FI88046C - Foerfarande foer framstaellning av hepariner med laog molekylvikt - Google Patents

Description

Tv 1 88046

MENETELMÄ ALHAISEN MOLEKYYLIPAINON OMAAVIEN HEPARIINIEN VALMISTAMISEKSI

Keksintö koskee menetelmää uusien alhaisen 5 molekyylipainon omaavien hepariinien valmistamiseksi, joilla on säännöllinen rakenne, ja jotka ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia.

Erityisesti keksintö liittyy alhaisen MW (Molecular weight, molekyylipaino) omaaviin hepariineihin, 10 joilla on aktiivisuutta tiettyjen fysiologisten järjestelmien säätelyn alueella, samalla kun niistä puuttuu melkein täydellisesti antikoagulanttiaktiivisuus, joka ilmenee antitrombiini III:n (ATIII) kautta.

Tiedetään, että hepariini omaa antikoagulant-15 tiaktiivisuutta, joka ilmenee pääasiassa antitrombiini III:n (ATIII) kautta.

Hepariinin rakenne/aktiivisuus -suhteiden tutkimus on osoittanut, että tämän tyyppinen antikoagulanttiaktiivisuus on yhteydessä erityisesti ns. hepa-20 riinin epäsäännöllisten alueiden kanssa, ja varsinkin alueiden kanssa, jotka vastaavat rakenteen DEFGH omaa-via pentasakkarideja, jotka on kuvattu patenttihakemuksessa FR 2.535.324 ja joilla on kaava: 25 r™* r^Oi 0 0 N?** ^ NH60- M Nft50- o*- Ntti0 0 E f 6 -* 30 Tiedetään myös, että hepariinin tai hepariinin fragmenttien tietyt aktiivisuudet voidaan säilyttää jossakin määrin AT III:a varten olevan sitoutumiskohdan puuttuessa tai kun tämä jälkimmäinen on modifioitu, mutta rakenteet, jotka vastaavat näistä aktiivisuuksis-35 ta, ovat tuntemattomia.

Siten, Folkman et ai. (Science Voi. 221 -1983 -s. 719-725) on julkaissut, että inhibitorista aktiivi- 2 88046 Λ suutta angiogeneesia vastaan todetaan heksasakkaridien seoksilla, joilta puuttuu antikoagulanttiaktiivisuus, ja niitä on käytetty yhdessä kortikoidien kanssa.

Karnowsky et ai. on suorittanut kokeita O-5 desulfatoiduilla ja N-desulfatoiduilla hepariineilla ja on osoittanut, että ne omaavat aina, mutta vähemmässä määrin, standardihepariinin inhibitorisia aktiivisuuksia sileiden lihassolujen proliferaatioon.

Lisäksi hepariinin antikomplementtiaktiivi-10 suus, joka on riippumaton antikoagulanttiaktiivisuudes-ta, on osoitettu.

Eräs tutkimus on osoittanut, että hepariinin antikoagulanttiaktiivisuutta voidaan muuttaa suorittamalla katkaisuja ei-sulfatoitujen uronihappojen hii-15 liatomien C2~C3 välillä natriumperjodaatin avulla.

Siten, Fransson ja Lewis ovat kuvanneet julkaisussa Febs. Letters, voi. 97, No. 1, s. 119-123, 1979 koeolosuhteet, joissa hepariiniin kohdistetaan perjodaatin vaikutus joko pH-arvossa 3 ja 4 °C lämpöti-20 lassa tai pH-arvossa 7 ja 37 °C lämpötilassa. Saadut hepariiniketjut on hapetettu selektiivisesti D-gluku-ronihappojen kohdalla ensimmäisessä tapauksessa, kun taas hapetus kaikkien ei-sulfatoitujen uronihappotäh-teiden kohdalla aikaansaadaan toisessa olosuhteiden 25 tyypissä.

Saadut ketjut pelkistetään NaBH4 avulla tai fragmentoidaan emäksisessä väliaineessa β-eliminaa-tiomenetelmän mukaisesti.

Kirjoittajat päättelevät, että D-glukuronihap-30 potähteiden hapetuksen ja katkaisun tuloksena on hie noinen molekyylipainon pienentyminen, mutta antikoagulanttiaktiivisuus säilyy.

Toisaalta ei-sulfatoitujen D-glukuroni- ja L-iduronihappojen katkaisuteho pH 7 37°C lämpötilassa 35 johtaa antikoagulanttiaktiivisuuden lakkaamiseen ja molekyylin huomattavampaan fragmentoitumiseen.

Artikkelissa, joka on julkaistu julkaisussa 3 88046 τ,

Carbohydrate Research 36, s. 339-348, 1974, Fransson esittää uronitähteiden perijodihapetuksen dermatansul-faatissa eri pH-arvoissa 4°C tai 37°C lämpötilassa.

Kirjoittaja korostaa, että työskentelemällä 5 pH-arvossa 5 katkaisut glukuronihappojen tasolla saadaan aikaan vain suhteessa, joka on vähemmän kuin 5 %, ja että työskentelemällä pH 3 näitä katkaisuja ei saada lainkaan aikaan. Nämä tulokset näyttävät siten olevan ristiriidassa hepariinilla saatujen tulosten kanssa, 10 joissa katkaisut tapahtuvat edullisesti D-glukuronihap-pojen tasolla pH-arvossa 3.

Perjodaatin vaikutusta on myös esitetty Casu et ai. toimesta julkaisussa, Arzneim. Forsch./Drug Res. 36 (1) No. 4, s. 637-642, 1986.

15 Tämän artikkelin mukaan hepariinin erilaiset valmisteet kohdistetaan perjodihapetukselle (pH 5.3, 4°C 24 h ajan), joka katkaisee kaikkien ei-sulfatoitujen uronihappojen paikkojen 2 ja 3 hiiliatomien välisen sidoksen. Viitteen mukaan valmiste kohdistetaan seuraa-20 vassa vaiheessa osittaiseen happohydrolyysiin ja saadut fragmentit dialysoidaan.

Tämä osittainen happohydrolyysivaihe johtaa ketjujen huomattavaan fragmentoitumiseen ja ainakin osittaiseen funktionaalisten ryhmien tuhoutumiseen, 25 kuten on korostettu Fransson'n toimesta julkaisussa, Carbohydr. Res. 80, 131-145 (1980).

- Lisäksi tämä menetelmä johtaa väistämättömästi laaja-alaisesti vaihtelevan MW:n omaavien ketjujen * seokseen, ja tuottaa erityisesti lukuisia di-, tetra- 30 ja heksasakkarideja.

Esillä olevan keksinnön keksijät ovat nyt osoittaneet, että pysyvien farmaseuttisten ainekokoo-muksien valmistamiseksi, joita voidaan käyttää terapiassa tiettyjen fysiologisten järjestelmien säätelyyn, 35 seuraavien ominaisuuksien yhdistelmät ovat oleellisia: fragmenttien pituus; varausaste; ATIII varten olevan sitoutumiskohdan puuttuminen; mikäli halutaan välttää 4 88046 antikoagulanttiaktiivisuuteen liittyvät ei-tolvottavat vaikutukset.

Perjodihapon ja fragmentoinnin avulla tapahtuvia katkaisumenetelmiä tutkimalla keksijät ovat ha-5 vainneet, että suorittamalla perjodihapetus spesifisissä olosuhteissa, mutta myös käyttämällä spesifisten vaiheiden yhdistelmää, on mahdollista saada edullisella välillä olevan alhaisen MW omaavien hepariinin fragmenttien ainekokoomus, joista fragmenteista puuttuu 10 sitoutumiskohta ATIII:lle, ainakin suurimman osan niiden funktionaalisesta ryhmistä säilyessä.

Keksinnön tarkoituksena on siten tuoda esiin menetelmä hepariinikokoomuksien valmistamiseksi, jotka, aktiivisina annoksina, on varustettu arvokkailla farma-15 kologisilla ominaisuuksilla, jotka ovat lähes samat kuin hepariinin vastaavat ominaisuudet, ilman että ne on varustettu epäedullisilla antikoagulanttiominaisuuk-silla.

Keksinnön mukainen fragmentointimenetelmä 20 hepariinia varten mahdollistaa halutun MW omaavien fragmenttien saamisen, joista kuitenkin puuttuu sitoutumiskohta ATIII:a varten ja joiden varausaste vastaa lähes luonnon hepariinin ketjuissa olevien vastaavien sekvenssien varausastetta.

25 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu ja kokoomuksia voidaan käyttää lääkeaineiden valmistuksessa, jotka ovat aktiivisia erityisesti tiettyjen fysiologisten järjestelmien säätelyssä.

Keksinnön mukaisesti valmistetuille kokoomuk-30 sille on tunnusomaista, että ne on muodostettu oleellisesti fragmenteista, joista puuttuu ei-sulfatoidun uronihappoglukosamiini N-sulfaatti -tyypin toistuvat disakkaridisekvenssit ja jotka vastaavat seuraavaa yleistä kaavaa I: 35 R - (X-Y)n - R' (I) 5 88046 jossa X tarkoittaa joko sulfatoitua iduronihappotähdet-tä, jolla on kaava II: φ - 0S03 10 tai, ainakin 1 tähde kahta ketjua kohden, ei-sulfatoi-tua uronihappotähdettä (D-glukuroni- tai L-iduroni-), joka on katkaistu paikkojen 2 ja 3 hiiliatomien välistä ja jolla on kaava III: COO"

K

/ (III) °~\ /

20 CH2OH CH2OH

Y tarkoittaa kaavan IV mukaista D-glukosamiinitähdettä:

ViKR 2 30 jossa R: on vetyatomi tai -SOj ryhmä; R2 on -SO” ryhmä tai -CO-CH3 ryhmä, -SO” ryhmien osuuden ollessa ainakin 90 %; ja R3 on -SO~ ryhmä tai vetyatomi, -S03 ryhmien osuuden 35 ollessa ainakin 70%; R tarkoittaa vetyatomia tai tähdettä: 6 88046 Γ") . - KHR? jossa - R3 tarkoittaa samaa kuin edellä; ja R4 tarkoittaa vetyatomia tai uronihappotähdettä; 10 R' tarkoittaa joko vetyatomia, tai modifioima- tonta uronihappotähdettä, tai uronihappotähdettä, joka on modifioitu perjodihapetuksen aikana ja jonka aldehy-difunktiot on pelkistetty alkoholeiksi; välillä 7 < n < 15 suurimmalle osalle frag-15 mentteja, mikä vastaa ketjuja, joiden MW on n. 4800 -9000; tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävistä suoloista .

On syytä huomata, että avoimet X-tähteet ovat tähteitä, jotka ovat pysyneet liittyneinä glykosamino-20 glykaaniketjussa β-eliminaatiovaiheen aikana emäksisessä pH-arvossa. Ne edustavat joko ei-sulfatoitua D-glu-kuronihappoa tai ei-sulfatoitua L-iduronihappoa, joiden sidokset asemassa 2 ja 3 olevien hiiliatomien välistä on katkaistu.

25 Sellaisten keksinnön mukaisella menetelmällä : saatujen kokoomuksien, jotka on karakterisoitu HPLC:n avulla, joka on suoritettu TSK 2000 SW-pylväällä liitettynä fotometriseen detektoriin aallonpituudella 205 nm, käyttäen 0.5 M Na2S04 liuottimena, virtausnopeudella 30 1 ml/min: - keskimääräinen molekyylipaino on luokkaa 6000 - 7000 Da, erityisemmin 5800 - 7000 Da, ja erikoisesti luokkaa 6000 Da, fragmenteista 70 % mahtuessa välille 4800 ja 9000 daltonia ja 90 % välille 3600 ja 11000 Da; 35 - molekyylipaino huipun korkeimmassa kohdassa on luok kaa 6000 - 6500 Da, tarkemmin 5500 - 6500 Da, ja erikoisesti luokkaa 5500 - 6000 Da; 7 88046 Λ - ketjuista vähemmän kuin 5 % on pienempiä kuin dode-kasakkaridit; - ketjuista vähemmän kuin 5 % on yli 11000.

Keksinnön mukaisesti hepariinikokoomukset ovat 5 kokoomuksia, jotka on saatu fraktioimalla alkoholin avulla mineraalisuolojen läsnäollessa seos, joka on saatu hepariinin depolymeroinnista, jossa on vaikutettu vahvalla emäksellä hepariiniketjuihin, joihin on kohdistettu etukäteen perjodaattivaikutus, depolymerointia 10 seuratessa aldehydiryhmien, jotka ovat muodostuneet perjodihapetuksen aikana, pelkistys.

Edulliseen tapaan keksinnön mukaisesti saadut kokoomukset omaavat sulfaattiryhmien -SO" ja karboksyy-liryhmien COO per mooli välisen suhteen 2.2 - 2.8. Tämä 15 suhde on erityisesti 2.4. Tämä korkea suhde verrattuna hepariiniketjujen keskiarvoihin johtuu keksinnön mukaisesti saatujen, alhaisen molekyylipainon omaavien hepariiniket ju jen rakenteesta, joka on muodostettu oleellisesti trisulfatoiduista disakkaridiyksiköistä. Näiden 20 alhaisen MW omaavien hepariinien sanotaan olevan rakenteeltaan säännöllisiä näiden disakkaridiyksikköjen läsnäolon ja tieteellisen kirjallisuuden viitteiden (PERLIN A.S., CASU, B. SANDERSON, G.R. "220 MHz Spectra of heparin, chondroitins and other mucopolysacchari-25 des". Can. J. Chem. 1970; 48; 2260-8) perusteella.

Keksintö liittyy myös näiden kokoomusten suoloihin, erityisesti natrium-, kalium-, kalsium- ja magnesiumsuoloihin, kuin myös fysiologisesti hyväksyttävien orgaanisten kationien suoloihin.

30 Keksinnön kohteena on siten määriteltyjen - hepariinifragementtikokoomuksien valmistusmenetelmä, joka sisältää hepariinin kontrolloidun hapetuksen per-jodaatin avulla.

Esillä olevan keksinnön mukaiselle menetelmäl-35 le on tunnusomaista, että: a) hepariinin vesiliuosta lopullisessa konsentraatiossa 0.5 - 5 % (p/til.) käsitellään perjodihapolla lopulli- τ» 8 88046 sessa konsentraatiossa 0.5 - 4 % (p/til.), pH ollessa 4.5 - 6.5 ja lämpötila 0-10 °C; b) näin saatuja hepariiniketjuja käsitellään vahvalla emäksellä pH-arvossa, joka on >n. 11; 5 c) näin saatuja depolymeroituja fragmentteja käsitellään pelkistävällä aineella; d) ylimääräisen pelkistävän aineen poiston jälkeen, tarvittaessa, pelkistetyt fragmentit seostetaan alkoho-liliuottimen avulla mineraalisuolalisäyksen jälkeen; 10 e) näin saadun sakan vesiliuosta, johon on lisätty mineraalisuolaa, käsitellään alkoholilla hyvin alhaisen molekyylipainon omaavien fragmenttien poistamiseksi; f) näin muodostunut saostunut tuote otetaan talteen ja käytettyä vahvaa emästä vastaava suola muutetaan tar-15 vittaessa toiseksi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

On huomattava, että vaihe e) vastaa fraktioin-tia tiettyjen ketjujen poistamiseksi eikä globaalia saostusta.

20 Erityisesti tämä menetelmä koostuu seuraavien vaiheiden yhdistelmästä: - hepariinin kontrolloitu hapetus, joka suoritetaan antamalla hepariinin reagoida vesiliuoksessa lopullisessa konsentraatiossa 0.5 - 5 % (p/til.) perjodihap- 25 posuolan kanssa, joka on lopullisessa konsentraatiossa, 0.5 - 4 % (p/til.), pH:ssa 4.5 - 6.5 ja edullisesti pH 5, ja lämpötilassa 0-10 °C, n. 15 - 48 h ajan valolta suojattuna; - saatujen hepariiniketjujen depolymerointi lisäämällä 30 vahvaa emästä, kuten natriumhydroksidia pH-arvossa, joka on >n.ll, erityisesti 11 - 12, edullisesti 11.2 -11.6, ja edullisimmin lähellä arvoa 11.5; - depolymeroituneiden fragmenttien pelkistys pelkistävän aineen avulla ja, tarvittaessa, reagoimattoman pel- 35 kistävän aineen poiston jälkeen; - hepariinin pelkistyneiden fragmenttien talteenotto saostamalla liuottimen avulla, johon ne ovat liukene- I: 9 88046 Λ mattomia; - haluttujen fragmenttien eristys fraktioimalla alkoholin avulla mineraalisuolojen läsnäollessa vesiliuos, joka on saatu uudelleenliuottamalla aiemmin eristetty 5 sakka veteen, ja muodostuneen sakan talteenotto.

Suorittamalla depolymerointi spesifisen menetelmän mukaisesti yhdistettynä keksinnön menetelmän fraktiointivaiheen käytöllä mahdollistaa fragmenttien kokoomuksen eristämisen, jonka fragmentit vastaavat 10 spesifistä terapeuttista profiilia ja omaavat erityisesti tyydyttävän terapeuttisen indeksin.

Perjodihapetusvaiheessa hepariinia ja perjodi-happosuolaa käytetään edullisesti määrinä, jotka tuottavat lopulliset konsentraatiot 1.5 - 5 % ja 1.5 - 2.5 15 % (p/til.) vastaavasti.

Perjodihapon suolat koostuvat edullisesti nat-riummetaperjodaatista.

Jäljelle jäävän perjodaatin poistamiseksi suoritetaan dialyysi käyttäen dialyysiputkea huokoisuu-20 della 3 - 4000 Da n. 15 h ajan.

Voidaan käyttää myös anioninvaihtohartsikroma-tografiaa, esim. käyttäen hartsia, kuten kaupallisesti saatavaa Amberlite IRA 400, jota käytetään määränä, joka riittää pidättämään jäljelle jääneen perjodaatin 25 ja perjodaattijohdannaiset, jotka ovat muodostuneet reaktion aikana, so. 1/6 - 1/8 reaktiotilavuudesta, esimerkiksi. Tämä menetelmä, nopeampana kuin dialyysi ja paremmin toistettavana, mahdollistaa β-eliminaation suorittamisen lähtien olosuhteista, jotka on helppo .. 30 standardoida.

Keksinnön erään edullisen sovellutuksen mukaisesti hepariini liuotetaan veteen, erityisesti de-mineralisoituun veteen, lämpötilassa 4 °C, konsentraa-tiossa n. 5 % (p/til.), lisätään perjodihapposuolaa, 35 kuten natriummetaperjodaattia, saadaan lopulliseksi konsentraatioksi n. 2 % (p/til.). Liuoksen pH sovitetaan välittömästi arvoon 5 laimean suolahapon tai lai- n 10 38046 mean natriumhydroksidin avulla. Liuoksen annetaan seistä pimeässä +4°C lämpötilassa edullisesti 24 h ajan.

Jäljelle jääneen perjodaatin poistamiseksi suoritetaan dialyysi käyttäen dialyysiputkea huokoisuu-5 della 3 - 4000 Da n. 15 h ajan vasten juoksevaa demine-ralisoitua vettä.

Saadut hepariiniketjut kohdistetaan depolyme-rointivaiheeseen emäksisessä väliaineessa.

Tähän tarkoitukseen lisätään vahvaa emästä, 10 erityisesti konsentroitua natriumhydroksidiliuosta, aikaansaaden emäksen lopulliseksi molaarisuudeksi 0.2 N.

Saatua emäksistä liuosta sekoitetaan 2 h ajan huoneenlämpötilassa.

15 Sitten hepariinin depolymerointifragmentit saatetaan pelkistysvaiheeseen aldehydiryhmien muuttamiseksi, jotka on saatu uronihappotähteiden hiiliatomien C2 ja C3 välisen sidoksen katkaisusta.

Pelkistyvää ainetta, kuten natriumborohydri-20 diä, käytetään määränä 50 mg/g käytettyä hepariinia, ja sekoitusta jatketaan 6 h ajan huoneenlämpötilassa.

Reagoimaton pelkistävä aine tuhotaan alentamalla pH arvoon 4 hapon, kuten suolahapon, avulla, ja edullisesti sekoitetaan voimakkaasti n. 15 min ajan.

25 Hepariinin pelkistetyt fragmentit otetaan talteen saostuksella.

Edullisesti pH sovitetaan arvoon 7 emäksen, erityisesti konsentroidun natriumhydroksidin, avulla, sitten 20 g/1 mineraalisuolaa lisätään ja saostus suo-30 ritetaan 1.5 alkoholitilavuudella.

Käytetty mineraalisuola koostuu edullisesti natriumkloridista. Alkoholin saostusta varten turvaudutaan edullisesti etanoliin.

Muodostunut sakka otetaan talteen sentrifu-35 goinnilla, pestään liuottimena, johon se on liukenematon, kuten etanolilla, kuivataan 40°C lämpötilassa vakuumissa.

r* 11 88046

Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti valmistettujen fragmenttien eristämiseksi tästä sakasta suoritetaan fraktiointivaihe.

Alkoholifraktiointi on edullista suorittaa 5 seuraavasti:

Hepariinifragmenttisakka uudelleenlluotetaan veteen, erityisesti demineralisoituun veteen, huoneen lämpötilassa, so. n. 18 - 20°C, saaden konsentraatioksi 5 % (p/til.).

10 Lisätään mineraalisuola kuten natriumkloridi määränä, joka riittää antamaan lopullisen konsentraati-on 1 %. Liuoksen pH sovitetaan arvoon 3.5 hapon avulla, esim. laimean suolahapon avulla.

Sitten lisätään kohtalaisesti sekottaen 0.85 15 liuotintilavuus liuotinta kuten etanolia, johon halutut fragmentit ovat liukenemattomia.

Tämän jälkeen seos jätetään seisomaan n. 10 h ajaksi 18-20°C.

Sakka kerätään sentrifugoimalla, pestään liu-20 ottimella kuten etanolilla ja kuivataan vakuumissa 40°C lämpötilassa 24 h ajan.

Tarvittaessa tämä sakka kohdistetaan lisäpuh-distusvaiheeseen sen jälkeen, kun se on liuotettu demineralisoituun veteen. Vaihe sisältää kromatografoinnin 25 anioninvaihtohartsilla, kuten Amberlite IRA 400 hartsilla, OH", jonka tilavuus on luokkaa 1/10 reaktiotila-vuudesta, mahdollisten epäpuhtauksien poistamiseksi.

Saatu tuote sisältää hepariinifragmenttien seosta, josta suurin osa omaa MW:n, joka vaihtelee 30 välillä n. 4800 ja 9000 Da. Tarvittaessa näin saatu .. tuote voidaan muuttaa toiseksi farmaseuttisesti hyväk syttäväksi suolaksi, kuten kalsiumsuolaksi, kalium-suolaksi tai magnesiumsuolaksi, tunnettujen menetelmien mukaisesti.

35 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut hepariinikokoomukset, jotka koostuvat oleellisesti fragmenteista, joiden molekyylipaino on välillä 4800 ja 12 88046 9000, ja joista puuttuu sitoutumiskohta ATIII varten, mahdollistaa arvokkaiden farmakologisten ominaisuuksien hyödyntämisen, jotka ominaisuudet liittyvät hepariinin säännöllisiin osiin. Aktiivisina annoksina näillä ko-5 koomuksilla on vain hyvin vähän antikoagulanttiaktiivi-suutta.

Farmakologisten ominaisuuksien tutkimukset ovat siten osoittaneet, että nämä kokoomukset aikaansaavat inhibitorisen vaikutuksen sileiden lihassolujen 10 kasvussa, joka vaikutus on lähes sama kuin hepariinin vastaava vaikutus.

Erilaiset kokeet ovat mahdollistaneet muiden inhibitoristen vaikutusten osoittamisen, erityisesti komplementin aktivaation suhteen, ja yliherkkyystyypin 15 viivästyneeseen inflammatoriseen reaktioon, kuin myös heparanaasin entsymaattiseen aktiivisuuteen.

Ne kykenevät myös aikaansaamaan vahvistavan ja stabiloivan vaikutuksen solukasvun tietyille tekijöille.

20 Lisäksi nämä ainekokoomukset ovat melkein vaarattomia ja ne ovat erityisen pysyviä.

Siten ne sopivat erityisen hyvin muodostamaan lääkkeiden aktiivisia pohjia.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu-25 ja kokoomuksia voidaan käyttää farmaseuttisissa valmis-teissä. Tällaisille valmisteille on tunnusomaista, että ne sisältävät vaikuttavan määrän mainittua kokoomusta, joka muodostuu oleellisesti hepariinin fragmentista, kuten edellä on määritelty, yhdessä farmaseuttisen 30 kantajan kanssa.

Keksinnön mukaisesti valmistettujen kokoomuksien ominaisuuksien kannalta katsottuna näitä kokoomuksia sisältävät farmaseuttiset valmisteet ovat erityisen käyttökelpoisia seuraavissa terapeuttisissa indikaati-35 oissa: sileiden lihassolujen proliferaation estossa ve-risuoniplastiikan aikana,

II

τ> 13 88046 - kudoksen korjaamisen kiihdyttämisessä, erityisesti ihotautien yhteydessä, - progressiivisten aterogeenisten vaurioiden kehittymisen ja valtimon kovettumisdegeneraatioon liittyvän 5 ilmiön estossa, - shokkitilojen estossa, - tiettyjen etäispesäkkeiden kehittymisen estossa.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja kokoomuksia sisältävät farmaseuttiset valmisteet voidaan antaa eri 10 muodoissa.

Suun kautta antoa varten turvaudutaan erityisesti kapseleihin, pastilleihin, tabletteihin, pillereihin, liposomeihin. Nämä valmisteet sisältävät edullisesti 50 mg - 5 g per yksikköannos, ja edullisesti 20 15 - 250 mg kapseleille, pastilleille ja pillereille.

Siten antomuodot riippuvat oleellisesti annettavasta annoksesta. Kapselit, pastillit ja pillerit ovat käytännöllisiä alhaisia annoksia annettaessa. Suurempien annoksien antoa varten on käytännöllisempää 20 käyttää juotavia liuoksia.

Muihin antomuotoihin kuuluu suihkeet, aerosolit, voiteet ja rasvat.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettuja kokoomuksia voidaan edelleen käyttää steriileissä 25 tai steriloitavissa, injektoitavissa farmaseuttisissa ainekokoomuksissa, jotka on tarkoitettu annettavaksi sekä laskimonsisäisesti että lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti.

Nämä liuokset sisältävät edullisesti n. 10 -30 150 mg/ml aktiivista ainetta, kun ne on tarkoitettu injektoitaviksi ihonalaisesti, ja n. 10 ja n. 100 mg/ml, kun ne on tarkoitettu laskimonsisäistä injektiota tai perfuusiota varten.

Havainnollistavana esimerkkinä esitetään an-35 nos, jota voidaan käyttää ihmisellä: tämä annos sisältää, esim. n. 500 mg/yksikköannos annon potilaalle ihonalaisesti 2-3 kertaa päivässä. N. 1000 mg/päivä Λ ΐ4 88046 annetaan laskimonsisäisesti, kun taas perfuusiona injektoitavat määrät voivat nousta useisiin kymmeniin ml. Nämä annot suoritetaan epäjatkuvaan tapaan säännöllisin väliajoin tai jatkuvana perfuusiona.

5 Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu ja kokoomuksia voidaan käyttää myös biologisissa rea-gensseissa, jolloin aktiiviset aineosat koostuvat hepa-riinin fragmenttikokoomuksista, kuten edellä on määritelty. Näitä biologisia reagensseja voidaan käyttää 10 viiteaineina tai standardeina vertailevissa kokeissa eri fysiologisissa järjestelmissä, joiden säätelyssä GAG:t ovat mukana.

Keksinnön mukaista menetelmää ja menetelmällä valmistettua kokoomuksta havainnollistetaan seuraavissa 15 esimerkeissä ja viitatuissa kuvissa 1-5, - Kuvat 1 ja 3 ja kuvat 2 ja 4 esittävät HPLC kuvaajia pelkistetystä depolymerointiseoksesta ja keksinnön mukaisesti valmistetusta kokoomuksesta, vastaavasti - kuva 5 on keksinnön mukaisesti valmistetun kokoomuk-20 sen 13C NMR spektri.

ESIMERKKI 1: Hepariinifragmenttikokoomuksen valmis tusmenetelmä .

1) Hepariiniketjujen katkaisu perjodihapon avulla 25 10 g injektoitavaa hepariinia sian limakal voista sen natriumsuolan muodossa, titrattuna 157 ul/mg Codex-määrityksissä ja 155 u/mg Yin et ai. mukaisessa anti-tekijä Xa-määrityksessä; liuotetaan 250 ml demine-ralisoituun veteen 4°C. Liuoksen pH sovitetaan arvoon 30 5.0 konsentroidun suolahapon avulla. 10 g natriummeta- perjodaattia (NaI04, MW: 213.89) liuotettuna 250 ml demineralisoituun veteen 4°C lämpötilassa lisätään kohtalaisesti sekoitettaen. Seoksen pH sovitetaan arvoon 5.0 konsentroidun suolahapon avulla. Liuos jäte-35 tään pimeään 24 h ajaksi kylmään huoneeseen +4°C lämpötilaan.

2) Jäljelle jääneen perjodaatin poisto I, 15 88045

Sitten reaktioliuos jaetaan 3 NOJAX 40R dia-lyysiputkeen (huokoisuus 3-4/000 Da) ja se kohdistetaan dialyysiin 15 h ajaksi vasten juoksevaa demineralisoi-tua vettä.

5 3) Depolymerointi emäksisessä väliaineessa

Dialyysin jälkeen saatuun 780 ml liuokseen lisätään 16 ml 10 N natriumhydroksidia, ja seosta sekoitetaan 3 h ajan huoneenlämpötilassa (luokkaa 18-21°C) .

10 4) Pelkistys

Sitten lisätään 500 mg natriumborohydridiä (NaBH4/ MW:37.83) ja liuosta sekoitetaan jälleen 4 h ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen pH tehdään 4 konsentroidun suolahapon avulla. 15 min sekoituksen 15 jälkeen pH sovitetaan arvoon 7 konsentroidun natriumhy-droksidin avulla.

Näin saatuun 820 ml liuokseen lisätään 16.4 g NaCl, jonka jälkeen 1270 ml etanolia.

Seoksen annetaan seistä 3 h ajan, sitten sent-20 rifugoidaan 2500 r/min 20 min ajan.

Sakka kerätään, uudelleensuspendoidaan 200 ml raakaan etanoliin, jauhetaan Ultra-TurraxR avulla ja lopullisesti talteenotetaan suodattamalla sulatetulla ... BÖchner-suodattimella. Tämän jälkeen se kuivataan va- 25 kuumissa 40°C 5 h ajan.

Siten saadaan talteen 8.9 g välituotetta, jolla on seuraavat ominaisuudet: - Codex-määritys: 8 ui/mg - APTT-määritys: 7 ul/mg 30 - Anti-Xa -määritys: 8 u/mg.

Kokoomuksen molekylaarinen jakautuminen on esitetty kuvassa 1, joka vastaa HPLC kuvaajaa, joka on kuvattu sivulla 5 esitetyssä olosuhteissa.

5) Alkoholifraktiointi 35 8.9 g liuotetaan n. 120 ml demineralisoituun veteen huoneenlämpötilassa. 1.78 g NaCl lisätään ja liuoksen pH lasketaan arvoon 3,5 suolahapon avulla.

TV

i6 88046

Liuoksen tilavuus sovitetaan 178 ml demineralisoidun veden avulla. 151 ml raakaa etanolia lisätään sekoittaen. Sekoitusta jatketaan 15 min ajan, kun lisäys on suoritettu, sitten seoksen annetaan seistä 10 h huo-5 neenlämpötilassa.

Muodostunut sakka kerätään sentrifugoinnilla 20 min ajan 2,500 r/min. Se uudelleensuspendoidaan 150 ml raakaan etanoliin, hienonnetaan Ultra-Turrax avulla, otetaan talteen suodattamalla Bljchner-suodattimella, 10 pestään 300 ml raa'alla etanolilla ja lopuksi kuivataan vakuumissa 40°C 24 h ajan.

Tämä johtaa 5.0 g talteenottoon valkoisen jauheen muodossa, 5.0 g tuotetta IC 1772, jolla on seuraavat ominaisuudet: 15 - Codex-määritys: 11 ul/mg - APTT-määritys: 9 ui/mg - Anti-Xa-määritys: 12 u/mg.

Saadun kokoomuksen molekylaarinen jakautuminen ilmenee kuvan 2 kokeessa, joka vastaa HPLC-kuvaajaa, 20 joka on suoritettu edellä olevissa olosuhteissa.

13C NMR ANALYYSI

Hiili 13 NMR spektri on esitetty kuvassa 5. Tämä spektri määritettiin liuoksessa, jossa yhdiste oli .. . liuotettu deuteriumoksidiin 25 MHz 35°C. Kemialliset 25 siirtymät on mitattu metanolin suhteen (51.6 ppm).

Tämän spektrin tulkinta osoittaa, että siinä on 2-O-sulfo-a-L-iduronihappo (l->4) 6-O-sulfo-N-sulfo-α-D-glukosamiini (l->4) tyypin disakkaridiket jun tyypilliset signaalit.

30 Anomeeristen hiilien segmenttien läsnäolo havaitaan erityisesti kohdassa 101.7 ppm (2-0-sulfo-a-L-iduronihappo), kun taas ei-sulfatoiduille D-glukuro-ni-ja L-iduronihapoille tyypilliset signaalit puuttuvat (104.5 ppm) vastakkaisesti hepariinivalmisteen spekt-35 rille, jossa ne voivat edustaa 30-40 % kaikista signaaleista uronihapoille.

C-2 glukosamiinin alueessa on läsnä vain sig- i

Tv I’ 8 8 045 naali kohdassa 60.5 ppm (C-2 N-sulfo-glukosamiini). N-asetyyli-glukosamiinille tyypillinen signaali (56.4 ppm) on tuskin havaittavissa, kun taas se on läsnä lähtöhepariinissa.

5 C-6 glukosamiinin alueella (62.5, C-6-OH ja 69, C-6-OS) havaitaan ei-sulfatoidun ja sulfatoidun fragmentin kahden signaalin läsnäolo.

On tärkeää huomata, että signaalien 99.4 ppm ja 101.7 ppm intensiteettisuhde vastaa arvoa 1, mikä 10 vahvistaa 2-0-sulfo-L-iduronihapon yksinomaisen läsnäolon .

N-asetyyli-glukosamiinin useiden tähteiden läsnäolo voidaan havaita. Vastaavasti signaali NHAc:lle (24.6 ppm) on ilmeinen.

15

Konduktometrinen analyysi:

Sulfaatioaste konduktometrisesti määritettynä on 2.3. Varausten lukumäärä per disakkaridiyksikkö on 3.3.

20 ESIMERKKI 2: 1) 200 g injektoitavaa hepariinia, natrium-suolana, titrattuna 154 ul/mg Codex-määrityksessä ja 158 u/mg anti-tekijä Xa -määrityksessä, liuotetaan 5 1 25 demineralisoituun veteen +4°C.

Liuoksen pH sovitetaan arvoon 5.0 konsentroidulla HCl. Kohtalaisesti sekoittaen sitten lisätään: 200 g natriummetaperjodaattia liuotettuna 5 1 demineralisoituun veteen +4°C. Seoksen pH sovitetaan jälleen 30 5.0 konsentroidun HCl:n avulla.

Saatu liuos jätetään pimeään 24 h ajaksi kylmään huoneeseen +4°C kohtalaisella sekoituksella.

2) Tämän jälkeen se jaetaan 50 dialyysiputken kesken ja dialysoidaan 14 h ajan vasten juoksevaa demi- 35 neralisoitua vettä huoneenlämpötilassa.

3) Kun tämä dialyysi on tehty, 14.5 1 liuos otetaan talteen ja siihen lisätään 116 g puhdasta nat- 8 8046 n riumhydroksidia pellettien muodossa. Näin saatua liuosta sekoitetaan 3 h ajan huoneenlämpötilassa.

4) 10 g natriumborohydridiä sitten lisätään ja sekoitusta jatketaan 4 h ajan.

5 Liuoksen pH alennetaan arvoon 4 lisäämällä konsentroitua HC1 15 min ajan, sitten se jälleen nostetaan arvoon 7 konsentroidun natriumhydroksidin avulla; Näin saadun liuoksen tilavuus on 15.2 1. Sit-10 ten lisätään 304 g NaCl, jonka jälkeen 22.8 1 etanolia.

Seoksen annetaan seistä 48 h huoneenlämpötilassa. Kirkas supernatantti imetään pois, sakka kerätään, se uudelleensuspendoidaan 3 1 raakaan etanoliin, jauhetaan Ultra-Turrax avulla, ja otetaan talteen suo-15 dattamalla lasifiltterillä.

Lopuksi se kuivataan vakuumissa 40°C 15 h ajan.

181 g hepariinifragmentteja otetaan talteen ja niillä on seuraavat ominaisuudet: - Codex-määritys: 10 ul/mg 20 - APTT-määritys: 9 ui/mg - Anti-Xa-määritys: 9 u/mg - molekylaarinen jakautuminen: katso kuva 3.

5) Nämä 181 g liuotetaan n. 3 1 demineralisoi-tuun veteen huoneen lämpötilassa.

25 36.2 g NaCl lisätään ja liuoksen pH sovitetaan 3.5 konsentroidun HC1 avulla.

Liuoksen tilavuus sovitetaan 3.62 1 deminera-lisoidun veden avulla. Lisätään 3.077 1 raakaa etanolia kohtalaisesti sekoittaen. Sekoitusta jatketaan 15 min 30 ajan kaiken lisäyksen jälkeen ja seoksen annetaan seistä 10 h ajan huoneen lämpötilassa. Muodostunut sakka kerätään sentrifugoimalla 20 min 2500 r/min. Se uudelleensuspendoidaan 2 1 raakaan etanoliin, jauhetaan

Ultra-Turrax avulla, otetaan talteen suodattamalla 35 filtterillä, pestään 3 1 raa'alla etanolilla ja lopuksi kuivataan vakuumissa 40°C 24 h ajan.

Lopuksi saadaan 104 g valkoista jauhetta, • Tv 19 88046 jolla on seuraavat ominaisuudet: - Codex-tiitteri: 13 ul/mg - APTT-tiltteri: 10 ul/mg - Anti-Xa-tiitteri: 13 u/mg 5 - molekyylijakautuminen: katso kuva 4.

ESIMERKKI 3: 1) Hepariiniketjujen katkaisu perjodihapon avulla 45 g injektoitavaa hepariinia sian limakal-10 voista sen natriumsuolan muodossa liuotetaan 600 ml demineralisoituun veteen. 18 g natriummetaperjodaattia liuotetaan 200 ml demineralisoituun veteen 5°C ja lisätään kohtalaisella sekoituksella. pH sovitetaan arvoon 5 lisäämällä konsentroitua HC1 ja reaktiotilavuus teh-15 dään 900 ml tislatun veden avulla. Liuosta pidetään pimeässä 24-26 h ajan kylmässä huoneessa (0-10°C). Muodostunut sakka poistetaan suodattamalla.

2) Jäljelle jääneen perjodaatin poisto 900 ml hepariinin hapetusreaktiota suodatetaan 20 ioninvaihtohartsin läpi, Amberlite IRA, Cl (Rohm and Haas Company, USA), hartsin tilavuuden ollessa 1/8 osaa reaktiotilavuudesta (110 ml), 2 h ajan.

Pylvästä huuhdellaan 225 1 demineralisoidulla vedellä. Huuhteet yhdistetään suodatetun liuoksen kans-25 sa. Täten saadaan 1,125 ml perjodaatista ja jodaatista vapaata liuosta. Perjodaatin puuttuminen tarkistetaan titrimetrisesti. 5 ml oksihepariiniliuoksen titraus- käyrä 2.5 ml 1 N natriumhydroksidilla osoittaa perjodaatin puuttumisen. Liuoksessa oleva perjodaatti olisi 30 tuottanut tyypillisen taipumisen arvossa pKa n. 7.8.

3) Depolymerointi emäksisessä väliaineessa Beta-eliminointi aloitetaan lisäämällä 10 N

natriumhydroksidia vähitellen, kunnes pH on 11.5. Reaktion annetaan jatkua 1 h ajan huoneen lämpötilassa (18-35 23°C) samalla sekoittaen.

4) Pelkistys 10 g natriumborohydridiä lisätään sitten jo- 2ο 8 8 0 46 Λ kaista 100 g käytettyä lähtömateriaalia kohti.

Pelkistystä jatketaan ainakin 3 h ajan sekoittaen. Tämän jälkeen ylimäärä pelkistävää ainetta poistetaan lisäämällä 25 g/1 NaCl, sitten liuoksen pH sovi-5 tetaan arvoon 4 väkevän HCl avulla. Tämän jälkeen liuos sovitetaan neutraaliin pH-arvoon konsentroidun NaOH avulla.

Tuote saostetaan lisäämällä 1.5 tilavuusyksik-köä raakaa etanolia. Sakan annetaan asettua 48 - 72 h 10 aikana, sen jälkeen se dehydratoidaan etanolilla ja kuivataan vakuumissa 40°C 12 h ajan.

5) Alkoholifraktiointi

Tuote liuotetaan demineralisoituun veteen (180 ml 10 g käytettyä hepariinia kohti). Lisätään 2 g 15 NaCl 10 g kohti. pH sovitetaan arvoon 3.5 ja liuos saatetaan tilavuuteen 200 ml käytettyä 10 g kohti demi-neralisoidulla vedellä.

0.85 tilavuusyksikköä raakaa etanolia lisätään samalla varovasti sekoittaen. Sakan annetaan asettua 20 48-72 h aikana. Sakka otetaan talteen, dehydratoidaan raa'alla etanolilla, jauhetaan Ultra-Turrax avulla ja kuivataan 40°C. Tuote saadaan valkoisen jauheen muodossa. Alkoholiin liukeneva tuote analysoidaan HPLC avulla. Oligosakkarideille on mitattu keskimääräinen mole-25 kyylipaino luokkaa 3500.

6) Puhdistus

Edellisessä vaiheessa saatu tuote liuotetaan tuottamaan 5 % liuos demineralisoituun veteen ja puhdistetaan Amberlite IRA 400, OH" (1/10 reaktiotilavuu-30 desta) anioninvaihtopylväässä.

Tämän jälkeen tuote testataan sen ominaisuuksien suhteen. Sulfaatioaste (määritetty julkaisun, Helbert J.R. ja Marini M.A., Biochemistry, 1963, 2, 1101-1106, mukaisesti).

35 S03/COO" suhde vaihtelee välillä 2.2 - 2.4.

Anti-IIa ja Anti-Xa-aktiivisuudet: - TCK (1): 4 u/mg ·η 2ΐ 88046 - USP (2): 13 u/mg - Anti-IIa-aktiivisuus (3): 12 u/mg - Anti-Xa-aktiivisuus (4) (Yin ja Wessler): 8 u/mg 5 - Anti-Xa-aktiivisuus (kromogeeniselle subst raatille S 2222 puhdistetussa järjestelmässä): 1 u/mg.

Mittausten suorittamiseksi käytetyt viitteet ovat seuraavat: 10 (1) : R.R. Proctor ja S. Rapaport - Am. J. Clin. Pat hol., 1961, 36, 212-219 (2) : XXIst American Pharmacopoeia.

(3) : Mitattu trombiiniajän keston avulla.

(4) : E.T. Yin, S. Wessler, J.V. Butler - J. Lab. Clin 15 Med., 1973, 81, 298-310.

URONIHAPPOTÄHTEIDEN OSOITUS, JOIDEN RENGAS ON AVAUTUNUT C2 JA C3 VÄLISTÄ

Smith-hajoaminen arvossa pH 3 ja 100°C 1 h 20 aikana 5 % IC 1772 liuoksessa tuottaa oligosakkaridi-ketjujen spesifisen katkaisun uronihappojen, jotka ovat avautuneet C2 ja C3 välistä, tasolla. Tuloksena tuotteen keskimääräinen molekyylipaino alenee, kuten on osoitettu TSK 2000 geelisuodatuksella refraktometrisen määri-25 tyksen avulla.

Tulokset on ilmaistu seuraavasti: - Mna tarkoittaa keskimääräistä molekyylipainolukua, kuten on määritelty W.W. YAU, J.J. KIRKLAND ja D.D.

. ‘ BLY (teoksessa Modern size-exclusion liquid chromatrog- 30 raphy, Wiley Interscience Publication) toimesta, sellaisenaan testatulle tuotteelle; - Mnb tarkoittaa keskimääräistä molekyylipainolukua, sen jälkeen, kun on suoritettu Smith-hajoitus edellä esitetyn mukaisesti; 35 - Mna/Mnb -1 antaa kohtien lukumäärän, jotka ovat herk kiä Smith hajoitukselle oligosakkaridiketjussa, mikä vastaa uronihappojen, jotka ovat auenneet C2 ja C3 koh- 22 88046

rI

dalta, lukumäärää.

Koe suoritettiin IC 1772 kahdella erällä, p 46 VH p 55 VH

Mna 5503 5573 5 Mnb 3896 3745 (Mna/mnb) - 1 0.4 0.5 Tästä ilmenee, että analyysiolosuhteissa, IC 1772 sisältää vähintään yhden avonaisen uronihapon 10 kahta ketjua kohti.

IC 1772 ANTIKOAGULANTTIVAIKUTUS IHMISEN PLASMASSA

Alla on esitetty tulokset, jotka on saatu: 1. In vitro anti-IIa ja anti-Xa-aktiivisuuksista eri 15 järjestelmissä.

2. Trombiinin koagulaatioajat (TCT).

1) In vitro anti-IIa ja anti-Xa-aktiivisuudet Määritys IC 1772 Hepariini 20 u/mg standardi u/mg TCK1 10 160 USP2 13-15 160 anti-IIa3-aktiivisuus 16 160 25 anti-IIa-aktiivisuus (kromogeenisella substraatilla S 2238 puhdistetussa järjestelmässä) 36 160 anti-IIa-aktiivisuus (kromo-30 geenisellä substraatilla, S 2238 plasmajärjestemässä) 1 160 anti-Xa4-aktiivisuus (Yin ja Wessler) 12-15 160

anti-Xa-aktiivisuus (kromo-35 geenisellä substraatilla S

2222 puhdistetussa järjestelmässä) 2-3 160 i 23 88 046 • τ, anti-Xa-aktiivisuus (kromo-

geenisella substraatilla S

2222 plasmajärjestelmässä) 5-10 160 5 Mittausten suorittamiseksi käytetyt viitteet ovat seu-raavat: (1) : R.R. Proctor ja S. Rapaport - Am. J. Clin. Pathol., 1961, 36^ 212-219.

(2) : XXIst American Pharmacopoeia.

10 (3) : Mitattuna trombiiniajän kestona.

(4) : E.T. Yin, S. Wessler, J.V. Butler - J. Lab.

Clin. Med., 1973, 81j_ 298-310.

2) - TCT: 15 Taulukossa 1 alla, tulokset on ilmoitettu koagulaatioaikojen muodossa ilmaistuna sekunneissa 3 määritykselle, jotka on suoritettu 3 tyyppisellä plasmalla, joita on käytetty APTT aktiivisuuden tutkimisessa. Vertailu on suoritettu normaaliplasmassa. Tu-20 lokset vastaavat kahden riippumattoman määrityksen keskiarvoa.

TAULUKKO 1 uq/mq normaali- plasma, josta on poistettu plasma

25 ATIII HC II ATIII HCII

0 22 20 20 20 2,5 36 26 24 22 : 5 110 51 27 22 10 > 300 >300 40 22 30 Trombiiniajän kesto havaitaan annoksilla 5 ja erityisesti 10 ug/ml, jotka näyttävät riippuvan HCII:-sta.

SILEIDEN LIHASSOLUJEN (SMC) PROLIFERAATION INHIBITIO 35 IN VITRO Koemalli:

Pehmeät lihassolut (SMC) saadaan Sprague Dawley- Λ' 24 88 046 rotan aortan vatsaosasta. Pienet näytepalat asetetaan RPMI-1640 kasvatusalustaan, jota on täydennetty 20 % vasikan sikiöseerumilla (FCS). 1-2 viikon lopussa SMC erottuu kudoksista ja alkaa proliferoitua.

5 5-8.103 SMC asetetaan kasvamaan monikuoppalevyil- le. 24 h kuluttua niiden kasvu keskeytetään pesemällä, jonka jälkeen lisätään RPMI kasvualustaa +2 % verihiutaleista vapaata plasmaa (tai RPMI +0.4 % FCS) 72 h ajaksi.

10 Sitten solut asetetaan jälleen 5-7 päiväksi RPMI

kasvualustaan, jota on täydennetty 20 % FCS yhdessä tai ilman testattavaa yhdistettä, jota saatetaan eri konsentraatioissa.

SMC nettokasvu kontrollinmäärityksissä ja määri-15 tykeissä, joihin on lisätty testattavia tuotteita, saadaan vähentämällä kokeen alussa olevien solujen lukumäärä kokeen lopussa olevien solujen lukumäärällä (toistomittaukset Coulter counter -avulla).

Inhibitioprosentti saadaan seuraavalla kaavalla: 20 testattujen solujen nettokasvu % Inhibitio = 1 - ------------------------------x 100 vertailusolujen nettokasvu (kts. Castellot et ai., J. Cell. Biol., 102, 1986, 25 1979-1984).

... Tulokset, jotka riippuvat IC 1772 konsentraati- osta, ovat seuraavat (vertailun vuoksi ilmoitetaan hepariinilla saadut inhibitioarvot).

30 Tuotteen määrä Inhibitio IC 1772 Hepariini 1 ug/ml kasvualusta 25 % 20 % 10 ug/mg " 45 % 60 % 100 ug/ml " 70 % 80 % 35 Aktiivisuus, joka on hyvin lähellä standardihe- pariinin aktiivisuutta, havaitaan tässä koemallissa.

l· 25 8 8 0 46 • Λ SILEIDEN LIHASSOLUJEN (SMC) PROLIFERAATION INHIBITIO IN VIVO: PALLOKATETRIMALLI.

Koemalli:

Koe suoritetaan Sprague Dawley urosrotilla, 5 jotka ovat 5 kuukautta vanhoja ja painavat n. 500 g.

Eläimet nukutetaan ja vasemman karotidivalti-mon endoteliumi käsitellään pallokatetrin intralumi-naalikanavan avulla veritulpan poistoa varten, joka on saatettu karotidin ulommaiseen haaraan.

10 Tutkittava tuote tai steriili blankki-liuos annetaan jatkuvana infuusiona laktatoidussa Ringer-liuoksessa vasempaan kaulalaskimoon (käytetään osmoottista infuusiopumppua (Alzet), joka on asetettu eläimen selkään). Käsittelyä jatketaan 4 viikon ajan no-15 peudella 2.5 ul/h. Annettu annos oli 1 mg/kg/h.

28 päivän kuluttua eläimet nukutetaan ja ka-rotidivaltimot poistetaan. 17,9 ja 1 h ennen nukutusta eläimet saavat tritioitua tymidiininä vatsaontelon sisäisenä injektiona.

20 Tulokset on ilmaistu DNA:n määränä vahingoit tuneissa oikeanpuoleisissa karotideissa (RC) ja vahingoittumattomissa vasemmanpuoleisissa karotideissa (LC) seuraavan laskutavan mukaisesti. τ w DNA* käsitellyt eläimet 25 Inhibitio (%) = 1 - --------------------------x 100 ; · DNA* vertailueläimet

L

DNA - DNA„

* LC RC

DNA = ----------------

30 DNA

..... RC

. . (kts. A.W. Clowes ja M.M. Clowes, Labor. Investig., 1985, 52 (6), 612-616).

Tulokset:

Ensimmäisessä määrityksessä, jossa oli kymme-35 nen eläintä, testatulla tuotteella IC 1772 havaitaan n. 50 % inhibitio, joka on lähellä hepariinin inhibi-tiota.

Λ 26 88046

KOMPLEMENTTIJÄRJESTELMÄN INHIBITIO

Hepariini inhiboi komplementin vuorottelvan vahvistavan C3 konvertaasin kehittymistä inhiboimalla proteiinien C3b ja B välisen bimolekulaarisen komplek-5 sin muodostumista.

Hepariinin ja tuotteen IC 1772 vaikutusta C3b-B sitoutumiseen tutkittiin käyttäen B-proteiineja, jotka oli leimattu 125I (125I—B), ja lampaan erytrosyyttejä proteiinin C3b (EsC3b) kantajina.

10 Hepariinin tai testatun oligosakkaridin kon- sentraatio, joka vaaditaan aikaansaamaan n. 50 % C3b-B kompleksin muodostuksen inhibition, merkitään IC50.

Tämä mittaus tehdään in vitro puhdistettujen proteiinien järjestelmässä.

15 Koejärjestelmä

EsC3b(0.75-2.5 X 107) inkuboidaan 125I-B eri konsentraatioissa veronaalipuskurissa, joka sisältää 0.1 % gelatiinia ja 5 mM Mg2+, 30 mn, 30°C.

70 μΐ kaksoisnäytteet jokaiselle reaktiolle 20 sijoitetaan 300 μΐ dibutyyliftalaatin (Merck-Clevenot, Ranska) ja dinonyyliftalaatin (Coger, Pariisi) (7:3 til./til.) 0.5 ml seoksiin polypropyleeniputkissa.

Putkia sentrifiguoidaan 1 min ajan 8000 g Beckman mikrofuugilla (Beckman, Pariisi), sitten ne 25 leikataan juuri sakkautuman yläpuolelta. Sidotun li-: gandin radioaktiivisuus lasketaan.

;Y: Tuote IC 1772 määritettiin verrattuna hepa- riiniin. Tulokset, jotka on ilmaistu IC 50 ovat seu-raavat: 30 IC 1772: 0.4 μg/ml

Standardihepariini: 0.5 μg/ml Vuotoaika:

Tuotetta annetaan kaniineille laskimonsisäisesti annoksina 5 mg/kg 15 min ajan ja 1 h ennen koet-35 ta. Koemalli on Cade'n mukainen, kuten on kuvattu Cade et ai. julkaisussa, Thromb. Res. 35, 613-625, 1986.

Suoritetut määritykset osoittavat, että tuote I;

TV

27 8 8 0 46 ei lisää vuotoaikaa annoksina 5 mg/kg annettuna laskimonsisäisesti .

IC 1772 antitromboottisen aktiivisuuden tutkiminen Seuraavaa mallia käytetään: 5 Eläimet nukutetaan 70 mg/kg Ketaset (R> (Bris tol Lab, Syracuse, NY) avulla lihaksensisäisesti. Kirurgisilla menetelmillä eristetään 2 cm palat oikeasta ja vasemmasta kaulalaskimosta. Tutkittavat tuotteet injektoidaan laskimonsisäisesti korvan marginaalilas-10 kimoon tasan 5 min jälkeen trombogeenisen aineen, kuten konsentroidun trombiinikompleksin ja käärmeen myrkyn (PCC/RVV) seoksen, injektiosta. 20 s kuluttua kau-lalaskimo sidotaan, ja 10 min kuluttua laskimon salpauksesta laskimo-osat poistetaan ja asetetaan fysio-15 logiseen seerumiin, sitten hyytymisen muodostumisen taipumus arvioidaan asteikon 0-4 mukaisesti (4 tarkoittaa yksittäistä hyytymää ilman vapaita erytrosyyttejä) (FAREED, J. WALENGA, J.M., KIUMAR, 2 ja ROCK, A. "A Modified stasis thrombosis model to study the an-20 tithrombotic actions of heparin and its fractions". Sem. Thromb. Hemost. 11 (2), 155-175, 1985).

IC 1772, annettuna laskimonsisäisesti annoksina 1 mg/kg 10 kaniinin ryhmälle, osoitti erittäin hyvää antitromboottista aktiivisuutta kaikissa eläi-25 missä.

Claims (6)

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen, alhaisen molekyylipainon omaavista hepariineista koostuvan kokoomuksen valmistamiseksi, jolta puuttuu mel-5 kein täydellisesti antikoagulanttiaktiivisuus ja joka sisältää oleellisesti fragmentteja, joista puuttuu ei-sulfatoidun uronihappo-glukosamiini N-sulfaatti -tyypin toistuvat disakkaridisekvenssit ja joilla fragmenteilla on yleinen kaava I: 10 R - (X-Y)n- R1 (I) jossa X tarkoittaa joko sulfatoitua iduronihappotäh-dettä, jolla on kaava II:

15 A—°\ Λοο Y (II) OSOj’ 20 tai, ainakin n. 1 tähde per 2 ketjua, ei-sulfatoitua uronihappotähdettä (D-glukuroni- tai L-iduroni-), jonka rengas on avautunut paikkojen 2 ja 3 hiiliatomien välistä ja jolla on kaava III coo“ £y ..... CHjOH CHjOH 30 Y tarkoittaa D-glukosamiinitähdettä, jolla on kaava IV: o J j(tA- "" 29 8 8046 n jossa R3 on vetyatomi tai ~SO~ ryhmä; R2 on -SO" ryhmä tai -CO-CH3 ryhmä, -SO” ryhmien osuuden ollessa ainakin n. 90 %; ja R3 on -SO” ryhmä tai vety-5 atomi, -SO” ryhmien osuuden ollessa ainakin n. 70%; R tarkoittaa vetyatomia tai tähdettä: /“< io / y. (v) ννγ khk2 15 jossa R3 - R3 tarkoittaa samaa kuin edellä; ja R4 tarkoittaa vetyatomia tai uronihappotähdettä; R* tarkoittaa joko vetyatomia, tai modiftoimetonta uronihappotähdettä, tai uronihappotähdettä, joka 20 on modifioitu perjodihapetuksen aikana ja jonka aldehy-difunktiot on pelkistetty alkoholeiksi; välillä 7 < n < 15 suurimmalle osalle fragmentteja, mikä vastaa ketjuja, joiden molekyylipaino on n. 4800 - 9000; tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttä-25 viä suoloja, mainitun kokoomuksen omatessa edullisesti keskimäärin 3.3 varausta per disakkaridiyksikkö, ··. tunnettu siitä, että: a) hepariinivesiliuosta lopullisessa konsentraatiossa 0.5 - 5 % (p/til.) käsitellään perjodihapolla lopulli- 30 sessa konsentraatiossa 0.5 - 4 % (p/til.) pH-arvossa 4.5 - 6.5, lämpötilassa 0-10 °C; b) näin saatuja hepariiniketjuja käsitellään vahvalla emäksellä emäksen lopullisessa molaarisuudessa 0.1 - 0.3 N; 35 c) näin saatuja depolymerointifragmentteja käsitellään pelkistävällä aineella; d) pelkistävän aineen ylimäärän poiston jälkeen, tar- Λ 30 88046 vittaessa, pelkistetyt fragmentit saostetaan lisäämällä alkoholiliuotinta mineraalisuolalisäyksen jälkeen, e) näin saadun sakan vesiliuosta, johon on lisätty mineraalisuolaa, käsitellään alkoholilla, 5 f) näin muodostunut saostunut tuote otetaan talteen ja, tarvittaessa, käytettyä vahvaa emästä vastaava suola muutetaan toiseksi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että se koostuu seuraavien vaiheiden yhdistelmästä: - hepariinin kontrolloitu hapetus antamalla hepariinin reagoida vesiliuoksessa, lopullisessa konsentraatiossa 0.5 - 5 % (p/til.), edullisesti 1.5 - 5 % (p/til.), 15 perjodihapposuolan kanssa, joka on lopullisessa konsentraatiossa 0.5 - 4 % (p/til.), edullisesti 1.5 - 2.5 % (p/til.), pH-arvossa 4.5 - 6.5, edullisesti pH 5, lämpötilassa 0-10 °C, edullisesti 4 °C, n. 15 - 48 h ajan ja valolta suojattuna, perjodihapposuolan ollessa 20 edullisesti natriummetaperjodaattia, - saatujen hepariiniketjujen depolymerointi lisäämällä vahvaa emästä kuten natriumhydroksidia määränä, joka riittää antamaan lopullisen emäsmolaarisuuden n. 0.1 -n. 0.3 N, pH-arvossa, joka on korkeampi kuin n. 11, 25 erityisesti välillä 11 - 12, ja edullisesti 11.2 -: ·*: 11.6, ja edullisimmin 11.5, - depolymeroitujen fragmenttien pelkistys lisäämällä pelkistävää ainetta ja reagoimattoman pelkistävän aineen poiston jälkeen, tarvittaessa, erityisen dialyysin . 30 suoritus dialyysiputkilla, joiden huokoisuus on 3 - 4,000 Da n. 15 h ajan, pelkistettyjen hepariinifragmenttien talteenotto seostamalla liuoksella, johon ne ovat liukenemattomia, - haluttujen fragmenttien eristys fraktioimalla alkoho-35 lilla mineraalisuolan läsnäollessa vesiliuos, joka on saatu uudelleenliuottamalla veteen aiemmin eristetty sakka, ja ottamalla talteen muodostunut sakka; 3i 88046 jolloin hepariinin pelkistettyjen fragmenttien talteenotto suoritetaan edullisesti sovittamalla pH arvoon 7 ja sitten, mineraalisuolan kuten NaCl lisäyksen jälkeen, lisäämällä 1 - 1.5 tilavuusyksikköä liuotinta, 5 kuten etanolia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hepariinin pelkistetyt, saostetut fragmentit liuotetaan 5 % (p/til.) pitoisuuteen vesiliuokseen, johon mineraalisuola on 10 lisätty lopullisessa konsentraatiossa 1 %, liuoksen pH sovitetaan arvoon 3.5 ja lisätään 0.85 tilavuusyksikköä alkoholiliuotinta kuten etanolia.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että HPLC-määrityk- 15 sen mukaisesti, joka on suoritettu TSK 2000 SW pylvään avulla, joka on liitetty fotometriseen detektoriin aallonpituudelle 205 mm, ja käyttäen 0.5 M Na2S04 liuottimena virtausnopeudella 1 ml/min, hepariinifragmentti-kokoomuksen: 20. keskimääräinen molekyylipaino on luokkaa 6000 - 7000 Da, tarkemmin 5800 - 7000 Da, erityisesti luokkaa 6000 Da, 70 % fragmenteista sijoittuessa välille 4800 - 9000 Daltonia, ja 90 % välille 3600 - 11000 Da, - molekyylipaino huipun korkeimmassa kohdassa on luok-25 kaa 6000 - 6500 Da, tarkemmin 5500 - 6500 Da, erityisesti :’· ' luokkaa 5500 - 6000 Da, - ketjuista alle 5 % on pienempiä kuin dodekasakkaridit, -ketjuista alle 5 % on suurempia kuin 11000.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen 30 menetelmä, tunnettu siitä, että kokoomuksen NMR-spektri vastaa kuvan 5 spektriä.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kokoomuksen sisältämät fragmentit valmistetaan natrium-, kalium-, 35 kalsium- tai magnesiumsuolojen muotoon. 32 88 046