarídico das moléculas de fucano necessita de técnicas de lise que é essencial controlar para não se proceder a uma degradação excessiva do fucano que conduza à perda das suas propriedades.

Os ensaios já realizados neste sentido não permitiram a obtenção de um processo de degradação de fucanos que forneça fracções de peso molecular intermédio; com efeito, as técnicas utilizadas conduziam a uma degradação insuficiente dando fracções de peso molecular superior a 40 KDa, quer a uma degradação quase total fornecendo fragmentos desprovidos de acção anti-coagulante.

Colliec et al.; IV emes journées d'hémostase et de thrombose

Paris; Mars 1988^/, £Fischer et al., International Congress on thrombosis (Athens) , Mai 1988 J, ^COLLIEC etal.,. JPolymers in Medicine, Varsovie, Octobre 1988£.

Consequentemente, a presente invenção tem por finalidade conseguir fracções polissacarídicas de peso molecular relativamente baixo, obtidas por lise de fucanos de lagas castanhas. Tem igualmente por finalidade preparar agentes anti-coagulantes e anti-trombõticos especialmente interessantes porque a^suas activi-dade se exerce por inibição do factro lia e porque não possuem acção anti-Xa, e porque não apresentam os efeitos secundários devidos ao peso molecular elevado e ao grande teor em proteínas residuais dos fucanos impuros e porque são por são por outro lado obtidos a partir de algas castanhas que são matérias primas facilmnte disponíveis em grande quantidade. Tem igualmente por finalidade preparar um novo agente anticomplementar otido a partir de fucanos de algas castanhas. A presente invenção diz respeito a polissacaridos sulfatados, obtidos a partir de fucanos de Feofíceas, caracterizados pelo facto do seu peso molecular, determinado por filtração sobre gel em comparação com um padrão polissacarídico, ser superior a 5 e inferior a 40 KDa, pelo seu teor de enxofre ser superior ao dos fucanos de origem, porque contém menos Q15% de proteínas con-taminantes e porque são mais solúveis que os fucanos que lhes deram origem e porque possuem propriedades anti-coagulantes e anti-trombóticas.

Os polissacaridos sulfatados de acordo com a presente invenção são susceptíveis de se obterem por lise de um fucano impuro extraído de Feofíceas. 10 10

Utilizando uma técnica preferida obtêm-se polissaca-ridos sulfatados, de acordo com a presente invenção, com pesos moleculares médios inferiores ou iguais a 20 KDa.

Utilizando uma outra técnica preferida obtêm-se polissa-caridos sulfatados de acordo com a presente invenção com pesos moleculares médios compreendidos entre 20 e 35 KDa.

Utilizando uma técnica também preferida obtêm-se polissa-caridos sulfatados de acordo com a presente invenção com um teor de enxofre superior em 2 a 20% ao dos fucanos que lhes deram origem.

Utilizando uma disposição particularmente vantajosa desta técnica obtêm-se polissacaridos sulfatados por hidrólise ácida de fucanos extraídos de "Fucus vesiculosus, cujo teor de enxofre ê superior em aproximadamente 15 a 20% do dos fucanos que lhes deram origem e cujo teor de proteínas ê inferior a 0,05%.

Utilizando uma outra disposição particularmente vantajosa desta técnica, obtêm-se polissacaridos sulfatados por hidrólise ácida de fucanos extraídos da "Ascophyllum nodosum" com um teor de enxofre superior em aproximadamente 2 a 5% ao dos fucanos que lhes deram origem e um teor de proteínas inferior a 0,05%.

Utilizando uma outra disposição particularmente vantajosa desta técnica, obtêm-se polissacaridos sulfatados por hidrólise ácida de fucanos extraídos de "Pelvetia canaliculata" cujo teor de enxofre ê superior em aproximadamente 15 a 20% ao dos fucanos que lhes deram origem e cujo teor de proteínas é inferior a 0,05%.

Utilizando ainda uma outra disposição particularmente vantajosa desta técnica, obtêm-se polissacaridos sulfatados por hidrólise ácida de fucanos extraídos de "Undaria pinnatifida" cujo teor de enxofre ê superior em aproximadamente 10 a 15% ao dos fucanos que lhes deram origem e cujo teor de proteínas ê 0,05% inferior.

Os inventores da presente invenção demonstraram, in vitro e in vivo, que os polissacaridos sulfatados, de acordo com a presente invenção possuem por sua vez propriedades anti-coagu-lantes e antitrombõticas. Contrariamente às sub-populações polis-sacarídicas de peso molecular baixo descritas por Nishino et al., os polissacaridos, de acordo com a presente invenção, actuam essencialmente ao nível da última fase da coagulação. A presente invenção diz também respeito a um agente anti-coagulante e anti-trombôtica, activo quer in vitro quer in vivo, activador dos cofactores HC:XEe ATUI, caracterizado pelo facto de incluir pelo menos um polissacarido sulfatado tal como se definiu antes. A presente invenção dia ainda respeito a uma técnica para a obtenção de polissacaridos sulfatados definidos antes, caraoi·. terizada pelo facto de se proceder a uma lise de um fucano bruto proveniente de feofíceas, técnica essa em que se fracciona o lisado obtido por filtração sobre gel e em que se recolhem as fracções de peso molecular superior a 5 e inferior a 40 KDa.

Utilizando uma técnica preferida, de acordo com a presente invenção, a lise de fucano processa-se por hidrólise ácida.

Utilizando uma disposição particularmente vantajosa desta técnica, a hidrólise ácida efechia^se por acção do ácido sulfú-rico 0,5 a IN, a uma temperatura compreendida entre 409 e 509C, durante 1 a 4 horas.

Utilizando uma outra técnica preferida,; de acordo com a 12 presente invenção, a lise do fucano processa-se por radiolise, submetendo o fucano a uma irradiação, especialmente de raios gama.

Ainda utilizando uma técnica preferida, de acordo com a presente invenção, a lise do facano processa-se por hidrólise enzimãtica. Esta técnica implica a utilização de pelo menos um enzima capaz de fragmentar o esqueletohidrocarbonado do fucano,'por exemplo um :enzima do tipo; ^£-l-2-fucasidase; podem, litilizar-sè. também, -misturas de enzimas constituídos por exemplo por sucos digestivos de moluscos marinhos ou obtidos a partir dos mesmos ou ainda por enzimas contidos em bactérias que degradam as algas.

Ainda de acordo com uma outra técnica preferida, de acordo com a presente invenção, a lise do fucano processa-se utilizando técnicas físicas nomeadamente por ultra-sons.

Utilizando uma técnica vantajosa, de acordo com a presente invenção, recolhem-se as fracções cujo peso molecular ê inferior ou igual a 20 KDa. O peso molecular dos polissacaridos sulfatados de acordo com a presente invenção, permite a sua solubilização, mesmo em concentrações elevadas, no plasma e em soluções injectãveis.

Por outro lado, contêm, comparativamente aos fucanos impuros, uma baixa percentagem de proteínas contaminantes. É pois possível utilizar estes produtos no homem como medicamentos. Isto ê particularmente vantajoso em certas aplicações das propriedades anti-trombóticas de polissacaridos sulfatados de acordo com a presente invenção, em especial na prevenção de tromboses venosas por injecção sub-cutânea dum agente anti-trombótico; esta aplicação exige a utilização de soluções relativamente concentradas o 13 que era impossível com os fucanos não farccionados; é também possível utilizar polissacaridos sulfatados de acordo com a presente invenção por via oral e transdirmica.

As fracções com um peso molecular compreendido entre 5 e 100 KDa, obtidas a partir de fucanos, possuem uma outra acção anti-complementar igual ou superior ã dos fucanos não fraccio-nados.

Assim, a presente invenção diz ainda respeito a um agente inibidor da activação do complemento, caracterizado por incluir fucanos extraídos de Feofíceas e/ou as suas fracções.

Utilizando uma técnica preferida para a preparação do agente inibidor de activação do complemento, de acordo com a presente invenção, o mesmo compreende uma fracção de peso molecular superior a 50 KDa obtida a partir de um fucano extraído de Feofíceas.

Utilizando uma técnica preferida de preparação do agente inibidor da activação do complemento de acordo com a presente invenção, o mesmo inclui uma fracção de peso molecular médio compreendido entre 5 e 50 KDa, obtida a partir de um fucano extraído de Feofíceas.

Ainda utilizando uma técnica preferida para a preparação do agente inibidor da activação do complemento, de acordo com a presente invenção, o mesmo inclui polissacaridos sulfatados tal como defenidos antes.

Compreender-se-a melhor a presente invenção com a ajuda complementar da descrição que se segue e que se refere a exemplos de obtenção de polissacaridos sulfatados de acordo com a presente invenção a partir de fucanos extraídos de diferentes algas castanhas e à demonstração das actividades destes polissacaridos.

No entanto, deve ter-se em atenção que estes exemplos são apresentados unicamente a título de ilustração do objectivo da presente invenção, não constituindo pois em nenhuma hipótese uma limitação. I - Obtenção de fracções polissacarídicas sulfatadas de acordo com a presente invenção

Exemplo 1; Fraccionamento de fucanos e purificação das fracções obtidas A) Extracção de fucanos de algas castanhas

Extraem-se os fucanos a partir de material parietal dos talos de algas castanhas, utilizando uma técnica clássica de extracção orgânica. Esta técnica deriva da técnica de Black et al. C "J- Sei. Food Agric."; 1952^. 0 protocolo de extracção pode ser esquematizado como se segue: trituraram-se os talos em álcool absoluto contendo 5% em peso de formol. Submete-se a massa obtida a uma primeira extrac ção, pelo etanol a 95% contendo 5% em peso de formol, depois a uma segunda extracção utilizando uma mistura de acetona/tolueno (2:1, v/v). Após secagem na estufa, submete-se o material obtido a uma ou mais extraeçoes ácidas com ácido clorídrico 0,01 M contendo 2% em peso de cloreto de cálcio.

Após neutralização com hidróxido de sódio, trata-se o extracto ácido com cloreto de N-cetilpiridínio o que permite a formação dum complexo com os fucanos mais sulfatados, e o enrique- 1

( cimento da preparação nestes últimos. 0 precipitado obtido é depois redissolvido numa solução de cloreto de cálcio 3M e depois liofilizado. B) Fraccionamento de tucanos extraídos. 1- etapa; degradação do extracto impuro a) por hidrólise ácida

Dissolve-se o extracto ácido a 10 mg/ml em uma solução de ácido sulfúrico IN â temperatura fixa de 45°C. Controla-se a degradação determinando a viscosidade (viscosímetro do tipo Ubbelohde com um capilar de escoamento com um diâmetro de 0/5 mm) e interrompe-se essa degradação adicionando uma solução de hidróxido de -sóóio 1M antes da hidrólise total do fucano. No decurso da degradação, calcula-se a viscosidade específica reduzida spec./C) de 30 em 30 minutos. Concentra-se a solução do extracto ácido degradado, submete-se a ultrafiltração utilizando uma: membrana com uma entrada de fenda de 1000 daltons e por último liofiliza-se. b) por radiação A hidrólise radioquímica realiza-se sob irradiação a partir de uma fonte de cobalto 60 de 60.000 Ci. Irradiam-se os fucanos impuros â temperatura ambiente durante 92 horas com um debito de dose de 2081 rads/minuto o que equivale a uma dose de irradiação de 11,5 Mrads para todas as amostras. c) degradação enzimãtica A degradação enzimãtica do extracto bruto de "Pelvetia canaliculata" dos extractos brutos do suco digestivo de haliotide (Haliotis tuberculata) e de aplisia (Aplvsia californica) realiza-se do seguinte modo: dissolve-se o fucano impuro numa concentração de 10 mg/ml num tampão de citrato-fosfato; pH 5,8 (ácido cítrico = CgHgO^ a 0,1 M e fosfato de hidrogénio disodico = Na2HPO 21^0 a 0,2 M) . Aquece-se a solução de fucanos a 37°C e adicionam--se 200 Jxl de extractos digestivos hora a hora, para assegurar uma concentração constante do enzima activo. Controla-se a degradação determinando a viscosidade, calculando-se a viscosidade específica reduzida, (^sp)/C, a partir de diferentes amostragens. Interrompe-se a reacção numa solução de carbonato dissódico (Na2c03) 0,2 M. 2- etapa : Fraccionamento preparativo do extracto impuro degradado a) ã escala laboratorial

Tratam-se 500 mg de liofilizado com 5 ml de cloreto de sódio 2 M e depositam-se numa coluna (altura de 35 a 45 cm x 4,8 cm) de gel de fraccionamento (Sephacryl S-200 ou S-300). 0 débito linear i de 3,33 cm/hora. Realiza-se uma dupla detecção à saída da coluna com a ajuda de refractómetro diferencial e de um detector ultra-violeta a 280 nm. Calibra-se a coluna com a ajuda de padrões polissacarídicos. Registam-se os sinais utilizando um registador de dupla via. Após o estudo dos cromatogramas, reunem-se as diferentes fracções obtidas à saída da coluna (5 ml) fl7 em 3 ou 4 fracções. Concentra-se cada fracção, ultrafiltra-se sobre uma membrana com uma entrada de fenda de 10.000 daltons para a primeira fracção, e sobre uma membrana de entrada de fenda de 1.000 daltons para as outras fracções, e liofiliza-se b) â escala semi-industrial

Tratam-se 30 g de liofilizado com 125 ml de cloreto de sódio 0,2 M e depositam-se sobre uma coluna de Sephacryl S-200 (altura 60 cm x diâmetro 11,3 cm). Sendo o débito linear de 15 cm/hora. Realiza-se uma dupla detecção â saída da coluna, com a ajuda de um refractómetro diferencial e de um detector ultra--violeta a 280 nm. Registam-se os sinais utilizando um registador de dupla via. Após estudos dos cramatogramas reunem-se as diferentes fracções obtidas à saída da coluna (30 ml) em 3 ou 4 fracções. Concentra-se cada uma das fracções, ultrafiltra-se sobre uma membrana com uma entrada de fenda de 10.000 daltons para a primeira fracção e sobre uma membrana de entrada de fenda de 1000 daltons para as outras fracções e liofiliza-se. A figura 1 representa o fraccionamento preparativo sobre o gel Sephacryl S-200 (domínio de fraccionamento 250 x 10° a 3 - - 5 x 10 daltons) do extracto acido de fucano degradado pelo acido sulfúrico IN a 45°C : A^ = 1- fraccção (PM ^ 20 KDa); A2 = 2- fracção (20 KDa ^ PM ^ 10 KDa); A^ = 3- fracção (PM ^ 10 KDa); Vm = volume morto e Vt = volume total. A curva ponteada (----) representa a quantidade de material eluído avaliada por refractometria diferencial. A curva a cheio (-) representa a quantidade de proteínas medida por absorção ultra-violeta a 280 nm. ί ' í

Exemplo 2 : Caracterização físico-química das fracções obtidas

Espectro infra-vermelho: A figura 2 representa os espectros infra-vermelhos do fucano impuro (2a) extraído das paredes laterais de "Fucus vesiculosus", e de uma fracção A£ (2b) de peso molecular médio 13 x 10 obtida por hidrólise ácida deste extracto ácido. O pico a 1240 cm ^ ê característico de grupos sulfurilo. O pico a 850 cm ^ mostra que a maioria dos grupos sulfato se encontra em posiçáo sobre a L-fucose; alguns destes grupos sulfato encontram-se em posição Cg como o demonstra a formação de um patamar a 820 cm . A maior parte das funções carboxílicas encontram-se sob uma forma não dissociada como o demonstra o pico a 1720 cm \ comparado a uma ligeira formação de um patamar a 1420 cm ^ que representa as funções carboxílicas sob uma forma dissociada.

Determinação do peso molecular A determinação do peso molecular em g/mole das fracções de fucano realiza-se por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) utilizando uma coluna Si-Diol.500 (domínio de fracciona- 6 ^ mento 5000 a 10 daltons) mediante a injecçao de 50 ^j.1 de polissa-caridos padrão (Pululano dos laboratórios Polymer Laboratories Ltd.) ou da fracção de fucano estudada, a 2 mg/ml em cloreto de sódio 0,2 M, sendo o débito de 1 ml/minuto e a detecção realizada por refractometria. Os cromatogramas são arquivados após análises graças a uma microcumputador que possui um programa GPC (cromatografia de exclusão estérica sobre gel permeável), registam-se os resultados utilizando uma impressora.

Teor de enxofre e de azoto: 0 teor de enxofre e de azoto das fracções de fucano obtêm--se em % (em peso de produto puro) por análise elementar.

Teor de proteínas: 0 teor de proteínas determina-se em % (em peso de produto puro), utilizando o ensaio calorimétrico de Bradford (teste "Bio-Rad") considerando como referência a albumina bovina. 0 quadro 1 permite estabelecer uma comparação entre as propriedades fxsico-químicas do fucano bruto, quer dizer do extracto ácido (EA) não fraccionado, e de polissacaridos sulfatados de acordo com a presente invenção, representados pela fracção A2 obtida por hidrólise ácida a partir de fucanos impuros extraídos de 4 algas castanhas: Ascophyllum nodosum (An), Fucus vesiculosus (FV), Pelvetia canaliculata (Pc), Undaria pinnatifida (Up).

Quadro 1

Peso S proteína rendimento molecular médio % % O. Ό EA (An) 7 x 105 00 10 0,36 — A2 (An) 18 x 103 9/1 <0,01 57 EA (Fv) 8 x 105 00 0,85 - A2(Fv) 13 x 103 9,2 < 0,01 57 EA (Pc) 75 x 104 9,4 0,19 - A2 (Pc) 18 x 103 11 < 0,01 40 EA(Up) 48 x 104 7,2 0,26 - A2(Up) 23 x 103 8,0 < 0,01 36 0 quadro II permite estabelecer uma comparação entre as propriedades físico-químicas do extracto ácido (EA) não fraccio-nado, e de polissacaridos sulfatados, de acordo com a presente invenção, representados pela fracção A2 obtida por radiõlise a partir de fucanos de 3 algas castanhas : Ascophyllum nodosum (An), Fucus vesiculosus (Fv), Pelvetia canaliculata (Pc).

Quadro II

Peso molecular médio s % proteína % rendimento % EA (Ah) 7 X 105 8,9 0,36 - A2 (An) 17 X 103 7,8 0,11 46 EA(Fv) 8 X 105 7,8 0,85 - A2(Fv) 17 X ΓΟ 0 1—1 8,6 <0,01 56 E2(Pc) 75 X 104 9,4 0,19 - A2(Pc) 15 X io3 9,7 0,10 58 Ea(Up) 48 X 0 I—1 7,2 0,26 - A2(Up) 13 X 104 8,0 0,11 36 II - Comparação da actividade biológica de fucanos brutos e de fracções obtidas por lise dos primeiros

Exemplo 3 ; Actividade anticoagulante in vitro:

A actividade anticoagulante do fucano não degradado e de fracções de fucano degradado de peso molecular compreendido entre 10 e 20 KDa, avalia-se pelo tempo de cefalina-caulino (TCK). A actividade ê indicada em unidades internacionais por mg de produto 21 %'~<Í (Ui/mg), através da relação seguinte: (declive da recta relativa à fracção de fucano/declive da recta relativa à heparina padrão) x actividade em Ui/mg de heparina padrão (Heparina H108 fornecida pelos laboratórios Choay). 0 declive calcula-se a partir da recta obtida representando 0 logaritmo do tempo de coagulação em segundos, em função da concentração em anti-coagulante (concentração da heparina 0,5 a 1 jig/ml de plasma, e do fucano 10 a 50yig/ml). 0 quadro III permite estabelecer uma comparação entre as actividades anti-coagulantes do extr.acto ácido (EA) , (ou fucano bruto) e da fracção A2 (obtida por hidrólise ácida) de algas castanhas: Ascophyllum nodosum (An), Fucus vesiculosus (Fv), Pelvetia canaliculata (Pc) e Undaria pinnatifida (Up).

Quadro III

Actividade anticoagulante1 (Ui/mg) EA(An) 4,5 A2 (An) 6,6 EA (Fv) 5,0 A2 (Fv) Ol 00 i EA(Pc) 4,0 A2 (Pc) 2,0 EA(Up) - A2(Up) 1,3 1

Actividade anti-coagulante determinada tomando como referência ( (

Λ ί uma heparina padrão H108 a 173 Ui/mg. 0 quadro IV permite analisar com maior precisão a acção anti-coagulante de polissacaridos sulfatados, de acordo com a presente invenção, permitindo a comparação entre os efeitos respetivos no tempo de Quick (TQ), no tempo de cefalina-caulino (TCK), no tempo de trombina (TT), e no tempo de reptilase (TR), da frac-ção A2 (Pc) e da heparina.

Quadro IV

Tempo de coagulação ^segundos) F2 (PC) (jig/ml) TQ TCK TT TR 0 13 56 25 22 10 14 70 40 22 25 15 100 130 22 30 15 120 >180 21 50 15 155 > 180 22 100 18 220 > 180 22 Heparina (Jig/ml) TQ TCK TT TR 0,25 14 85 90 22 0,5 14 120 >120 22 0,75 14 150 >120 22 1 14 >200 >120 22 5 17 >200 >120 22 10 23 >200 >120 22 0 que acabámos de descrever demonstra que os polissacaridos sulfatados, de acordo com a presente invenção, actuam essencialmente sobre o tempo de trombina.

Exemplo 4 ; Actividade anti-coagulante in vivo: influência de polissacaridos sulfatados de acordo com a presente invenção nos parâmetros da coagulação A actividade anti-coagulante de fracções polissacarídicas, de acordo com a presente invenção, avalia-se no coelho. Injecta--se em coelhos de 3 kg uma fracção de peso molecular médio de 15.000 .Da preparada de acordo com a técnica de hidrólise ácida descrita no exemplo 1. Os coelhos são sangrados a intervalos regulares e avaliam-se os parâmetros da coagulação no sangue retirado, mediante a avaliação do tempo de trombina (TT) e do tempo de cefalina-caulino (TCK). O quadro V mostra a evolução dos parâmetros da coagulação em função do tempo, apés injecção de 0,5 ml de uma solução de polissacaridos sulfatados de acordo com a presente invenção (frac-ção A2 da Ascophyllum nodosum, obtida por hidrólise ácida), a 100 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml e a título de comparação após injecção de heparina a 2 mg/ml.

Quadro V

Tempo de colheita TT (seg.) TCK (seg.) A2 (An) 0 35 23,3 100 mg/ml lOmn > 240 115 30mn >240 88,4 4n30m 31 32,4 A2 (An) 0 48 30 40 mg/ml lOmn >240 73,4 30mn > 240 58,8 4h30m 23,4 25 A2(An) 0 33 25 30 mg/ml lOmn > 300 59,2 30mn 123,6 47 4h30m 20,3 24 0 28,4 23 Heparina lOmn >240 52 30mn >240 60 4h30m - -

Exemplo 5 : Actividade antitrombotica in vivo; trombose experimental 1/Têcnica 0 modelo de trombose experimental utilizado é o de Fessler e Hauptmann £ Stanford Wessler, Santley M. Reimar e Mindel C. Sheps; "J. Appl. Physiol"; 1959 p. 943-946; 14 p.J no coelho, que utiliza o factor Xa. £ J. Hauptamnn, B. Kaiser, P. Markwardt e G. Nouak; "Thromb. Haemostaris Stuttg.";/431980 P· 118-123J7, como agente estimulador da trombose.

Os ensaios realizaram-se com uma fracção polissacarídica, de peso molecular médio 20.000 - 2000 obtida por hidrólise acida de fucano impuro, como se descreveu no exemplo 1. Injecta-se o produto por via endovenosa nas doses de 0,150; 0,625; 1,25; 2,5 e 5 mg/kg, 10 minutos antes da indução da trombose. Cada dose ê ensaiada em cinco coelhos. Realizou-se uma determinação da DE50 (Dose eficaz 50, que corresponde ã dose que diminui em 50% o peso do trombo formado) antitrombótica por regressão logarítmica, o que concorreu para o aparecimento de um valor médio de 0,40 mg/kg (compreendido entre 0,23 e 0,66 mg/kg). A colheita de sangue realiza-se 10 minutos após a injecção por via endovenosa logo apõs a criação do saco venoso. Os resultados médios obtidos para cada dose estão resumidos no quadro VI.

Quadro VI

Dose injectada (mg/kg) TCKa (seg) iprjn·^ (seg) TQC (seg) 0 30,6 20,4 8,5 0,150 31,8 22,2 8,5 0,625 35 24,9 8,7 1,25 40,2 38,5 8,6 2,5 50,9 45,2 8,5 5 67,6 71,2 8,4 Testemunhas 28,8 21,4 8,3 a) Tempo de cefalina-caulino b) Tempo de trombina c) Tempo de Quick

Estes resultados confirmam os observados in vitro e descritos no exemplo 3 e no quadro IV.

Também os resultados observados nos coelhos testemunha incluídos no protocolo de trombose experimental, mas aos quais só se administrou o dissolvente da fracção A2, estão indicados neste quadro. Os pesos médios de trombos húmidos colhidos na veia contralateral, para as doses de 0,15; 0,625; 1,25 e 5 mg/kg estão indicados no quadro VII.

Quadro VII

Dose (mg/kg) 5 1,25 0,625 0,15 Testemunhas Peso de Trombos (mg) 0,0 0,0 23,5 40 76,9

Exemplo 6 : Determinação da actividade anti-complementar global de fucanos e das suas fracções A actividade anti-complementar determina-se doseando o CH50 (complemento hemolítico 50), na presença ou na ausência de fucanos. 0 doseamento do CH50 permite apreciar a actividade funcional global da via clássica do sistema de complemento do soro humano. Este ensaio consiste em determinar a mais pequena quantidade de soro humano recentamente recolhida capaz de conduzir á lise de 50% dum determinado numero de glóbulos vermelhos de carneiro sensibilizados de forma optimizada por anti-corpos de coelho anti-glõbulos vermelhos de carneiro (ES = Eritròcitos sensibilizados).

As proteínas da via clássica do sistema do complemento reconhecem esses glóbulos vermelhos como um elemento estranho e activam-se por cisões sucessivas para reagir sobre os glóbulos vermelhos o que conduz ã lise dos mesmos. É possível determinar as propriedades de inibição de um polímero como a heparina ou do fucano doseando o CH50 na presença do polímero. A capacidade de inibição ê dada pela concentração em mg de polímero por ml de soro humano diluído a 1/4, capaz de inibir 50% da lise das células, estabelecendo uma curva dose/resposta da lise das células em função da concentração do polímero. Quanto menos intensa esta for mais importante ê a actividade anti-complementar do polímero. Para avaliar a actividade anti-complementar dos fucanos, tem-se utilizado o extracto ácido (fucano impuro) bem como fracções de diferentes pesos moleculares obtidas por hidrólise ácida do dito fucano impuro. As condições experimentais são as seguintes: misturam-se 50Jil de SHN (soro humano normal) puro com 50 ^jj.1 de fucano, em diferentes concentrações (.0,2 a 0,5 mg/ml) ; após uma· incubação de 30 minutos â temperatura de 37°C, adicionam-se 4900 Jl de tampão VBS++. Obtem-se a solução A.

Por outro lado, misturam-se 0,3 a 0,8 ml de tampão VBS++ a 0 a 0,5 ml da solução A, para obter um volume total de 0,8 ml; adiciona-se â mistura 0,2 ml de eritrocitos sensibilizados; após / 1» 28 uma incubação de 45 minutos à temperatura de 37°C, centrifuga-se a mistura durante 10 minutos a 1300 g e ã temperatura de 4°C e procede-se â leitura da Densidade õptica a 414 nm.

Composição do tampão VBS++: 42,5 g 1,875 g 2,85 g 1000 ml

Cloreto de sódio Véronal (dietil-barbital de sódio) Ãcido dietil-barbitúrico Ãgua destilada q.b. para

Ajusta-se o pH para 7,4; misturam-se 20 ml desta solução com 80 ml de ãgua destilada: adiciona-se 0,5 ml de cloreto de cálcio 0,03 M e 0,5 ml de cloreto de magnésio 0,10 M.

Os resultados obtidos podem observar-se no quadro VIII (2-. coluna). As fracçoes de fucano sao 3 a 100 vezes mais activas que a heparina H108 analisada nas mesmas condições. Esta actividade é independente da actividade anti-coagulante.

Quadro VIII

Fracçoes DI50 (CH50) (mg/ml) DI50 C3A (mg/ml) DI50 C4A (mg/ml) EA An 0,035 - 0,16 nd 0,14 An 0,26 0,070 nd An 1 - 1,37 0,10 0,11 A^ An 0,20 0,175 0,024 Αχ Pc 0,036 nd nd A2 Pc 0,60 nd nd A2 FV 1,95 nd nd a2 up 1,26 nd nd Heparina 4 0,15 0,05

Demonstra-se assim que o fucano impuro, assim como as fracções de peso molecular médio compreendido entre 5 e 100 KDa, inibem totalmente a activação do complemento e possuem uma acção anti-complementar superior à da heparina. Com efeito, enquanto que no caso da heparina sao necessárias 4 mg/ml de polímero 50% da lise das células, neste caso não são necessários mais do que 0,035 a 1,95 mg/ml (de acordo com o peso molecular) de fucanos impuros ou fraccionados, para obter o mesmo efeito. Observou-se assim que as fracções de peso molecular médio de 18.000 KDa, preparadas como se descreve no exemplo 1, inibem 50% da lise das células numa concentração de 1,3 mg/ml e que as fracções de peso molecular médio compreendido entre 5 e 10 KDa inibem 50% da lise das células numa concentração de 0,20 mg/ml.

Exemplo 7 : Avaliação de C3a e de C4a por radioimunodoseamento

Determina-se a concentração das proteínas C3a e C4a libertadas em fase líquida durante a activação no sobrenadante por radioimunodoseamento.

Este ensaio realiza-se do modo seguinte, com a ajuda de um Kit de radioimunodoseamento C3a-desarg 1251 (comercializado por Amersham).

Misturam-se 50jj,1 de SHN puro activado pelo Sêphadex, com 50 jal de tampão VBS++, e 100 jil de fucano em concentrações variáveis (0,1 a 5 mg/ml). PÕe-se a mistura numa incubadora 30 minutos â temperatura de 37°C depois do que se centrifuga durante 5 minutos a 1700 g. Colhem-se 160 jxl de sobrenadante, aos quais se adicionam -2 10 ul de EDTA (8,66 x 10 M), (que bloqueia a activaçao do com- plemento), depois 170 ji 1 de agente precipitante (fornecido com o Kit de doseamento). Depois de uma incubação de 5 minutos â temperatura ambiente, centrifuga-se a mistura durante 2 minutos a 10.000 g, e dilui-se o sobrenadante (1/4 a 1/512), antes de proceder ao doseamento RIA. A actividade da amostra (Dl 50) exprime-se com a quantidade de fucano necessária para inibir 50% da quantidade de C3a normalmente gerada em 1 ml de SHN diluido a 1/4. Esta dose inibidora ê expressa em mg de fucano/ml de SHN diluido a 1/4. Os resultados estão indicados no quadro VIII (coluna 3).

Uma solução de 0,21 mg/ml de A2 (An) no SHN diluido a 1/4 permite diminuir a activação do C3 até valores inferiores aos da activação expontânea de SHN.

Por outro lado, 0,5 mg da mesma fracção são suficientes para inibir totalmente a activação de C3 contido em 1 ml de SHN diluido a 1/4 e submetido a um activador (Sephadex, que conduz â concentração de 15 mg/ml uma activação total do complemento) colocado em quantidade superior â necessária para uma actividade total do compplemento.

Os resultados relativos a C4a estão igualmente relatados no quadro VIII (coluna 4).

Daqui ressalta que a presente invenção não só se limita âs técnicas nela descritas nem â realização dos exemplos também descritos de forma mais explícita; a presente invenção engloba pelo contrário todas as variantes que possam acudir ao espírito do perito na matéria sem se desviar do seu plano e disposição iniciais nem das suas conclusões.

Claims

31 R Ε I V I ND -I CAÇÕES 1.- Processo para a preparação de polissacaridos sulfatados, obtidos a partir de fucanos extraídos de Feofíceas, com um peso molecular, determinado por filtração sobre gele relativamente a um padrão polissacarídico, superior a 5 e inferior a 40 KDa, com um teor em enxofre superior ao dos fucanos iniciais, contendo menos de 0,15% de proteínas contaminantes e mais solúveis que os fucanos que lhes deram origem e possuindo propriedades anticoagu-lantes e antitrombõticas, caracterizado pelo facto de se proceder à lise de um fucano bruto proveniente de feofíceas, de se fraccio-nar o lisado obtido por filtração sobre gele e de se recolherem as fracções de peso molecular superior a 5 e inferior a 40 KDa.
2.- 32 2. - processo âe acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se realizar a lise dos fucanos brutos provenientes de feoflceas por hidrólise ácida.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se realizar a hidrólise ácida por acção de ácido sulfúrico 0,5 a IN, a uma temperatura compreendida entre 40° e 50°C e durante 1 a 4 horas.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obterem polissacaridos sulfatados com um peso molecular médio inferior ou igual a 20 KDa.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obterem polissacaridos sulfatados com um peso molecular médio compreendido entre 20 e 35 KDa.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se obterem polissacaridos sulfatados com um teor em enxofre superior de 2 a 20% ao dos fucanos que lhes deram origem.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se obterem polissacaridos sulfatados por hidrólise ácida de fucanos extraídos de "Fucus vesiculosus", com um teor em enxofre quperior, aproximadamente, de 15 a 20% ao dos fucanos que lhes deram origem e com um teor em proteínas inferior a 0,05%.
8, - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se obterem polissacaridos sulfatados por hidrólise acida de fucanos extraídos de "Ascophyllum nodosum", com um teor em enxofre superior, aproximadamente, de 2 a 5% ao dos fucanos que lhes deram origem e com um teor em proteínas inferior a 0,05%.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se obterem polissacaridos sulfatados por hidrólise ácida de fucanos extraídos de "Pelvetia, canaliculata", com um teor em enxofre superior, aproximadamente, de 15 a 20% ao dos fucanos que lhes deram origem e com um teor em proteínas inferior a 0,05%.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se obterem polissacaridos sulfatados por hidrólise ácida de fucanos extraídos de "Undaria pinnatifida", com um teor em enxofre superior, aproximadamente, de 10 a 15% ao dos fucanos que lhes deram origem e com um teor em proteínas inferior a 0,05%.
11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se realizar a lise dos fucanos brutos provenientes de feofíceas por radiolise, submetendo os fucanos a radiações, principalmente raios gama. 34
12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-do pelo facto de se realizar a lise dos fucanos brutos provenien tes de feofíceas por hidrólise enzimãtica.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-do pelo facto de se realizar a lise dos fucanos brutos provenientes de feofíceas por processos físicos, principalmente por soni-cação.
14. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 e 11 a 13, caracterizado pelo facto de se isolarem as frac-ções cujos pesos moleculares são inferiores ou iguais a 20 KDa.
15. - Processo para a preparação de agentes anticoagulantes e antitrombõticos activos quer in vivo quer in vitro, activadores dos factores HC.II e ATUI, caracterizado pelo facto de se utilizar, na respectiva formulação, pelo menos, um polissacarido sulfatado quando preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 4 a 10.
16. - Processo para a preparação de agentes inibidores da activação dc complemento, caracterizado pelo facto de se utilizar, na respectiva formulação, fucanos extraídos de feofíceas e ou fracções dos mesmos. 17.-

/
17. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracteri-zado pelo facto de se utilizar uma fracção de peso molecular superior a 50 KDa obtida a partir de um fucano extraído de feofíceas
18. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracteri-zado pelo facto de se utilizar uma fracção de peso molecular médio compreendido entre 5 e 50 KDa obtida a partir de um fucano extraído de feofíceas.
19. - Processo para a preparação de agentes inibidores da ac-tivação do complemento, caracterizado pelo facto de se utilizar, na respectiva formulação, polissacaridos sulfatados quando preparados pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 4 a 10, Lisboa, 12 de Junho de 1990 i i