TW446710B

TW446710B - Preparation and use of sulfated oligosaccharides

Info

Publication number: TW446710B
Application number: TW085104940A
Authority: TW
Inventors: Christopher Richard Parish; William Butler Cowden
Original assignee: Univ Australian
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1996-04-25
Publication date: 2001-07-21
Also published as: NZ305815A; IS4596A; NO974911D0; WO1996033726A1; CA2218872C; JPH11504018A; EA199700347A1; EP0837683B1; BR9608041B1; BR9608041B8; EA001199B1; FI974060A; CN1090021C; IL118047A0; EP0837683A4; EP0837683A1; HUP9802394A2; US6143730A; PL323080A1; CA2218872A1

Description

< Λ 4 6 7 1 0 Α7 Β7 五、發明說明（丨）發明領域： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明偽龆於硫酸化寡糖，其製餚K及其作為抗血管生成，抗轉移及/或抗發炎劑的用途。發明背景：硫酸乙醯肝累屬於多糖類的聚葡萄糖胺族，它們存在於大多數的多细胞動徳中，並且分佈於各處，並於细胞表面及多數組織（1, 2)的细胞外母質（EC Μ)中表琨出來。硫酸乙醛肝素通常以蛋白多糖形式存在，並且對分子的核心多胜肽的定序和選殖有大幅度的進展。到目前為止，例如，至少有 S 種不同硫酸乙醢肝素蛋白多糖（RSPG)的核心多胜肽於细胞表面（3 )上被發琨。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製最初 HS?Gs在细胞表面及ECM中扮演了重要的结構性角色。然而，硫酸乙醢肝素鏟顯示了顯著的结構分散（2,4), 這也就是說它們可提烘重要（I號貿訊給許多生物程序；因 lit,雖然硫酸乙醯肝素鐽最初合成為葡萄糖苷騸基和 P 乙醯葡萄糖胺基殘基由/3 卜4和α 1-4鍵所埋接的餌單交替單元，但仍有許多後績的改良。該多糖為去乙篚化和 Ν-碲酸化的，並且蘄萄糖苷醯基軍元經C 5差商異構作用而成為iduronosyl單元< uronosyl及葡萄糖胺基 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2J〇x297公釐）. 經濟部智慧財產局具工消費合作社印製 Α7 Β7__ 五、發明說明（〆）殘基並進行不同的〇-碇酸化。這些改良的變異性包括了約；]ϋ種不同的二糖順序，當依硫酸乙醯肝素鏈作不同順序的排列時，理論上可產生非常多不同的硫酸乙醯肝素结構。£因如此，只存在於肥大细胞顆粒中的抗凝血劑多糖肝素代表差同異構和硫酸化都達到最大硫酸乙篚肝素s 多數硫酸乙醢肝素包含了由相對較畏延伸之非硫酸it軍元所連接之高度硫酸化殘S的短延伸。有相當明顯的證據顯示，硫酸乙醯肝素在赝泛範園的生拗程序（2 - 4 )扮演重要角色。特別地是，它們可作為锣及细胞-细胞交互作用（5,6)之黏合分子的配合基，它們可參與綑胞-ECM的交互作用（5,6),並且可作為成長因子如鹽基性潘維继母细胞成長因子（bFSF) H,S)和血管肉皮成長因子（VEGH (3)的基本细胞表面受睡，SSPSs 亦為基膜的主要成份，它為细胞移動（10)的主要障壁。基膜障壁僅在细胞分衙有降解酵素（li),包括内配糖酵素，如可裂解碲酸乙醯犴素鍵（12,13)之乙醯肝素醒時才可攻锻頃發琨，在許多有碇酸乙醢肝索參與的生物程序中，蔀涉及獨特疏酸乙醢肝素结櫞的辨認，其中碇酸鹽於多糖鐽中的位置是相當重要的（3)。舉例來說，已證S碇酸乙醯肝素順序可甶酸性和鹼性F G F ( U , 1 6 )來辨認，並可由 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） n n , T 一-^I ϋ ϋ ( t i ϋ n t 線—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 44671 Ο Α7 __Β7___ 五、發明說明（々）乙醯肝素醞裂解=:基於這些觀察，本發明目的之一在於合成皈酸fb寡糖，其可阻蹯成長因子對硫酸乙醯肝素的辨認並且可抑制乙醯肝素醒對硫酸乙醯肝素的裂解。在成長因子的詛斷上，低分子量的媼酸乙截肝素懕是特別有效率，咸信綑胞表面硫酸乙艎肝素中介了連接於受體（17)之成長因子的交聯。除此之外，硫酸化募糖為有效的乙醱肝素藺抑制劑，係因其可作為該酵素的不可裂解基質。具有成長因子抑制活性的硫酸化寡糖有許多臨床的用途。硫酸乙醢肝素連结成長因子，如bFSf和VFSF,為有效的血管誘發劑（i S )。成人除非在受傷癒合時.否則甚少有血管生成情形。然而，成人有許多與血管生成相醆的疾病。在逭些疾病中，血管生成是相當重要的（13-20)。這些情況最重要的是血管生成伴讁著固題腫磨，增殖性視網膜病（proliferative reti II 〇patiiies) is(及 ® 濕性 H 節炎的成長。可阻斷主要血管生成成長因子，如bFGF及YEGF 作芾之硫酸化寡糖，對於治療與血管生成相關疾病是特別有效的。同樣地，可抑制乙藤肝素醑作用的硫酸ib寡糖有許多臨康上的應用，内皮细胞下層基膜為内皮细胞、腫瘤细胞及白血球通注血管壁的主要晋體障礙。乙醢肝素醑與許多蛋白質分解酵案 ί洌如胞漿素，S質金屬蛋白質酵素）本紙張尺度適用中0國家標準（CNS)A4規格<210 « 297公爱） — — — — —— — — — —--I -lull— I 訂 (請先閱讀背面之注意"項再填寫未頁) 4 46710 A7 ____B7___ 五、發明說明（Y ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 鐽由侵駱细胞（Π - i 3 , 21)的方式，於基膜降解中扮演重要角色因此·藉由防止基膜的降解.具有乙醢肝素藹抑制活性的碇酸化寡糖，表現了抗轉移及抑制發炎的活性. 並且可抑制早期的血管生成。硫酸化冪埔可同時抑制血管生成成畏因子作用和乙醯肝素酶作用，因此可於許多臨床狀況，Μ如高度轉移之固體腫瘤和風濕性關節炎的治療中使用。國際專利申諝案第 PCT/A(J88/QQ0 17 號（公告编號 W08S/ G53G1)揭示了可阻斷或抑制肝燐脂酸活性之碌酸化寡糖如肝燐脂和改良過之肝憐脂，岩藻多糖，聚戊糖，菌葡萄聚糖硫酸鹽及鹿角菜λ噬菌體應用於動物或患者抗轉移和/或抑制發炎的治療。經濟部智慧財產局員工消费合作社印製在進行本發明時，發明者使用自然產生之寡耱或包含己糖均聚物之全合成募糖來製餚硫酸化寡糖。這些化合物中有部汾已證S為入類ώ管生成，腫瘤轉移和發炎的有效抑制劑。所獲得的簧杩與硫酸化寡糖藉由抑制血管生成成長因子的作用和/或乙醯肝素菌作觅而呈琨其生物效果的情況瞄合，並且可獲得同時為血管生成和乙醯肝素醯活性之有效抑制劑的硫酸化冪糖。發明概要本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟邨智慧財產局員工消費合作社印製 “446710 Α7 Β7 五、發明說明（$ ) 本發明提洪了硫酸化寡糖*其中該寡糖具有如式1的通式： R! -(Sx)n-R2 (I) 其中 1和Rz及每—Rx為單糖單元，它們可相同或不間，相鄺的軍糖單元S i— 2，1~>3，134和/或 i〇6糖苷_所連接，並且η為1至6的整數。本發明之疏酸化寡糖以單糖單元之聚合物為主.簞糖單元可甶1— 2, 1今3，1~>4和/或1->δ糖苷鍵連接並且可包含3至8個簞糖單元。該冪蒱較佳地包含31 6 猫軍糖簞元（亦卽η為i至4),更佳地包含5至6 涸軍糖軍元（η為3至4)。該聚合物可包括僅包含一種類型單糖單元之均聚锪，或者包括S含兩棰或更多頚型單糖軍元之雜聚物。葷糖單元可互相連接而形成寡糖，較佳的簞糖為六碳糖，Κ及呋喃糖如果糖或肤哺糖如葡萄糖，甘露糖，阿卓糖，阿洛糖，塔羅糖，半乳糖，艾杜糖或古羅糖。己糖可為D-或L-结構。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ϋ iaf I » .^1 ϋ 一^1** · ϋ· n n i n I 線丨 {請先閲讀背面之注4事項再填寫本頁) ^ 446710 A7 _B7_ 五、發明說明（k ) 本發明另一方面提洪具有通式S的新穎合成寡糖： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Ry - iRy)n - Ry ( S ) 其中每一liy基為相同的筮且各代表單糖眾元.，相鄰的單糖單元由 3 , 1— 4和 /或6糖苷鍵所連拉並且π為1至δ的整數。固時，本發明亦提供了化學式如逋式ϋ的硫酸化寡糖 0 在通式S的均聚合寡糖中，單糖單元較佳地為六碳糖如葡萄糖，甘露糖，阿卓糖，阿洛糖，塔羅糖，半乳糖，艾杜糖或古羅糖。同時，在這呰寡糖中，η較佳地為1至 4的整數，更佳地為3至4的整數。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製通式I和Κ的寡糖亦包括單糖單元遝衍生的化合物，特別是單糖軍元為磷酸鹽，乙醯基或其它單糖之酯類衍生锪的化合韌。一般而言，本發明之硫酸化寡糖的製顔可經由.此門技術中所習知之方法硫ih S糖而獲得對應的氧-硫酸化衍生物。適當的碇酸化法說明如下。要碇酸化的寡糖可為自然 -S - 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS)A4規格（210 x297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 i 4 4 6 7 ! Ο A7 B7 r--------—- — ，五^、發明說明（1 ) 生成產物，包括自然生成的寡糖例如棉子糖和水蘇糖.Μ 及自然生成之多糖遝酵素或化學降解所製蔺的寡糖*洌如麥芽丁麥芽戊醣和麥芽己醏；葡萄耱三醣，葡萄耱四糖和葡萄糖五醣；钦骨謬四-，六-及八糖；Κ及從酵母 .菌P i c h i a h ο I s t i i而潯的甘露戊豳磷酸鹽。如前所述，本發明之硫酸化寡糖已證茛有乙醢肝素酸和/或成畏因子抑制活性®因此，本發明另一方面擴展至荊逑疏酸化寡糖作為抑制血管生成.抗轉移和/或抗發炎劑，Μ治療溫血動物（包括人類）S者的搿途。因此，本發明亦醒於一種對人類或溫血動锪患者進行抑制血管生成，抗轉移和/或抗發炎治療的方法，其包括對患者施用具療效量，至少一種如上逑的硫酸化寡糖= 活性成分的葩用量必須具育療效。具有療效量指所施馬的量至少必須獲得預期效果*或者能延遲或停止特殊狀況的進_汀。當然，Ϊ£些兩量取法Si冶療的特殊狀況，抗況的嚴重程度以及涸別患者的犹況，如年龄，生理狀涅，體格，體重Μ及合併治療。這些园素為習於it門技銜之人士所熟®並且只要例行霣驗即可決定。一般而言，最大劑量，亦卽最高安全劑量必須依健全的醫學判斷。然而，習於此. 門技衛人士都知道，低繭量或可容忍爾星可依發學原因， -9 - 各紙張尺度適用中國國家標準（CNS)M規格（210 x 297公爱）裝---—！！訂---------線 f靖先閱璜背面vat事項一^填寫本頁) 4治 446 7 1 A7 B7 五、發明說明（3 ) 心埋學原因或其它任何原因來施用。本發明亦關於以前述至少一種之硫酸化寡糖封人類或其它溫监動锪患者進行抑制血管生成，抗轉移和/或抗發炎治療之藥劑的製筒ύ 除it之外，本發明亦提珙了抑制血管生成，抗轉移和 /或抑制發炎治療的築學或獸發藥组成物•其包括至少一種如前所述之碇酸化寡糖，以及藥學上和猷8薬上可接受的載體或稀釋繭。經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 I------- — —il — i- I I 1 I I I , — I I* l (請先閱讀背面之注帝？事項再填寫本頁) 這些治療组成物的配製為習於肚領域之人士所熟知適合的藥學上或獸醫藥上可接受的載體和/或稀釋劑包括任何及所有傳统的溶劑，分敗介質，填充劑，固體載體，水溶疲，塗層，抗细菌和抗徽菌劑，等張及延遲吸牧劑等等。於藥學上和獸翳藥上之活性物霣中，使用這些介質和試頷的方式為此門技術中的習知方式，並且在 Reaington 翳藥學（第1S版，M a e k 岀版社，質西法尼亞•美國）中K簧施涡來說明1除了與活性成份不相容的傳统介質或試劑外，本發明於_學組成物和獸B藥組成物中，使用可相客的介質或試劑其它活性成分亦可包含本發明之組成物 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210« 297公爱） ...> 446 71 〇 A7 B7 五、發明說明（1) (請先閱璜背面之注意事項再填寫本頁> 组成物可合宜地配製成眾位劏量的肜式，R便於疵用及劑量的均一化。此處所採闱的單位劑董形式偽指實體分離的單一劑量，用以治療人類或動物患者；每單位包含了定量的活性成分，這些量的活性成分與_學或戢S藥載體和/或稀釋劑温合時，坷提洪預期的治療效果。本發明之新穎單位劑量胗式的規格直接地取決於（a)活性成分的獨 _特性及所想要達到的治療效果，以及ib)此門技術中，合成用於特定谄療之活性成分的原有限制。本發明之磺酸化寡糖可周於治療與血管生成有闢的疾病，S括與固體瞜廇，增殖性視網膜病和風潟性闥節炎有鼹的血管生成疾病，並且可用於治療炎性疾病，以及在硫酸化寡糖之乙醯肝素钃抑制活性可特別有效地抑制白血球浸入的症狀，包括主要關鍵為白血球浸人的慢性炎性疾病如風濕性闥節炎，多發性硬化，與胰烏素有關的糖尿病，腸炎疾病如漬攝性结膳炎及Chron’s病，同種異體移置病 (ai 1 ΰgr af t re j e c t i〇n)以及慢性氣喘經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在本說明書中，除非文中提到，否則” S括”一詞係指包括了所陳述的事韧，但亦未將任何其他事物排除在外，發明詳述本紙張尺度適用中國國家標準<CNS)A4規格（210x 297公釐） ;>(446 7 1 〇 Α7 _Β7__ 五、發明說明（> (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 如前所述，本發明偽關於碩酸化寡糖以及其作為抑制血管生成，抗轉移和/或抗發炎劑的周途。部分寡糖可來自天然來源，隨後可進行硫酸化，然而，迫切需要的是合成一定越畏和立體化學之募糖的藺單程序，本發明提供了由藺單的起始物質有效率地合成和分離六碳糖之寡聚物的改良方法，其中這些寡聚物的糖單聚锪i系以1—3,14 4和14 6鐽連接。本發明製備六碳粳募聚物的方法與K往可獲得高產量糖寡聚物之製酋方法形成強烈的對比，寡聚化的程度可容易的控制並且由本發明之方法衍生而得產物為均勻的線性寡聚物，其可使甩荫單的層析技術來分離和鈍化。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在許多科學和專利文獻中，可發覺許多製镅糖聚合锪和寡聚物方法的例子。例如，在一常用的程序中，未改& 的糖單聚锪，不管是軍獨存在或於溶劑中，可於催化劑存在下邡熱，以獲得具有不同化學鍵（22,23)之分支和線注聚合產物。另一種於陽離子交換澍脂（24)存在下熔化糖 S勺方法亦可獲得高分子量高分支的聚合物。在這兩種洌子中，在每一聚合鍵形成時伴隨有一分子水的損失。另一種習知逐步聚合法的例子涉及Koeings- Knarr反應的使用，其中於位置丨含有非羥基（如漠或氯原子）且於其ί也糖 -1 2 - 本紙張尺度適用中國固家標準（CNS)A4規格（210 * 297公釐） Α7 4 46 7 1 〇 __Β7____ 五、發明說明（U ) 羥基上含有保護基（如乙醯基）的糖，與其他糖U4) 的羥基在位置1反應。在這些方法中.於聚合鍵形成時會損失不為水的分子，如H8r。這些製海寡糖的方法是冗搔的，需要製備複雄的起始物質並且整體上僅獾得差勁的產量（25)。在類似方法中，眾所皆知地，於碳δ位置含有一级酵基，於位置2,3,4上含有氧-保護綦（如乙醢基）以及於泣置i含有離去基如溴的己糖，特別是在催化劑如氧化鍍的存在下.會自我冷凝為1,6鐽结的聚合物；在逭方法中，可由1-溴-2,3,4-三-氧-乙睡基- a - D -葡萄糖中製儀一系列的觼臈獼精：然而，因在分子内组合作時，會彤成1,6 -無水->3 - D -葡萄糖而使得寡糖的產鼉降低；二聚物和三聚物的產量並不理想U4X)和 (22S),四聚物和五聚物的產鼉更差（不到5X)並且分離六聚物的產量僅為 U (28)。最近的文獻描述了 i,6-鍵结-点-哺糖基軍元 U7)和D-菌葡萄聚耱（28)聚合锪的化學合成，其傜無水糖的開瓖聚合反應而製餚。此方法必須花相當大的工夫去製腾無水糖起始物質，並且無法證實，即使在例如 -so t下進行反應，可很容易的製儀寡糖。另一種方法係進行 ί , 2 , 3 , 4 -四-0 -乙醯基-召-β -前萄糖之酸催化 -13- 本紙張尺度適用中®國家標準（CNS)A4规格（210 x 297公釐）閲讀背面之注 !袭訂經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 446 7 1 〇 A7 B7 五、發明說明（7) — mm — — — —— — if — — — — — (請先閱讀背面之注意事'«再填寫本頁) 熔解反應，从製備1,6’-鍵结的募糖乙酸_溫合物，其於去乙醢化及層析之後，可顯示其大部份為軍糖及二糖，亦即葡萄糖（15%),左旋聚铺萄糖（U)和艇腰乙騸（162), 當寡糖產量相當低時，特別地為龍膜丙睡（42)和雎釅丁醣（Q.SS )(23)。此方法在下文中將再詳述（30)並且雖然聚合產物的產量有稍微改善，但所想要的寡糖的產量仍是相當的差c 因fc, 從文獻中可看出.雖然已有許多製備多數寡糖的方法，但到目前為止，仍未有從容易取得且便宜的起始物質高產量地合成均霣寡糖的方法出現。在芫成本發明通程中，本發明者發現了一種可由容易取得且便宜的起始物霣高產置地合成六砒喃寡糖的方法。在這方面，本發明提供了一樓製儷六吡哺寡糖的方法，該方法包括於降懕下，路易士酸或其他催化爾的存在下，加熱於鈍性溶劑中的己糖乙醢鹿或其他酯衍生物。經濟部智慧財產局員工消费合作社印製根據此方法，衍生後的六碳糖，包括（但非限定）葡萄糖，甘鼉糖，半轧糖，阿卓糖，塔羅糖，古羅糖.艾杜糖和阿洛糖的1,2,3,4-四-氧-乙醞衍生物的寡聚合可於控制情況下進行，Μ獲得氧-乙醜化己糖寡糖.在這方法中，寡聚合（鍵長）的程度可藉由控制i聚合反 -14- 本紙張尺度適用t囲國家標準<CNS)A4規格（210 * 297公釐）

.- - - —y· _，ι I ·| ι.·ι _丨》— ·ι，_ __ · ， » Η I I ，. I _ : I ’，丨 _ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4d6T1 0 A7 ___B7 五、發明說明（\3) 應進行的溫度K及改變反懕進行的時間來控制。在寡聚合反應之後，粗混合產物可進一步的乙醚化，Μ使得寡糖剰下的游離羥基乙醯化。乙醯基可吸牧紫外線，窜助分光光度計於寡糖從柱中洗淨時，分辨乙酸化寡糖。乙酪保護基亦甩從募糖混合物中移除，並且可依大小，Μ膠濾層析法來分離所獲得的寡糖。在本文中所描述的例子中，硫酸化寡糖被分離並個別地Κ納鹽形式使用。可了解地是，其他葯學上可接受鹽. 如眄鹽或葯學上可接受的胺鹽可被分離，並Κ相同的方式來使用。因此，本文中所提及的醗酸化寡糖”包括了硫酸化寡耱的納盥或其他葯畢上可接受鹽。本發明進一步的特激於以下的實施例中有更完整的描述。然而，必須注意的是這些詳细的敘述僅為證霣本發明，而並不是將本發明限定在所描逑的範围中3 實施例 1,2和3 Μ本文中所揭示的新穎方法來製備合成募糖，實施例 4,5和 6說明了募糖的硫酸化過程，實陁例7說明了疏酸化寡糖作為抑制血管生成•抗轉移和 /或抑制發炎劑之搿途（於S施例1和2中，”ND»表示”未決定”。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） — — — — — — — If! i— — — — — — ^·]ιιι)( — * (請先閱讀背面之沒意事項再填寫本頁)

dd671 〇 A7 B7 五、發明說明（A) 圈式簡簞說明在以下的圖中：第1圖顯示麥芽己糖碇酸鹽對人類活體外血管生成的效果。上圖為對照血管生成在開始培養14天後的數位影像。下圖顯示了於20微克/毫升麥芽己糖存在下的血管生成。第2圈顯示了不同濃度之麥芽醣硫酸發（口），麥芽丁醣疏酸鹽（〇)和麥芽己豳硫酸盥（_ )對人類活體外血管生成的效果。甶血管生成之數位影像所獲得的資枓為開始培養後丨4 天的反懕。每一數值為均值士標準誤差（n=4)。第3圜顯示了從Pichia hoUUi而得的硫酸化甘露戊醣磷酸鹽，在不同濃度下對人類活體外血管生成的效果。由血管生成之數位影像所獲得的資科為開始培養後 19 天的反應。每一數值為均值土禰準誤差（11 = 4)。第4圖顥示了不同鰱畏之皈酸化麥芽寡糖對老鼠乳腺癌13762 MAT的轉移效用。對照組動物於寡糖不存在下接受13762 ΜΑΪ细胞。A組動物於注射腫瘤细胞時，於靜脈注射每棰化合物2輋克。B組動物於注射腫瘤细胞時，皮 -1 6 - 本紙張尺度適用t國國家標準<CNS)A4規格（210x297公S ) (請先Mlt背面之注意事項再填寫本買> -I 1^^ * n I I n 一^- ϋ κ ϋ ϋ ϋ I 線，經濟部智慧时產局員工消費合作社印製 \ ί Λ 4 6 7 1 0 Α7 Β7 五、發明說明（〆）下注射每植化合韧4毫克，垂直柱代表平均數的標準誤差 ·:， (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 第5圖為對不同鍵長之硫酸化麥芽寡糖抑制细胞表面之硫酸乙醢肝素與 BALB/c 3T3细胞之结合而使得 aFGF 固定之能力的評估。不游雄的 3T3细胞M Rose Bengai 染色法並於540 η· 下測量染色吸收度而董化。不同麥芽糖寡糖的硫化程度列於表2。第6圖顯示了不同醗酸化程度之麥芽己睡硫酸鹽抑制老鼠乳腺癌13762 MAT之轉移的能力。X軸的數字代表砠酸鹽基團/麥芽己醣分子的數目。對照组動物於化合物不存在下注射腫瘤细胞。於注射腫瘤细胞時，Κ靜脈注射法注射2毫克/老鼠劑量的寡糖。垂直柱代表平均值的標準誤差。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製第7圖顯示了不同數目硫酸盥基團 /分子之要茅己餹對人類活體外血管生成的效果。於2GQ徽克/鸯升濃度下加入募糖並且於無血漘介質下進行分析。於含血清 (20¾ FCS)或無血清（無FCS)介霣的S驗中，可S察到類似的血管生成反應。麥芽己醣最多可包括20涸碩酸锂分子。四次測定的数據為平均埴土標準誤差。 -17- 各紙張尺度適用中國困家標準（CNS>A4规格（210 * 297公釐）經濟部智慧財產局員工消费合作杜印製 4467 丨 Ο Α7 ____Β7 _ 五、發明說明（第8圖顯示了含有不同甘露釀的硫酸化寡糖對人類活體外血管生成之效果。括弧內的數值代表寡糖硫酸化的ί 。於20U微克/毫升滬度下加人寡糖並旦於含有血潰的介質存在下進行分析。四次測定的數據為平均值土標準誤差ϋ 第3圈顧示了不同鍵長之硫酸化甘露醣幕糖對老鼠乳腺癌13762 MAT轉移的效應。對照組動物於寡糖不存在下注射1 3 7 6 2 MAT细胞。受治療動物在靜脈注射腫瘤细胞之後立即於皮下注射 2罨克（A)或4毫克（B)之每種化合物。垂直柱代表平均值之標準誤差。第lfl 圖顯示了不同鐽畏之碇酸it半乳糖和葡萄糖募糖對老鼠乳腺癌13762 MAT轉移的效懕。括®内的數值代表寡糖之硫酸X。對照组動物於寡糖不存在下注射1 3 7 6 2 HAT细胞。受治療動物在靜齦注射腫瘤细胞之後立即於皮下注射2毫克之每種化合物。垂直柱代表平均埴之摞犟誤差。實施例1 甘兹糖寡糖之製辟方法如下：將1,2,3,4 -四-氧 - 乙醯甘露糖（3 1) (1 5 . (3 克，4 3牽莫耳）和氛化鋅 -18- 本纸張尺度適用+國國家標準（CNS〉A4規格（2J0 X 297公釐） n n I ϋ 1 Jt n n t n n f n n 1 I 線 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁> 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製

Vl 446 7 1 Ο Α7 Β7 五、發明說明（4) (1.5 克）於四甲if通（7奄升）中充分的温合，於約 11 ϋ t：及降壓的情況下，加熱並攪拌混合物6小時；接著硬化反應物團塊並停止產生蒸氣（醋酸）。在整個反應過程中，驗石灰管偽置於反應容器和冥空源之間，謀反應物自然冷卻並將部份反應混合物（11.Q克）溶解於無水啶（20鸾升）中，再於此溶疲中加人醋酸酐（2毫升），此混合物由常壓濕氣所保護，再於約 50 X：下，加熱並攪伴兩小時。冷卻後，加入乙酵（1〇毫升）並靜置温合物兩小時。於降壓下蒸發毗啶，乙酵和所生成的醋酸乙海， Κ水密集的沖洗殘餘物，Κ去除氛化鋅•四甲撐®和吡啶，將殘餘栩溶解於二氯乙烷，再Κ水沖洗並將有檄層經無水睫酸納乾燥。藉由將二氛乙烷溶疲應用至矽膠60U3Q克 )的短柱（4X4Q 公分）中，Κ氛仿洗提再Μ丙_洗提而將衍生募糖分為兩®分豳部份。先以氛仿洗提可獲得含有 3至5軍位甘兹糖之完全乙醢化里糖和寡聚物的混合物（溫合物Α)。接著以丙醑洗提可獲得每分子含有 6至12 睡甘露糖里位之完全乙醢化募聚物的温合物（溫合物Β) Ο 將混合物AU克）應用至堆叠有滑石级矽膠（Η)的柱（3 . 3 X 1 3 5公分）。Κ丙_ /石油醚（沸點6 0 - 8 0 t )洗提該柱，丙酮/石油醚剛開始的比例為1:5並慢慢提高丙醑的百分比直至1 : 1的比例為止。浞速〇 · 5毫 -19- 私紙張尺度適用中理國家標準<CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 I ------------------訂--- ------1.. (請先閲讀背面之注意事·項再填寫本頁) ,-挪..箏私為 446 7 1 0 A7 B7 經濟部智慧財產局具工消费合作社印製五、發明說明（θ) 升 /分，藉由收集適當的分豳部份（由矽膠滑石分析，決定）並於降壓下去除溶劑，可獲得S完全氧-乙酸化甘露糖寡糖la至Id如下（η為甘露糖殘基數目；產霣，分子旋光度（C = 2, CHC1 )):la (3;0.7 克，4.2SS, [ α 】 =+ND) ; lb (4 ; 4 . 1 克，8.4%, [ α ] = +50); lc(5;1.2 克，7·3!ϊ· [ α ] = +47.3); U(6;0.8 克，5.22·[ α ] = +36.0)。溫合物B(7.fl克）以類似於混合物Α的方式進行層析，但剛開始的洗提液成分為丙醑 /石油醱（沸點 60-80 V ) 4:5,並將且丙酮的百分比逐漸提升至 100X。以這種方式可獲得完全氧-乙醢化甘兹糖寡糖Id 至如下（η 為甘兹糖殘基數目；產量，分子旋光度 (C = l, CHCL3}):ld (6:1.6 克，lfl.4X, [ a ] : m); le (7:3.2 克，21.23：, [ ct ] = + 50.0) : If (8; 0.5 克· 3 . 4ϊ , [ α ] = +4 7.0 ) ; 1 g ( 3 ; 0 · 7 克，4 . Π , [ α ] = + 5 3 } ; 1 ii (1 〇 ; 〇 . 3 克，5 . 7 2，[ cc ] = + 5 4 ) ; 1 i (11; ¢). 0 2 克，0. 1¾, [ oc ] = +UD) ; lj(12;0‘G3 克，0.2：?, [ α I = + N D) ΰ 將化合物1 a (1 . 5 5克）溶解於無水乙酵i 4 0毫升）中並於室溫與攪拌情況下加人 1H甲醇納（8.6奄升）。過《掉所得到之沈狼物，以甲醇徹底的沖洗.接著乾煉。 Μ元素分析（CHN值與預期相差土 U),由®嗔霧質譜測定（Η 5ίΗ)和核磁共振光譜可測定出產勸 (2a; 0 . 61 克 -20- 本紙張尺度適用中0國家標準<CNS)A4規格（210 X 297公釐） — — — — — — — — — — — — — ·1111111 «— — — — — — I— I ^ <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) '446 7 1 0 Α7 __Β7_ 五、發明說明（νΐ > ,7〇ϊ, I α ] = +72 ΰ )為甘露丙醣。以類以方法處理寡聚物ib至lj,可獲得如下的甘露糖寡糖 U為甘蕊糖殘基數目；乙睡化衍生物的產率 S, 分子旋光度 (CM, H 0)): 2b, (4:75¾. [ a ] = +78 ° );2c, (5;S5X, [ ot ] = +80 ° ) ;2, (6;3S5：，[ ct 1 = 84 ° );2e,(7;S8SI；,[ cc 丨=δδ·3 ° );2f.(8;m[ a ]=+9S. Q ° );2g, (9；99X, [ a ] = +106 。 );2h, (lfl;99X, [ a ]= +l〇〇 · ) ; 2i , (11; 98X , [ a 1 = ND);2j,(12 ; 98X, [ a ] = ND)。 <諝先閲讀背面之沒$項再填寫本頁) 離分式方析層 0 過膠由经可糖寡糖10 兹1 甘約些於這由藉可此因

下應降 P 热加式方述如以經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 -四-氧-乙醢甘露糖（15 ·0克，43蠢萁耳）及氛化辞（1,5克）於四甲撐通（7毫升）中的充分攪拌混合物6小時。自然冷卻反應混合籾並加入水（50毫升），於室溫下攪伴反應混合物5分鐘並將水層倒掉。重覆沖洗過程，接著將團塊溶解於氯仿中，Μ水沖洗並經無水礙酸鈉乾煥。過瀘之後，於降壓下去除氛仿，可獲得粗乙醯化寡糖温合锪（11.3克）。將該混合韧溶解於異丙酵（20 毫升）及甲酵（¢30毫升）中，接著加人 1M於甲酵（8 鸯升）中的甲爵鈉並於室溫下猙置温合物1小峙。過Μ 掉所獲得的沈澱並Κ甲醇（30鼍升）沖洗兩次。在乾燋之後，將反應温合物（6.5 克）應用至精綑級 Ρ2 膠 -21- 本紙張尺度適用中國S家標準<CNS)A4規格（210 X 297公釐） V 446 7 1 ο Α7 ____Β7___ 五、發明說明（r〇) (請先W讀背面之沒意事項再填寫本頁)

UioRad)膠濾柱（套層；5 X 3 0公分）頂端，該«柱係以水（流速為每分鐘 Q.5華升）於6Qt：下運作2天來穩定。以水於¢30 TC且流速為每分鐘0.5毫升下，洗提 '滅往。甶差別折射分析可辨視波峰為由柱中洗提而得的產物，並且可因而收集分餾物=以這種方式可收集對應於11 個分開峰之區域的分餾物。每一分餾物於60 t：,相同的 P2膠柱中再層析，並於Q.5毫升/分流速下以水洗提。因此，對第一次膠濾所得到之甘兹戊醣的分餾物再層析，可獲得兩邊各有一属部的中央峰。藉由在降壓下除去水而分雔於中央峰洗提的產物，藉此可獲得0.5克的物質，該物質於60 C, 0.3毫升/分的流速下，在相同的 P2膠柱中再進行再曆析。由上述方式可獲得興前述2c相同的甘霣戊 _ (Q.3 克）。霣测值 C38.4:H6.7, C Η 0 *

8Η0理綸值C33.5: HS.35：。氮的S涵值及預期值均為（U Ο 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 M HP LC可發現該化合物大致上是純的。可由结構如下的Dionex HPLC系統來決定：柱：Code - CPMAi#12 3i ( + guarciinn2)。季菝雜子交換柱 0 深測器：電化學探測器（ED40: IAMP) -22- 本紙張尺度適用中國B家標準（CNS>A4規格（210 X 297公a ) 446 7 1 0 經濟部智慧財產局具工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（4) 流速：1毫升/分溶劑：溶疲 Α: 0·1Η NaOH 溶液B : 1Μ醋酸酷於0 · 1Η N a 0 Η中成份：蒔間（分） % k % B 動作 0 9 5 5 洗提 2 0 9 0 1 0 洗提 2 5 0 1 0 0 洗提/沖洗 3 0 0 1 0 0 洗提 /沖洗經電嗔菝質譜測定顧示該化合锪之Μ質量為828 , SP 甘露戊豳之正確分子量。从類似方式.可分離與前述2a, 2b, 2d及2e相同的甘露丙騮，甘兹丁醣，甘露己醑和甘露戊醣。货施例2 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -- -------I裝--------訂.--------線 (請先Μ讀背面之ii意事項再填寫本頁) · .-¾: ·： ,ι3^η.·受 44671 0 經濟部智慧財產局員工消费合作杜印製 Α7 Β7 五、發明說明（α) 本簧施例顯示了於較實施例1為低溫下進行聚合反應的效果。除了於9 0 t：下進行聚合反應8小時不同外，採兩與實施例所述製備甘露糖寡糖相同的方式聚合 1,2,3,4 -四-氧-乙趄葡萄糖，可獲得葡萄糖之寡糖。依霣施例1的方式處理反應溫合物並Μ柱狀層析來分離產物，其中該柱（7公分X 155公分）為堆叠滑石级的矽膠（Β ) 。採用類似於實施例 1所述的洗提法，可製備完全氧-乙皤化的葡萄糖寡糖 3a至3e如下（η為葡萄糖殘基之数目；產量，分子旋光度（C = 2, CflCi )): 3a (3;4·14克 ,24.9Χ, [ a ] = +37.5。）； 3b ( 4 ; 2 . 32 克.18.42.[ α 3 = +44 β ) ;3c(5;2.99 克cc ] - +37.5 );3d(3; 1.37 克.3.33：, [ ct ] = +36 ° ):3e(7:0.18 克 ,1.2¾. [ α ] = +33 ° )。將化合物3aU.O克）溶解於無水甲醇（30蠹升）中並於室溫下加入1M甲醇納（5.5毫升）。過Μ掉跅獲得的沈澱物，以甲酵充分地沖洗，接著乾煥。由元素分析，電噴蓀質譜测定（Κ + = 504) 及核磁共振光譜溷定，可辨視產物（4a;[ct 】 = 63·5° )為葡萄丙醣。以類Μ方式處理寡糖4b至4 e,可獲得Κ下的葡萄糖（η為葡萄糖殘基的數目；產率 I 分子旋光度（C = 2, H20) ) : 4b (4;85ϊ, la ] = +83 ° }: 4c (5;90S, [ α ] = +84 -24- 本紙張尺度適用中困a家榡準（CNS)A4規格（210 x 297公* > --------I----- I I I I - I - --------- <請先！5讀背面之注意事·«再填寫本茛) 唓峰鼸 “ 44671 0 A7 B7 五、發明說明（y) ° );4d(6;g〇X，[ ct ] = +86 。）； 4e (7; 89Ϊ, [ Cf 1 = + 92 ·5。 }。這些葡萄糖寡糖可以膠濾if析方式分離。因此，於 U〇降壓下，加熱经充分攪拌之1,2,3,4 -四-氧經濟部智慧財產肩員工消費合作社印製 -- - - - ---l-t — I I - . I I I I I I — 1 — — — — · <請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁》 - 乙醢葡萄糖（15.ϋ克，43毫莫耳）和於四甲撐® (7 毫升）中之氯化鋅（1.5克）的混合物6小時，可獾得乙醚化葡萄糖寡粳混合物。將反懕物溶解於二氛甲烷中， Κ水沖洗，再經無水硫酸納而乾換。於降廑下去除二氯甲烷，將產物稱重並溶解於異丙酵（20毫升）和甲酵（6Q 毫升）中，接著加入於甲酵（3毫升）中的1Μ甲酵納，譆混合物於室溫下靜置1小時。過瀘掉所獲得的沈澱物並 Μ甲酵（30毫升）沖洗兩次。將部分温合物（7.6克）溶解於水（10 毫升）中並應用於堆ft有糈细级 P2膠 (Bio Rad)的5X3G公分水套層之層析柱。在層析柱使用前堆叠、預熱並於6DT：下運作兩天。在添加葡萄糖冪糖混合物之前，維持柱於 6〇υ下並K水（1毫升/分）洗提。由差別折射分析可辨視波峰為由柱中洗提而得的產物，並且可因而收集分餾物。Μ這種方式可收集對應於10涸分開峰之區域的分餾物。每一分餾物於60 相同的Ρ2 膠柱中再層析，並於ϋ.5毫升/分流速下以水洗提。因 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 « 297公釐） · .ή二二以其兑說,,雖麻释_級_恥嫌·；^ 44671 〇 Α7 五、發明說明（外）此，對甘兹戊醣（G.59克}的分餾物再進行層析可獲得兩邊各有一肩部的中央峰。藉由在降壓下除去水而分離於中央峰洗提的產物，籍此可獲得〇.3克的物質，該物寅於60它，Q.3笔升/分的流速下，在相同的P2膠往中再進行再層析。由上述方式可獲得與前述4c相同的葡萄戊豳（0.2克）。以類似方式可分雜與4a,4fc,4d和4e 之葡萄丙葡萄丁睡，葡萄己豳和葡萄庚醣。實施例3 其他六碳糖之冪糖包括半乳糖，阿卓糖，塔羅糖，古羅糖，2：杜糖和阿洛糖，可由實施例1和2所掲示之方法製餌。洌如，半乳糖寡糖可K下列方式來製備：於四甲撐 (10毫升}中充分地溫合1,2,3,4- 四-氧-乙醢半乳糖（21.0 克）和氮化鋅（2. 1克），於約90 t ,降壓下加熱並攪拌混合物1 7小時；此時反應物已硬化並且蒸氣（醋酸）已厣止產生。在整画反憨過程中，反懕容器和異空源間置有鹼石灰菅。讁反懕混合物自然冷卻，接著將反應物溶解於二Μ甲烷，稱重產樹並將其溶解於異丙酵（30罨升）和甲酵（70牽升）中，接著加入於甲醇 (10 髦升）中的1Μ甲酵納，將混合物於室溫下靜置 1 -2 6 - 本紙張尺度適用中國國家標準<CNS>A4規格（210 X 297公* > <靖先閲讚背面之注意事項再填寫本頁) --裝--------訂---------線. 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 446 7 1 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消t合作社印製五、發明說明（〆）小時。過逋掉所獲得沈澱，並以甲醇（3 0毫升）沖洗兩次。Μ如實施例1和2所述對甘露糖和葡萄糖聚合物的膠班暖析法來分離混合物。由差別折射分析可辨視波峰為由柱中洗提而得的產锪，並且可因此收集分餾物。Κ此方式可收集8份分餾物。這些分餾物的7份於6QX：，相丨司的Ρ2膠柱中再歷析，第一次並於 Q.5毫升/分溁速下，Κ水洗提，第二次流速則為0.3毫升/分。Μ此方式可獲得如下之半乳糖寡糖：半乳丙酿，1.03 克，5.3Ϊ; 半乳丁醣，1· 15克，6 . QX; 半乳戊醣，1.21 克，6.32; 半乳己醣，4.26克，22.1S; 半乳庚醣，2.11 克，1U; 半乳辛醣，1.31克，9.9Χ Κ及半乳壬醣，Q.08克，（KU 實施例4 於 80 1C, 在三氯化硫-砒啶錯合物（Q.8 克 )(Aldrich}於翮蒸餾之DHF(1毫升）的溶疲中，逐癱加入甘31戊醣（2CMQ.1克）於無水吡噬（3鼍升）的溶液中.接著再於S fl °C下加熱3 0分鐘。在上層清液仍溫熱下傾析，再Μ甲酵（2牽升）充分地冲洗黏稠殘餘物三次。在傾析甲醇殘餘物後，將產物溶解於水（5毫升）中並Μ醋酸鋇（約0 . 4克於2毫升水中）於激烈报伴下中和（至Ρ Η值約為G )。在離心（3 0 0 0 X g)之後，潷去 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS>A4規格（210 X 297公釐） -------------裝--------訂， (請先Μ讀背面之it意事硝再填寫本頁) ΙΒΙ| ¥ 44671 〇 A7 B7_ 五、發明說明（A) <請先閱讀背面之泫意事碩再填寫本頁) 並保留上層清菠·再Μ水（3X10毫升）徹底地沖洗碇酸鋇沈澱。合併保留上層清液與沖洗物並將其置於 D0WEX 50W- XS - 4 0 0鵾離子交換樹脂（Η形式）的柱（1·0Χ14 公分）上。以水洗提該柱，直至洗提物圼中性。攪拌洗提物（約50毫升）並Κ醋酸鈉（〇·7克）中和（至PH 為 7)。Μ丙嗣（2Q0毫升）稀釋溶液並難心（I750xg) Μ分離產物。於甲酵存在下將反應物丸磨成细粉狀，接著仍於甲酵存在下攢拌並過濾掉。以甲酵沖洗固體數次，可獲得鈍 ί無搪無豔）化合韧（0.2克，66¾)。產物並未受鋇離子（经由微量分析和火焰皤子化而得）或氮（激量分析）的污染。所獲得產物，磺酸化甘兹戊釀，在17 個可能硫酸化的位置有II個碇酸化。實测值C14.2;fl3.fl;S14.1;Na7.3 。C Η 0 S Na 38 H20 理論值 C14.1;H5.2;S13‘8;!Ja7.23! 。氮和鋇的實測值和期望值均為經濟部智慧財產局Μ工消费合作社印製實施例5 在無水氮氣環境下，於三氧化硫-¾啶（Aldrich化學公司）（4克）於無水DO(5 毫升）的混合物中加人無水吡啶（10毫升），溫熱混合物至50 1C並且於葡萄己糖（4d)(G.5克）（以寅腌例2所述之方法所分離出來者 -2 8 ~ 本紙張尺度適用中國a家標準<CNS>A4規格（210 X 297公釐） 446 7 1 Ο Α7 Β7___ 五、發明說明（A ) (讀先Μ讀背面之王意事項再填窝本頁) )—次加人時，快速的攪伴°再加人額外的at® (5毫升 )並於80 t：，連續攪拌下加熱混合物90分鐘。將反懕混合物置於4 Γ下過夜。從反應容器中傾析加人甲醇（3毫升）並且分解半固體，再以•甲酵充分地混合。在毽定後，傾析甲酵並重覆該程序°於殘餘固體中加人水（5 毫升）並將所獲得溶液置於5G罨升測試管中，再Κ水 (5 毫升）沖洗反應容器.再與第一次的溶液合併。Κ 40Ha0H將所獲得溶疲之ΡΗ調整至約7-S,接著加入甲酵（4G毫升）。離心（3Q0Qxg)所獲得之温濁溶疲25分鐘，並由沈澱物中傾析澄清溶液a再次將殘餘固體溶解於水（10¾升）中，加入甲醇（4β毫升），再離心試管15 在葎去澄濟上圈溶劑後，將固體溶解於水（10罨升）中，再流經 Ρ2膠脫鹽柱 U . 5公分X 2 5 0公分；精细级Ρ2 膠 Bio&act),可獲得預期之硫-1, 6 -葡萄己睡之硫酸化衍生物的納發4

實拖例S 經濟部智慧財產局員Μ消费合作社印製雖然簧葩例 1,2 和.3掲示了六碳糖均聚物的合成，但通常去合成多數的寡糖结梅仍是相困境難的。因此，較簡眾的方式為從天然來源中疏酸化所指定结構的冪糖。在本實胨例中所使用的天然寡糖產物有兩種等級。第—级的寡糖不需要進一步的降解及分餾。這類寡糖的例子為麥芽 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準<CNS)A4規格（210*297公« > ,ί4 4 46 7 1 〇 Α7 --------—_ Β7 _ 五、發明說明（>2 ) <请先閲讀背面之沒意事項再填寫本頁) m*植物蜜糖和菜豆糖。第二级寡糖包括由自然生成多糖糖，這些多糖偽經由酵素或化學方式部份降解得。這類冪糖的例子包括多醣類，軟贵膠和菌葡萄聚糖所衍生的寡糖以及來自酵母菌 Pichia holstii的甘兹戊_碇酸強。 ^ ^ Μ , 植物蜜糖和菜豆糖係向聖路易的西格瑪化學么\司所I»賈。麥芽丙睡，麥芽丁醣，麥芽戊睡，麥芽己釀和麥芽庚醣係來自日本東京的 Seikagaku,其為由α 1-4 糖均聚物，多醣之部分澱粉酵素消化而純化的募糖ΰ耽骨膠丁己-和辛糖像如前述（32)，對牛睪丸玻尿酸酵繁潸化之軟骨膠-6-硫酸盥進行膠瀘分皤而纯化。環己庚-和辛糖來自西格瑪公司。這些寡糖可依實施例5所逑之方法硫酸化。經濟邨智慧財產局員Μ消f合作社印製麥芽己醣硫酸鹽偽Μ下列方式來製備。於80勺，在三氧化碕-吡啶錯合物（4.0克）（Aldrich)於顒蒸豳之 DMF(5 毫升）的溶疲中，逐滴加入麥芽己睡（0.5克）於無水吡啶（15鸾升）的溶疲，並於80亡下，進一步加熱所有溶疲 31)分鐘。在上層清疲仍溫热時傾析，並以甲醇（10毫升）徹底的沖洗黏稠殘餘物三次。在傾析甲酵殘餘物後，將產物溶解於水（15毫升）中，並Μ醋酸鋇（約2. Q克於10毫升水中）於激烈攪伴下中和（ -30- 本紙張尺度適用中a國家禅準<CNS)A4規格（210 X 297公釐） 4 446 71 Ο Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明) 至PH值約為6)。在雄心（3000xg)之後，傾析並保留上層疲體，再以水（3X1D毫升）徹底地沖洗硫酸鋇沈*8。合併保留上層清液與沖洗物並將其置於DOWEX 50Ϊ - X8 -400陽雛子交換樹脂 U彤式）的柱（2.5X14公分）上。以水洗提該柱，直至洗提物圼中性，攪拌洗提物（約 2 5 0 毫升）並K醋酸納（3·5克）中和（至PB為7) 。以丙嗣 U升）稀釋溶疲並雜心（175Qxg)以分雄產物。於甲酵存在下將反應物九磨成细粉狀，接著仍於甲醇存在下攪拌並遇濾掉。Μ甲酵沖洗過濾物數次，可獲得纯（無櫬無鹽）化合物（Q.S8克；552)。產物並未受鋇雕子（經由激量分析和火焰離子化而得）或氮（徽霣分析）的污染。該產物在20個可能硫酸化的位S有 14儷位置疏酸化。實測值 C13.9，H2.2;314.3;Na6.7X。C Η 0 S Na.45 Η 0之理論值C13S;B5.1;S14.3;Sa6.63i。氮和鋇之實溷值分別為0.32和0%,而期望值均為0X。由上述麥芽己醣硫酸鹽之 1 HNMR 數據（300 MHZ-Genini 3〇[];參考由TMS而得之丙醑2.25)顯示在 20 個可能硫酸化的位置有 14 個疏酸化。這可由約在 4.15ppa(20個H)與在4.4ppm( 16個H)附近的氫的化學位移來決定。可假設所有主要的ΟΗ基，亦即位置6的 -31- 泰紙張尺度適用中0國家標準（CNS)A4規格（210 * 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . -----— —訂 11-----I ' • 446 7 10 A7 ___B7 _ 五、發明說明（方0) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本Ϊ ) 0H基•因為立體阻礙最少，所K會被硫酸化。可進一步的假設在内部糖殘基中，僅有一涸其他位置會碇酸化。末端糖殘基，除了在位置6上的之外，會有另外兩個位置硫酸甘萏戊睡硫酸鹽係由來自雙染色體酵母菌 Pichia holstii (菌種 ORL Y- 2 4 48 之前身 Hansenula holstii)的外多糖所製锚。P. holstii成畏的方法及甘露戊醣磷酸鹽的分龌係K (33,34)萌述之方法為主。簡言之，粗外多糖像經由乙醇沈澱而從需氣成長的酵母:菌培養上®濟液鉀鹽分離，接著進行酸水解，Κ從外多糖之磷酸甘齑聚糖軍醣核（ΡΡΜΕ)中釋出甘露戊S磷酸鹽。接著以不同的乙酵沈澱和膠過濾將 PPME和甘兹戊明磷酸鹽分別分離成鋇鹽。該寡糖的结構為1)-6-?^11-«-(卜3)-(^11-α -(l-3)-Man- α - (1 -2)Man (34) 0 經濟部智慧財產局貝Μ消费合作社印製以下列方式來製備由酵母菌外多糖中分離的酵母菌甘露戊醣磷酸鹽（33,34)的硫酸鹽。將酵母菌甘露戊豳磷酸盥（G.03克）於13HF(2牽升）和吡啶（3毫升）中之懸浮液加入三氧化礙-吡啶錯合物（Q. 8克）（Aldrich) 於 DHF(1毫升）中的溶液。於SQ 10下加熱該溫合物2 小時。在上層潰液仍溫熱下傾析，再以甲醇（2毫升）徹底地沖洗黏穉殘餘物三次5 -32- 本紙張尺度適用中a0家標準<CNS)A4規格（210 X 297公« > …44671 Ο Α7 ____Β7___ 五、發明說明u\) <請先閲讀背面之泫意事項再填寫本頁) 在傾析甲酵殘餘物後，將產物溶解於水（5鼍升）中 ,並Μ醋酸鋇（約Q . 7克於5毫升水中）於激烈攪拌下中和（至ΡΗ值約為6)。在難心（3000xg)之後，傾析並保留上圈清莪，再K水（3χ1ϋ牽升）徹底地冲洗硫酸鋇沈濺。合併保留上層清疲與沖洗物並將其置於 D〇iiEX 50W - X8 - 400陽離子交換樹腊（Η形式）的柱（2.5 Χ14公分}上。以水洗提該柱，直至洗提物呈中性。攪拌洗提物（的50毫升）並以醋酸納（0.4克）中和（至 ΡΗ 為 7)。以丙酮（150 «升）稀釋溶液並離心 ( 1 7 5 0 xg)以分離產物。於甲酵存在下將反應物丸磨成细粉狀，接著仍於甲酵存在下攪拌並過®掉。Μ甲酵沖洗固鱧數次，可獲得疏酸化之酵母:菌甘露戊醣磷酸鹽（Q.18克）。產物並未受鋇雜子（經由微量分析和火焰雄子化而得）或氮（微量分析）的污染。經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製該產物在 16個可能礙酸化的位置，有10個位置碇酸化。實溷值 C15.35:H2.7;P1.2;S13.7;Sa8.5。C Η 0 PS Na · 2 5 H20 理論值 C 1 5 . 3 ; Η 3 · 5 ; P 1 . 3 ; S 1 3 . 6 ; fi a8.8 X。

氮和鋇的實測值分別為0.1 6Z及QS,期望值則分別為〇Z ύ 1,6 - α - 葡萄糖寡糖係由菌铺萄聚糖（平均分子 -3 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 * 297公釐）經濟部智慧財產局異工消費合作社印製 1 446 7 10 A7 ____B7_ 五、發明說明（量7101)0;西格瑪化學公司）的酸水解而製镅。因此，將菌葡萄聚糖（5克）溶解於蒸豳水（1011華升）中•再 κ 1 μ鹽酸使溶液ρ η值調整至1. s。迴流（1 〇〇 t： y溫合物48小時。於降壓下乾燥混合物，K蒸餾水加至1〇〇 «升，再於降懕下進行第二次乾熥。將無水乙酵 UUG毫升）加人殘餘物中並於降壓下蒸發。於殘餘物中邡人蒸圈水至4罨升，接著加入堆叠有精细级P2膠（BioRad)之 5 X3G公分水套層的層析柱中。在歷析柱使用之前堆叠.預熱並於38 C下蓮作兩天。在加入1,6- ct -葡萄糖寡糖混合物之後，雄持層析柱之溫度在 60 1C.再K水（1 毫升/分）洗提。由差別折射分析可辨視波峰為由柱中洗提而得的產物，並且可因而收集分餵物。以瘥種方式可牧集對應於分開峰之區域的分餾物。每一分皤物於60 t：, 相同的P2膠柱中再層析並於 0.5牽升/分流速下K水洗提。因此，對象可辨視出為1,6- α -葡萄己醣（0.19 克）的分餾物再曆析，可獲得兩邊各有一肩部的中央峰。藉由在降壓下除去水而分離於中央峰洗提的產物，藉此可獲得Q.1S 克的物質，該物質於60 C, 0.3毫升/分的流速下，在相同的Ρ2膠柱中再進行再層析。由上述方式可獲得葡萄己醣（0·14克）（電噴兹Μ =390)。 Κ類似的方式可分雄1,6- α -葡萄丙醣· 1,6- ct -葡萄丁醣（0.21克）和1,6- α -葡萄戊醣（〇·17克）。 -34- 本紙張尺度適用_國國家標準<CNS)A4規格（210 x 297公釐） ----— — — In illlln ^--1111111 (請先閲讀背面之it意事項再填寫本頁) .i 4 46 7 1 0 a? B7 五、發明說明（V) 實腌例？ (請先《讀背面之注意事項再填寫本頁> A .物質和方法硫酸化寡糖的抑制凝血活性硫酸化寡糖的抑制凝血活性*係如前所述（35)，利用凝血酵素時間和活化部份凝血質時間兩植程序來測定。兩程序的活性都與肝燐脂對照組比較*抑制凝血活性是K肝燐胞活性的百分比表示。人類血管生成試驗經濟部智慧財產局具工消費合作社印製所使用的試驗方法述於圃際專利申請案第 PCT/AD95 /OGU35號。其内容敘述於下供參考。出生6小時内，從人類胎盤剪下直徑約卜2毫米，長2-5公分血管。血管用解剖鉗和虹膜切除剪刀切成 1-2鼍米县，並放置在含 2.5鼍米/毫升：fungizone的Hank’s BBS，血管段在使用前要清除殘餘血塊•浸在Hanfc’s BBS中。切割血管時 W 放大鏡燈輔肋（M a g g y 1 a m ρ , (I e w b 〇 u π d , B a 1 at a i n . N S W · 漠大利亞）。靜脈和動脈血管都進行血管生成反應試驗* 試驗時，靜脈和動脈血管分開使用。 -3 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNSM4規格（210 X 297公釐） 44671 0 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製五、發明說明（血管生成試驗是以 24 或48 井培養盤（Costan, Cambridge, USA)進行。在24井試驗中，每井都添加30 微升的牛凝血酵素（毎毫升5QNIH軍位於0.15M SaCl; 西格瑪化學公司，聖路易，H0)，然後添加3囊克/毫升 Hediuni 193中的牛獾雄蛋白原（Signa) 1 .0毫升。迅速混合凝血酵素和缵維蛋白*並在血塊形成前放一段血管在并中心。通常30秒即會形成雄维膠，血管段則會懸在醪中〇膠彤成後，每井中加人1.0毫开Medium 199 (含有 20 %牛E胎血清），ίΚ2毫克-胺基己酸，L-麩酸及抗生素（g e n t a a y c i η和 f u n g a ζ ο n e)在4 8井的試驗中，所有用槩體積減半。血管在37 1C的高濕環境中培驀14-21 天，用槩每星期換兩次。血管生成係K電睡影像分析定量。培養物的數位影像是利用裝在反顯微鏡（Olyipus,東京，日本）上的flycaffl數位攝影機攝取，並K SIHIuage 钦體處理。乙醯肝素藺試驗乙醢肝素菔試驗偽覼察血清蛋白，富組胺酸糖蛋白（HRG) 和硫酸乙庭肝素鐽结合，並遮蔽乙醛肝素醑的裂解位置。基於乙醯肝素酶裂解之疏酸乙醯肝素不能和HRGg纟實，乙醢肝素醑試驗係利用3 Η —標記的具有乙藤肝素酸 1 蒙 — — — — — — I! — · * I I i 賺 I I — 1 — ！ — 1 I j (請先《璜背面之注意碩再填S本頁)

44671 〇 A7 B7 五、發明說明（；j<) (猜先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 之硫酸乙醚肝素之攝入，讁硫酸乙醢肝素與HRG偶合珠结合後，再測量未偶合的3 Η。捶入愈多的基質，就有愈多的3 Η標記不掂和HRG珠结合。因此，這種方法可以簡軍快速的測試組織抽出物中乙瞌肝素醑的活性*並評估各種化合物對乙醢肝素酶之抑制。開始時，牛腸的硫酸乙醢肝素在睡肢水合物中加熱* 以部分的去-Ν-乙醢化，然後再用3 Η -醋酸酐重新乙醯化》雞的HRG K Rylatt等人（138U (37)的方法鈍化，再依製造商的說明，與CNBr活化Septiarose 4B(Pharaiacia)偶合。人類血小板肝乙醯肝素酶活性係依K 6GP莫耳3 放射經濟部暫慧財產局負工消f合作社印敦禰E的牛腊硫酸乙醢肝素來培着（37 1C * 30分莆）鈍化的人頚血小板乙_肝素蔺而決定。人類血小板乙醯肝索醱對晾酸乙醢肝素的活性•正如在高度轉移培驀的人體癌 fiCT116*鼠腺癌 1372MAT和鼠黑瘤M6细胞媒的乙醛肝素酶活性。其活性依由較小的（約 5KDa )疏酸乙醱肝素瑰的生產率來決定。這些硫酸乙醣肝素塊在培養温合物（ 100 微升）通過HRG-Sepharose迷你柱（堆叠有20G微升珠）時*可留住較大的未裂解和部分裂解的基質。在乙醯肝素酶仰制試駿中，不同澀度的抑制諝在加入 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） Α7 44671 Ο Β7____ 五、發明說明（>) 放射標記基質前即先加入。抑制劑在整個培蕃期間都留在反應混合物中。 (請先W讀資面之迮意事項再填寫本頁) 轉移試驗各種硫酸化寡糖的抑制轉移活性是利用高轉移性的老鼠乳腺搔1 3 7 6 2 MATU5) 來評估。踵瘤细胞依前述（3 5 ) 置於活體外。雌性Fisher 3 4 4老鼠（IQ-13週大）靜脈注射含 10 % FCS，内有20萬個1 3 7 6 2 MAT 细胞的 0.6橐升RPMI 1640介質。注射腫描细胞時，這些小動物也注射2 S克的硫酸化寡糖，若K靜脈注射、腹嫫注射或皮下注射寡糖亦可獲得類似的结果。腫瘤细脃注射13天後*將老鼠的肺移出放在Bouin溶疲中最少24小時•然後在解剖顯微鏡下評估肺轉移情形》將碇酸化寡糖處理過的老鼠肺轉移數目和對照组的觀察结果作比較，其中每组至少有四隻老鼠。經濟部智慧財產局員工消f合作社印製硫酸化寡糖於FGF -硫酸乙醢肝素作甩中的效果

進行结合試驗（其细節不在fe詳述（38) ) Κ ϋ S a F G F和b F G F與肝憐脂的结合，並評估不同的疏酸化寡糖抑制此種作用的掂力。簡眾地說* FGFs被固定在36并 PVC盤的井中，然後測試放射標記的肝燐腊结合固定庄之 ~ 3 8 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 * 297公釐） 446 7 1 0 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（4) FCFs的能力。在抑制試酿中*亦測試不同稀釋程度的硫酸化寡糖抑制FGF-肝燐胞作用的能力。抑制的结果是K抑制2 0 %及5 Q %肝憐脂结合到固定的 F G F s所需之碇酸化寡埔灌度表示。無欏記的肝燐胞於所有的结合一抑制試驗中偽做為對照组。如（39}所述的FGF-硫酸乙醢肝素作用，係以溷量 BU8/C 3T3鎩維母细胞和用 PVC固定的FGFs之结合來評估。綑胞结合係利用黏埋细胞的Rose Bengal染色偵測。硫酸化寡糖抑制這種细胞黏連的能力也被涵試，這種能力完全決定於 3UB/C 3T3妞胞（33 )表面碇酸乙醸肝素的结構。實驗數摟K可抑制5Q % (1C 50)黏連之硫酸化寡糖濃度表示。氣_炎症模式本測試係以UQ)所述之程序為基礎。第一天在遝麻醉老鼠刮掉毛的肩胛骨間背部的皮下注射5毫并無菌空氣，於老鼠背部形成皮下氣囊。第三天再注射2.5毫升空氣來充氣〇第六天在氣囊中直接注入56毫克/毫升磔甘醇酸鹽1.0毫升或Ι.ϋ毫升鹽水使其發炎。硫甘醇酸盥注射後約1 7 - 2 0小時，動物以子宮頚脫位致死，囊中的细胞則Κ注射2 . 5牽升冰冷P B S / 5 % F C S而取出。注射 -39- 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） J — 瞻 — — — — — — — — — 醫 1 — I I I — — alllljlli <靖先《讀背面之注帝？#*項再填寫本頁) Α7 Β7 |、發明說明（# ) 硫甘酵酸鹽後，立刻在分開的位置皮下注射（5G徴升於 PBS中）碇酸化寡糖，測試其抑制發炎反應的能力。於油中皮下注射（2 5毫克/公斤）作為抑制發炎的用藥的對照組的prednisolone。每一囊中的细胞含里以Coulter 計數器測定·不同的白血球次族群則以免疲螢光流動细胞計數器測里。老鼠氣喘模式硫酸化寡耱抑制由氣®過敏原（卵蛋白索* OVA )所引發的咭伊紅血球浸入肺中的能力係利用（41)所逑之鼠氣喘模式來測試。第 0 天和第 12 天在老鼠 iC57BL/8,6至10通大）腹膜内注射溶於 0.9 %無菌鹽水的 50 毫克 0VA/1 毫克 Aihydrogel (CSL Ltd, Parkville,澳洲）譲老鼠起敏。第24天讓老鼠曝兹於溶於 Q.3 %無菌鹽水的 0VA U〇毫克/毫升）氣溶膠中3次，每次30分鐘，每次間隔丨小時。第26天和28天重覆相同程序。氣溶膠是噴霧氣Μ 6升/分的速度產生平均直徑為30澉米的顆粒進入8D0立方公分的封閉空間。老鼠在第29天Κ子宮頸脫位致死。其氣管用套管插入，氣道管腔於 37Τ：用含 8SA (〇,1 % wt/v〇i)的〇.9 %無菌盥水清洗4 X 1毫 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4规格（210 κ 297公鼇） — — — — —1ΙΙΙΙ1Ι — - I I (婧先閲讚背面之注意事母再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消费合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明up 升。每次沖洗回收約Q. 8鼍升的蒸餾液。將一隻老鼠所取得的支氣管與肺胞灌洗疲 UAL F)收集在一起，並以擷準血球計測量细胞數目。 K May-flrunwale-Gieiisa溶疲進行细胞離心和差別染色，K形態學準則遂別嗶伊紅血球。計翼每蠹升B A L F中嗜伊紅血球的數目。硫酸化寡糖係用插入腹膜的Alzet迷你滲透幫浦注射或K氣溶膠形式進入肺部。迷你滲透幫浦於第23天，0U激發前24小時插入並連鑛釋出槩物，直到第29天動物被置死。在氣溶膠釋放的例子中，老鼠在第23,25及27天曝兹於 0.3 %馥水中的疏酸化募糖氣溶膠中3 0分鐘共3次（間隔1小時）〇簧驗性自體免疫腦脊越災（EAE)模式 EAE之選擇性轉移所用的脾细胞依（43)所述方式準備。簡言之*路易士鼠以髄燐脂鹽基蛋白起敏，免疫脾细胞於活體外M ConA活化，而K3Qx lOConA活化的 EAE效應细胞以靜脈注射到各接受者。含有硫酸化寡糖的迷偌滲逋窜浦（Alzet) 在细胞轉移時植人皮下，並釋出 70毫克/公斤/天的劑量14天。臨庞EAE係依下列概要分级：0，表無®狀；1，表尾巴末稍半弛缓；2，表全部尾巴弛緩，3，表失調，直立有困難；4，表後肢無力* 5 良紙張尺度適用中固届家標準<CNS)A4規格（210 x297公釐〉 ( i I ί I I I illlln ^» — — — —1 — 11^ <請先閱讀背面之ii意事項再填寫本頁》經濟部智慧財產局員工消贄合作社印製 446 7 1 Ο Α7 - _Β7__ 五、發明說明（ *表後肢麻庳。腸炎模式

老鼠的腸炎偽以歆水中加入 5 % (w/v) 由 TdB

Consultanay , Uppsala,瑞典，所提供之菌葡萄聚糖醸酸納（DSS)引發。將溶液的PH值調至8.0並經0.45 ϋ 介質膜通瀘。每日收集DDS溶液，再過逋，並用新鲜DSS 溶液調整容稹。6至7遇大的雄BAU/c鼠Κ體重驊選* 體重在20至23¾克的老鼠則Κ每籯5隻分狙。老鼠從第0天開始到第10天* K 8小時間隔注射硫酸化甘露戊糖®酸鹽（20毫克/公斤/天）或賦彤藥（無菌水）。將注射容積標準化為100微升，並於頸背做皮下注射。所有老鼠的SJSS消耗率，龌重及症犹皆每天記錄*腹瀉和直腸出血症狀嵌輕重程度給予1到4的分數。有黏液時亦要記錄，並給予輕度腹瀉的等级。腹®和直腸出血分數總和除以該日該组存活老鼠數目。缌分數是腹瀉和直腸出血分數之總和。 β.结果 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格<210 X 297公釐） 111! — — ! — — — * 11 — — I 訂 — f — · 1) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 446 7 彳〇 A7 B7 五、發明說明（LtA) <諳先閲讀背面之涑意事項再填寫本買> 硫酸化天然寡糖的抑制血管生成和抗轉移活性一旦一系列的硫酸化天然寡糖合成後*它們卽進行一系列的生物學試驗。表1趙结12種疏酸化彩式之天然寡糖的測試结果。表1亦包括suraiain (—種具有中度抑制血管生成和硫酸乙醢肝素抑制活性之化合物）和肝燐脂的生物活性K供比對之用〇所有的硫酸化寡糖試驗，最祗顯示有可忽路的抗凝血活性，亦即< 2 %肝燐脂的活性（表1)。這是一種很重要的性質，因為肝燐脂【一種很強的抗轉移化合物）有很強的抗凝血活性|因此臨床用途有限。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製有三種硫酸化天然寡糖有相當強的人通血管生成抑制效果，即磙酸化甘露戊醣磷酸鹽（由P.&olstii衍生），麥芽丁豳碇酸鹽及麥芽己_硫酸盟。在疽些化合物中*甘露戊8«酸盥和麥芽己釀最強，其50 %抑制濃度為2徽克/毫升，而麥芽丁醣的 δ(3 %抑制濃度為20徽克/ 毫升。苐1圖顯示了 2 0激克/牽升麥芽己醣硫酸鹽顯著的血管生成抑制。有趣的是肝燐脂的抗血管生成活性很低。因此（U乎顯示疽種類型的活性需要較短鍵的硫酸化寡糖，第2圚顯示了更完整的麥芽糖系列抑制血管生成滴定， -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格<210 * 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 44671 Ο Α7 _____Β7_ 五、發明說明（γ) 第3圖則顯示了硫酸化甘露戊酿磷酸鹽滴定。可Κ看出在麥竽糖系列中*麥芽耱硫酸發的抑制活性較弱，但麥芽丁醣和麥芽己鼬硫酸鹽則是相當強的抑制劏（第2圖）〇所有表1所示的血管生成試驗皆包括於血管生成試驗一開始|卽在培養介質中添加寡糖。不過，初步研究（數攞未提出）顯示，雖然在培罨開始時有最佳的抑制效果| 但是在血管生成反應開始後，添加麥芽己豳硫酸S亦能抑制血管生長。硫酸化寡糖的抑制乙鼸肝素酶活性亦有很大的差異。最強的抑制劑是硫酸化甘S戊醣磷酸鹽和麥芽己_碇酸鹽，這兩種物質的活性類Μ於肝燐胞活性（表1)。有趣的是，這兩種物霣也是有效的血管生成抑制劑。不邊，很多種物質的血管生成抑制和乙醢肝素藺抑制活性沒有鼷連。洌SO硫酸化環多_是很好的乙_肝素藹抑制劑*但卻是很差的血管生成抑制钃。麥芽糖系列對越畏和乙醢肝素藺抑制活性之駿係也很具告知性。表3顯示完整的麥芽糖条列，從二糖（麥芽糖）到ir耱（麥芽戊醣）之乙發[肝素蘅抑制活性。愛芽糖無抑制活性，麥芽丙酺為弱的抑制劑* 麥芽丁豳為中等抑制劑，而五-，六-it糖則顯示高抑制活性《因此，最好的乙篚肝素酶抑制需要硫酸化五糖或更高。 -44' 各紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21CM 297公S ) --I----裝！ —訂.i !線 (請先閱讀背面之注意事項再填sf本f > 44671 0 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 A7 B7 五、發明說明（w) 很多硫酸化糖也做了活題内的抗轉移活性測試（表1 )。一般而言，乙醯肝素酶抑制和抗轉移活性相當有關偽。因fc，乙醯阡素菌抑制活性最強的碕酸化甘蕊戊醣磷酸盟和麥芽己驩硫酸鹽圼現了最強的抗轉移活性，事實上，他們防止轉移的能力和肝燐脂相差不大（表1 )。其它兩種物質 > 八環多釀硫酸鹽和菜豆糖硫酸鹽的抗轉移也相當有效，與他們中等的抑制乙醢肝鬵釀活性相當一致。總通而言I這些數據顯示硫酸化甘露戊醣®酸留和麥芽己釅硫酸鹽同時具有相當好的抑制血管生成、抗轉移以及抑制肝燐胞酵素活性。麥芽糖系列疏酸化寡糖之抗轉移活性在第4疆中顯示得較為詳细。隨著鐽長的增加，募糖的抗轉移活性键定増加*以五—，六一，ΐ糖具有最強活性。若Κ 2棄升/ 老鼠的劑量做靜脈注射·麥芽糖瞄酸鹽韮無縳移的效果· (第4Α圖）但以4毫克/老鼠進行皮下注射，抗轉移的能力相當明顯（第4Β圖）。接下來的簧驗則顯示硫酸化寡糖抗縛移活性和注射路徑（邸靜脈·皮下或腹膜注射 )無鬮，抗移轉活性部相當接近（未顯示數據）。事實上麥芽糖碇酸鹽的抗轉移活性在給動物高劑霣時才親察得到。因為麥芽糖硫酸盟是很差的乙醢肝素酶抑制劑，這顯示乙醯肝素醌抑制可能不是硫酸化寡酸糖抑制腫瘤轉移的唯 -45- 衣紙張尺度適用中困國家檁準（CNS>A4規格（210 X 297公釐） ...緣" .,ν — IHIIIIIII1I — - I I I I I I I allllilf I J (諳先閱讀背面之注意事項再凑寫本頁) ‘ 44671 Ο Α7 ____Β7___ 五、發明說明（#) —方式.特別是使用高劑量募糖時。 (請先Μ讀背面之沒意事領再填窵本頁) 環多雖硫酸化後也甩於研究，因其為非線性寡糖。有趣的是這些化合物谨呈現溫和的活性（表1 ) *逭顯示最佳的活性可能需要線性寡糖s另外’活性最強的硫酸化募糖的抑制血管生成、轉移和乙睡肝素藺活性S比目前正處於抑制血管生成臨麻試驗階段的suramin有效。由於化合物的抑制血管生成活性並不一定和其乙醢肝素醑抑制活性直接顒連，似乎顯示硫酸化冪糖可經由其它機制抑制血管生成。如前所述，有些硫酸化寡糖可經由干擾生長因子-碇酸乙篚肝累交互作用而擾動血管生成因子的作用。先前分析（參閲國際專利申謅案 PCT/AUg5/G(Hfl5號 )顯示兩於本實施例的人體血管生成試驗和内生的 bFGF 很有闞，而較少和FGF及VEGF作用相閱。因此’各種碇酸化寡埔部裒來檢驗其抑制 bFGF· aFGF及VGFG與肝燐脂或硫酸乙藹肝素交互作用的能力。經濟部智慧財產局員工消f合作社印製頃發現，赌著鐽長增加，麥芽糖系列的硫酸化寡糖對 bF(3F和aFGF與细胞表面硫酸乙醯肝素交互作搿的抑剌能力亦增加（表2 )，也就是說麥芽糖是很差的抑制_，但五一，六一，ir糖的抑制能力則很強。硫酸化甘露戊醣® 酸鹽也圼現不錯的抑制活性（表2 ) 麥芽糖系列碇酸化 -46- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 η 297公釐）經濟部智慧財產局員Μ消費合作社印製 ^ 446710 A7 ____B7__ 五、發明說明（〆0 寡糖抑制a F G F -硫酸乙醯肝素交互作用的完全抑制曲媒如第5圖所示。另有研究顯示麥芽己醣硫酸鹽對放射檑記的肝燐脂和 b F G F及a F G F的结合也是很強的抑制劑（數據未顯示）° 因麥芽己醣硫酸鹽為最強的抗血管生成及抗轉移化合物之一，其硫酸化程度對其生物活性的影霣有較詳细的試駿。最初發現卽使高度硫酸化之麥芽己醣有一些抗凝血活性，但其活倥與肝燐脂相比仍然太低（表2)。不邊，陲硫酸化的增加*麥芽己醣抑制乙盤肝素顬活性和FGF與硫酸乙醱肝素结合的能力則圼現络定增邡（表2)。不過 *在硫酸化達 S5 上時*兩系统的抑制活性即趨平缓轉移的抑制研芫（第6圖）也顥示鼸著疏酸化程度增加，麥芽己醣硫酸鹽會變為更有效的抑制轉移藥。相反的，過於高度疏酸化的麥茅己豳對血管生成的抑制能力則較差（第7圖）。這些數據顯示抑制血管生成和轉移的最佳硫酸化寡糖结構有微小的差異。不過，有幾種從天然寡糖所衍生的硫酸化寡糖已經鑑定同時有很強的抗轉移和抑制血管生成活性。這些化合物為來自P. ho 1 st i i的疏酸化甘露戊豳磷酸盥K及麥茅戊酿、麥茅己醣和麥芽庚醣硫酸鹽 0 -47- 本紙張尺度適用尹國國家標準<CNS)A4規格（210 X 297公釐） - ------!!_ 裝 — II 訂·！線 <锖先《讀背面之沒意事項再瀵寫本頁> 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 ^ 44671 Ο Α7 __Β7_ 五、發明說明（硫酸化合成寡糖的抑制血管生成和抗轉移活性簧施例1至5中的疏酸化合成冪糖也被測試其生物活控。表3總结含有甘露糖、半乳糖或葡萄糖之礙酸化合成寡糖抑制血液凝固、乙醢肝素酿活性和生畏因子一硫酸乙醯肝素结合的能力。所有的合成硫酸化寡糖测試结果，其抑制凝血活性可K忽略。但是除了甘露糖和葡萄之三糖之外，其它所有的硫酸化寡糖都是良好的乙醢肝素醗活性和生畏因子一硫酸乙醢肝#结合抑制劑。事S上*總體而言，含4至6個己糖軍位（卽D-甘露糖，Β-半乳糖.或 D-葡萄糖）的硫酸化合成寡糖在這些試驗中的活性很高。半乳丙醣硫酸豳是個例外，其活性和其它半乳糖系列寡糖的活性相當。在人體血菅生成試驗中*即使五糖和六糖的活性較四糖高，硫酸化甘露糖寡糖仍為抑制劑，類似於碇酸化甘露戊釀磷酸鹽的情況。同樣地，硫酸化甘兹糖四一，五一，六糖和醗酸鹽甘露戊驄磷酸鹽具有相同的抑制轉移活（第 9圖）。含疏酸化寡糖之半孔糖和葡萄己醣疏酸鹽亦具有抑制轉移活性*只不過其活性較含甘齑糖之化合窃稍低。聢酸（b寡糖的抑剌發炎活性 _48~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 χ 297公麓） !!1!裝！ —訂.—！！線 (請先閱讚背面之it意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 4 4 46 710 A7 ___B7_ 五、發明說明（0) 如前所述，白血球進入發炎位置的主要障礙是肉皮下基膜。為穿透此膜，白血球必須疵用一系列的降解酵素（ 11)，特別有顒連的是内配糖酵素，乙醢肝素藺，其可裂解硫酸乙醯肝素鏈基膜並且對白血球的外黎很重要（i 2， 13)。事簧上，如轉移抑制研究（35)，抑制乙韹訐素酶活性的硫酸化多糖是很強的消炎劑（43， 44 )。基於這些觀察>可為習於此門技藝之人士預期的是* 具有效的抗血管生成和抗轉移抑制活性的礙酸化冪糖亦為有效的抑制發炎化合物。這観點下特別重要的是麥芽己醣硫酸鹽和甘鼉戊豳硫酸鹽。再者*血管生成與如風濕往醑節炎的慢性炎症有關（18)，這些化合物的抑制血管生成活性在治療發炎時有特別的匾值。在幾個動物的炎症試驗中，已獲得有莉於此種推瀏的證據。苜先，麥芽己豳碟酸鹽、甘露戊釀硫酸鹽和硫酸化甘露戊豳磷酸鹽可有效的抑制由硫甘酵酸鹽所引起的氣囊炎症（表4)。事實上，在一實驗中，注射一劑甘露戊醚硫酸鹽對防止白血球遼人（一般大部分為蹯中性白血球）的效果與prednisolone相同，但是麥芽己豳碇酸盥的效果則稍差。如果間隔6小時注射兩等份劑量硫酸化寡糖，抑制發炎的效果更大。 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇χ 297公変） --------裝------訂---------線 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁》力鼠能老的發炎引腸 Μ 制，抑鹽鹽酸酸硫 S 糖醣聚戊萄 0 葡甘菌試入測加來中鼠水老飲 Μ在是 Λ4671 0 Λ7 ____B7_ 五、發明說明（0) 其次*碇酸化募糖抑制老鼠慢性氣喘的能力也做了試驗。本實驗是以空氣過敏原刺激（4 1 )，謀_伊紅血球大量流人老鼠肺部。這種炎症反懕和人類慢性氣喘相同。利兩迷你滲逋幫浦給槩，麥芽己酗碇酸盥和甘露戊醣硫酸發可有效的抑制瞎伊紅血球在老鼠肺部内的累漬（表5 ) 。如果K氣溶膠方式給藥（40毫克/毫升溶菠），麥芽己釀硫酸盟也顯示一些抑剌發炎的活性。第三，甘露戊醣碇酸鹽和甘兹戊醣磷酸盟在一項老鼠疾病試驗中，可有效的抑制EAE (表6)。事S上，有一箜K硫酸化寡糖治療的動物並沒有產生病狀。這箜數據與早期研究中所顏示的，具抑制乙醢肝素醑活性之硫酸化寡糖可降低EAE嚴簠性的结果一致（43)。產生如潰遢性结腸炎的结腸炎，較輕微程度則引發Chron 病。簧驗结果發現2 0毫克/公斤/天的碇酸化甘兹戊 ϋ磷酸鹽能有效的減軽急性结腸炎，並可防止因疾病而導致的體重減輕（表7)。本罝驗的對照组注射硫酸化寡糖，但在飲水中不加人菌葡萄聚糖硫酸鹽。 50 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---I I I I-----I ---I I I I I ------ <請先閲讀背面之注意事項卑填寫本頁》經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4 46 71 Ο Α7 Β7 五經濟部智慧財產局員工消費合作社印製發明說明（0 參考文獻 i ‘ D i e 11： i c h，C ‘ P . iU d e r，ϋ . 8 ·和 S tr a u s s B i ΰ c he iii, B i o phy s . it e 5 . C ο ii . ill S 6 5 - 8 7 (1083 l . K j e 1 i en , L 和 Lindahl, U.(1!33U A π n u . Rey Biocheffl. 60, 443-475 3 . David, 0.( 1 9 9 3 ). F A 3 E B J . 7 , 1 0 2 3 - 1 0 3 0 ^ 4. Esko, J.D. (1931) . C u r r. Opin. Cell Biol 3 , 8 0 5 -810 ^ . Cole, ,1157-1165 和 Akeson, R. ( 1 9 8 9 ) Neuron ο o si b e , D . R . , Watt, S . M .和 Parish C.R. B 1 ο o S 4 , 7 3 9 - 7 5 2 7 . Y a y ο n, A ., Kiagsbrun, M . , E s k o , J . D. , l e d e r, P. 和 0 r n i t z , D . H . ( 1 3 3 i) · C e 1 1 6 4 , S 4 ：l - S 4 3 :. a P r a e g e r, r u f k a , A ‘和 0 1 w i n , 8. β · U 3 31) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公釐） --------訂--------I 11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 « 4 4671 Ο Α7 _Β7_ 五、發明說明（# )

Science 252, 1705-1708 : 9 . Gitay-Goren, ϋ. , Soker, S . , Viodavsky, I . 和 N e u f e 1 d , G . ( 1 S 3 2} . J . Biol. C h 8 is. 2 6 7,6 0 3 3 -8038- 10. Yurcheiico, P.U.和 Schittny, J‘C,(193G)‘ FASEB J . 4 , 1 5 7 7 - 1 5 30^ 11. Stetier, S.W., Aznavoorian, S.和 L i o 11 a , L. A . (1893). Aanu. Rev. Ceil Biol. 9, 541-573^ 12 . Eldars., Bar-Ser, S., Fuks, Z.和 Vlodavsky, I. (19S7).SeiBin. Throab. Heiost. 13, 475-488 ^ 13. S a k a j i ia a , M . , Iriraura, T . 和 Nicoison, G.1.(1388). J.Ceil Biochei. 38, 157-167^ 14 . Turnbull, J.E., F e r n i g, D.G., K e, Y., W U k i n s ο n，M · C .和 G a i 1 a g ii e r , J · T . ( 1 9 3 2 ) . I . Biol . C h e m. 2 6 7 , 1 0 3 3 7 - 1 0 3 4 1 - 15. Mach, H . , V o 1 k i r , D , ， Burke, C . J. H i d d a u g h, C . R . , L i n h a r d t , R . j . , F r o m bi , J . E .和 Loganathan, 0. -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) ---------------------訂---------11 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) * 4 46 710 A7 B7 五經濟部智慧財產局員工消費合作社印s 、發明說明（0) i 1 g ϋ ；]).生锪化學 H , 5 4 S 0 - 5 4 8 S。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝------- 1 6 . S! u r c 〇 i b e , V . , Ford, M . 0 . , «i π d s c h u t , J . A .和 Bartlett, P.F.(139 3 ). Science 26il, 103-106-^ 17 . S p i v a k - K r o i z sn a η , T . , L e non , M , A . , D i k i c , I, L a d b u r y , J . E . , Pinchasi, D·,Huang, J., J a y e , Ά,, Crualsy.G. 3Schiessinger, J. 和 Lax, I. Cell 7 9. 1ϋ ί 5- 1 0 2 4 〇

I 18. Folkiaan，J,和 Brem，H. (U32).血管生成和炎症於 tf ” 炎症基本原則和臨庞關連 "Eds G a Π i n, J, I . , |

I

Goldstein, 1 Λ.和 Snyderian, R . S . , Raven Press,紐

I 約ώ ! 4 13. Folkiaan，J. ίί3Η).血管生成腫廇於”癌症翳學' !

I

E d H g U a n d , J . F .，L e a & F e b i g e 費城： J

I

20. F ο I k i a n, ,i .和 Kiagsbm M.U93 7)· Science J 1 i! 3 5 , 4 4 2 - 4 4 7 - *

I

I 21. Ratner，S. (ISM) * 1 人性轉移 iL 3H00。 ]

I

_ 5 0 _ I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（210 x297公迓> 44671 Ο Α7 Β7 五、發明說明（γ/) A hi e r . C h e ι. 3 o c . 8 0 ：i. (TCoila, P.S.和 Lee 351-2354〇 1 3 8 4 ) . J. C hei. Soc

Evan, W.L., Reynold, D . D . 和 Talley 1 9 5 1) . A d v . C a r b o h y d . C h e a . 6 . 2 7^ 2 5 . G ο I d s t i π , G a r b o h y d. C h ei. 21, 4 3 1-512- Z 6. Haq. S.和 Whelan, W.J..U356). J· Chen. Soc. 4 5 4 3 - 2 7 . 0 k a d a , M . , S u i i t o ia ο , H . , 3 u i i , K 10 Sugiiooto, T . , (19 8 4) . J . A is e r . C h e i. Soc. 17, 2451-2453- -------------裝·-------訂 *-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

2 8 . 0 k a d a , 和 T a d a , Y ,Susiitonio, B . , H i r a s a w a , T . , In a r a , K . 1986). Polyni. J., (Tokyo). l〇, 601-811 29. 0 1 C ο II a , F . S .和 H c G r a t li, D. , ( 1962) . Chera. -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 44671 Ο Α7 _B7_ 五、發明說明（0 ) I n d . , 1 7 8 - 1 7 9·^ 3 Ο . HcGrath, D. , lee, E.E.和 O’Coila, P.S_, i 1 9 δ a 5 . Carbohydrate Res., 1 1 , 4 5 3 - 4 6 0 r-· 3 1. ίϊ e y n 〇 i d , D ‘ i) ·，和 E v a n s，W . L. , J . A i e r. C h e in. S。c、 (1947} . 83 , 68^ 3 2 . Glaser, J.H.和 Conrad, H.E. (1979). J. Biol.

Chei. 2 5 4, 6 5 8S- 5 5 3 7 - 33. Anderson, R.F., Cadiaus, H.C. Benedict, S.G_ 和 Siodki, M.E.(1960). Arch. Biochem. B i o p ft y 5. 8 9, 289-232^ 3 4 . B r e t h a u e r, R . K . , K a c z o r o w s k i, G . J . 和 W e i s e , M.J. (1373).生檢化學 12, 1251-1253-。 35. Parish, C . R . , C ο o ib e , D . E . , Jaiiobsen , R . B .,

Bennett , F . A .和 Underwood, P . A . (1 9 S 7) , I nt.J. Cancer 4 ϋ, 511-518 ^ 〇 6. Guo, Y.和 Conrad, ϋ.Ε·Π389). Anal Biochent. -55- 本紙張尺度適用_國國家標準（CNS)A4規格（2I0« 297公《 ) ------ --------裝--------訂.--------線 (請先閱讀背面之;i意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 …4467 1 Ο Α7 _Β7_ 五、發明說明（外） I 7 〇 , 3 G - 1 0 4 ^ 3 7 . R y i a 11 . D . β . , S i a , D . Y . Ji u n d y , J . R .和 P a r i s ii, C . R . i 1 a 8 i) . Ear. J . B i o c h e m, 11 9 , 6 4 1 - 5 4 6 > 33. 3rown, Hendry, I.A.和 Parish, C.1LU935)· E s p . Cell Res. 2 1 7 , 1 3 2 - 1 3 9·^ :3 B . B r o w n . R , J ,和 P a r i s h , C . R . U 3 i) 4 ).生窃化學 3 3 , 1 3 9 1 8 - 1 3 3 27'^ 4 ϋ. Forrest, Μ . J . , Brooks, P . M . , T a k a g i, T.和 Kowanko, 1.(1388).於”風濕病之動构模式的CRC手撒 ” Eds. Gr eenwa i d t R . A .和 Diamond, S . S. , CRC Press, Boca Eaton , V o1. 1, p.l25〇 4 i. Foster, P . S . , Hogan, 3 . P . , R a s s a y , A .J.,

Matt'n aei，K.I‘和 Young. (1938). J . Exp. Med. 183, 195-Σϋ 1 〇 41 . Lelievre, S 和 Larsen, A.i(.U334)· Cancer Res. 54 , 3^ 9 3 - 3 9 3 7 - -5 6 - 本紙張尺度適用_國國家標準（CNS>A4規格（210 X 297公釐） ---------------------訂 --- - ----- C請先M讀背面之注$事項再填寫本頁) Α7 44671 Ο Β7_ 五、發明說明（A) 4 α . i 1 ί e fi b 〇 r g , 1).0. 和 Parish, C . S . ( 1 9 3 8 } J.Ifflniunol. 140, 3401-3405 - 44 . Bartlett, H . R . , C o « d e n, S · δ . 和 Parish, C.R.(19S5) J. Leuk. Biol. 57, 207-213^ -------------裝-------訂！------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐）

Claims

44671 〇 AS Β3 C8 D8 r,·.

一棰碇酸化寡糖其中該冪糖具有通式經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Ri - (Rx) n — R2 (I) 其中Rt和1^2 K及每個Rx表示為六碳糖單糖單元其所有可為相同或不同•相鄰的六碳糖單糖單元由至少一個選自142，1—3，144及/或14S糖苷鍵所組成之族群中之鐽所連接，其中於六碳糖軍糖簞元上之至少55%可獲得羥基為0 —磺酸化，且η為1至6的整數 :其條件為該寡糖不為包括144連接铺萄耱殘基之化合物或包括144達接果糖之化合物。 4 .· 2 ·如串讀專利範圔第1項之硫酸化寡糖，其中η為 1至4 » 3 ·如申請專利範圍第2項之疏酸化寡糖，其中η為 3或4。 4 ·如电語專利範圍第1項之硫酸化寡糖*其中該六碳糖軍糖簞元為選自果糖，葡萄糖，甘露糖*阿卓糖，阿洛糖，塔羅糖，半乳糖，艾杜糖和古羅糖所組成之族群中之六碳糖。 5*如串讀專利範圍第1項之疏酸化某糖，其中該募糖具有通式Ϊ : -1- 本紙張尺度逍用t國國家輮準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I I I I I ’衣 I 訂 (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 “446710 as B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Ry — ( R y ) n — R y (E) 其中每一R y基為相同並且各代表六碳糖單糖單元，相鄰的軍埔軍元由103 * 144及/或146糖苷鍵所連接；且η為i至6的整數。 S ·如申請專利範圃第5項之硫酸化寡糖，其中η為 i至4。 7 ·如申讅專利範園第6項之硫酸化寡糖*其中η為 • ^ . 3或4 0 8 *如申請專利範圍第5項之硫酸化寡糖*其中Ry 表示單糖單元*其係為選自葡萄糖，甘萏糖*阿卓糖，阿洛糖，塔羅糖，半乳糖，艾杜糖和古羅糖所组成之族群中 z. m m ° 9 *如申讀專利範圍第8項之疏酸化寡蒱，其中Ry 表示葡萄糖*社露糖或半乳糖。 1 0 ·如申請專利範圃第1項之疏酸化寡糖，其中該寡糖為天然生成的寡糖。 1 1 ·如申諳專利範圔第1 0項之硫酸化寡糖，其中 ^^^1 ^^^1 —I— i ---1 : Jt ...... * - . - l^i n^i WSJ (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙琅尺度適用中國國家輮準（CNS) A4说格（210X297公釐） 446 7 1 Ο AS Β8 C8 D8 ___ 六、申請專利範圍該寡糖選自植物蜜糖和桨Η糖·。 I n i I (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 2 .如申請專利範疆第1項之硫酸化寡糖，其中該寡糖係由天然生成之多粳的酵累或化學降解所製備。 1 3 ·如申請專利範圃第1 2項之硫酸化寡糖，其中該寡糖為多醣類一，软骨素一或葡聚醣衍生的寡糖。 1 4，如串請專利範靦第1 ?項之硫酸化寡糖|其中該寡糖係選自要茅丁醣，麥芽戊'®，麥芽己醣*葡萄丙睡，葡萄丁醣，葡萄戊睡* Μ及软骨素丁一，己一和辛醣ύ 1 5 *如审讀專利範圓第i 2項之硫酸化冪糖*其中該寡糖為來自酵母菌Pichia ho 1 st i i的甘霱戊醣磷酸鹽。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 6 ·如申請專利範園第1項之碇酸ib寡耱*其係用於作為治療溫血動锪（包括人類）患者之抗血管生成、抗轉移及/或抗發炎劑。 1 7 · —種用於抗血管生成、抗轉移及/或抗發炎治療的_學或獸醫藥組成物，其包括至少一種如串諝專利範圔第1至i 5項中任一項的硪酸化寡糖，K及其藥孿或獸 -3 - 本紙張尺度適用中國國家樑準（CNS ) A4洗格（2丨0X297公釐） 44671 Ο 經濟部智慧財產局員工消脅合作社印製 Α8 Β8 C8 D8六、申請專利範圍翳槩上可接受的載體或稀釋劑。 18 ‘ 一種通式（Ϊ)之寡糖： Ry - (Ry) n — Ry (K) 其中每一 R y基為相同並且各代表單糖軍元，相鄰的單糖單元由143 ，及/或136糖苷鐽所蓮接；且η為i至6的整數。 1 9 ·如申諸專利範現第1 8項之寡糖，其中η為1 至4。 20，如申讀專利範圔第1 9項之寡糖，其中η為3或4。 21 *如申諳專利範圍第18或19項之寡糖，其中 Ry表示軍糖蕈元，其係選自葡萄糖*甘露糖，阿卓糖，阿洛糖*塔羅糖*半乳糖，艾杜糖和古羅糖所组成之族群中之六碳糖。 22 *如申諳專利範圍第2 1項之寡蒱，其中Ry表示葡萄糖，甘露糖或半乳糖。 23 ·如申語專利範圔第1 8項之寡糖，其中Ry為 -4- 本紙張尺度適用中國國家搮準（CNS ) A4规格（210><297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

644 ο 8 8 8 8 ABC0 經濟部智慧財產局員工消资合作社印製六、申請專利範圍完全0 —乙醢化的單糖，或其中Ry為以醯基而非乙醢基芫全0 -酷化的單糖。 n n^i Bn·— n in n a^^i— -' "-5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X29?公釐）