FR3047179B1 - Ulvanes sulfates et utilisation dans la regulation des troubles de la coagulation - Google Patents
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Abstract
L'objet de l'invention est un ulvane sulfaté présentant un taux de sulfates supérieur ou égal à 15% en masse par rapport à la masse totale de l'ulvane. L'invention a également pour objet des extraits et des compositions l'incluant, son procédé d'obtention ainsi que son application comme médicament en particulier comme antithrombotique / anticoagulant.
Description
ULVANES SULFATES ET UTILISATION DANS LA REGULATION
DES TROUBLES DE LA COAGULATION
La présente invention concerne des ulvanes sulfatés chimiquement présentant un taux de sulfates plus élevé que celui des ulvanes naturels communes sur les côtes françaises. L'invention a également pour objet ces polysaccharides pour leur application dans le domaine de la santé, en particulier pour leurs propriétés anticoagulantes et antithrombotiques.
La coagulation sanguine correspond à la formation d'un caillot (clou plaquettaire ou thrombus). C'est un processus indispensable à l'arrêt d'un saignement après une blessure dans un fonctionnement physiologique non pathologique.
La cascade de coagulation est classiquement divisée en trois voies : la voie extrinsèque, la voie intrinsèque et la voie commune. La voie extrinsèque et la voie intrinsèque activent toutes les deux la voie commune finale du facteur Xa, de la thrombine (lia) et de la fibrine.
Mais lorsque la coagulation sanguine survient à l'intérieur des vaisseaux sanguins, ce qui peut se produire spontanément, les caillots risquent de provoquer de graves problèmes, tels que l'interruption de l'apport vital de sang aux organes, ou de perturber les échanges dans les organes vitaux comme le poumon. Ces affections dites thromboemboliques, sont souvent dues à un dérèglement de la coagulation sanguine, provoquant la formation d'un thrombus (caillot sanguin) qui entraîne l'oblitération des vaisseaux et qui peut migrer en périphérie. Parmi les maladies thromboemboliques, on distingue :
La maladie thromboembolique veineuse : qui concerne les veines (thrombose veineuse profonde) et les poumons (migration du thrombus au niveau des poumons entraînant une embolie pulmonaire),
La maladie thromboembolique artérielle : qui correspond à la formation d'un thrombus au niveau d'une artère ou du cœur. Ce thrombus peut migrer au niveau d'une artère du cerveau (accident vasculaire cérébral, AVC) ou au niveau des artères périphériques (membres inférieurs par exemple). La fibrillation auriculaire (trouble du rythme provoquant des contractions irrégulières des oreillettes) entraîne la formation de thrombus au niveau du cœur, dont la principale complication est la survenue d'un AVC.
Ces affections peuvent être évitées ou traitées par l'utilisation d'anti-thrombotiques, qui permettent ainsi de préserver l'intégrité des organes et prévenir toute lésion grave qui pourrait se révéler irréversible dans certains cas.
Il existe trois catégories d'anti-thrombotiques :
Les antiagrégants plaquettaires qui empêchent l'agglutination des plaquettes et la formation de caillots sanguins,
Les thrombolytiques, encore appelés fibrinolytiques, qui sont des médicaments qui dissolvent les caillots (thrombus), et
Les anticoagulants, qui empêchent le développement des caillots existants et la formation de nouveaux caillots dans les artères ou dans les veines.
Les anticoagulants sont indispensables pour la prévention et le traitement de pathologies thromboemboliques. Ils présentent un rapport bénéfice/risque bien établi et sont utilisés depuis plus de 60 ans dans de nombreuses situations cliniques.
Il existe quatre grandes classes d'anticoagulants :
Les antivitamines K, tels que la warfarine,
Les inhibiteurs directs de la thrombine (médicaments anti-lla), tels que la bivaluridine ou le diabigatran étexilate (traitement oral)
Les inhibiteurs directs du facteur Xa non hépariniques (médicaments anti-Xa) tels que les xabans (traitement oral) qui agissent directement sur le facteur Xa, dans la cascade de la coagulation sans utiliser l'antithrombine comme médiateur,
Les héparines comprenant l'héparine non fractionnée (NF) et les héparines de bas poids moléculaires (HBPM).
Les anticoagulants oraux directs (médicaments anti-lla et anti-Xa) sont efficaces dans le traitement des maladies thromboemboliques mais présentent un risque hémorragique très supérieur aux héparines.
Les HBPM sont obtenues par dépolymérisation chimique ou enzymatique des chaînes d'HNF issues de muqueuses porcines. Elles présentent des variations en composés pharmacologiquement actifs, des propriétés chimiques et physiques diverses conduisant à des effets biologiques particuliers, voire des différences d'efficacité qui constituent des obstacles à leur utilisation. L'héparine non fractionnée (NF), est l'agent antithrombotique le plus utilisé dans la prévention et le traitement des pathologies thromboemboliques. Néanmoins, au cours des traitements par l'héparine NF, il peut survenir des effets secondaires tels qu'une réaction allergique ou une complication hémorragique due à sa forte activité anticoagulante, Xa- et lla-dépendante. De plus, l'héparine NF se révèle peu active dans la prévention et le traitement de la thrombose artérielle. En outre, l'héparine présente une faible biodisponibilité et enfin elle présente l'inconvénient d'être extraite de muqueuses de mammifères (intestins de porcs en majorité ou poumons de bœuf) ce qui présente un risque potentiel de transmission d'agents non conventionnels lors de son utilisation. Aussi, pour toutes ces raisons, il convient de trouver une alternative à l'héparine NF.
Des dérivés de l'héparine NF ont été proposés, tels que le Lovenox®, mais ils ne sont pas aussi efficaces que l'héparine NF et présentent aussi des effets secondaires. L'héparine NF et ses dérivés agissent principalement sur l'une des deux enzymes clés de la coagulation : le facteur Xa et la thrombine (facteur lia), et ce d'une manière antithrombine-dépendante. L'objectif de la présente invention est de proposer un actif anticoagulant d'origine non mammalienne, palliant les inconvénients des produits de l'art antérieur, et présentant : une action sur la voie commune de la coagulation et une activité anti-Xa antithrombine-dépendante inférieures à celles de l'héparine NF et de ses dérivés, pour limiter fortement les effets secondaires, une activité sur les voies extrinsèque et intrinsèque de la coagulation proche de celle de l'héparine, pour une bonne efficacité anticoagulante, et une activité sur les trois voies (intrinsèque, extrinsèque et commune) équivalente ou supérieure à celle du LOVENOX®. A cet effet l'invention vise des ulvanes sulfatés par sulfatation chimique.
Des ulvanes produits par fractionnement de l'algue Ulvo sp. ont été décrites dans la demande FR2998894 et leurs propriétés antithrombotiques ont été mentionnées. Néanmoins leur efficacité n'est pas satisfaisante et éloignée de celle de l'héparine NF.
Par ailleurs d'autres polysaccharides marins ont été décrits dans la littérature comme présentant une activité anticoagulante, en particulier : des polysaccharides d'origine bactérienne, mais ceux-ci présentent des coûts de production trop élevés, des polysaccharides d'origine macro-algale, dont l'efficacité anti coagulante est inférieure à celle de l'héparine et qui peuvent présenter une cytotoxicité.
La présente invention vise spécifiquement des ulvanes sulfatés présentant un taux de sulfates supérieur ou égal à 15% en masse par rapport à la masse totale de l'ulvane, ou des extraits d'Ulves comprenant ces ulvanes sulfatés.
Avantageusement ces ulvanes sulfatés, d'origine algale, présentent une activité importante sur les voies extrinsèque et intrinsèque de la coagulation, au travers des tests TCA (temps de céphaline activée) et TP (temps de prothrombine) supérieure à celle du Lovenox® et très proches de celle de l'héparine NF. Selon un autre avantage, ils présentent une activité sur la voie commune de la coagulation ainsi qu'une activité anti-Xa antithrombine dépendante inférieure à celle de l'héparine NF et du Lovenox®. L'invention a donc également pour objet ces ulvanes sulfatés pour leur application comme médicament, en particulier comme anticoagulants et antithrombotiques. L'invention vise aussi un procédé d'obtention de ces ulvanes ainsi que des compositions en contenant. L'invention est maintenant décrite en détails en regard des Figures annexées sur lesquelles : la Figure IA représente le spectre RMN 13C de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes obtenu selon le procédé du brevet FR2998894, la Figure IB représente le spectre ESI-MS HR de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes obtenu selon le procédé du brevet FR2998894,
La Figure 2A représente le chromatogramme HPLC-SEC gamme de dextran
La Figure 2B représente la régression polynomiale gamme de dextran
La Figure 2C représente le chromatogramme HPLC-SEC de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes obtenu selon le procédé du brevet FR2998894, la Figure 3A représente le spectre RMN 1H de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes obtenu selon le procédé du brevet FR2998894, la Figure 3B représente le spectre RMN 1H de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes sulfatés obtenu selon l'invention de l'exemple 2, la Figure 4 représente le chromatogramme HPLC de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes sulfatés obtenu selon l'invention de l'exemple 2, la Figure 5 représente les résultats de l'activité anti-Xa antithrombine-dépendante de l'héparine NF, du Lovenox® et de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes sulfatés obtenu selon le procédé selon l'invention de l'exemple 2, la Figure 6 représente les résultats de l'activité anti-lla anti-thrombine dépendante de l'héparine NF, du Lovenox® et de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes sulfatés obtenu selon le procédé selon l'invention de l'exemple 2, la Figure 7 représente les résultats de l'analyse TCA de l'activité anticoagulante des différents extraits : héparine NF , Lovenox®, et de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes obtenu selon le procédé du brevet FR2998894 et l'extrait d'ulves contenant des ulvanes sulfatés obtenu selon le procédé selon l'invention de l'exemple 2, (avec un temps de coagulation du plasma en absence de principe actif de 38,2 s contrôle négatif), la Figure 8 représente les résultats de l'analyse TP de l'activité anticoagulante des différents extraits : héparine NF , Lovenox®, et de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes obtenu selon le procédé du brevet FR2998894 et l'extrait d'ulves contenant des ulvanes sulfatés obtenu selon le procédé selon l'invention de l'exemple 2, (avec un temps de coagulation du plasma en absence de principe actif de 13,1 s contrôle négatif), la Figure 9 représente les résultats de l'analyse TT de l'activité anticoagulante des différents extraits : héparine NF , Lovenox®, de l'extrait d'ulves contenant des ulvanes obtenu selon le procédé du brevet FR2998894 et l'extrait d'ulves contenant des ulvanes sulfatés obtenu selon le procédé selon l'invention de l'exemple 2, (avec un temps de coagulation du plasma en absence de principe actif de 12,9 s contrôle négatif). L'invention a donc pour objet des ulvanes sulfatés présentant un taux de sulfates supérieur ou égal à 15% en masse par rapport à la masse totale de l'ulvane.
Les ulvanes sont des polysaccharides anioniques sulfatés solubles dans l'eau extraits d'algues vertes de type ulve ou entéromorphe. Leur structure chimique est basée sur la répétition de différentes unités di-osidique.
Par « ulvanes sulfatés » au sens de l'invention, on entend des ulvanes qui possèdent un taux de sulfate supérieur aux taux de sulfates des ulvanes naturellement sulfatés présents dans les
Ulves, algues communément récoltées sur les côtes françaises, ce taux de sulfates étant obtenu par une sulfatation chimique.
La taux de sulfates des ulvanes sulfatés selon l'invention est supérieur ou égale à 15%, préférentiellement supérieur ou égal à 20%.
Les ulvanes sulfatés selon l'invention, en plus des sulfates, sont constitués par des sucres neutres, en particulier rhamnose, xylose, glucose, et des acides uroniques. La quantité de chacun de ces constituants peut varier en fonction de l'espèce d'ulve, de la région d'origine et de la saison notamment.
Ils présentent préférentiellement un poids moléculaire compris entre 50 000 et 60 000 Da. Toutefois, les ulvanes sulfatés selon l'invention peuvent être dépolymérisés après extraction et avant sulfatation, et dans ce cas ils présentent préférentiellement un poids moléculaire compris entre 500 et 50 000 Da. La dépolymérisation peut être réalisée par des méthodes classiques telles que par exemple hydrolyse chimique par résine échangeuse d'ions ou acide libre, enzymatique, ultrasons, ou radicalaire.
Les ulvanes sulfatés selon l'invention sont donc extraits d'ulves par un procédé adapté puis sulfatés par un procédé de sulfatation chimique.
Ils peuvent se présenter seuls ou sous forme d'un extrait d'Ulves comprenant des ulvanes sulfatés selon l'invention. Les extraits selon l'invention comprennent préférentiellement au moins 70% d'ulvanes sulfatés en masse par rapport au poids total des matières sèches de l'extrait, préférentiellement au moins 80%. Ces extraits peuvent contenir éventuellement d'autres constituants. Préférentiellement ces extraits ne contiennent pas de lipides et contiennent très peu voir pas de protéines, de préférence moins de 1% de protéine en masse par rapport à la masse sèche de l'extrait, ce qui limite fortement les risques d'allergie. L'invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'ulvanes sulfatés selon le procédé qui comprend au moins les étapes suivantes : - extraction d'au moins un uivane à partir d'ulves, - sulfatation du ou des ulvane(s) extrait(s) de façon à obtenir un ou des ulvane(s) présentant un taux de sulfates d'au moins 15% par rapport à la masse totale de(s) ulvane(s). L'extraction d'ulvanes ou d'un extrait comprenant des ulvanes à partir d'ulve peut-être réalisée par tout procédé adapté, préférentiellement par un procédé de fractionnement tel que décrit dans le brevet FR2998894, à savoir un procédé comprenant la mise en œuvre des étapes suivantes : - éventuellement dessalage des algues, et/ou broyage des algue(s). - diffusion à l'eau d'ulves, - filtration des pulpes récupérées après l'étape a) de façon à obtenir un jus de pressage d'une part et des pulpes de pressage d'autre part, - ultrafiltration du jus de pressage de façon à obtenir un rétentat d'une part et un perméat d'autre part, - déminéralisation du rétentat d'ultrafiltration et décantation du rétentat déminéralisé, ou décantation du rétentat d'ultrafiltration et d) déminéralisation des produits issus de la décantation, - récupération des protéines végétales présentes dans les algues d'une part et des polysaccharides sulfatés présents dans les algues d'autre part.
Les ulvanes obtenus sont naturellement sulfatés et présentent un taux de sulfatation inférieur à 15%. Ils sont ensuite sulfatés.
La sulfatation est préférentiellement réalisée à l'aide du complexe sulfure trioxyde pyridine dans le DMF et la pyridine, en particulier par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - l'extrait d'ulve contenant l'ulvane est dissout à hauteur de 30 à 50 g/L dans un mélange DMF/pyridine (5 à 10 :1 (v/v)), - le mélange est chauffé à une température comprise entre 50 et 70°C, - la sulfatation est opérée par ajout progressif de 1.5 à 5 g de complexe SO3-pyridine pendant 1 à 3 heures à une température comprise entre 50 et 70°C sous agitation, - le mélange est ensuite laissé entre 1 et 3 heures à une température comprise entre 50 et 70°C sous agitation, - après refroidissement à température ambiante, le mélange est centrifugé entre 3000 et 7000g pendant 5 à 15 min à une température comprise entre 2 et 6°C, - le surnageant est ensuite éliminé et le culot est dissout dans une solution de NaOH 2,5 M puis mélangé avec de l'éthanol absolu pour atteindre une concentration finale en éthanol de 70 à 90% (v/v), - après 10 à 14 heures à une température comprise entre 2 et 6°C sous agitation, le précipité obtenu est isolé par centrifugation (entre 8 000 et 12 000g, 5 à 15 min, 2 à 6°C) et dissout dans de l'eau ultrapure, - la solution contenant l'ulvane sulfaté est finalement dialysée pendant 6 à 8 jours contre de l'eau ultrapure (seuil de coupure entre 0,5 et 1,5 kDa) puis lyophilisée.
Les ulvanes sulfatés selon l'invention ou les extraits en contenant se présentent préférentiellement sous forme liquide mais peuvent être lyophilisés ou séchés pour se présenter sous forme de poudre.
Les ulvanes sulfatés ou les extraits contenant ces ulvanes sulfatés sont préférentiellement intégrés dans des compositions. L'invention vise en particulier des compositions comprenant au moins 1% d'ulvane ou d'extrait en masse par rapport à la masse totale de la composition. Ces compositions peuvent se présenter sous toute forme, préférentiellement sous forme liquide injectable.
Les ulvanes sulfatés ou extraits en contenant présentent une forte activité anticoagulante, sur les trois voies de la coagulation. L'activité anticoagulante des ulvanes sulfatés selon l'invention est supérieure à celle des ulvanes naturels avec un faible taux de sulfates, n'ayant pas subi de sulfatation.
En outre, de façon étonnante la sulfatation ne confère pas de cytotoxicité élevée au produit selon l'invention contrairement à la sulfatation d'autres polysaccharides. L'invention vise par conséquent les ulvanes sulfatés ou les extraits en contenant, seuls ou intégrés dans des compositions comme médicament, en particulier comme médicament anticoagulant et/ou antithrombotique. Les ulvanes sulfatés selon l'invention sont particulièrement utiles dans la prévention et/ou le traitement des troubles thromboemboliques, en particulier les maladies thromboemboliques veineuses ou artérielles, en permettant ainsi de préserver l'intégrité des organes et prévenir toute lésion grave qui pourrait se révéler irréversible. L'invention est à présent illustrée par un exemple d'ulvane sulfaté selon l'invention, d'un extrait en contenant, de son procédé d'obtention et de résultats d'essais comparatifs avec des anticoagulants de référence et avec la même ulvane non sulfaté chimiquement.
Exemple 1 : Ulvane non sulfatée chimiquement et extrait en contenant
Le procédé comprend les étapes suivantes : a) Lavage des algues à traiter, b) Broyage des algues lavées, c) Diffusion à l'eau des algues lavées, dans un volume d'eau réduit, d) Filtration des pulpes récupérées après l'étape a) de façon à obtenir un jus de pressage d'une part et des pulpes de pressage d'autre part, e) Ultrafiltration du jus de pressage de façon à obtenir un rétentat d'une part et un perméat d'autre part, f) Déminéralisation du rétentat d'ultrafiltration puis décantation du rétentat déminéralisé, g) Récupération des protéines végétales présentes dans les algues d'une part et des polysaccharides sulfatés présents dans les algues d'autre part, h) Neutralisation de l'extrait de polysaccharides sulfatés et lyophilisation.
Le protocole est décrit en suivant. 1 kg d'algues sèches de type Ulvo sp. est trempé dans 20 L d'eau brute pendant 10 min à température ambiante. Les algues sont ensuite essorées et pressées à l'aide d'un cône en tissu afin de retirer le plus d'eau possible. Les algues lavées sont ensuite broyées dans 5 L d'eau déminéralisée à 80°C à l'aide d'un broyeur à couteau jusqu'à l'obtention de particules de moins de 2 mm de diamètre. Les 5 L de broyât sont transférés dans une cuve thermostatée à 80°C contenant 10 L d'eau déminéralisée chaude. L'extraction est réalisée sous agitation constante à l'aide d'un agitateur à pales à une vitesse de rotation de 10 tours/min pendant 2h. Les pulpes sont ensuite soutirées de la cuve, filtrées et pressées à l'aide d'un cône en tissu afin d'extraire le plus de jus possible. Environ 13 litres de jus d'extraction sont récupérés puis filtrés via une unité d'ultrafiltration équipée d'une membrane de type Kerasep KBW 15 kDa de Novasep Process. La filtration est réalisée à 80°C, 5 bars et à un débit de circulation de 450 L/h, soit une vitesse de circulation de 5 m/s. La filtration est poursuivie jusqu'à obtenir un rétentat qui est alors soutiré de l'unité. Un volume de 1,5 L de ce rétentat est ensuite déminéralisés par passage sur une colonne contenant 100 mL de résine anionique forte de type Amberlite FPA 98 sous forme OH", montée en série avec une colonne contenant 200 mL de résine cationique forte de type Amberlite IR 120 Na sous forme H+. La circulation s'effectue à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit de 2 BV/h. Le produit désionisé est ensuite laissé à décanter dans une éprouvette plongée dans un bain marie à 180°C pendant 1,5 h. Le surnageant purifié riche en polysaccharides sulfatés est alors séparé du culot protéique précipité par centrifugation à 5000 g pendant 15 min. L'extrait est enfin neutralisé par ajout de NaOH jusqu'à l'obtention d'un pH de 7 puis lyophilisé, ce qui permet d'obtenir le produit tel que décrit ci-dessous.
La composition de la solution obtenue est présentée dans le tableau ci-dessous :
L'extrait obtenu présente une masse molaire moyenne en masse (Mw) comprise entre 50 000 et 60 000 Da et un degré de polymérisation de 140 (tableau 2). L'indice de polydispersité est assez faible.
Masses molaire moyennes, degré de polymérisation (DP) et indice de polydispersité du produit obtenu :
la> Masse molaire moyenne en nombre : moyenne des masses molaires pondérée par le nombre de chaînes de chaque longueur. N,: nombre de moles d'espèces polymériques. M,: masse molaire des espèces polymériques. <b) Masse molaire moyenne en masse : moyenne des masses molaires pondérée par la masse de chaînes de chaque longueur. <c) Degré de polymérisation. Mo: masse molaire moyenne des unîtes monomériques. <d) Indice de polydispersité : distribution des masses molaires des différents polysaccharides au sein du polymère.
Le spectre RMN 13C de l'extrait est présenté sur le Figure IA, et le spectre ESI-MS HR est présenté sur la Figure IB.
La masse molaire a été identifiée par HPLC d'exclusion sérique (SEC) avec deux colonnes en série (Figures 2A à 2B). La gamme utilisée est une gamme dextran. Le chromatogramme HPLC-SEC est présenté sur la Figure 2C.
Le spectre RMN 1H est présenté sur la Figure 3A.
Exemple 2 : Ulvane sulfaté selon l'invention et extrait en contenant L'extrait d'Ulve contenant les polysaccharides de l'exemple 1 est dissout dans un mélange composé de 10 mL de DMF et 1,4 mL de pyridine. Le mélange est chauffé à 60°C. La sulfatation est opérée par ajout progressif de 3 g de complexe SO3-pyridine pendant 2 h à 60°C sous agitation. Le mélange est ensuite laissé 2 h à 60°C sous agitation. Après refroidissement à
température ambiante, le mélange est centrifugé à 5000 g pendant 10 min à 4°C. Le surnageant est ensuite éliminé et le culot est dissout dans 5 mL de solution de NaOH 2,5 M puis mélangé avec 45 mL d'éthanol absolu pour atteindre une concentration finale en éthanol de 90% (v/v). Après 12 h à 4°C sous agitation, le précipité obtenu est isolé par centrifugation (10 000 g, 10 min, 4°C) et dissout dans 60 mL d'eau ultrapure. La solution contenant les ulvanes sulfatés selon l'invention est finalement dialysée pendant 7 jours contre de l'eau ultrapure (seuil de coupure 1 kDa) puis lyophilisée.
La composition de la solution obtenue est présentée dans le tableau ci-dessous :
Le poids moléculaire des ulvanes sulfatés obtenus est de 50000 à 60000 Da.
Le chromatogramme HPLC-SEC (même gamme étalon que pour l'exemple 1 - Figures 2A et 2B) est présenté sur la Figure 4. La masse molaire et le degré de polymérisation sont identiques à ceux de l'exemple 1 (Figure 2C).
Le spectre RMN 1H est représenté sur la Figure 3B.
Le spectre RMN 1H de l'exemple 2 (invention) sur la Figure 3B présente des pics correspondant à des déplacements chimiques de 2,69, 2,80 et 2,96 ppm qui n'apparaissent pas sur le spectre de l'exemple 1 (art antérieur) sur la Figure 3A. Ces pics correspondent à des hydrogènes de type H-CR2-O-SO3" et confirment bien une modification de la sulfatation.
Efficacité anticoagulante des ulvanes sulfatés selon l'invention
Deux types de tests ont été réalisés sur l'exemple 1 correspondant à l'art antérieur (identifié par POL-Ol-SEPROSYS) et l'exemple 2 correspondant à l'invention (identifié par POL-02-ULR) afin de déterminer leur activité anticoagulante :
Des tests enzymatiques ciblant précisément l'activité des extraits sur les deux enzymes centrales de la coagulation : le facteur Xa et la thrombine (facteur lia) (Figure 8). La grande majorité des anticoagulants commerciaux actuels sont des inhibiteurs de ces facteurs de la coagulation ; soit par inhibition directe (exemples : le Pradaxa®,
inhibiteur direct de la thrombine, Xarelto® et Eliquis®, inhibiteurs directs du facteur Xa [8]), soit par une inhibition antithrombine-dépendante (exemples : les héparines non fractionnées (HNF) présentant des activités anti-Xa et anti-lla équivalentes, ou les héparines de bas poids moléculaire (HBPM), comme le Lovenox®, dont l'activité anti-Xa prédomine sur l'activité anti-lla [8])
Des tests par coagulométrie étudiant l'activité des extraits sur les trois voies principales de la coagulation : la voie intrinsèque, la voie extrinsèque et la voie commune. a. Méthode :
Pour chaque test, des anticoagulants commerciaux ont été testés comme témoins positifs : une héparine non fractionnée (HNF, Heparin sodium sait 12865E, numéro de lot 201274) provenant d'Interchim (Montluçon, France) et du Lovenox® (Enoxaparine sodique), fourni par le Centre Hospitalier de La Rochelle. • Activité anti-Xa/lla :
Les kits Stachrom ATI II et Stachrom Heparin (Stago, France) ont été respectivement utilisés pour évaluer l'activité inhibitrice antithrombine-dépendante des extraits sur les facteurs Xa et lia. L'antithrombine, le facteur Xa, la thrombine et les substrats ont été préparés en suivant les recommandations du fournisseur. L'antithrombine a ensuite été diluée au 1/2 dans le tampon du kit, lui-même dilué au l/10ème. Les analyses ont été réalisées en microplaques 96 puits : 25 pL d'extrait à différentes concentrations (ou de témoin positif ou négatif) ont été incubés avec 25 pL d'antithrombine (0,626 pg/pL) à 37°C pendant 30 s. 25 pL de facteur Xa ou de facteur lia (lln25 nKat/mL) ont ensuite été ajoutés. Après 30 s d'incubation, 25 pL de substrat du facteur Xa à 3,25 nM (CBS 31.39; CH2-SC>2-D-Leu-Gly-Arg-pNA, AcOH) ou 25 pL de substrat du facteur lia à 1,4 nM (CBS 61.50; EtM-SPro-ARG-pNA, AcOH) ont été ajoutés. L'activité des facteurs Xa et lia a finalement été mesurée à 405 nm toutes les 6 s pendant 5 min. La vitesse initiale a été calculée à partir de la pente du segment linéaire de la cinétique. • Test de coagulométrie L'activité anticoagulante des extraits a été déterminée par les tests TCA (temps de céphaline activée, majoritairement voie intrinsèque de la coagulation), TP (temps de prothrombine, majoritairement voie extrinsèque de la coagulation) et TT (temps de thrombine, voie commune de la coagulation).
Le temps de céphaline activée (TCA) est un test semi-global de la coagulation sanguine. Il s'agit de mesurer le temps de coagulation d'un plasma sanguin recalcifié en présence de céphaline (substitut plaquettaire) et d'un activateur particulaire (silice, kaolin, acide ellagique...). Il explore la voie dite intrinsèque de la coagulation (facteur VIII, facteur IX, facteur XI, facteur XII, la prékallicréine, le kininogène de haut poids moléculaire, et dans une moindre mesure le fibrinogène, facteur II, facteur V et facteur X).
Le temps de prothrombine (TP) explore la voie extrinsèque de la coagulation, impliquant les facteurs de coagulation suivants (appelés complexe prothrombinique) : facteur I (fibrinogène), facteur II, facteur V, facteur VII et facteur X.
Le temps de thrombine (TT) est le temps de coagulation d'un plasma sanguin citraté lors de l'ajout d'une quantité connue de thrombine et de calcium. Il teste la transformation du fibrinogène en fibrine.
Tous les tests ont été réalisés au moyen d'un coagulomètre Start4 et des kits de Stago, en suivant les recommandations du fournisseur. Brièvement, 90 pL de plasma humain normal (Stago) ont été mélangés avec 10 pL des extraits à différentes concentrations (ou témoins) solubilisés dans une solution de NaCI 0,9%. Pour le test TCA, 100 pL de réactif TCA ont ensuite été ajoutés au mélange avant une incubation de 3 min à 37°C. La coagulation a alors été lancée par ajout de 100 pL de CaCb 0,025 M, et le temps de coagulation (TCA) a été mesuré. Pour les tests TP et TT, le mélange a été incubé pendant 2 min (TP) ou 1 min (TT) à 37°C, avant l'ajout de 200 pL de réactif TP ou 100 pL de réactif TT et mesure du temps de coagulation (TP ou TT). Pour tous les tests, le témoin négatif a consisté à utiliser une solution de NaCI 0,9%. b. Résultats - activité anticoagulante :
Les graphiques représentés sur les Figures 5 à 9 présentent les résultats comparatifs obtenus pour chaque test de coagulation pour POL-Ol-SEPROSYS, POL-02-ULR (invention) ainsi que pour les témoins Héparine NF et Lovenox®. L'activité anti-Xa/lla antithrombine-dépendante est représentée sur la Figure 5. L'extrait POL-Ol-SEPROSYS ne présente pas d'activité antithrombine-dépendante anti-Xa (pas d'activité à 1000 pg/mL; données non présentées sur la Figure 5). Au contraire, POL-02-ULR présente une activité qui est maximale pour une concentration d'environ 100 pg/mL. Néanmoins, il est à noter que l'activité de POL-02-ULR est bien inférieure à celle de l'héparine NF et du Lovenox® puisqu'un facteur d'environ 100 en concentration sépare les activités de ces témoins et de POL-02-ULR. Ces premiers résultats nous conduisent à penser que l'extrait sulfaté d'ulvanes ne présente pas la même activité anticoagulante que les extraits commerciaux testés. L'activité anti-lla anti-thrombine dépendante des extraits est présentée sur la Figure 6.
De même que pour l'activité anti-Xa, l'activité anti-lla antithrombine-dépendante de POL-02-ULR est inférieure à celle de l'héparine NF (Figure 6). Un facteur d'environ 100 en concentration sépare en effet les activités de l'héparine NF et de POL-02-ULR. Cependant, elle augmente tout de même avec la sulfatation puisque POL-Ol-SEPROSYS est inactif sur l'activité anti-lla antithrombine-dépendante (données non présentées sur la figure 5). • Activité comparative des extraits sur les différentes voies de la coagulation :
Test TCA (figure 7) :
Le test TCA concerne surtout l'activité anticoagulante sur la voie intrinsèque de la coagulation et, dans une moindre mesure, la voie commune de la coagulation. L'activité observée pour POL-Ol-SEPROSYS est très faible (Figure 7). En effet, à une concentration de 1000 pg/mL, le temps de coagulation du plasma en présence de l'extrait est inférieur à 100 s, ce qui correspond à une concentration 100 fois supérieure à celle du Lovenox® et 1000 fois supérieure à celle de l'héparine NF pour la même activité. Au contraire, POL-02-ULR présente une activité très intéressante sur ce test, avec une activité supérieure à celle du Lovenox® et légèrement inférieure à celle de l'héparine NF. Le procédé de sulfatation chimique a donc permis d'augmenter de façon significative l'activité de l'extrait POL-Ol-SEPROSYS sur la voie intrinsèque et/ou commune de la coagulation.
Test TP (Figure 8) :
Le test TP, qui évalue l'activité des extraits sur la voie extrinsèque de la coagulation montre à nouveau un effet majeur du procédé de sulfatation sur l'activité de POL-02-ULR (Figure 8). En effet, POL-Ol-SEPROSYS est inactif sur cette voie de la coagulation tandis que l'extrait sulfaté POL-02-ULR présente une activité très intéressante, un facteur 3 en concentration seulement séparant les activités de l'héparine NF et de POL-02-ULR. Un résultat intéressant sur ce test concerne l'activité du Lovenox®, qui est bien inférieure à celles de POL-02-ULR et de l'héparine NF puisqu'un facteur supérieur à 10 en concentration sépare les activités de POL-02-ULR et du Lovenox®. L'extrait sulfaté présente donc une activité plus intéressante sur la voie extrinsèque de la coagulation que le Lovenox® commercial.
Test TT (Figure 9) :
De même que pour les tests précédents, une augmentation de l'activité anticoagulante de l'extrait est observée après sulfatation chimique (Figure 9). Pour cette voie cependant, l'activité de POL-02-ULR est légèrement inférieure à celle du Lovenox®, ce qui n'est pas le cas pour les autres voies de la coagulation. Ce résultat nous amène à penser que l'activité anticoagulante de POL-02-ULR est plus importante au début de la cascade de la coagulation, qu'il s'agisse des voies intrinsèque ou extrinsèque, que sur la voie finale commune de la coagulation. Ceci est cohérent avec les résultats obtenus pour l'activité anti-lla de POL-02-ULR : cet extrait sulfaté présente en effet une activité plus faible que celle de l'héparine NF sur cette enzyme importante de la voie commune de la coagulation.
Le tableau ci-après récapitule les résultats obtenus pour les différents tests d'activité anticoagulante. Il représente la concentration de polysaccharides, ou héparine NF/Lovenox®, nécessaire pour doubler le temps de coagulation par rapport au contrôle négatif (NaCI 0,9%).
w Concentration d'extrait (pg/mL) nécessaire pour doubler le temps de coagulation par rapport au contrôle négatif (NaCI 0,9%) lb> Concentration d'extrait pour laguelle l'enzyme conserve 50% d'activité résiduelle
Une forte augmentation de l'activité anticoagulante après sulfatation de POL-Ol-SEPROSYS permettant d'obtenir POL-02-SEPROSYS est observée, et ce pour tous les tests. Au niveau du test TCA, la concentration de 500 pg/mL permettant de doubler le temps de coagulation pour POL-Ol-SEPROSYS est diminuée à une concentration de 2,4 pg/mL pour POL-02-ULR : cette concentration est deux fois moins importante que pour le Lovenox® (4,7 pg/mL). L'activité est tout de même inférieure à celle de l'héparine NF.
Pour le test TP, l'extrait POL-Ol-SEPROSYS inactif devient après sulfatation un extrait beaucoup plus actif que le Lovenox®, présentant une concentration permettant de doubler le temps de coagulation de 45 pg/L. Comme pour le test TCA, un facteur d'environ 3 seulement en concentration sépare l'héparine NF de POL-02-ULR.
Seul le test TT présente des résultats pour lesquels le Lovenox® est plus actif que POL-02-ULR. Cependant, la différence observée n'est pas très importante et, là encore, le procédé de sulfatation chimique a permis d'augmenter de façon importante l'activité anticoagulante, en passant d'une concentration de 40 pg/mL pour doubler le temps de coagulation, à 2,6 pg/mL (facteur 15).
En ce qui concerne l'activité anti-Xa/lla antithrombine-dépendante, l'activité de POL-02-ULR (invention) augmente fortement comparée à POL-Ol-SEPROSYS.
Claims (17)
- REVENDICATIONS1. Ulvane sulfaté présentant un taux de sulfates supérieur ou égal à 15% en poids par rapport au poids total de l'ulvane, pour son application comme médicament anticoagulant et/ou anti-thrombotique, et/ou dans la prévention ou le traitement des troubles thromboemboliques.
- 2. Ulvane sulfaté pour son application selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il est obtenu par sulfatation d'un ulvane extrait d'ulve,
- 3. Ulvane sulfaté pour son application selon la revendication 1 ou 2f caractérisé en ce qu'il présente un poids moléculaire compris entre 50 000 et 60 000 Da.
- 4. Ulvane pour son application selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu’il est dépoiymérisé après extraction et sulfatation, et en ce qu’il présente un poids moléculaire compris entre 500 et 50 000 Da.
- 5. Ulvane pour son application selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il présente un taux de sulfates supérieur ou égal à 20% en poids par rapport au poids total de l'ulvane.
- 6. Ulvane pour son application selon l'une des revendications 1 à 5 ou extrait d’ulve en contenant, pour son application dans la prévention ou le traitement des troubles thromboemboliques.
- 7. Extrait d'ulve comprenant un ulvane sulfaté selon l'une des précédentes revendications, pour son application comme médicament anticoagulant et/ou anti-thrombotique, et/ou dans la prévention ou le traitement des troubles thrombo-embolîques.
- 8. Extrait d'ulve pour son application selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu’il comprend au moins 70% en poids de l'ulvane sulfaté selon l'une des revendications 1 à 5 par rapport au poids total de l'extrait sec.
- 9. Extrait d'ulve pour son application selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend moins de 1% en poids de protéines par rapport au poids total de l'extrait sec.
- 10. Composition comprenant au moins un ulvane selon l'une des revendications 1 à S ou un extrait selon l’une des revendications 7 à 9, pour son application comme médicament anticoagulant et/ou anti-thrombotique, et/ou dans la prévention ou le traitement des troubles thrombo-emboliques.
- 11. Composition pour son application selon la précédente revendication, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 1% d'uivane ou d'extrait en masse par rapport à la masse totale de la composition.
- 12. Composition pour son application selon l'une des revendications 10 ou 11 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de solution injectable.
- 13. Procédé d’obtention d’un uivane selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant au moins les étapes suivantes : - Extraction d'au moins un uivane à partir d'ulves - Sulfatation des ulvanes de façon à obtenir des ulvanes présentant un taux de sulfates d'au moins 15% par rapport à la masse totale des ulvanes.
- 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la sulfatation est réalisée à l'aide du complexe sulfure pyridsne dans le DMF et ta pyridine,
- 15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la sulfatation est réalisée par la mise en œuvre des étapes suivantes : - l'extrait d'ulve contenant l'uivane est dissout à hauteur de 30 à 50 g/l. dans un mélange DMF/pyridine (5 à 10 :i (v/v)), - le mélange est chauffé à une température comprise entre 50 et 70°C, - la sulfatation est opérée par ajout progressif de 1.5 à 5 g de complexe SQs-pyridine pendant 1 à 3 heures à une température comprise entre 50 et 70eC sous agitation, - le mélange est ensuite laissé entre 1 et 3 heures à une température comprise entre 50 et 70°C sous agitation, - après refroidissement à température ambiante, le mélange est centrifugé entre 3000 et 7000g pendant S à 15 min à une température comprise entre 2 et 6’C, - le surnageant est ensuite éliminé et le culot est dissout dans une solution de NaOH 2,5 M puis mélangé avec de l'éthanol absolu pour atteindre une concentration finale en éthanol de 70 à 90% (v/v) - après 10 à 14 heures à une température comprise entre 2 et 6°C sous agitation, le précipité obtenu est isolé par centrifugation (entre 8 000 et 12 000g, 5 à 15 min, 2 à 6’C) et dissout dans de l'eau ultrapure, - la solution contenant l'uivane sulfaté est finalement dialysée pendant 6 à 8 jours contre de l'eau ultrapure (seuil de coupure entre 0,5 et 1,5 kDa) puis lyophilisée.
- 16. Procédé selon Tune des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que l'extraction à partir d'ulve est réalisée par la mise en œuvre des étapes suivantes : - diffusion à l'eau d'ulves, - filtration des pulpes récupérées après l'étape a) de façon à obtenir un jus de pressage d'une part et des pulpes de pressage d’autre part, - ultrafiltration du jus de pressage de façon à obtenir un rétentat d'une part et un permeat d’autre part, - déminéralisation du rétentat d'ultrafiltration et décantation du rétentat déminéralisé, ou décantation du rétentat d'ultrafiltration et d) déminéralisation des produits issus de la décantation, - récupération des protéines végétales présentes dans les algues d'une part et des polysaccharides sulfatés présents dans les algues d'autre part,
- 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu’avant l’étape de diffusion à l'eau il comprend également l'une et/ou l'autre des étapes suivantes : - dessalage des algues, et/ou - broyage des aîgue(s).
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