JP2000507993A

JP2000507993A - 合成多価ｓＬｅｘ含有ポリラクトサミンとその使用法

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Publication number: JP2000507993A
Application number: JP9513991A
Authority: JP
Inventors: レンコネン，オッシ; レンコネン、リスト
Original assignee: グリシムオユ
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2000-06-27
Also published as: AU7087296A; WO1997012892A1; EP0874861A1; PL325873A1; NO981361L; CA2231073A1; HUP9900058A2; NO981361D0; CZ89098A3; AU713078B2; US5965544A; SK39498A3

Abstract

(57)【要約】本発明は新規組成物および炎症反応の治療におけるその使用に関する。とくには、本発明は新規合成オリゴ糖構築物ならびに内皮表面上の対応するオリゴ糖に結合するリンパ球を阻止して望ましくない炎症反応を軽減するか、または改善するためのその使用に関する。さらには、本発明は結合を選択することにより特徴づけられる、細菌感染および転移性癌などのほかの疾患の状態における前記構築物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】合成多価ｓＬｅｘ含有ポリラクトサミンとその使用法発明の分野本発明は、新規組成物と、それらを炎症反応の治療に使用することに関する。具体的には本発明は、新規合成オリゴ糖構築物、とりわけｓＬｅｘで多重に修飾されたポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンと、内皮表面上の対応するオリゴ糖へのリンパ球結合を阻止し、それによって望ましくない炎症反応およびリンパ球結合を特徴とするそのほかの疾患状態を軽減もしくは改善する前記ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの使用法に向けられる。さらに本発明は、この新規糖類を使用して内皮に対する細菌接着を阻止し、それによって細菌性感染を予防および／または治療することに向けられる。本発明のさらなる使用は、ｓＬｅｘ陽性腫瘍細胞の転移をこれらのグリカンによって阻害する癌治療の分野にある。発明の背景セレクチン媒介性細胞接着血液から体内の病原提示している領域への白血球の遊走は炎症カスケードと呼ばれている。細胞接着は、その炎症性傷害に隣接する血管内皮と白血球との特異的結合を可能にし、そのような接着により、白血球循環を維持して必要とされる部位に白血球を導くのを助けるのに役立つ高い血管ずり応力と高い血流速度が妨害される。炎症反応中の白血球の遊走には、４種類の血管接着分子ファミリー、すなわち（１）インテグリンファミリー、（２）インテグリンファミリーのカウンターレセプターである免疫グロブリンスーパーファミリー、（３）セレクチンファミリー、および（４）セレクチンファミリーのカウンターレセプター、すなわちシアロムチン接着ファミリーが提示する特殊な炭水化物、が関与する。セレクチンは「レクチン細胞接着分子」（ＬＥＣ−ＣＡＭ）としても知られている。セレクチンは３つのグループに分類される。Ｌ−セレクチン（ＬＥＣＡＭ −１、ＬＡＭ−１、ｇｐ９０^MEL、Ｌｅｕ−８、ＴＱ−１、ＣＤ６２ＬおよびＤＲＥＧ）は種々の白血球上に発現し、リンパ球、単球、好中球および好酸球上に構成的に発現する。Ｅ−セレクチン（ＬＥＣＡＭ−２、ＣＤ６２ＥおよびＥＬＡＭ−１）は炎症メディエーターによって活性化された内皮上に発現する。Ｐ−セレクチン（ＧＭＰ−１４０、ＰＡＤＧＥＭ、ＬＥＣＡＭ−３およびＣＤ６２Ｐ）は血小板のアルファ顆粒と内皮細胞のワイベル−パラデ（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ）小体中に貯蔵され、炎症性刺激によって活性化された内皮上にも発現する。セレクチンファミリーの要素はすべて、炭水化物の認識によって細胞接着を媒介するようである。白血球の浸潤に関する現在の理論は、白血球と内皮の表面に位置する数個の接着分子の連続的な作用に基づいている。リンパ球の浸潤は、セレクチンファミリーのメンバーとそれらのオリゴ糖含有カウンターレセプターとの相互作用によって開始される。リンパ球接着に関する現在の知見の概説については、たとえばSp ringer,T.A., Annu Rev.Physiol 57:827-872(1995)を参照のこと。セレクチンはすべて、シアリルルイス（Ｌｅｗｉｓ）ｘ（ＮｅｕＮＡｃα２− ３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）（ｓＬｅ^xまたはｓＬｅｘ）とシアリルルイスａ（ＮｅｕＮＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ）（ｓＬｅ^aまたはｓＬｅａ）およびこれらに関連する炭水化物配列物に結合する（Bertozzi,C.,Chemistry and Biology,2:703-708(1995)）。Ｌ−セレクチン依存性認識は、末梢リンパ節(Gallatin,W.M.ら,Nature 303:30-3 4(1983)）と炎症部位（Ley,K.ら,Blood 77:2553-2555(1991)）への正常なリンパ球浸潤に先立って起こり、Ｌ−セレクチン欠損マウスではこれらがどちらも損なわれる（Arbones,M.L.ら，Immunity 1:247-260(1994)）。現在、Ｌ−セレクチンに対する糖タンパク質リガンドは、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４およびＭＡｄＣＡＭ−１の３種類が知られている。Ｌ−セレクチンの生物学的リガンドの正確な構造はまだわかっていないが、おもな炭水化物エピトープ（epitope）は、いくつかの共通した構造上の特徴を持つ。これらはＮ−アセチルラクトサミン骨格を持つＯ−グリコシド結合ムチン型オリゴ糖であり、その末端のＮ−アセチルラクトサミン末端は３Ｎ−シアリル化または３Ｎ−硫酸化、３−フコシル化されており、６−硫酸化または６Ｎ−硫酸化されているばあいもある。糖リガンドの多価性はセレクチン結合を増大させる。過去の研究では、内皮に対するＬ−セレクチン媒介性白血球接着を阻害するオリゴ糖の能力は、シアリルＬｅ^x 基の数が増大するにつれて増大すること（Turunen,J.P.ら,J.Exp.Med．182(4):1 133-1141(1995)）、また多価シアリルＬｅ^X構造はＥ−セレクチン阻害剤としてとりわけ強力であること（DeFrees,S.Λ.ら,J.Am.Chem.Soc．115:7549-7550(199 3);Welply,J.K.ら,Glycobiology 4:259-265(1994);DeFrees,S.A.ら,J.Am.Chem.S oc．117:66-79(1995)）が示されている。Ｐ−セレクチンリガンドＰＳＧＬ−１のポリラクトサミン骨格は分枝状で、数個のフコースを含有しており（Wilkins, P.P.ら,J.Biol.Chem.271:18732-18742(1996)）、多重にフコシル化され多重に硫酸化されたグリカンがＧｌｙＣＡＭ−１中に存在すること（Hemmerich,S.ら,J.B iol.Chem．270:12035-12047(1995)）から、セレクチンに対する１つの天然炭水化物リガンドもまた多価でありうることが示されている。末梢リンパ節の高内皮細胞は、Ｌ−セレクチンカウンターレセプターの一部であるシアリルルイスａおよびシアリルルイスｘ（ｓＬｅａおよびｓＬｅｘ）エピトープを発現する（PaavonenおよびRenkonen,Am J.Pathol．141:1259-1264(1992 );Munro,J.M．ら,Am.J.Pathol．141:1397-1408(1992);Sawada,M.ら,Biochem.Bio phys.Res.Comm.193:337-347(1993)）。ほかのいくつかの部位にある内皮細胞はｓＬｅａおよびｓＬｅｘ陰性であるが、炎症性刺激により、元来陰性であった内皮がこれらのオリゴ糖構造を新規に（de nove）発現するように誘導することができる（Turunen,J.ら,Eur.J.Immunol．24:1130-1136(1994)）。培養内皮細胞はいくつかの機能的なα２，３シアリルトランスフェラーゼとα１，３フコシルトランスフェラーゼ（（ポリ）ラクトサミンからのｓＬｅｘ産生に関与する酵素）を持つので、これらの細胞は少なくともｓＬｅｘを産生する機構を持っている（Majuri,M.ら,Eur.J.Immunol．24:3205-3210(1994)）。多くの研究により、セレクチンは多くの組織で様々な急性および慢性炎症状態に関与すると提言されている。多くの異常な炎症状態で組織を損傷する白血球の有害な遊走を妨害するように薬物を設計できるかもしれないと提言されている。しかし、きわめて高濃度（ｍＭの範囲）の荷電単糖類でしか、接着は阻止されなかった。フコイジン（fucoidin）（フコース−４−硫酸のポリマー）および酵母細胞壁ポリホスホマンナンエステル（ＰＰＭＥ）などの多価陰イオン性糖類の特定のサブセットは、ｎＭの範囲の濃度でこの接着を阻止することが示されている（Stoolman,L.M.ら,J.Cell Biol．99:1535-1540(1984)）。また、ｓＬｅ^x構造から誘導されるオリゴ糖は抗炎症活性を持つことも報告されている。このオリゴ糖のシアル酸含有（ｓＬｅ^x）型と硫酸エステル（スルホ−Ｌｅ^x）型はどちらもin vivoで抗炎症活性を持つことが報告されている（Lasky,L.A.,Annu.Rev.Biochem ．64:113-139(1995);Mulligan,M.S.ら,Nature 364:149-151(1993);Mulligan,M.S .ら,J.Exp.Med．178:623-631(1993);Buerke,M.ら,J.Clin.Invest．91:1140-1148 (1994);およびNelson,R.M．ら，J.Clin.Invest．91:1157-1166(1993)）。リンパ球浸潤は急性器官移植片拒絶反応には不可欠であるから（Renkonen，R. ら，Cell．Immunol．77:188-195(1983)）、移植片へのリンパ球移行の調節の分析は重要である。腎臓移植片中の尿細管周辺毛細管内皮（peritubular capillar y endothelium）（PTCE）は、拒絶反応中にｓＬｅｘを新規に発現し、数が増大したリンパ球と結合し始めることが示されている（Turunen,J.ら,Eur.J.Immunol．24:1130-1136(1994)）。 Venotらの米国特許第5,352,670号明細書には、シアリルトランスフェラーゼとシアル酸供与体としてのＣＭＰ−シアル酸類似体、および非還元末端にβＧａｌ（１−３）βＧｌｃＮＡｃ二糖またはβＧａｌ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ二糖を持つオリゴ糖グリコシド受容体分子を用いる、α−シアリル化オリゴ糖グリコシドの酵素的合成法が開示されている。国際特許公開番号WO 95/03059号パンプレット（Gaetaら）には、細胞接着の阻止、とくにＥ−セレクチン結合を阻害することによる細胞接着の阻止に有用な、２つのグリコシド結合したｓＬｅｘ部分を含有する合成糖類が開示されている。これらのｓＬｅｘ含有オリゴ糖は、ガラクトース骨格上に合成される。発明の概要細胞表面Ｌ−セレクチンのその炭水化物リガンドによる認識は、リンパ球を炎症部位の毛細管内皮上で回転させる。この１次的な接触は組織に対する白血球の浸潤のための先行条件であるので、天然のＬ−セレクチンリガンドと競合することができる遊離オリゴ糖類によるその阻害は、魅力的な治療上の選択肢である。本発明者らは、異常な炎症状態を制御することの重要性を認識し、またそれを媒介する薬物の必要性を認識して、セレクチン媒介性反応を阻害することができるオリゴ糖を合成した。これらの研究の結果、リンパ球Ｌ−セレクチンが内皮表面上の対応するオリゴ糖に結合するのを阻止する新規オリゴ糖を同定し、炎症の軽減治療を必要とする患者に当該オリゴ糖を投与した結果、その炎症が軽減される臨床的治療を完成するに至った。したがって本発明は、まず合成オリゴ糖、具体的には２価ｓＬｅｘオリゴ糖、４価ｓＬｅｘオリゴ糖、および多価性の増大したそのほかのｓＬｅｘ含有オリゴ糖であって、本質的に天然の汚染物質を含まないもの、ならびにそれを含有する組成物に向けられる。本発明の合成オリゴ糖類は、ＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌ β１−４（Ｆｕｃ1−３）ＧｌｃＮａｃ（ｓＬｅ^x）エピトープがβ１−３’結合および／またはβ１−６’結合で結合している直鎖状または分枝状のポリラクトサミン骨格（ＬａｃＮａｃ）_n（ただし、ｎ＞１、残基間結合はβ１−３’および／またはβ１−６’である）からなる（式中、ＮｅｕＮａｃ：シアル酸、Ｇａｌ：ガラクトース、Ｆｕｃ：フコース、ＧｌｃＮａｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン）。このようなオリゴ糖類は、リンパ球の外表面上にあるセレクチン分子、とくにＬ−セレクチンと結合し、それによって内皮表面上のセレクチン対応オリゴ糖に対してリンパ球が結合するのを阻止できる、ということが示されている。さらに本発明は、分枝状ポリラクトサミン骨格の４価ｓＬｅｘグリカンに向けられる。これは１価ｓＬｅｘ４糖と比較して、ラットの心臓および腎臓移植片を拒絶する際に内皮に対するＬ−セレクチン媒介性リンパ球接着の阻害剤として１００倍効力があることがわかった。さらに本発明は、直鎖状ポリラクトサミン骨格上にｓＬｅｘ残基を持つ４価ｓＬｅｘグリカンに向けられる。３つのＬａｃＮａｃ残基からなる直鎖状骨格を持つ４価ｓＬｅｘグリカンは、Ｌ−セレクチン媒介性細胞接着の強力な阻害剤である。さらに本発明は、Ｌ−セレクチンリガンドに特有のいくつかの特徴を満たすオリゴ糖、具体的には、末端のα２，３’でシアリル化され、α１，３でフコシル化されている２つのＮ−アセチルラクトサミン基（シアリルルイスｘ、シアリルＬｅ^x）を担持する分枝状ポリラクトサミン骨格を持つ１２量体Ｏ−グリコシドコア２型オリゴ糖アルジトールに向けられる。この実施態様では、ＮｅｕＮａｃ α２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１−３）ＧｌｃＮａｃ（ｓＬｅ^x）エピトープを、二糖アルジトールにβ１−３’、β１−６’またはβ１−６結合によって結合させることができる。モノフコシル化アルジトール（すなわち１価シアリルＬｅ^x）はＬ−セレクチン依存性リンパ球結合を有意に阻害し、ジフコシル化１２糖アルジトール（すなわち２価シアリルＬｅ^x）はきわめて効力のある阻害剤（ＩＣ₅₀（結合の５０％を阻害する阻害濃度）＝０．１５μＭ）であった。また本発明は、前述のオリゴ糖およびアルジトール類を酵素的に合成する方法にも向けられる。さらに本発明は、本発明のオリゴ糖組成物（前述の酵素的に合成されたアルジトール類を含む）の投与により、内皮表面へのリンパ球のセレクチン媒介性結合、とくにＬ−セレクチン媒介性結合を阻害する（ただし、Ｅ−およびＰ−セレクチン結合をも阻害する）方法であって、とりわけそのリンパ球−内皮細胞接着反応が移植拒絶、関節炎、慢性関節リウマチ、感染、皮膚病、炎症性腸疾患および自己免疫疾患の結果である慢性または急性の炎症と関係するものに向けられる。さらに本発明は、本発明のオリゴ糖組成物の投与により、細菌性感染を予防および／または治療する方法にも向けられる。さらに本発明は、本発明のオリゴ糖組成物の投与により、癌を治療する方法に向けられる。さらに本発明は、どんな炎症状態においても病原を提示している部位に対する白血球の有害な遊走を阻止または妨害する方法に向けられる。図面の簡単な説明図１（パネルａ〜ｌ）。スタンパー−ウッドラッフ（Stamper-Woodruff）アッセイにおける正常な心臓組織および移植された心臓組織中の内皮構造に対するリンパ球の結合。顕微鏡写真は、リンパ球（丸くて黒色）に焦点が合い、下の（灰色）組織はわずかに焦点がずれるように撮影した。結合したリンパ球を小さな黒い矢印で示す。パネル（ａ）は、正常な心臓の心内膜にはきわめて少数のリンパ球しか結合していないことを示している。同種移植片（ｃ）と同様に同系移植片（ｂ）でも、結合したリンパ球の数もきわめて低レベルである。同じ観察を細動脈でも行なった。正常な心臓（ｄ）中のこれらの構造は事実上リンパ球を全く接着せず、同系移植片（ｅ）と同種移植片（ｆ）における結合はきわめて低レベルであった。正常な心臓（ｇ）と同系移植片（ｈ）の細静脈（破線でしるした部分）はわずかなリンパ球を接着するに過ぎなかったが、これとは対照的に、同種移植片（Ｉ）中の細静脈は多数のリンパ球を接着した。筋間毛細管は、正常な組織（ｊ）と同系移植片（ｋ）において、いくらかのリンパ球を接着した。パネル（ｌ）は同種移植片中の筋間毛細管へのリンパ球接着に明らかな増大があったことを示している。このパネルには、筋間毛細管の横断面と縦断面が多数認められ、これらの構造に接着した少数のリンパ球にのみ、矢印でしるしを付けてある。いずれのパネルでも、心筋の上に直接接着したリンパ球もいくらかあり、内皮構造の上にはないことに注意せよ（パネルａとｌに白い矢印で示す）。図２。酵素的に合成した種々の分枝状オリゴ糖構築物の、同種移植片内皮へのリンパ球接着に対する効果。ｓＬｅｘファミリーに属するオリゴ糖はいずれもリンパ球結合を減少させたが、４価ｓＬｅｘの阻害能はほかのｓＬｅｘ−オリゴ糖類より有意に優れていた。フコースを欠くｓＬＮ類はいずれも効果がなかった。３回の実験のうち典型的な１実験の平均αＳＥＭを示す。図３（パネルａ〜ｄ）。ジアンテナグリカン（diantennary glycan）の５００ＭＨＺ ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの展開図。Ａ）グリカン２。Ｂ）グリカン３。Ｃ）グリカン４。Ｄ）グリカン５と６の混合物。左側の展開図の強度は右側の展開図の強度の２倍である。ＨＯＤとｓｓｂはそれぞれ、残存水シグナルとそのスピニングサイドバンドを示す。アステリスクを付したシグナルは重水中に存在する不純物から生じるものである。図中の指示線は、表記のシグナル多重線の化学シフト値に置かれている。正確な化学シフト値については表３を参照のこと。図４（パネルａ〜ｃ）。グリカン３のフコシルトランスフェラーゼ生成物のクロマトグラフィー分析。Ａ）完全な反応でえた生成物のＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィー。横棒はどのようにしてグリカン４を集めたかを示している。ＰＡＤ反応を実線で示し、酢酸ナトリウム勾配を破線で示す。Ｂ）部分的な反応からのＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィー。Ｄ１、Ｄ２およびＤ３と記したピークは、それぞれ糖４、糖５と６の混合物および糖３に相当した。Ｃ）脱シアリル化した糖５と６の混合物の同時β−ガラクトシダーゼおよびβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化物のペーパークロマトグラフィー。クロマトグラフィーは、（Niemela,R.ら,Glycoconjugate J.12:36-44(1995)）に記述されているように、ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：５）の上相を用いてワットマン（Whatman ）IIIＣｈｒペーパーで行なった。矢印ＡおよびＢは、それぞれＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇａｌβ−４ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ−４ＧｌｃＮＡｃの溶出位置を示す。図５（パネルａ〜ｂ）。グリカン９の合成における中間体と最終生成物のクロマトグラフィー分析。Ａ）７のα２，３−シアリルトランスフェラーゼ反応からえた糖類のモノキュー（Mono）Ｑ５／５ＨＲカラムによるイオン交換クロマトグラフィー。ゼロ、モノ、ジおよびトリと記した矢印は、それぞれＧｌｃＮＡｃ、３’−シアリルラクトース、ジシアリル化オリゴ糖およびトリシアリル化オリゴ糖マーカーの溶出位置を示す。２１４ｎｍにおけるＵＶ吸光度を太い線で表わし、ＮａＣｌ勾配を破線で示す。横棒はテトラシアロ糖８に合わせた物質を示す。Ｂ）糖８のフコシルトランスフェラーゼ生成物のＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィー。Ｔ１、Ｔ２およびＴ３と記したピークは、それぞれ８のテトラ、トリおよびジ−フコシル生成物に相当した。ピークのテーリングは、糖類の還元末端ＧｌｃＮＡｃの塩基触媒２−エピマー化によるものと考えられる。ＰＡＤ反応を実線で示し、酢酸ナトリウム勾配を破線で示す。図６（パネルａ〜ｃ）。テトラアンテナグリカンの５００ＭＨＺ ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの展開図。Ａ）糖７のスペクトル。Ｂ）糖８のスペクトル。Ｃ）糖９のスペクトル。アステリスクを付したシグナルは重水中に存在する不純物から生じるものである。左側の展開図の強度は右側の展開図の強度の２倍である。図中の線はシグナル多重線の化学シフトを示す。正確な化学シフト値については表４を参照のこと。図７（パネルａ〜ｂ）。脱シアリル化テトラアンテナオリゴ糖の質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）。Ａ）図５ＢピークＴ１からえた脱シアリル化糖の質量スペクトル。Ｂ）図５ＢピークＴ２からえた脱シアリル化糖の質量スペクトル。図８。酵素的に合成したｓＬｅｘオリゴ糖（白抜き記号）とｓＬＮオリゴ糖（黒塗り記号）の、腎臓移植片内皮へのリンパ球接着に対する効果。白抜きの円（ ○）モノＳＬｅｘ（グリカン１）、黒塗りの円（●）モノｓＬＮ、白抜きの正方形（□）ジＳＬｅｘ（グリカン４）、黒塗りの正方形（■）ジｓＬＮ（グリカン５）、白抜きの三角形（△）テトラｓＬｅｘ（グリカン９）、黒塗りの三角形（▲）テトラｓＬＮ（グリカン８）。４価ｓＬｅｘのリンパ球阻止能は、ほかのｓＬｅｘオリゴ糖類より明らかに優れていた。３回の実験の平均を示す。ＳＥＭが１０％を超えることはなかった。明解にするため、記号は付していない。図９。グリカン１２から、直鎖状骨格の４価シアリルルイスｘ糖１７への、さらにはルイスｘ糖１８への本発明の合成経路の概略。図１０。Ａ．グリカン１６の陰イオン交換（モノキュー）クロマトグラフィー。Ｂ．合成混合物からゲル濾過によって単離したグリカン１７のＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィー。８分で溶出する主ピークはグリカン１７に相当し、一方、１２分でのピークはその還元末端−ＭａｎＮＡｃ類似体を含有すると考えられる。後者はおそらく、グリカン１７および／またはその前駆体の還元末端−ＧｌｃＮＡｃのＣ２における塩基触媒エピマー化によって生成したのだろう。グリカン１７のトリフコシル類似体類の溶出領域と予想される、１５〜１７分で溶出するオリゴ糖は観測されなかった。図１１。グリカン１６の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの展開図。パネルＢ．グリカン１７の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル。アステリスク（＊）を付した共鳴は未知の不純物から生じるものである。図１２。合成オリゴ糖類の存在下、ラットの心臓移植片を拒絶する内皮に対するリンパ球のＬ−セレクチン依存性結合。３つの実験のうち代表的な１実験の平均±ＳＥＭを表わす。４価シリアルルイスグリカン９および１７はリンパ球接着を強く阻害し、およそ１ｎＭのＩＣ₅₀ 値を示した。非フコシル化類似体８および１６は阻害特性を示さなかった。図１３。アルジトール系の糖類の構造と単糖残基の表示。図１４（パネルＡ〜Ｃ）。グリコシルトランスフェラーゼ反応後の糖類のクロマトグラフィー分析。ピークの番号は表６の糖類を示す。Ａ．６０ｍＭＮａＯＨを溶離剤とするＨＰＡＥＣによる、糖２４のガラクトシルトランスフェラーゼ反応の生成物の分析。非ガラクトシル化、モノガラクトシル化およびジガラクトシル化生成物の計算位置を示す。Ｂ．モノキューカラムでの陰イオン交換クロマトグラフィーによる、糖２５のシアリルトランスフェラーゼ反応後の反応混合物の分析。ジシアリル１０糖２６が主生成物としてえられた。荷電オリゴ糖類の領域にあるほかの２つのピークはＣＭＰ（ａ）とＮｅｕＡｃ（ｂ）である。Ｃ．２６のフコシルトランスフェラーゼ反応でえられるモノフコシル化糖とジフコシル化糖（それぞれ２７と２８）のＨＰＡＥＣによる分離。ＮａＡｃの直線勾配を、０分の１００ｍＭＮａＯＨ、２５ｍＭＮａＡｃから２０分の１００ｍＭＮａＯＨ、１００ｍＭＮａＡｃまで適用した。図１５（パネルＡ〜Ｄ）。糖２５（パネルＡ）、糖２６（Ｂ）、糖２７（Ｃ）および糖２８（Ｄ）の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの展開図。アステリスクで示した共鳴は非炭水化物起源のものである。図１６。Ｏ−グリコシド２価ｓＬｅｘアルジトール２８のＴＯＣＳＹスペクトルの一部分（スピンロックタイム８０ｍｓ）。ＧｌｃＮＡｃ残基のアノマープロトンと非アノマープロトンの間の相関ピークを示すこの展開図から、ＧｌｃＮＡｃ残基５および６については、残基のフコシル化によりプロトンのほとんどがダウンフィールド（低磁場）シフトしていることが明らかであるが、残基３についてはそうではない。図１７。一部重複した¹Ｈ−ＮＭＲ共鳴の割り当てに使用した２価ｓＬｅｘＯ−グリカンアルジトール２８のＤＱＦＣＯＳＹスペクトル。図１８。酵素的に合成したオリゴ糖構築物の、腎臓同種移植片を拒絶する尿細管周辺毛細管内皮へのリンパ球接着に対する効果。使用した記号は次の通りである：白抜きの四角形（□）２つのシアリルＬａｃＮＡｃ単位を持つＯ−グリカン２６、白抜きの三角形（△）１価シアリルＬｅ^x Ｏ−グリカン２７、白抜きの円（○）２価シアリルＬｅ^x Ｏ−グリカン２８、黒塗りの三角形（▲）１価シアリルＬｅ^x４糖１、黒塗りの円（●）２価シアリルＬｅ^xグリカン４。Ｏ−グリコシド型２価１２糖アルジトール２８が、６−結合側鎖にフコース残基を持たない１価類似体２７より強力な阻害剤であることは明らかだった。同時に、フコースを持たないグリカン２６はリンパ球結合を全く阻害しなかった。２８の還元されたＯ−グリコシドコア配列を欠く糖４は２８よりわずかに弱い阻害剤であった。このことは、このＯ−グリコシドコア配列も結合に重要でありうることを示した。３回の独立した実験のうち代表的な１実験の平均αＳＥＭを示す。好ましい実施態様の詳細な説明本発明は、新規合成オリゴ糖とそれを含有する薬学的に許容しうる組成物、ならびに急性または慢性の炎症状態を治療するための治療法におけるそれらの使用に関する。本発明の合成オリゴ糖は、ＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１−３）ＧｌｃＮａｃ（ｓＬｅ^x）エピトープがβ１−３’結合および／またはβ１−６’結合によって結合している直鎖状または分枝状のポリラクトサミン骨格（ＬａｃＮａｃ）_n（ただし、ここにｎ＞１、残基間結合はβ１−３’および／またはβ１−６’である）からなる（ここでＮｅｕＮａｃ：シアル酸、Ｇａｌ：ガラクトース、Ｆｕｃ：フコース、ＧｌｃＮａｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン）。このようなオリゴ糖は、１価ｓＬｅｘの多量体（multimer）であることが好ましく、とくに表２ならびに図９および図１３に図示するようにｓＬｅｘの２価および４価多量体であることが好ましい。好ましい実施態様において合成オリゴ糖は、表２および図９に示すように２２糖４価ｓＬｅｘ構築物である。このような多量体型ｓＬｅｘの合成は化学的方法および／または酵素的手段によって達成される。たとえば、１価ｓＬｅｘ４糖、２価ｓＬｅｘ１０糖および分枝状ポリラクトサミン骨格を持つ４価ｓＬｅｘ２２糖の構築は、Ｎ−アセチルラクトサミン、６糖Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃ（Wilkman,A.ら,Carbohydrate Re s．226:155-174(1993)）および１４糖Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３］Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Seppo,A.ら ,Bioch.34:4655-4661(1995)）をそれぞれ１価、２価および４価ｓＬｅｘ糖類の受容体として使用することにより達成できる（実施例２も参照のこと）。まず、これらの受容体をＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃおよびヒト胎盤由来のα２，３シアリルトランスフェラーゼとともに充分にインキュベートすることにより、それらをα ２，３シアリル化する。つぎに、単離した全シアリル化糖類を、Natunen,J.ら,G lycobiol．4，577-583(1994)(これは参考文献として本明細書の一部を構成する) に記述されているように、ＧＤＰ−フコースとヒト乳汁α１，３フコシルトランスフェラーゼ（類）の部分精製品で、完全にα１，３フコシル化する。その試料サイズを外部Ｎ−アセチルグルコサミンに対してＵＶ吸収によって見積もる。構築物の特徴づけは、イオン交換クロマトグラフィーと５００ＭＨｚにおけるＩＤ ¹Ｈ−ＮＭＲ分光法によって行なった。直鎖状ポリラクトサミン骨格を持つ４価ｓＬｅｘ２２糖は、８量体ポリラクトサミンＬａｃＮＡｃβ１−３’（ＧｌｃＮＡｃβ１−６’）ＬａｃＮＡｃβ１−３’（ＧｌｃＮＡｃβ１−６’）ＬａｃＮＡｃ（ここでＬａｃＮＡｃは２糖Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃである）から出発して、まずそれをβ１，３−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼ反応で伸長することにより、５段階合成で達成することができる。単離した糖混合物をブタ胃粘膜由来のβ１，６−ＧｌｃＮａｃトランスフェラーゼによって触媒される反応に付す。つぎに、えられたオリゴ糖をβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ反応で７つのＬａｃＮａｃ単位からなる分枝配列（array）に変換し、それをさらにシアリル化およびフコシル化して４価ｓＬｅｘ糖にする（実施例６も参照のこと）。本発明はさらに、Ｌ−セレクチンリガンドに特有ないくつかの特徴を持ち、Ｌ −セレクチンリガンド結合の強力な阻害剤として作用することができるオリゴ糖アルジトールの酵素的合成にも関する。この実施態様では、ＮｅｕＮａｃα２− ３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１−３）ＧｌｃＮａｃ（ｓＬｅ^x）エピトープをβ１ −３’結合、β１−６’結合またはβ１−６結合で二糖アルジトールに結合させることができる。このようなアルジトール類は１価ｓＬｅｘの多量体であることが好ましく、とくに図１３に図示するようにｓＬｅｘの２価多量体であることが好ましい。きわめて好ましい実施態様では、当該アルジトールは、図１３に図示するように、２つの末端α２，３Ｎシアリル化およびα１，３フコシル化Ｎ−アセチルラクトサミン基（シアリルルイスｘ、シアリルＬｅ^x）を担持する分枝状ポリラクトサミン骨格を持つ１２量体Ｏ−グリコシドコア２型オリゴ糖アルジトールである。２糖Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからこの１２糖アルジトールに至る合成経路上の各糖の構造は、１次元および２次元¹Ｈ−ＮＭＲ分光法を含む数種類の方法で確認した。この合成の最終段階である６−結合側鎖のα１，３フコシル化は進行が遅く、分枝担持Ｎ−アセチルラクトサミン単位のＧｌｃＮＡｃ残基のＨ−１共鳴に顕著なシフトを伴った。セレクチンリガンドの構造上のいくつかの特徴を分析した後、０、１または２個のα１，３結合フコース残基でシアリル化Ｎ−アセチルラクトサミン残基が修飾されたシアリル化Ｏ−グリコシドポリラクトサミンアルジトールを合成することに決めた。本発明者らはここに、適当な１０〜１２糖類の酵素的合成、クロマトグラフィーと１次元および２次元¹Ｈ−ＮＭＲによるそれらの構造的な特徴づけ、および詳細に記録されたラット腎臓移植片拒絶モデル（Renkonen,R.ら,Am.J.Pathol 137:643-651(1990);Turunen,J.P.ら,Eur.J.Imm unol．24:1130-1136(1994)）中の内皮に対するリンパ球のＬ−セレクチン媒介性結合の阻害剤としてのそれらの使用を開示する。最終的な合成生成物と、フコース残基の一方または両方を欠くそれらの類似体を、ラット腎臓移植片を拒絶する際のin vitroでのＬ−セレクチン媒介性リンパ球−内皮相互作用の阻害剤として試験した。非フコシル化Ｏ−グリコシドオリゴ糖アルジトールは阻害活性を持たなかったが、モノフコシル化アルジトール（すなわち１価シアリルＬｅ^x）は結合を有意に阻止し、ジフコシル化１２糖アルジトール（すなわち２価シアリルＬｅ^x）はきわめて強力な阻害剤（ＩＣ₅₀、（結合の５０％を阻止する阻害濃度）＝０．１５μＭ）であった。多価性に加えて、Ｏ−グリコシドコアのＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−オール（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−ｏｌ）配列もＬ−セレクチンに対するグリカンの親和力を増大させるようである。このことは並行して行なった阻害実験によって示された。すなわち、この並行実験では、２価１２糖アルジトールに似ているが還元されたＯ−グリコシドコアを欠くジシアリル化およびジフコシル化分枝状ポリラクトサミン１０糖がＯ−グリコシド１２糖アルジトールより有効性の低い阻害剤（ＩＣ₅₀＝０．５μＭ）であることが明らかになった。したがって、本発明のとりわけ好ましい実施態様として、当該アルジトールはそのＯ− グリコシドコア中にＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−オール配列を含有する。非フコシル化Ｏ−グリコシド構築物２６（糖番号については図１３を参照のこと）は阻害活性を持たなかったが、モノフコシル化したもの（２７）はＬ−セレクチン依存性リンパ球結合を０．５μＭで３７％阻止した。ジフコシル化された分子（２８）はきわめて強力な阻害剤（ＩＣ₅₀＝０．１５μＭ）だった。したがって、末端末端に多重のシアリルＬｅ^xエピトープが存在すると、Ｌ−セレクチンに対するその糖の親和力が増大する。また、過去に合成された、化合物２８の近位Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−オール配列を欠く２価シアリルＬｅ^xグリカン（４）は、並行実験で、アルジトール２８よりも低い阻害能を示した。本発明の炎症治療方法では、そのような治療を必要とする患者（動物およびとくにヒト）に、有効なレベルの本発明の合成炭水化物を、一般的には薬学的に許容しうる組成物として、投与する。その患者には、多価の形態の混合物、とくに表２ならびに図９および図１３に示す２価および４価ｓＬｅｘ化合物の有効な混合物を含有する組成物を投与してもよい。このような医薬組成物はさらに、本発明の合成炭水化物の有効な能力と協奏的に作用しそれを増進させるために、ほかの望ましい成分、たとえば、白血球Ｌ−セレクチンを認識しそれに結合する抗体またはその複合体などを含有してもよい。「炎症状態」とは、炎症反応を伴う生理学的または病理学的状態を意味する。このような状態には、種々の器官／組織移植、たとえば皮膚移植片、腎臓、心臓、肺、肝臓、骨髄、角膜、膵臓、小腸、器官／組織拒絶、関節炎、感染、皮膚病、炎症性腸疾患および自己免疫疾患が含まれるが、これらに限るわけではない。炎症状態は慢性であっても急性であってもよく、Ｌ−セレクチンカウンターレセプターを構成的または誘導的に発現させる組織に集中していてもよい。本明細書に示すように、Ｌ−セレクチンカウンターレセプターを発現させない組織は、一定の生理状態でそれを発現させるように誘導されうる。たとえば、本明細書に示すように、ｓＬｅｘ発現は急性に拒絶された器官移植片の毛細管内皮上に誘導され、この新規ｓＬｅｘ発現はリンパ球を循環系からその移植片に引き寄せ、したがって炎症と拒絶を生じさせる。しかし、本発明の方法は、リンパ球Ｌ−セレクチンが内皮表面上の対応するオリゴ糖に結合するのを阻止する。「本質的に汚染物質を含まない」とは、その多価ｓＬｅｘが、その生成物が当該多価ｓＬｅｘのin vitro合成またはin vivo合成中には存在した望ましくない物質または不必要な物質を含まないか、もしくはそれらを許容できるレベルでしか含まない程度にまで精製されていることを意味する。「治療(treatment)」または「治療する(treating)」という用語は、本発明の合成オリゴ糖を、セレクチン接着事象、とくにＬ−セレクチン媒介性接着事象によって媒介される傷害の予防、改善、防御または治療を含む目的で、対象（subject）に投与することを包含するものとする。このような治療は、必ずしも炎症反応を完全に改善する必要はない。また、このような治療は、当業者に知られているほかの伝統的な炎症状態軽減治療と併用してもよい。本発明の方法は、たとえば炎症状態の検出前に、その危険が高い患者（たとえば移植患者など）内でそれが発現するのを防止するために、「予防的」治療として施してもよい。ヒトまたは動物の患者に投与する場合、本発明の組成物は、それを経口投与、非経口投与（静脈内、筋肉内または皮下投与を含む）、槽内（intracisternal）投与、膣内投与、腹腔内投与、局部（local）投与（散剤、軟膏または滴剤を含む）、経鼻投与（噴霧剤を含む）、局所（topical）投与、腸投与または直腸投与に適合させるような任意の方法で製剤化することができる。したがってこの薬剤は、たとえば注射剤、エアゾール製剤、懸濁剤、溶液剤、分散剤、乳剤、滅菌散剤、浣腸剤などの形態をとることができる。この薬剤は、従来の製薬上の慣行に従って、薬学的に許容しうる補形薬（excipient）、担体、溶媒またはビヒクル（vehicle）、たとえば等張食塩水、エタノール、ポリオール、ポリエチレングリコール、グリセロールなどを用いて製剤化することができる。本薬剤の投薬レベルは、その患者におけるセレクチン、とくにＬ−セレクチン媒介性接着事象の阻止によって抗炎症効果を与えるに足りるだろう。経口投与用の固体投与形態としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれる。このような固体投与形態では、活性化合物を少なくとも１つの不活性な従来の補形剤、充填剤または増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅緩剤、湿潤剤、吸着剤、滑沢剤および／または緩衝剤と混合することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤などの固体投与形態は、コーティング剤や殻（shell）を用いて調製することができる。活性化合物を１つまたはそれ以上の補形剤とともにマイクロカプセル封入型にすることもできる。経口投与用の液体投与形態には、薬学的に許容しうる乳剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。液体投与形態には活性化合物に加えて、当該分野で一般に使用される水やそのほかの溶媒などの不活性な希釈剤、溶解剤および乳化剤を含めることができる。このような不活性希釈剤のほかに、本発明の組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤などの添加剤、甘味料、着香料および芳香剤を含んでもよい。懸濁剤は活性化合物に加えて懸濁化剤を含んでもよい。本発明の組成物はリポソームの形態で投与することもできる。当該分野では知られているように、リポソームは一般にリン脂質やほかの脂質物質からえられる。リポソームは、水性媒質中に分散した単層状または多層状の水和した液晶によって形成される。非毒性の生理学的に許容しうる代謝可能な脂質であって、リポソームを形成できるものはいずれも使用できる。リポソームの形態の本発明の組成物は、本発明の合成多価ｓＬｅｘ含有ポリラクトサミンに加えて、安定化剤、保存剤、補形剤などを含有することができる。好ましい脂質はリン脂質、ホスファチジルコリン類（レシチン類）、天然および合成のｂＰｏｔｈである。リポソームを形成させる方法は当該分野ではよく知られている。本発明の組成物と方法は、セレクチン、とくにＬ−セレクチン媒介性接着が増大した炎症反応を伴う任意の状態の治療に適している。したがって、本薬剤は敗血症性ショック、乾癬や慢性関節リウマチのような慢性炎症疾患および心臓発作、卒中および器官移植後に起こる再潅流損傷、外傷性ショック、多臓器不全、自己免疫疾患、喘息、炎症性腸疾患、組織拒絶、関節炎、感染（とくに局所感染）、皮膚病など（ただしこれらに限らない）を含む症状の治療に有用である。それぞれの場合に、本発明化合物の有効量を単独で、もしくは薬学的に許容しうる組成物の一部として、そのような治療を必要とする患者に投与する。本発明の化合物を組み合わせてそのような投与を必要とする患者に投与してもよいと考えられる。ｓＬｅｘとｓＬｅａが関与する細胞接着は一定の癌の転移に、ある役割を果たすことが示されている。したがって、本発明のさらなる用途は癌治療にあり、これらのグリカンによってｓＬｅｘ陽性腫瘍細胞の転移を阻害することができる。もう１つの実施態様として、有効なレベルの本発明組成物を、炎症の２次的で有害な炎症効果に対して治療効果がえられるように投与する。「有効なレベル」の本発明組成物とは、その治療を受ける患者に何らかの改善を与えるようなレベルを意味する。「異常な」宿主炎症状態とは、その対象のある部位における炎症のレベルが、その対象の健康な医学的状態に関する規範を越えていること、または望ましいレベルを越えていることを意味する。「２次的な」組織損傷または毒性効果とは、過剰なセレクチン（とくにＬ−セレクチン）接着事象（身体のどこかほかの場所での「１次」刺激の結果であるものを含む）が存在するために、そのほかの点では健康な組織、器官およびその中の細胞に起こる組織損傷または毒性効果を意味する。本発明の方法では、患者への本発明化合物の注入が、セレクチン発現白血球の「回転」能力の低下、したがって内皮に対する結合能力の低下をもたらし、それゆえにそのような細胞の炎症部位に対する接着および内皮に対する集中的な損傷が予防または阻害され、したがって冒された組織または細胞への望ましくない白血球の移行または流入が防御される。したがって本発明の医薬組成物は、患者の天然セレクチン（とくにＬ−セレクチン）がその患者内の当該セレクチンの生物学的標的（とくに内皮細胞）に結合するのを（完全にまたは部分的に）中和するに足る量で、本発明の合成炭水化物およびアルジトールを含有する組成物を提供する。本発明のオリゴ糖類は、化学的にまたは遺伝子工学によって、それらセレクチン結合化合物を所望の作用部位に誘導するほかの薬剤の断片に結合させることができる。また、本発明のオリゴ糖類またはそれらを含有する組成物に付加的な特性、とくに接着媒介性毒性効果の軽減を促進するというその化合物の能力を増進する特性またはその化合物の血流からの浄化を促進する特性あるいはそのほかの有利な特性が付与または増進されるように、ほかの化合物を化学的に、または遺伝子工学によって、本発明のオリゴ糖類に結合させてもよい。本発明のセレクチン結合性オリゴ糖類とそのオリゴ糖類を含有する組成物の投与量と投与法は、関節炎、組織損傷および組織拒絶などの炎症関連傷害を治療する臨床分野の当業者によって容易に決定されうる。一般的には、本発明組成物の投与量は、使用する合成炭水化物のタイプ、年齢、健康状態、治療される医学的状態、併用治療があればその種類、治療の頻度、望まれる効果の性質、組織損傷の程度、性別、症状の持続時間、もしあれば反適応症、および個々の医師が調節すべきそのほかの可変的要因などといった点に依存して変動するだろう。所望の結果をえるために、望ましい投与量を１回でまたは複数回で投与することができる。４価ｓＬｅｘ２２糖またはジフコシル化１２糖アルジトールのような本発明のオリゴ糖類を含有する医薬組成物は、単回投与形態で提供することができる。本発明の合成オリゴ糖を含有する医薬組成物は、任意の適当な投与用薬学的担体に入れて投与することができる。これらは、ヒトおよび動物内でセレクチン（とくにＬ−セレクチン）が媒介する事象の予防、軽減、防御または治療をもたらす任意の形態で投与することができる。定義として、疾患の「治療方法」などの表現は、本明細書と請求の範囲において常に、それら疾患の予防方法を包含すると解釈されるものとする。本発明の方法は、任意のタイプの移植組織または移植器官（たとえば心臓、肺、腎臓、肝臓、皮膚移植片、組織移植片など）の拒絶または炎症の予防に有用である。とくに非経口投与を行なう場合は、本発明の組成物として、滅菌水性溶媒または非水性溶媒、懸濁液および乳液を挙げることができる。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、注射可能な有機エステル類である。水性担体には水、水−アルコール溶液、乳液または懸濁液があり、食塩水や医薬用緩衝非経口賦形剤（塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース溶液、デキストロース＋塩化ナトリウム溶液、固定油または乳糖を含むリンゲル溶液など）が含まれる。静脈内用賦形剤には、体液および栄養補給剤、電解質補給剤、たとえばリンゲルデキストロースにもとづくものなどがある。とくに１次損傷がどちらかといえば急性ではなく長期間持続したり、遅発性である場合は、本発明の組成物を、ポンプを使用して投与したり、徐放剤として投与してもよい。１次損傷が急性ではなくむしろしばしば長期間持続したり遅発性になる例は、感染や捻挫であり、この場合は、組織または筋肉に対する損傷が１次感染または１次損傷の数日後まで現われない（または持続する）。本発明のセレクチン結合分子は、適当に挿入されたカテーテルを使用することにより、もしくは特定の器官を目指すように設計されたキメラ分子（または錯体）の一部としてその分子を提供することにより、高濃度で特定の器官に送達することもできる。長期間にわたって注射を繰り返す必要がある場合には、徐放剤としての投与が患者にとっては、より好都合である。たとえば、セレクチン媒介性傷害にもとづく遺伝的炎症疾患または慢性炎症疾患の治療に本発明の方法を使用する場合には、患者の快適性を最大限にするべく、本発明の組成物を徐放剤として投与することが望ましい。本発明の組成物は、その活性多量体炭水化物の生理活性が消化過程で破壊されず、またその化合物の特徴が腸組織を横切って吸収されうるものであるならば、経口投与用の錠剤、カプセル剤、散剤小包、または液体溶液などの投与形態で使用することができる。本発明の薬学的組成物は、それ自体は既知の方法で、たとえば従来の混合、造粒、糖衣形成、溶解、凍結乾燥などの方法を用いて製造される。本発明の組成物は、炎症が媒介する（慢性または急性の）生理学的損傷の制御に有用である。本発明の組成物は、セレクチン媒介性接着をその能力の最大限まで認識するための身体自身の機構をうまく回避する。静脈内投与形態では、本発明の組成物は、潜在的組織損傷の急性の管理に有効でありうるほど充分な即効性を持つ。また、低効力剤も軽度または慢性のセレクチン媒介性炎症障害の管理に有用である。急性器官移植片拒絶は大量のリンパ球浸潤を特徴とする。移植内皮の変化が、その移植片中に移行するリンパ球の増大をもたらすことは既に示されている。本明細書の実施例は、そのような移植の結果としてセレクチン（とくにＬ−セレクチン）が、元来はそのようなセレクチンを発現させない組織に誘導されることを立証するばかりでなく、リンパ球が心臓移植を拒絶する内皮には接着するが、in vitroスタンパー−ウッドラッフ結合アッセイで分析した同系移植片または正常な心臓の内皮には接着しないことをも立証する。上記ｓＬｅｘファミリーのいくつかの要素を酵素的に合成し、心臓内皮に対するリンパ球接着を阻止するそれらの能力について分析した。１価ｓＬｅｘ（４量体）、２価ｓＬｅｘ（１０量体）および４価ｓＬｅｘ（２２量体）はすべてリンパ球結合を有意に減少させたが、４価ｓＬｅｘ構築物による阻害は明らかにほかのｓＬｅｘファミリー要素より優れている。決定的な対照オリゴ糖、すなわち、フコースを欠くがｓＬｅｘファミリーの要素と同程度に荷電しているシアリルラクトサミン類（ｓＬＮ）は、リンパ球結合に対して何の効果も持たない。さらに、Ｌ−セレクチン媒介性リンパ球−内皮結合の強力な阻害剤であるシアリル化Ｏ−グリコシドポリラクトサミンアルジトール類を合成する方法も、本明細書に開示する。とくにジフコシル化された１２糖アルジトール（２価ｓＬｅ^x ）は、０．１５μＭの濃度で結合の５０％を阻害した。この２価ｓＬｅ^xアルジトールはそのＯ−グルコシドコアにＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−オール配列を含有し、これがＬ−セレクチンに対するこのグリカンの親和力を増大させていると思われる。以下の実施例は、本願に記述するタイプの実験を機械的に行なうことができるほど大量の複合型オリゴ糖の初めての合成を表わすものである。本発明は、これに関する従来の問題点を克服する。以下の実施例は単に本発明の例示を意図するものであって、決してその範囲を限定しようとするものではない。実施例実施例１Ｌ−セレクチン媒介性移植片拒絶の動物モデルと接着阻害のアッセイ移植片拒絶は白血球浸潤を特徴とする炎症過程である。初期の観察結果により、尿細管周辺毛細管内皮（ＰＴＣＥ）が腎臓同種移植片を拒絶するリンパ球侵入部位であることが示されている。拒絶中は、ＰＴＣＥがシアリルルイスｘを新規に発現し始め、Ｌ−セレクチンに大きく依存する機構によってリンパ球を結合する。したがって、リンパ球−内皮相互作用をＬ−セレクチンのオリゴ糖リガンドで阻害することは、炎症と拒絶を防止する魅力的な代替法となる。移植片浸潤性リンパ球の数が急性拒絶中に５−１０⁶のバックグラウンドレベルから３０×１０⁶をこえるレベルにまで劇的に増大することは、既に明らかにされている。心臓移植片拒絶および腎臓移植片拒絶用動物モデルには、同系交配のＷＦ（ＲＴ１^v）ラット系統とＤＡ（ＲＴ１^a）ラット系統を使用し、これらを集団で維持して、移植の系統内容認と、系統内混合リンパ球培養の不在について定期的に調べた。ＷＦ受容個体へのＤＡ移植を同種移植片とした。ＷＦへのＷＦ移植片と、ＤＡへのＤＡ移植片を同系対照とする。これらの動物モデルについては、（Renk onen,R.ら,Transplantation 47:577-579(1989);Renkonen,R.ら，Am.J.Pathol．1 37:643-651(1990);Turunen J.P.ら，Transplantation 54:1053-1058(1992);Turu nen，J.P.ら，Eur.J.Immunol．24:1130-1136(1994);Turunen，J.P.ら，J.Exp.Me d.，182:1133-1142(1995)）に、より詳細に記述されている。スタンパー−ウッドラッフ結合アッセイ摘出した同系（ＤＡからＤＡおよびＷＦからＷＦ）移植と同種（ＤＡからＷＦ）移植の小さな切片をティシュー・テック（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ）培地（ラブ −テック・プロダクションズ(Lab-Tek Productions),ネーパーヴィル(Nepervill e)、イリノイ州）に載せ、液体窒素で急速冷凍した。８μｍ厚の凍結切片を、その切片をリンパ球−内皮結合アッセイに使用する前１時間以内に調製した（Renk onen,R.ら，Transplantation 47:577-579(1989);Renkonen,R.ら，Am.J.Pathol． 137:643-651(1990);Turunen J.P.ら，Transplantation 54:1053-1058(1992):Tur unen，J.P.ら，Eur.J.Immunol．24:1130-1136(1994);Turunen，J.P.ら，J.Exp.M ed.，182:1133-1142(1995)）。腸間膜リンパ節リンパ球の単一細胞懸濁液を、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（２５ｍＭ）と０．５％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ(Gibco) 、グランドアイランド、ニューヨーク州）中での機械的崩壊によって作製し、それらの細胞を孔径５０μｍのメッシュに通した。細胞の９９％以上がリンパ球であり、細胞遠心調製物の免疫ペルオキシダーゼ染色とフローサイトメトリーでの分析によって分析したところ、そのリンパ球集団は８０〜９０％がＣＤ３陽性Ｔ細胞、５０〜６０％がＣＤ４陽性Ｔ細胞、２５〜３５％がＣＤ８陽性Ｔ細胞および１０〜２０％がＣＤ１９陽性Ｂ細胞からなっていた。前記の培地１００μｌ中の３×１０⁶個の細胞を、液体が漏れないようにワックスペンの環を用いて組織切片の上に接種した。その切片を振とう器上で水平に、６０ｒｐｍ、＋４℃で、３０分間回転させた。培養後、吸収性の紙で培地を静かに除去し、そのスライドを１．５％冷グルタルアルデヒド中で一晩固定した。そのスライドをチオニンで３０分間染色した。過剰のチオニンをＰＢＳ中でスライドから洗い流し、そのスライドをＰＢＳ−グリセロール（１：１）またはアクアマウント・マウンタント（ＡｑｕａｍｏｕｎｔＭｏｕｎｔａｎｔ）（ビーエイチディー・リミテッド（BHD Limited）、プール、英国）で固定した。これらの調製物から、種々の構造に結合したリンパ球の数を決定した。各試料から少なくとも１０〜２０個の高倍率視野を分析し、各群に３〜４匹の動物を含めた。心臓移植の拒絶中の白血球浸潤同種移植片から調製した組織切片中の内皮は、正常な心臓の同系移植片から調製した切片中の内皮と比べて、有意に多くのリンパ球と結合した（表１、図１）。解剖学上の位置をより詳細に分析する場合は、内皮をその血管構造のサイズに従って数種類のカテゴリーに分類した：(i)心内膜、(ii)細動脈、(iii)細静脈および(iv)筋間毛細管。リンパ球接着をこれらの様々な区画でアッセイしたところ、拒絶中は筋間毛細管と細静脈上に増大していることがわかった（表１、図１）。全ての心臓切片中の心筋層に対して、一定で低いリンパ球のバックグラウンド結合があった。リンパ球−内皮接着の特異性はいくつかの方法で立証された：i)これは、同系移植片と正常な無治療の心臓には事実上存在しなかった（表１）、ii)これは接着性白血球の起源によって左右されなかった（すなわちＤＡ細胞とＷＦ細胞はいずれもＤＡからＷＦへの移植片に等しく接着した（非掲載データ）、iii)これは、リンパ球を添加する前に組織切片をシアリダーゼで処理することによって阻害された。腎臓同種移植片の内皮に対して結合したリンパ球の増大 in vitroスタンパー−ウッドラッフアッセイでは、同種移植片の内皮に対して結合したリンパ球が、同系移植片または対照腎臓の内皮と比べて、４倍増大した。同種移植片中の結合したリンパ球の大半は、尿細管周辺毛細管内皮（ＰＴＣＥ）に位置し、一方、同種移植片中の主要血管および糸球体の内皮は、同系移植片または正常な腎臓中の同じ構造より有意に多いリンパ球を接着しなかった。腎臓移植片拒絶中のＰＴＣＥに対するリンパ球接着は、その大半がＬ−セレクチン依存性であることが明らかにされている。同時に、拒絶性腎臓のＰＴＣＥは、リンパ節高内皮と類似する形態上の特徴を示し、抗ｓＬｅｘｍＡｂおよびＬ−セレクチン−ＩｇＧ融合タンパク質と新規に（de novo）反応し始めた（Renkonen,R. ら，Am.J.Pathol．137:643-651(1990);Turunen,J.ら，Eur.J.Immunol．24:1130- 1136(1994)）。新規接着阻害分子の試験本発明による全ての新規オリゴ糖構築物類を、急性拒絶を起しているラット心臓および腎臓移植の内皮に対するリンパ球の接着（これらはＬ−セレクチンが本質的な役割を果たすモデルに相当する）を阻害するそれらの能力について試験した。オリゴ糖類を結合緩衝液に溶解し、リンパ球をこれらの溶液中、＋４℃で３０分間インキュベートした。その後、その糖溶液中のリンパ球をさらに洗浄することなくスタンパー−ウッドラッフ結合アッセイに加え、そのアッセイを上述のように行なった。実施例２分枝状ポリラクトサミン骨格を持つ合成グリカンの合成と特徴づけ（太字の番号は表２のグリカン構造に対応する）材料と方法受容体糖類Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）はシグマ（Sigma ）から購入した。グリカン２と７は、既述のごとく（Renkonen,O.ら，Biochem .Cell Biol．68:1032-1036(1990);Seppo,A.ら，Biochemistry 34:4655-4662(199 5)）、酵素を利用するin vitroでの合成法によって合成した。酵素調製物 α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を含有するヒト胎盤ミクロソーム（van den EijndenおよびSchiphorst,J.Biol.Chem．256:3159-3162(1981)）はつぎのように調製した：新鮮なヒト胎盤１００ｇを５００ｍｌの冷０．１Ｍトリス−マレイン酸ｐＨ６．７中、＋４℃でホモジナイズした。そのホモジネートを３４００ｇ、＋４℃で３０分間遠心分離し、その上清をさらに２００，０００ｇ、＋４℃で６０分間遠心分離した。そのミクロソームペレットを１０ｍｌの０．１Ｍトリス−マレイン酸ｐＨ６．７に懸濁して、８０ｍｇ／ｍｌのタンパク質（Bradford,M.M.,Anal.Biochem．72:248-254(1976)）を含有する懸濁液をえた。 α１，３／４−フコシルトランスフェラーゼは、エスピー−セファデックス（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｃ−５０を使用して、既述のごとく（Eppenberger-Ca stori,S.ら,Glycoconjugate J．6:101-114(1989)）、ヒト乳汁から抽出した。１Ｌの解凍乳から出発して、１００ｍｌのフコシルトランスフェラーゼ液をえた。その溶液を、３０ｋＤカットオフ膜カートリッジを装着したアミコン（Amicon）限外濾過装置を使用して５ｍｌに濃縮した。この調製物は８ｍＵ／ｍｌの総フコシルトランスフェラーゼと０．７９ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有した。トランスフェラーゼ反応 α２，３−シアリルトランスフェラーゼ反応は、受容部位（すなわち非還元末端ガラクトース残基）１００〜２００ｎｍｏｌに相当するオリゴ糖受容体、１０倍モル過剰のＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃおよびα２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を含有するヒト胎盤ミクロソーム２５μｌを含んだ０．１Ｍトリス−マレイン酸（ｐＨ６．７）１００μｌ中で行なった。この反応混合物を３７℃で１２〜１８時間インキュベートし、１００μｌの水を添加して、沸騰水浴中で２分間加熱することにより、反応を停止した。沈澱したタンパク質を遠心分離によって除去し、その上清と洗浄液を凍結乾燥し、その混合物からスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５ＨＲカラムでのゲル濾過によってオリゴ糖を精製した。α １，３／４−フコシルトランスフェラーゼ反応は、既述のごとく行い（Palcic,M .M.ら,Carbohydr.Res．190:1-11(19 89)）、スーパーデックス７５ＨＲカラムでのゲル濾過によって停止した。グリコシダーゼ消化シアリダーゼ反応については、１〜４ｎｍｏｌのオリゴ糖を１６μｌの０．1 Ｍ酢酸ナトリウム（soldium acetate）緩衝液ｐＨ５．０に溶解した。アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のシアリダーゼ（ベーリンガー（Boehringer））４０ｍＵ（４μｌ）を加えることによって反応を開始し、その反応混合物を３７℃で１６時間インキュベートし、スーパーデックス７５カラムでのゲル濾過によって停止した。 β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの同時反応用に、１〜２０ｎｍｏｌのオリゴ糖を３０μｌのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０に溶解した。１５０ｍＵ（２．４μｌ）のタチナタマメ（ｊａｃｋｂｅａｎ）β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（シグマ）と１００ｍＵ（１５μｌ）のタチナタマメβ−ガラクトシダーゼ（シグマ）をその反応混合物に加えることによって、反応を開始した。インキュベート（３７℃で１６時間）した後、沸騰水浴中で３分間加熱することにより反応を停止した。クロマトグラフィー法パルス電流検出による高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ− ＰＡＤ）をジオネックス・カルボパック（ＤｉｏｎｅｘＣａｒｂｏＰａｃ）ＰＡ−１カラム（４×２５０ｍｍ）で、既述のごとく行なった（Helin,J.ら，Carbohydr. Res.266:191-209(1995)）。このカラムは１ｍｌ／分の速度で溶出し、試料注入前に出発緩衝液で平衡化した。ピークを手動で集め、０．５倍容量の冷０．４酢酸を加えることによって直ちに中和し、減圧遠心機で乾燥した。乾燥した物質を、スーパーデックス７５カラムでの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ゲル濾過によって脱塩した。モノＱ（５／５）カラム（ファルマシア(Pharmacia)）での陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＬＫＢ２１５０ＨＰＬＣポンプと低圧混合システムを装着したＬＫＢ２１５２ＨＰＬＣコントローラーを用いて行なった。水で平衡化したそのカラムを、図５に示すように、１ｍｌ／分の速度で最初は水で無勾配的に溶出し、つぎにＮａＣｌの直線的勾配で溶出した。流出液をクラトス・スペクトロフロー（ＫｒａｔｏｓＳｐｅｃｔｒｏｆｌｏｗ）７５７ＵＶモニターを用いて２１４ｎｍまたは２０５ｎｍで監視した。図５に示すモノ−、ジ−およびトリ−シアリル化マーカーは、それぞれＮｅｕＮＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（オックスフォード・グリコシステムズ(Oxford Glycosystems)）、ＮｅｕＮＡα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＮｅｕＮＡα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎ β１−４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕＮＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ β１−２Ｍａｎα１−６（ＮｅｕＮＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ １−４［ＮｅｕＮＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２］Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃである。後者の２つのマーカーはジェラルド・ストレッカー（ＧｅｒａｒｄＳｔｒｅｃｋｅｒ）博士（フランス・リール大学）の厚意により贈られたものである。スーパーデックス７５ＨＲ（１０／３０）カラム（ファルマシア、スウェーデン）でのＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィーは、ＬＫＢ２１５０ＨＰＬＣポンプを用いて行なった。このカラムは、カラムのイオン交換作用を抑制するために５０ｍＭＮＨ₄ＨＣＯ₃を用いて１ｍｌ／分の速度で溶出した。流出液をスペクトラ−フィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）８４５０ＵＶモニターを用いて２１４ｎｍまたは２０５ｎｍで監視した。各ピーク中の糖類の量は、外部標準（ＧｌｃＮＡｃまたはＮｅｕＮＡｃ）を参照し、各ピーク中のカルボニル基数を考慮して、ピーク面積から見積もった。定量の精度は±２０％より良いと判断される。ＮＭＲ分光法ＮＭＲ分析に先立って、オリゴ糖試料を９９．９６％Ｄ₂Ｏ（シーアイエル(C. I.L.)、マサチューセッツ州、米国）に繰返し溶解し、凍結乾燥した。最後に試料を９９．９９６％Ｄ₂Ｏに溶解し、ナイロン膜フィルターに通した。¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、バリアン・ユニティー（ＶａｒｉａｎＵｎｉｔｙ）−５００分光計を５００ＭＨｚのプロトン周波数で操作することにより記録した。プローブ温度はサーモスタットで２３℃また２７℃に調節した。キャリア−周波数を残存Ｈ₂Ｏ／ＨＤＯシグナル上に置き、溶媒抑制は修正ＷＥＦＴシークエンスを用いて達成した。化学シフト値は、２．２２５ｐｐｍに設定した内部アセトンシグナルを参照してｐｐｍの目盛りで表わす。オリゴ糖中の個々の単糖残基は、その単糖からそのグリカンの還元末端へのグリコシド結合を最も簡略で明白な方法で示す上付き文字によって表わす。質量分析誘導体化されていないオリゴ糖のマトリックス補助レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は、ＬＡＳＥＲＭＡＴ装置（フィニガン・マット・リミテッド(Finnigan MAT Ltd.)、英国）を用いて行なった。操作条件と操作法はＫａｒａｓらの研究（Karasおよび旧llenkamp,Anal.Chem．60:2299-2301(1988) ）にならった。試料を５０ｍＭ２，５−ジヒドロキシ安息香酸（容量比７０：３０のアセトニトリル／水中）に溶解し、１０〜３０ｐｍｏｌのオリゴ糖を含有するその混合物１μｌを標準的なステンレス鋼ターゲットにのせた。その小滴を微晶質の形態に乾燥させた後、装置に挿入した。オックスフォード・グリコシステムズ（英国）から入手したオリゴマンノース９（Ｍａｎ₉ＧｌｃＮＡｃ₂；Ｍｗ＝１８８４；起源：ブタチログロブリン）を外部標準として使用した。表２本研究の合成中間体および生成物の構造オリゴ糖の酵素的合成１価およびオリゴ価（ｏｌｉｇｏｖａｌｅｎｔ）シアリルルイスｘグリカン（ｓＬｅｘ）とそれらのフコース非含有類似体（シアリルＬＮ）を代表する細胞接着実験用のオリゴ糖を酵素的に合成した。この合成には、既に生成されているポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン骨格（Renkonen,O.ら，Biochem.Cell Biol．68:1 032-1036(1990);Seppo,A.ら，Biochemistry 34:4655-4662(1995)）を使用し、それらを酵素的なα２，３−シアリル化およびα１，３−フコシル化反応で１価、２価および４価のｓＬｅｘグリカン１、４および９（構造については表２を参照のこと）に変換した。グリカン９は、実際に単糖プライマーから出発してこれまでに構築されたなかで、最も大きい純粋なオリゴ糖に相当する。ほかの合成生成物と同様に、ＮＭＲ分光法と質量分光法を含むいくつかの技術を用いて、これを詳細に特徴づけた。すべてのフコース残基は、予想通り（Niemela,R.ら，Glycoc onjugate J．12:36-44(1995)）、グリカン３および８の近位および「内部」のＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ残基にではなく、シアリル化されたＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ残基に転移したが、グリカン８の４つのシアリル化Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ単位のうちの１つは、そのほかのものよりはるかにゆっくりと反応し、予想外に純粋な形態のトリフコシル中間体（グリカン１０または１１）が生成した。１価ｓＬｅｘグリカン１の合成グリカン１は、本質的に既述のごとく（de Vriesら， FEBS Lett.,330:243-248(1993)）、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃから酵素的なα ２，３−シアリル化と、それに続く酵素的なα１，３−フコシル化によって製造した。その精製物を５００ＭＨｚにおける¹Ｈ−核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって特徴づけたところ、過去に記述されているものと同じスペクトルが観測された（非掲載データ）（Ballら，J.Am.Chem.Soc．114:5449-5451(1992);de Vrie sら，FEBS Lett.,330:243-248(1993)）。グリカン３の合成ビアンテナグリカン２の酵素的生成は既に記述されている（Renkonen O.ら，B iochem.Cell Biol．68:1032-1036(1990)）。ここでは、その未満Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ単位を末端α２，３結合シアル酸で修飾した。グリカン２（１００ｎｍｏｌ）をＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃおよびヒト胎盤ミクロソーム中に存在するα ２，３シアリルトランスフェラーゼとともにインキュベートし、えられた混合物を陰イオン交換ＨＰＬＣによって分画した。ジシアリル化したオリゴ糖マーカーと同様に溶出する画分（８５ｎｍｏｌ）を合わせ、凍結乾燥し、ゲル濾過によって脱塩し、ＮＭＲ分析に供した。そのジシアリル化生成物の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図３Ｂ、化学シフト値については表３を参照のこと）は、それがグリカン３に相当することを示している。グリカン２のスペクトル（図３Ａ、表３）と比較すると、２つのＮｅｕＮＡｃの付加が、それぞれ２．７５７ｐｐｍと１．７９９ｐｐｍにＮｅｕＮＡｃＨ− ３ａｘとＨ−３ｅｑの２当量のシグナルが出現することによって示される（図３Ｂ）。受容体残基³Ｇａｌと⁶ＧａｌのＨ−１シグナルはそれぞれ＋０．０８１ｐｐｍと＋０．０７９ｐｐｍ低磁場にシフトし、２当量の新しいシグナルが４．１１７ｐｐｍに現われる。これはα２，３−シアリル化ガラクトースのＨ−３に割り当てられる。これらのリポーター基シグナルは遠位ガラクトースのα２，３シアリル化に特有である（Vliegenthart,J.F.Gら,Adv.Carbohydr.Che m.Biochem．41:209-374(1983);KamerlingおよびVliegenthart,Biol.Magn.Res．1 0:1-287(1992);Machytka,D.ら，Carbohydr.Res．254:289-294(1994)）。グリカン４の合成グリカン３の試料（７５ｎｍｏｌ）をＧＤＰ−Ｆｕｃおよびヒト乳汁α１，３ −フコシルトランスフェラーゼとともにインキュベートした。その反応混合物をモノＱイオン交換クロマトグラフィーにかけると、ジシアリル化マーカーオリゴ糖と同様に溶出するピークがえられた（非掲載）。この物質をＨＰＡＥクロマトグラフィーにかけて、単一の主ピーク（７４ｎｍｏｌ、図４Ａ）をえた。この物質は出発物質または部分反応でえたモノフコシル化生成物（下記参照）よりも早く溶出し、それがジフコシル化生成物に相当することを示した（Hardy,M.R.およびTownsend,R.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3289-3293(1988)）。ジフコシル化生成物の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図３Ｃ、表３）は、２つのフコースが受容体に転移して、グリカン４がえられたことを示した。これらのフコースのＨ−１シグナルは、５．１１７ｐｐｍと４．０７８（α）／５．０９１（β）ｐｐｍで共鳴した（それぞれ³ＦｕｃＨ−１と⁶ＦｕｃＨ−１）。グリカン４でも、³Ｇａｌと⁶ＧａｌのＨ−１シグナルがグリカン３の対応するシグナルと比較するとシフトしていた（それぞれ−０．０２７ｐｐｍと−０．０２８ｐｐｍ）。これに対し、分枝しているガラクトースのＨ−１シグナルは事実上影響を受けず、還元末端のＧｌｃＮＡｃがフコシル化されなかったことを示した。これは、ポリラクトサミンの分枝形成Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ残基が、使用した条件ではフコシル化されないことを示す我々の過去のデータ jugate J．12:36-44(1995)）。グリカン５および６の合成反応時間とＧＤＰ−［¹⁴Ｃ］Ｆｕｃ供与体の量を制限することにより、グリカン３を用いて部分的フコシルトランスフェラーゼ反応も行なった。その反応混合物のＨＰＡＥクロマトグラフィー（図４Ｂ）では、それぞれジフコシル化生成物４および未反応の受容体３と同様に溶出するピークＤ１とＤ３を示した。中間ピークＤ２はモノフコシル化生成物５と６の混合物に相当する。その組成を明らかにするために、Ｄ２混合物を脱シアリル化した後、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼとともにインキュベートした。これは非フコシル化分枝を侵食したが（Kobata,A.,Anal.Biochem．100:1-14(1979)）、フコシル化されている側鎖は無傷のまま残った（すなわち脱シアリル化した５の上側の分枝と、脱シアリル化した６の下側の分枝を無傷のまま残った）。えられた異性体５糖類の混合物をペーパークロマトグラフィーによって最終的に分離した（図４Ｃ）（Niemela,R.ら，Glycoconjugate J．12:36-44(1 995)）。そのデータは、ピークＤ２が５と６の１：３混合物に相当することを明らかにした。ピークＤ２のＮＭＲスペクトルは、５．１１７ｐｐｍに強いＦｕｃＨ−１シグナルと５．０７８／５．０９１ｐｐｍに弱いシグナルを示し、グリカン４中の対応するシグナルの明白な割り当てを可能にした（表３）。本発明者らは過去に、３だけでなくビアンテナグリカン２も、使用した条件下に、部分反応において、１，３−結合分枝が優先的にα１，３フコシル化されることを示している（Niemela,R.ら，Glycoconjugate J．12:36-44(1995)）。表３：合成グリカン２〜４および６の構造レポーター基シグナルの ¹Ｈ−ＮＭＲ化学シフト^a ａ）化学シフトは2.225ppmにセットした内部アセトンシグナルを参照することにより、ppm尺度で示した。スラッシュにより分離されている２つの値が共鳴するばあいは、それらの値は当該分子のα／βアノマーに関する。ｂ）単糖残基の位置を正確に示すことについては、材料および方法の項を参照のこと。 N.D．測定不能グリカン８の合成テトラアンテナグリカン７の酵素的生成は既に記述されている（Seppo,A.ら， Biochemistry 34:4655-4662(1995)）。ここでは、その末端Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ単位を末端α２，３−ＮｅｕＮＡｃで修飾した。７の試料（７５ｎｍｏｌ）をＣＭＰ−ＮｅｕＮＡｃおよびα２，３シアリルトランスフェラーゼとともにインキュベートした後、上述のように処理した。モノＱカラムでのイオン交換クロマトグラフィー（図５Ａ）では、トリシアロオリゴ糖マーカーと同様に溶出する副生成物がえられ、主生成物（５９ｎｍｏｌ）はそれより遅く溶出した。主生成物の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、それが化合物８であることが確認される（図６Ｂ、表４）。受容体グリカン７のスペクトル（図６Ａ）と比較すると、８のスペクトルは、４当量のＮｅｕＮＡｃがα２，３結合で転移したことを明らかに示している。１．８０３ｐｐｍのＮｅｕＮＡｃＨ−３ａｘシグナルと２．７５６ｐｐｍのＨ−３ｅｑシグナル（ともに４当量）が出現することは、新たに付加されたＮｅｕＮＡｃ残基が実際にα２，３結合していることを示している（Vliegenthart,J.F.G.ら，Adv.Carbohydr.Chem.Biochem．41:209-374(1983);Ka merlingおよびVliegenthart,Biol.Magn.Res．10:1-287(1992);Machytka,D.ら，C arbohydr.Res．254:289-294(1994)）。この考えは、末端から２番目のガラクトースのＨ−３に割り当てることができる４ピークパターンが４．１１９ｐｐｍに出現することによって裏付けられる。末端から２番目のガラクトースのＨ−１シグナルも、３の場合と同様に、特徴的に＋０．０８０ｐｐｍ低磁場シフトし、この分子中の受容部位を正確に示している。表４：合成グリカン７〜９の構造レポーター基シグナルの ¹Ｈ−ＮＭＲ化学シフト^a ａ）化学シフトは2.225ppmにセットした内部アセトンシグナルを参照することにより、ppm尺度で示した。共鳴に２つの値があるばあいは、それらは各々当該分子のα／βアノマーに関する。ｂ）単糖残基の位置を正確に示すことについては、材料および方法の項を参照のこと。ｃ）（27）からのデータｄ，ｅ）割りあてを交換しなければならないのかもしれない。ｆ）^6,6FucH−１および^6,3FucH−１シグナルを別々に示すことができなかった。 N.D．測定不能グリカン９の合成グリカン８をＧＤＰ−Ｆｕｃおよびヒト乳汁由来のα１，３フコシルトランスフェラーゼとともにインキュベートした。その反応混合物をＨＰＡＥクロマトグラフィー（図５Ｂ）によって分画したところ、出発物質より早く溶出する２つの主ピークがえられた。ピークＴ１はテトラシアローテトラフコ−グリカン９であることがわかった。一方、ピークＴ２はテトラシアロ−トリフコーグリカンのほとんど純粋な単一の異性体に相当した。微量ピークＴ３はテトラシアロ−ジフコ −グリカンの混合物であると考えられる。Ｔ１グリカンをＡ．ウレアファシエンス（A.ureafaciens）由来のシアリダーゼで脱シアリル化した後、β−ガラクトシダーゼおよびβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの同時処理に供した。その後、ゲル濾過を行い、それに続いてＨＰＡＥクロマトグラフィーを行なったところ、脱シアリル化されたＴ１が無傷のままであることが明らかになった（非掲載データ）。このデータから、４つのフコースがＴ１中に存在し、それらが受容体グリカン８の非還元末端にあるシアリル化されたＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ単位に結合していることが確認された。したがってＴ１糖類は、グリカン９に相当した。Ｔ１糖類の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図６Ｃ；表４）により、４つのα結合フコースが存在することが確認される。これは、それぞれ５．１１９ｐｍ（２当量）、５．０８４ｐｐｍおよび５．０７６ｐｐｍ（各１当量）にある４つのＦｕｃＨ−１シグナルと、１．６６８ｐｐｍ（１２当量）のＦｕｃＨ−６シグナルとして認めることができる。４．８１ｐｐｍ付近のＦｕｃＨ−５シグナルは残存ＨＤＯピークと著しく重複しているので、正確にその位置を特定し、測定することができない。８中のガラクトースのＨ−１シグナルのうち、末端から２番目のシアリル化された残基のものだけが、フコシル化したときにシフトした。これらのシフト（^3, ³ Ｇａｌ＋^3,6Ｇａｌについては−０．０２５ｐｐｍ、^3,3Ｇａｌ＋^3,6Ｇａｌについては−０．０２７ｐｐｍ）により、フコシル化とシアリル化は７の末端Ｇａｌ β１−４ＧｌｃＮＡｃ単位でのみ起こったことが確認される。本発明者らは、８または９中にα２，６結合したＮｅｕＮａｃの信号を一切検出しなかった。たとえ８中の少量のα２，６−ＮｅｕＮＡｃが本発明者らのＮＭＲ分析を免れたとしても、それらはフコシル化されえないから、テトラフコシルグリカン９からは排除されているだろう（Paulson,J.C.ら，J.Biol.Chem．253:5617-5624(1978)）。１０または１１に相当する合成グリカンの特徴づけＴ２物質（図６Ｃ、表４）のほとんどは、一つの末端分枝にはＦｕｃがないが、ほかの３つの分枝にはＦｕｃが存在する、単一の異性体に相当した。グリカン９のスペクトルと比較すると、５．０８４ｐｐｍのＦｕｃＨ−１シグナルがＴ２糖類ではきわめて著しく減少していた。グリカン９では、このシグナルが^6,6 ＧｌｃＮＡｃまたは^6,3ＧｌｃＮＡｃに結合したフコースのＨ−１に割り当てられる。したがって、Ｔ２糖類はほとんど純粋な形態のグリカン１０またはグリカン１１に相当する。脱シアリル化したＴ１およびＴ２糖類中のＦｕｃ残基数をマトリックス補助レーザーディソープション質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって確認した。脱シアリル化したＴ１糖類（図７Ａ）は、ｍ／ｚ＝３１８３Ｄａ（［Ｆｕｃ₄Ｈｅｘ₇ＨｅｘＮＡｃ₇＋ＮＡ⁺］に関する計算値３１８３Ｄａ）の単一ピークを示し、脱シアリル化したＴ２糖類（図７Ｂ）はｍ／ｚ＝３０３５Ｄａ（［Ｆｕｃ₃Ｈｅｘ₇ＨｅｘＮＡ_c7+Ｎａ⁺］に関する計算値３０３５Ｄａ）の単一ピークを示した。実施例３酵素的合成シアリルルイスｘ型オリゴ糖類はいずれも心臓移植片を拒絶する内皮に対するリンパ球接着を阻害する心臓移植片拒絶は移植片へのリンパ球の大量の浸潤を特徴とする（Renkonen,R .ら，Cell.Immunol．77:188-19 Turunen,J.P.ら，Transplantation 54:1053-1058(1992)）。本願は、正常な動物ではｓＬｅａとｓＬｅｘを発現させない心臓内皮が、移植片拒絶エピソード（ｅｐｉｓｏｄｅ）中に、これらのオリゴ糖エピトープを発現するように誘導されうることを示す。シアリル化ルイスオリゴ糖類のこの新規発現は、ｓＬｅａ−、ｓＬｅｘ−およびＬ−セレクチン−依存的に、内皮に対するリンパ球接着を増大させる。拒絶された心臓移植片の内皮は、Ｌ−セレクチン−ＩｇＧ融合タンパク質で直接染色されるが、正常な心臓または同系移植片の内皮ではこれが起こらない。オリゴ糖による、急性拒絶エピソード中の心臓内皮に対するリンパ球接着の阻害を、酵素利用合成法によって実施例２で合成したオリゴ糖のファミリー、すなわち１価ｓＬｅｘ４糖類（１）、２価ｓＬｅｘ１０糖類（４）および４価ｓＬｅｘ２２量体オリゴ糖（９）ならびにそれらの非フコシル化シアリルラクトサミン類似体（３、８）を用いて調べた。リンパ球を様々な濃度のオリゴ糖と共に３０分間、プレインキュベートした後、さらに洗浄することなくスタンパー−ウッドラッフ結合アッセイに入れた。これらのオリゴ糖は、正常な心臓組織に対する結合よりわずかに高いに過ぎない同系移植片へのリンパ球結合を有意に変化させることはなかった（表１と非掲載データ）。一方、上記ｓＬｅｘファミリーの要素はいずれも、心臓内皮に対するリンパ球接着の阻害に有効であったが、４価ｓＬｅｘはほかのｓＬｅｘオリゴ糖と比べて明らかに優れていた（図２）。同時に、非フコシル化シアリルラクトサミングリカンは効果がなかった。これらの結果は、４価ｓＬｅｘ（２２量体オリゴ糖）が、心臓内皮に対するＬ −セレクチン依存性リンパ球接着の阻害に関して、２価または１価ｓＬｅｘオリゴ糖（それぞれ１０量体および４量体）より優れていることを示している。対照的に、ｓＬＮオリゴ糖類はリンパ球接着に対してなにも効果がなかった。総合するとこれらのデータは、心臓同種移植片を拒絶する際におけるＬ−セレクチン依存性リンパ球炎症の発生には、ｓＬｅａとｓＬｅｘの内皮発現の上方調節がきわめて重要であることおよびオリゴ糖がこの過程を阻害できることを示している。実施例４多価ｓＬｅｘオリゴ糖はリンパ球接着の高親和性阻害剤である（太字の番号は表２のグリカン構造に対応する）実施例１に記載の動物モデルを用いて、腎臓移植片が急性拒絶を受けている移植後３日目に、腎臓移植片を摘出した。リンパ球を様々なオリゴ糖構築物とともに３０分間プレインキュベーションし、もしくはこのプレインキュベーションを行なわずに、スタンパー−ウッドラッフ結合アッセイに加えた。３０分間の結合アッセイ後、遊離した細胞を洗い流し、結合した細胞の数を決定した。図８からわかるように、α２，３−シアル酸−およびα１，３−フコース含有ポリラクトサミン類（すなわち１価、２価および４価ｓＬｅｘ、それぞれ構造１、４および９）はすべて、ＰＴＣＥに対するリンパ球の結合を有意に阻害することができた。リンパ球接着は、０．５μＭの１価ｓＬｅｘ（１）で３９％減少し、２価および４価ｓＬｅｘ（４および９）のＩＣ₅₀値はそれぞれ１．０μＭおよび＜０．０５μＭだった。使用したなかで最も有効な濃度において、グリカン９はリンパ球接着を７３％まで阻害し、これは、これと同じ検定法で機能的に活性な抗Ｌ−セレクチン抗体ＨＲＬ−１（Turunen,J.ら，Eur.J.Immunol．24:1130-1136(1994) ）を用いてえられる６０％阻害よりもわずかに良い。フコース非含有構造、すなわちシアリルラクトサミンならびにグリカン３および８と、非機能的抗Ｌ−セレクチン抗体はいずれも、リンパ球接着を阻害せず、このアッセイにおけるフコースの決定的な役割を示した。４価グリカン９は明らかに最も強力な阻害剤であり、このことは、それがリンパ球表面上の数個のＬ−セレクチン分子に結合しうることを示唆している。このアッセイで主としてＬ−セレクチン依存性接着が測定されることは既に明らかにされている。α１，３結合したフコシル残基は、この結合アッセイにおける阻害性糖類の必須の構造的特徴を表わす。これは、Ｌ−セレクチン結合能を持つオリゴ糖類の特徴でもある（Foxall,C.ら，J.CellBiol．117:895-902(1992);I mai,Y.ら，Glycobiology 2:373-381(1992)）。このアッセイにおけるＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチン依存性接着の役割を排除することはできないが、使用したリンパ球はｓＬｅｘ陰性であるから、前記接着が起こる可能性は少ない。合成ｓＬｅｘグリカンのうち、４価の９は明らかにもっとも強力なリンパ球接着阻害剤であった（ＩＣ₅₀＜５０ｎＭ）。この実験で使用したｓＬｅｘ−グリカンの用量範囲は、マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ）上に固定した組換えセレクチンおよび１価ｓＬｅｘについて文献に報告されているもの（Foxall,C.ら，J．Cell Biol.117:895-902(1992)）より１０００倍低かった。結合力があまりに異なるので（Varki,A.,Proc.Natl.Acad.Sci．91:73 90-7397(1994)）、使用された２つのアッセイ（スタンパー−ウッドラッフおよびプレート上の固定組換えセレクチン）を直接比較することはおそらくできないだろう。Ｌ−セレクチンに対するグリカン９の高い親和性は、結合性ｓＬｅｘエピトープの多価性によって生じている可能性がきわめて高い。このことから、１分子の９が、スタンパー−ウッドラッフアッセイにおいて、リンパ球表面上のＬ−セレクチンの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）数個に結合するという可能性が生じる。細胞表面におけるＬ−セレクチンＣＤＲの架橋は、そのタンパク質のモノマー−オリゴマー状態とは無関係に起こりうる。ほかの表面構成要素との相互作用によって固定化されているモノマー型レセプターでさえ、２価のシアロシド（ｓｉａｌｏｓｉｄｅ）により、無傷のインフルエンザウイルス中の個々の血球凝集素トリマーで、細胞表面上で架橋型になりうる（Glick,G.D.ら，J.Biol.Chem．266:23660 -23669(1991)）。グリカン９中でｓＬｅｘ決定基同士を連結している糖鎖の長さも潜在的に重要である。９中のｓＬｅｘエピトープは、５つの単糖単位程度からなる鎖によって相互に連結されている。また、これらの鎖はすべて、少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｇａｌ結合を含有し、それによってその長さと柔軟性がさらに増している。結合性エピトープと結合する長くて柔軟な糖鎖スペーサーは、Ｌ−セレクチンのレクチンドメインの架橋につながる９の多座結合の確率を増大させると考えられる。５μＭの一次溶液を希釈すると、９の阻害効率の増大が一貫して観測された（図２および８）。このことは、５μＭでは豊富な４価リガンドが主として１価の形式でＬ−セレクチン分子に結合している可能性があり、これに対して、このリガンドを希釈すると９の多座結合の可能性が増大したことを示唆している。真のオリゴマーであれ、「機能上の」オリゴマー（たとえばほかの細胞表面構成要素によって相互連結されたモノマー）であれ、いずれにせよＬ−セレクチンは、１価として結合したリガンドよりも多価として結合した阻害剤を伴う状態の方が、ＰＴＣＥ結合に利用されにくいようである。適当な膜結合レクチンに対してとりわけ高い親和性を持つ多価糖リガンドの例はいくつかある。Ｌｅｅらの古典的な研究（Lee,R.T.ら，Biochemistry 23:4255-4 261(1981);Lee,R.T.ら，Biochemistry 28:8351-8358(1989)）は、オリゴマー型レクチンが多価糖リガンドをとりわけ高い親和性で結合することを示した。またほかにも、４つの末端Ｇａｌα１−３Ｇａｌ残基を含有する４価オリゴ糖はマウス精子の卵子に対する接着を効率よく阻害するが、類似の１価５糖Ｇａｌα１− ３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃは前記接着を阻害しないことも示されている（Litscher,E.ら，Biochemistry 34:4662-(199 5)）。さらに、Ｅ−セレクチンのオリゴ価ｓＬｅｘリガンドは１価ｓＬｅｘよりも良好な接着阻害剤であることも観測されている（DeFrees,S.A.ら，J.Am.Chem. Soc．115:7549-7550(1993);Welply,J.K.ら，Glycobiol．4:259-265(1994)）が、これまでのところ、Ｌ−セレクチン依存性モデル系におけるリンパ球接着の阻害に多価リガンドが増大した効力を持つことは、本研究によって初めて立証されたのである。合成グリカン９は、この実験のスタンパー−ウッドラッフ結合アッセイにおけるＬ−セレクチン媒介性細胞接着を、きわめて低濃度で阻害した。ラットとネコを用いたin vivo注射実験からえられたデータも、短期Ｐ−セレクチン媒介性炎症の阻害に関する低濃度ｓＬｅｘの重要性を立証している（Mulligan,M.S.ら，J .Exp.Med．17 8:623-631(1993);Mulligan,M.S.ら，Nature 364:149-151(1993);Buerke,M.ら，J .Clin.Invest．93:1140-1148(1994)）。長期（４８時間）炎症反応でさえ、抗Ｌ −セレクチンｍＡｂを動物に連続的に注入することによって阻害することができる。興味深いことに、これらの動物は末梢血白血球の百分率数に変動を生じなかった（Arbones,M.L.ら，Immunity 1:247-260(1994);PizcuetaおよびLuscinskas, Am.J.Pathol．145:461-469(1994)）。それぞれ実施例２および６に記述したオリゴ糖（グリカン９とグリカン１７）の酵素的合成は、現在までに単糖類から出発して合成されたもののなかで最も大きい純粋なグリカンである。さらに、４価のテトラアンテナｓＬｅｘであるグリカン９は、大部分がＬ−セレクチン依存性であるモデルにおいて、内皮に対するリンパ球接着の優れた阻害剤であり、このことは、Ｌ−セレクチンがリンパ球表面で「機能的オリゴマー」としてふるまう可能性を示唆している。この研究で使用した１価ｓＬｅｘ−グリカンの用量範囲は、可溶性組換えＬ− セレクチンと固定化ｓＬｅｘ糖脂質の間の結合の阻害について報告されたもの（ Foxall,C.ら，J.Cell Biol．117:895-902(1992)）より１０００倍低かった。明らかに、これら２つの検定データを直接比較することはできない（Varki,A.,Pro c.Natl.Acad.Sci．91:7390-7397(1994)）。興味深いことに、糖類１、４および９と共にリンパ球と拒絶性ラット心臓内皮を用いて行なった結合実験でえられたスタンパー−ウッドラッフデータ（Turunen,J.P.ら，J.Exp.Med．182(4):1133-1 141(1995)）は、本研究のデータときわめて類似していた。この類似性はおそらく、両実験群におけるリンパ球表面のＬ−セレクチンと糖類の間の決定的な相互作用を反映しているのだろう。ラットとネコを用いるin vivo注射実験でえられたデータも、短期Ｐ−セレクチン媒介性炎症の阻害に関する低濃度の１価ｓＬｅｘの重要性を立証している（ Buerke,M.ら，J.Clin.Inv．93:1140-1148(1994);Mulligan,M.S.ら，J.Exp.Med． 178:623-631(1993);Mulligan M.S.ら，Nature 364:149-151(1993)）。長期（４８時間）炎症反応でさえ、抗Ｌ−セレクチンｍＡｂを動物に連続的に注入することによって阻害することができる。興味深いことに、これらの動物とＬ−セレクチンノックアウトマウスはいずれも、末梢血白血球の百分率数に変動を生じなかった（Arbones,M.L.ら，Immunity，1:247-260(1994);PizcuetaおよびLuscinskas ,Am.J.Pathol.，145:461-469(1994)）。実施例５ｓＬＥＸによる患者の治療炎症状態と診断された患者を、多価ｓＬｅｘ（たとえば４価ｓＬｅｘ２２糖類）を含む組成物で治療する。この組成物は、リンパ球が内皮細胞表面上の対応するオリゴ糖に結合するのを阻止するに足る用量で、薬学的に許容しうる賦形剤中に含まれる。この組成物は、その状態が充分に改善されるまで、血清濃度がほぼナノモル濃度〜マイクロモル濃度の範囲になるような方法で与えられる。患者に投与する場合、その組成物は、それを経口投与、非経口投与、経鼻投与、腸または直腸投与に適合させるような任意の方法で、従来の製薬上の慣行に従い、薬学的に許容しうる賦形剤またはビヒクル（たとえば等張食塩水など）を使って製剤化される。この薬剤の投薬レベルは、セレクチンを阻止することによって、とくにその患者におけるＬ−セレクチン媒介性接着事象を阻止することによって、抗炎症作用を与えるに足りるだろう。本発明の組成物および方法は、セレクチン、とくにＬ−セレクチン媒介性接着が増大した炎症反応を伴う任意の状態の治療に適している。したがってこの薬剤は、組織拒絶、関節炎、感染（とくに局所感染）、皮膚炎、炎症性腸疾患、自己免疫疾患などの状態の治療に有用である。本発明組成物の「有効なレベル」とは、その治療を受ける患者に何らかの改善が与えられるようなレベルを意味する。「異常な」宿主炎症状態とは、その対象のある部位における炎症のレベルが、その対象の健康な医学的状態に関する規範を超えていること、または望ましいレベルを超えていることを意味する。「２次的な」組織損傷または毒性効果とは、過剰なセレクチン（とくにＬ−セレクチン）接着事象（身体のどこかほかの場所での「１次」刺激の結果であるものを含む）が存在するために、そのほかの点では健康な組織、器官およびその中の細胞に起こる組織損傷または毒性効果を意味する。本発明の組成物を患者に注入すると、セレクチン発現白血球の「回転」能力、したがって内皮に対する結合能力が低下し、それゆえにそのような細胞の炎症部位に対する接着および内皮に対する集中的な損傷が予防または阻害され、したがって冒された組織または細胞への望ましくない白血球の移行または流入が予防されると考えられる。したがって本発明の薬学的組成物は、患者の天然セレクチン（とくにＬ−セレクチン）がその患者内の当該セレクチンの生物学的標的（具体的には内皮細胞）に結合するのを（完全にまたは部分的に）中和するに足る量で投与される。本発明のセレクチン結合性炭水化物および組成物の投与量と投与法は、関節炎、組織損傷および組織拒絶などの炎症関連傷害を治療する臨床分野の通常の当業者によって容易に決定されうる。一般的には、本発明組成物の投与量は、使用する合成炭水化物のタイプ、年齢、健康状態、治療される医学的状態、併用治療があればその種類、治療の頻度、望まれる効果の性質、組織損傷の程度、性別、症状の持続時間、もしあれば反適応症、および個々の医師が調節すべきそのほかの可変的要因などといった点に依存して変動するだろう。所望の結果をうるために、所望の投与量を１回でまたは複数回で投与することができる。実施例６直鎖状ポリラクトサミン骨格を持つ４価ｓＬｅｘグリカンの合成と特徴づけ（本実施例で使用する合成経路の概略を図９に示す。また太字の番号は図９中のグリカン構造に対応する）材料と方法８糖グリカン１２の合成６糖ＬａｃＮＡｃβ１−３’ＬａｃＮＡｃβ１−３’ＬａｃＮＡｃをＵＤＰ− ＧｌｃＮＡｃおよびラット血清中に存在する中心作用性のβ１，６−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮａｃからＧａｌへ）（Guら，.Biol.Chem.，267 :2994-2999(1992)）とともにインキュベートすることにより、その６糖を２つの β１，６結合ＧｌｃＮＡｃ分枝で修飾した。えられたグリカン１２をクロマトグラフィーによって精製し、分解実験と¹Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって詳細に特徴づけた。¹ Ｈ−ＮＭＲ分光法ＮＭＲ実験に先立って、糖類を²Ｈ₂Ｏから２回凍結乾燥した後、６００ｍｌの² Ｈ₂Ｏ（９９．９９６％、ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ（Camb ridge Isotope Laboratories）、マサチューセッツ州ウォーバーン（Ｗｏｕｒｎ）、米国）に溶解した。このＮＭＲ実験はバリアン・ユニティー５００分光計を用いて２３℃で行なった。プロトンスペクトルの記録には、ＷＥＦＴシーケンスの変法（Hardら，Eur.J.Biochem.，209:895-915(1992)）を使用した。¹Ｈ化学シフトはアセトン２．２２５ｐｐｍを基準にした。マトリックス補助レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、加速電圧５ｋＶ、検出器での後段加速４ｋＶで作動するフィニガン・ビジョン（ＦｉｎｎｉｇａｎＶｉｓｉｏｎ）２０００飛行時間型装置（サーモ・バイオアナリシス・リミテッド（ＴｈｅｒｍｏＢｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｌｔｄ．）、ヘメル・ヘムステッド（ＨｅｍｅｌＨｅｍｓｔｅａｄ）、英国）で、窒素レーザー（３３７ｎｍ）からの照射と、マトリックスとしての２，５−ジヒドロキシ安息香酸とを用いて、陽イオン反射モードで行なった。外部標準を使用した。質量の割り当ては、とくに明記しない限り平均質量値として報告する。トランスフェラーゼ反応ブタ胃β１，６−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（Pillerら，J.Biol.Chem ．259:13385-13390(1984)）、ウシ乳汁β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Brewら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，59:491-497(1968)）、ヒト血清β１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（YatesおよびWatkins,Carbohydr.Res．12 0:251-268(1983)）、ヒト胎盤α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（Nemansk yおよびvan den Eijnden，Glycoconjugate J.，10:99-108(1993)）およびヒト乳汁α１，３−フコシルトランスフェラーゼ（Eppenberger-Castoriら,Glycoconju gate J.，6:101-114(1989);Natunenら，Glycobiology，4:577-83(1994)）を用いる反応は、本質的に既述のごとく行なった（Maaheimoら，Eur.J.Biochem.，234: 616-625(1995)）。クロマトグラフィー法スーパーデックス７５ＨＲ（ファルマシア、スウェーデン）によるゲル浸透クロマトグラフィーは２つの連続カラム（１０×３００ｍｍ）を使用し、０．５ｍｌ／分にて水（中性糖類）または０．０５ＭＮＨ₄ ＨＣＯ₃（シアル酸含有糖類）で行なった。流出液を２１４ｎｍで監視し、オリゴ糖を外部ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃと対照して定量した。陰イオン交換クロマトグラフィーについては、モノＱ（５／５）カラム（ファルマシア）を１ｍｌ／分の速度で、最初は水で無勾配的に４分間溶出し、つぎに８分間で０Ｍから０．０５ＭＮａＣｌに至る直線勾配で溶出し、最後に８分間で０．０５Ｍから０．５ＭＮａＣｌに至る直線勾配で溶出した。パルス電流検出による高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ− ＰＡＤ）は、（４×２５０ｍｍの）ジオネックス・カルボパック（ＤｉｏｎｅｘＣａｒｂｏＰａｋ）ＰＡ−１カラムを用い、１ｍｌ／分の流速で、最初は１００ｍＭＮａＯＨ中の１００ｍＭ酢酸ナトリウムで無勾配的に５分間行い、つぎに５５分間で１００ｍＭＮａＯＨ中の１００ｍＭ酢酸ナトリウムから２００ｍＭ酢酸ナトリウムに至る直線勾配で行なった。集めた画分を０．４Ｍ酢酸水溶液で中和し、スーパーデックスＨＲ７５でのゲル浸透クロマトグラフィーを用いて脱塩した。エキソグリコシダーゼ消化Ａ．ウレアファシエンスシアリダーゼ（ベーリンガー、マンハイム（Mannheim ）、ドイツ）による切断については、糖試料を８０ｍＵの当該酵素とともに４０ μｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０中で一晩インキュベートした。タチナタマメ β−ガラクトシダーゼとのインキュベーションは既述のごとく行なった(Renkone nら，Glycoconjugate J．6:129-140(1989))。β−ガラクトシダーゼの並行反応において、２糖の（³Ｈ）Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃが完全に分解されて、（³ Ｈ）Ｇａｌが遊離された。直鎖ポリラクトサミン骨格を持つ４価ｓＬｅｘグリカン（グリカン１７）の酵素的合成この５段階合成は、オクタマーポリラクトサミンＬａｃＮＡｃβ１−３’（ＧｌｃＮＡｃβ１−６’）ＬａｃＮＡｃβ１−３’（ＧｌｃＮＡｃβ１−６’）ＬａｃＮＡｃ（１２）から出発した。８糖１２（１５０ｎｍｏｌ）をまずβ１，３−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ反応で伸長した。９糖１３といくつかの未反応１２をスーパーデックス７５ＨＲクロマトグラフィーによって混合物として単離し、それをそのまま、ブタ胃粘膜由来のβ１，６−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼによって触媒される反応に供した。エられたオリゴ糖はマトリックス補助レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析で、ＧｌｃＮＡｃ₇Ｇａｌ₃（４８％）とＧｌｃＮＡｃ₆Ｇａｌ₃（２３％）からＧｌｃＮＡｃ₄Ｇａｌ₂（２．６％）までの範囲にわたる５成分を示した。この複雑な（ｃｏｍｐｌｅｘ）混合物は、ブタ胃粘膜の未精製のβ１，６−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ抽出物中に存在することが知られているβ−ガラクトシダーゼ活性とβ−Ｎ −アセチルグルコサミニダーゼ活性によって著しく生成した(Helinら，FEBS Let t.,335:280-284(1993))。この生成混合物のスーパーデックス７５ＨＲクロマトグラフィーでは、２つの充分に分離したピークがえられた（非掲載）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によると、６０．９４分に溶出する主ピークは２つの主要成分：ＧｌｃＮＡｃ₇Ｇａｌ₃（計算値ｍ／ｚ１９４９．８）に相当する（Ｍ＋Ｎａ）⁺ ｍ／ｚ１９４９．５（６５％）とＧｌｃＮＡｃ₆Ｇａｌ₃（計算値ｍ／ｚ１７４６．６）に相当する（Ｍ＋Ｎａ）⁺ ｍ／ｚ１７４６．７（３０％）を有していた。６２．９４分の小ピークの質量スペクトルの分子イオン領域で最も豊富なイオンは（Ｍ＋Ｎａ）⁺ ｍ／ｚ１３８０．５（モノアイソトピック（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ））であり、これは、それが主として（７０％）ＧｌｃＮＡｃ₅Ｇａｌ₂（計算値モノアイソトピックｍ／ｚ１３８０．５）を含有することを示した。モノアイソトピックｍ／ｚ１１７７．４、１５４２．５および１７４６．０の低存在量ピークは、それぞれＧｌｃＮＡｃ₄Ｇａｌ₂、ＧｌｃＮＡｃ₅Ｇａｌ₃およびＧｌｃＮＡｃ₆Ｇａｌ₃種（計算値モノアイソトピックｍ／ｚ１１７７．４、１５４２．６および１７４５．６）に割り当てることができるだろう。スーパーデックスＨＲ７５実験では、２つのＧｌｃＮＡｃ残基を欠くＧｌｃＮＡｃ₅Ｇａｌ₃とグリカン１４との間隔が約２分だった。 β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ反応により、１４を７つのＬａｃＮＡｃ単位の分枝状配列（ａｒｒａｙ）である１５に変換した。スーパーデックス７５ＨＲクロマトグラフィーは、受容体５より２．２分早く現われる充分形のあるオリゴ糖ピークを示した（非掲載）。バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ｐ−４カラムでも、４つの追加ガラクトース残基が、２つの追加ＧｌｃＮＡｃ残基と同じぐらいに、オリゴ糖の移動を遅らせる(Yamashitaら,Methods Enzymol.,83:105-126(1 982))。ガラクトシル化したオリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、ＧｌｃＮＡｃ₇Ｇａｌ₇（グリカン１５）の（Ｍ＋Ｎａ）⁺（計算値ｍ／ｚ２５９８．４）に相当するｍ／ｚ２５９８．１のシグナル（６５％）とＧｌｃＮＡｃ₆Ｇａｌ₆の（Ｍ＋Ｎａ）⁺（計算値ｍ／ｚ２２３３．０）に相当するｍ／ｚ２２３３．０のシグナル（３５％）を示した。 α２，３−シアリルトランスフェラーゼ反応により、１５を１６に変換し、後者の濃縮物をスーパーデックス７５ＨＲによるゲル浸透クロマトグラフィーによって単離した（非掲載）。さらに精製するため、その濃縮物をモノＱカラムによる陰イオン交換クロマトグラフィーに供した（図１０Ａ）。これらの実験では、グリカン１６が、実施例２に記載の異性体テトラシアログリカン９と同様のクロマトグラフを与えた。スーパーデックス７５ＨＲで脱塩した後、４５ｎｍｏｌの純粋なグリカン１６をえた。グリカン１６の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１１Ａと表５）により、その構造が確認される。少量のグリカン１６試料をカルボパック（ＣａｒｂｏＰａｃ）ＰＡ−１のジオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）カラムによるＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィーに供した。これは、実施例２に記載の異性体テトラシアロ化合物８と同等の位置である４３分に現われた（非掲載）。 α１，３−フコシルトランスフェラーゼ反応により、グリカン１６（３８ｎｍｏｌ）を４価ｓＬｅｘ糖１７に変換した。１７の予備精製はスーパーデックス７５ＨＲでのクロマトグラフィーによって行なった。続いてカルボパックＰＡ −１カラムでＨＰＡＥクロマトグラフィーを行うことにより、８分に現われる充分形のあるピークとして８をえた（図１０Ｂ）。４つのフコシル残基の存在は、カルボパックＰＡ−１に対するグリカン１７の親和性を、グリカン１６と比較して劇的に減少させた。これは、フコシル化された糖類の特徴であることが知られている(Hardy，M.R.およびTownsend,R.R.,Carbohydr.Res.，188:1-7(1989))。４価ｓＬｅｘグリカン９（表２参照）を用いる並行実験により、グリカン９とグリカン１７の試料各１ｎｍｏｌがカルボパックＰＡ−１で９分に同時溶出することがわかった。グリカン９のトリフコシル類似体（実施例２に記載のグリカン１０）はこれらの実験でははるかに遅く１６分に現われた。スーパーデックス７５ＨＲカラムで脱塩することにより、２４ｎｍｏｌのグリカン１７をえた。表５：23℃でのグリカン16および17の構造レポーター基シグナルの ¹Ｈ−ＮＭＲ化学シフトａ）残基の数値付けは以下のようにする：ｂ）２つの化学シフト値がグリカンのαピラソース型およびβピラソース型を表わすシグナルから生じた。グリカン１７の構造的特徴づけグリカン１７の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１１Ｂおよび表５）により、その構造が確認される。還元末端ＧｌｃＮＡｃのほかに、３つのβ１，３結合ＧｌｃＮＡｃ残基のＨ−１シグナルが４．６８４〜４．６９６ｐｐｍに認められ、それには４．６０３ｐｐｍの３つのβ１，６結合ＧｌｃＮＡｃ単位のＨ−１シグナルが付随している。６つのＧｌｃＮＡｃ残基は、３位と６位がＧｌｃＮＡｃ単位で２置換されているガラクトースのＨ−４に特有の化学シフト４．１３３ｐｐｍ（ Koendermanら，Eur.J.Biochem.，166:199-208(1987)）にＨ−４共鳴を示す３つのガラクトースに結合している。ガラクトースＨ−１領域は、４．４５２ｐｐｍに３つの分枝状ガラクトースのシグナルを、４．５１７ｐｐｍに３つのβ１，６結合ｓＬｅｘ決定基のシアリル化されたガラクトースのシグナルを、そして４．５３３ｐｐｍにβ１，３結合ｓＬｅｘのシグナルを示す。これらのガラクトースのＨ−３シグナルは特徴的に（KamerlingおよびVliegenthart,Biological Magne tic Resesonance,BerlinerおよびReuben編，第１０巻，Plenum Press，ニューヨークおよびロンドン(1992)，１〜２８７頁）４．０８９ｐｐｍにある。それぞれ２．７６２ｐｐｍと１．７９８ｐｐｍにあるＮｅｕ５ＡｃのエクアトリアルＨ− ３共鳴とアキシアルＨ−３共鳴から、４当量のα２，３結合Ｎｅｕ５Ａｃの存在が確認される（KamerlingおよびVliegenthart,Biological Magnetic Resesonanc e,BerlinerおよびReuben編，第１０巻，Plenum Press，ニューヨークおよびロンドン(1992)，１〜２８７頁）。２．０４ｐｐｍにあるメチルプロトンのシグナルは、１１個のＮ−アセチル基の存在に対応した。β１，３結合ｓＬｅｘ決定基中のフコース残基のＨ−１が５．１１９ｐｐｍで共鳴したのに対し、３つのβ１，６結合ｓＬｅｘ単位のものは５．０７６ｐｐｍで共鳴した。これらフコースのＨ−５シグナルとＨ−６シグナルは特徴的に（de Vriesら，FE BS Lett.，330:243-248(1993);Vliegenthartら，Adv.Carbohydr.Chem.Biochem. ，41:209-374(1983)）それぞれ４．８２０ｐｐｍと１．１６６ｐｐｍで共鳴した。Ｈ−１プロトンとＨ−６プロトンの積分値は、４つのフコースの存在を示した。グリカン１７中に４つのフコース残基が存在することは、分解実験とその後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって確認された。グリカン１７の試料（２ｎｍｏｌ）をアースロバクテリウム・ウレアファシエンスシアリダーゼで処理した。脱塩した反応混合物をモノＱクロマトグラフィーに供したところ、１ｎｍｏｌの中性アシアロオリゴ糖１８が生成していることが明らかになった。グリカン１８のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルには、ポリラクトサミンシグナルの８０％に相当する主要（Ｍ＋Ｎａ）⁺ピークがｍ／ｚ３１８２．８に認められた（Ｆｕｃ₄Ｇａｌ₇ＧｌｃＮＡｃ₇に関する計算値３１８２．９）。そのスペクトル中に認められる２つの副成分は、Ｆｕｃ₃Ｇａｌ₇ＧｌｃＮＡｃ₇（１２％）とＦｕｃ₃Ｇａｌ₆ＧｌｃＮＡｃ₆（８％）のように挙動した。無傷の８を繰返しカルボパックＰＡ−１でのＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィーにかけたが、Ｎｅｕ５Ａｃ₄Ｆｕｃ₃Ｇａｌ₇ＧｌｃＮＡｃ₇の予想位置付近の１６分に溶出する有意な量の物質は認められなかったので、これらのマイナーシグナルは脱シアリル化中または質量分析中に生成した分解産物であろう。グリカン１８はタチナタマメβ−ガラクトシダーゼ処理に耐性を示した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは変化せず、主成分として処理前にｍ／ｚ３１８２．８に観測されたＦｕｃ₄Ｇａｌ₇ＧｌｃＮＡｃ₇（Ｍ＋Ｎａ）⁺シグナル（計算値ｍ／ｚ３１８２．９）が処理後もｍ／ｚ３１８３．２に主成分として観測された。β−ガラクトシダーゼ耐性は末端Ｇａｌｂ１−４（Ｆｕｃａｌ−３）ＧｌｃＮＡｃ配列の特徴である（Kobata,Anal.Biochem.，100:1-14(1979)）。したがって、グリカン１７中のフコース残基はすべて、末端に位置するシアリル化されたＮ−アセチルラクトサミン単位に結合していた。このデータは、ヒト乳汁由来のα１，３−フコシルトランスフェラーゼが６’位に分枝を持つＬａｃＮＡｃ残基とは反応しないことを示す過去の発見を追認し、，12:36-44(1995);Maaheimo H.ら，Eur.J.Biochem.，234:616-625(1995);Seppo A.ら,Glycobiology，6:65-71(1996))。実施例７内皮に対するＬ−セレクチン依存性リンパ球接着の阻害剤として直鎖状または分枝状ポリラクトサミン骨格から誘導される４価ｓＬｅｘグリカン移植とリンパ球接着アッセイ同系交配のＷＦ（ＲＴ1^v）系統とＤＡ（ＲＴ１^a）系統の１０〜１２週齢ラットを、実施例１に記述したように、移植とリンパ球接着アッセイに使用した。この結合アッセイは、異なる日に行なった３つの実験からなる。各実験では、所定の濃度の糖類の存在下に、拒絶性心臓の６つの独立した切片とともにリンパ球をインキュベートした。Ｌ−セレクチン媒介性リンパ球接着の阻害並行実験として、４価ｓＬｅｘグリカン９と１７およびその非フコシル化類似体、グリカン８とグリカン１６の能力を、急性拒絶中の心臓内皮に対するＬ−セレクチン依存性リンパ球接着の阻害に関して比較した。リンパ球を様々な濃度のオリゴ糖とともに３０分間プレインキュベートした後、実施例１に記載のインキュベーション培地中でのスタンパー−ウッドラッフ結合アッセイに使用した。２つのｓＬｅｘ担持グリカン９と１７は、活性化した心臓上皮に対するリンパ球接着の阻害に有効であり、そのＩＣ₅₀値はどちらのｓＬｅｘグリカンについても１ｎＭ程度だった（図１２）。同じ電荷、同じ全体的構造およびほぼ同じ大きさを持つが、フコースを欠くきわめて重要な対照糖類８と１６は、リンパ球結合をバックグランドレベルから変化させなかった。このデータは、分枝状および直鎖状の４価ｓＬｅｘグリカンがともに、きわめて効率よく内皮に対するＬ−セレクチン依存性リンパ球接着を阻害し、それによって拒絶に関係する炎症を減少させることを示している。直鎖状骨格グリカン１７の生物学的特性は、その異性体である分枝状骨格グリカン９の生物学的特性と似ていた。これらのグリカンはどちらもスタンパー−ウッドラッフ接着実験においてきわめて強力なＬ−セレクチン拮抗剤だった。グリカン１７は０．５ｎＭに及ぶ阻害作用を示し、グリカン９も同等に強力なＬ−セレクチン拮抗剤だった（図１２参照）。１７と９がともにＬ−セレクチンに対する高親和性結合を示すことが注目される。これは、様々な起源のムチン類の部分集合が高親和性セレクチンリガンドであることを示すのデータ（Crottetら，Glycobiology，6:191-208(1996)）と類似している。明らかに、独特な骨格配列も厳密に規定された結合決定基も、Ｌ−セレクチンによる高親和性認識には必要でない。むしろ、ポリラクトサミンまたはポリペプチド性の骨格上に「正しく提示された」ｓＬｅｘ／ｓＬｅａ関連決定基の集団（クラスター）が重要なのである。本実施例において、グリカン１７と９の活性は、結合決定基中の完全なｓＬｅｘ配列の存在に完全に依存した。認識にはα１，３結合フコース残基の存在が必要だった。ここに報告する多価ｓＬｅｘグリカンの低いｎＭ濃度範囲は、１価ｓＬｅｘの阻害範囲よりも数桁低い。従来の他のＬ−セレクチン高親和性阻害剤には、内皮そのほかに由来するムチンがある（Baumhueter,S.ら，Science,262:436-438(199 3);Berg,E.L.ら，Nature 366:695-698(1993);Crottet,Pら，Glycobiology，6:19 1-208(1996);Hemmerich,S.ら，Biochemistry 33:4820-4829(1994);Hemmerich,S. ら，J.Biol.Chem.，270:12035-12047(1995);Hemmerich,S.およびRosen,S.D.,Bio chemistry 33:4830-4835(1994);Imai,Y.およびRosen,S.D.,Glycoconjugate J.，10:34-39(1993);Imai Y.ら,J.Cell Biol．113:1213-1222(1991);Lasky,L.A. ら，Cell 69:927-938(1992)）。興味深いことに、ホウ水素化アルカリによってこれらのムチンから遊離されるＯ−結合型オリゴ糖は、アフィニティークロマトグラフィー実験でＬ−セレクチンに対して検出しうる結合を示さなかった（Crot tetら，Glycobiology，6:191-208(1996)）。しかし本発明のデータは、適切な構造のオリゴ糖がＬ−セレクチンによって高い親和力で認識されうることを示している。グリカン１７と９の１価ｓＬｅｘと比べて高い生理活性は、その多価性に基づいている。多価ｓＬｅｘグリカンは、リンパ球微絨毛の先端にクラスターを形成することが知られているＬ−セレクチンの２分子または数分子を架橋する（Hass len,S.R.ら，Histochem.J.，27:547-554(1995);von Andrianら，Cell 82:989-9 99(1995)）。Ｌ−セレクチンの分節的な柔軟性は、炭水化物認識ドメインの提示に役立ち（Ro sen,S.D.およびBertozzi,C.R.,Curr.Opin.Cell Biol.，6:663-673(1994)）、それゆえに、与えられたリガンド分子における個々のｓＬｅｘ決定基の付近でも架橋形成が可能になる。たとえば９の２つのｓＬｅｘ決定基の近位末端は、そのポリラクトサミン骨格を最大に広げたコンフォメーションでさえ、せいぜい２ｎｍしか離れてない(Renouf,D.V.およびHounsell,E.F.,Int.J.Biol.Macromol.,15:37 -42(1993))。しかし、細胞表面に対する高親和性結合が、可溶性モノマー型Ｐ− セレクチン（Ushiyama,S.ら,J.Biol.Chem.，268:15229-15237(1993)）とＥ−セレクチン（Hensley,P.ら，J.Biol.Chem.，269:23949-23958(1994)）で観測されており、このことは、多価ｓＬｅｘグリカンが１つのＬ−セレクチンモノマー内の２つの異なる部位と結合することによってその高親和性を獲得することを示している。さらに、最近のデータ（Malhotra,R.ら，Biochem.J.，314:297-303(1 996)）は、Ｌ−セレクチンとその内皮リガンドの相互作用には、１価であるｓＬｅｘ認識部位（ＣＲＳ）と、酸性決定基を認識する別個の隣接する結合部位（ＡＲＳ）が両方とも占有される必要があることを示唆している。この配置は、シアリル化されたオリゴ糖のすぐ近くにチロシン硫酸残基を伴い、ＰＳＧＬ−１にＰ −セレクチン認識を生じさせる、集合パッチに似ている（Sako,D.ら，Cell，83: 323-331(1995);Wilkins,P.P.ら，J.Biol.Chem.，270:22677-22680(1995)）。したがって、４価ｓＬｅｘグリカン１７と９は、モノマー型Ｌ−セレクチンを２通りの方法、すなわち１つのｓＬｅｘ決定基とＣＲＳの間の特異的結合と、そのリガンド中のもう１つのｓＬｅｘ残基のシアル酸とＬ−セレクチンのＡＲＳの間の特異性の低い結合で、モノマー型Ｌ−セレクチンに結合する。これには、たとえばテトラシアログリカン１６の部分的にフコシル化された誘導体でさえ、とりわけ良好な接着阻害剤であることが必要である。その結合様式がどうであれ、グリカン１７や９を典型例とするＬ−セレクチンの糖類拮抗剤は、セレクチンのムチンリガンドやネオ糖タンパク質リガンド（Welply,J.K.ら，Glycobiology，4:259 -265(1994)）よりも抗原性がはるかに低いので、これらは有望な抗炎症剤である。Ｌ−セレクチン媒介過程に加えて、グリカン１７と９は、ほかのセレクチンが関与する接着現象をも阻害する。たとえばＮｅｌｓｏｎらのデータ（Nelson,R.M.ら，Blood 82:3253-3258(1993) ）は、Ｅ−セレクチン依存性接着がｓＬｅｘ糖類によって、Ｌ−セレクチン媒介過程よりもさらに効率よく阻害されうることを示している。実施例８オリゴ糖アルジトールの合成と特徴づけ（太字の番号は図１３中のグリカン構造に対応する）材料と方法酵素ブタ胃β１，６Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４８）、ウシ乳汁β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．９０）、ヒト血清β１，３Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４９）、ヒト胎盤α２，３シアリルトランスフェラーゼおよびヒト乳汁α１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ。糖類および単糖ヌクレオチドＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃおよびＧＤＰ−Ｆｕｃはシグマ（ミズーリ州セントルイス、米国）から購入した。ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ（シアリルＬｅ^X）１とＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１ −３（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１ −６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ４は、実施例２に記述したようにin vitro で酵素的に合成した。トランスフェラーゼ反応ブタ胃β１，６Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４８）（Seppo,A.ら，Biochem.Cell Biol．68:44-53(1990)）、ウシ乳汁β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．９０）（シグマ）（Brew,K.ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 59:491-497(1968)）およびヒト血清β１，３Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４９）（Seppo,A.ら，Biochem.Cell Biol．68:44-53(1990)）を用いる反応は、本質的には引用した文献に記述されているように行なった。 α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を含有する、使用したヒト胎盤ミクロソームは、実施例２に記述したように調製した。このトランスフェラーゼ反応は、５０μｌの緩衝液中で、１００ｎｍｏｌの糖類（受容部位２００ｎｍｏｌに相当）を２μｍｏｌのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃおよび２５μｌのヒト胎盤ミクロソームとともに３７℃で１７時間インキュベートすることにより行なった。沸騰水浴中で５分間加熱することによって反応を停止した。沈澱したタンパク質を除去し、合わせた上清と洗浄液を凍結乾燥した。 α１，３／４−フコシルトランスフエラーゼ（８ｍＵ／ｍｌの総フコシルトランスフェラーゼ；０．７９ｍｇ／ｍｌのタンパク質）は、実施例２に記述したようにヒト乳汁から抽出し、そのトランスフェラーゼ反応は既述のごとく行なった（Palcic,M.M.ら，Carbohydr.R es．190:1-11(1989)）。４糖Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃ（２２）の還元は、本質的に既述のごとく（RasiloおよびRenkonen,Hoppe Seyler' s Z.Physiol.Chem．363:89-93(1982)）、ＮａＢＨ₄を用いて行なった。この反応の完全性は、ホウ酸塩を含有しない糖を¹ＨＮＭＲにかけることによって制御した。クロマトグラフィー法バイオ−ゲルＰ−２（バイオ−ラッド、カリフォルニア州リッチモンド、米国）のカラム（１×１４４ｃｍ）またはバイオ−ゲルＰ−４のカラム（１×１４５ｃｍ）によるゲル浸透クロマトグラフィーは、０．０２％ＮａＮ₃水溶液を用いて行なった。スーパーデックス７５ＨＲのカラム（１０×３００ｍｍ）（ファルマシア、スウェーデン）によるゲル浸透クロマトグラフィーは、１ｍｌ／分にて水（中性糖類）または０．０５ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃（シアル酸含有糖類）で行なった。流出液を２０５ｎｍまたは２１４ｎｍで監視し、オリゴ糖を外部のＧｌｃＮＡｃとＮｅｕＡｃと対照して定量した。パルス電流検出による高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ− ＰＡＤ）は、（４×２５０ｍｍの）ジオネックス・カルボパックＰＡ−１カラムを用い、１ｍｌ／分の流速で行なった。中性糖類は、既述のように（Maaheimo,M.ら，FEBS Lett．349:55-59(1994)）クロマトグラフィーにかけた。シアリル化された糖類は０分の１００ｍＭＮａＯＨ、２５ｍＭＮａＡｃから２０分の最終組成１００ｍＭＮａＯＨ、１００ｍＭＮａＡｃに至るＮａＡｃの直線勾配で溶出させた。集めた画分を０．４Ｍ酢酸で中和し、スーパーデックスクロマトグラフィーで脱塩した。モノＱ（５／５）カラム（ファルマシア）での陰イオン交換クロマトグラフィーはつぎのように行なった。このカラムは１ｍｌ／分の速度で、水で無勾配的に４分間溶出し、つぎに１２分時点で０．０５Ｍの濃度に至るＮａＣｌの直線勾配で溶出し、つぎに２０分時点で０．５Ｍの最終濃度に至るＮａＣｌの直線勾配で溶出した。流出液を２１４ｎｍで監視した。¹ Ｈ−ＮＭＲ分光法ＮＭＲ実験に先立って、糖類を²Ｈ₂Ｏから２回凍結乾燥した後、６００μｌの² Ｈ₂Ｏ（９９．９９６原子％，ケンブリッジ・アイソトープ・ラボラトリーズ、マサチューセッツ州ウォーボーン、米国）に溶解した。このＮＭＲ実験は、バリアン・ユニティー５００分光計を用い、３００°Ｋで行なった。ＩＤプロトンスペクトルの記録には、ＷＥＦＴシーケンスの変法（Hard,K.ら，Eur.J.Biochem ．209:895-915(1992)）を使用した。重複する共鳴はＤＱＦＣＯＳＹ（MarionおよびWhthrich,Biochem.Biophys.Res.Commun．117:967-974(1985)）とＴＯＣＳＹ（BaxおよびDavis,J.Magn.Reson．65:355-360(1985)）によって割り当てた。これらの実験では、通例、４ｋ×５１２ポイントの行列を集め、フーリエ変換に先立って両次元で９０°シフトサイン−ベル重み関数を使用した。スキャン間に１秒の緩和遅延時間を使用し、Ｔ０ＣＳＹでは８０〜３００ｍｓのスピンロック時間（ＭＬＥＶ−１７）を使用した。¹Ｈ化学シフトは内部アセトン２．２２５ｐｐｍを基準とした。オリゴ糖アルジトールの合成６糖アルジトールＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１ −４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃ−オール２４は、既述のごとく合成した（Maaheimo,H.ら，FEBS Lett．349:55-59(1994)）。８糖アルジトール２５６糖アルジトール２４を、ウシ乳汁β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼおよび４倍モル過剰のＵＤＰ−Ｇａｌとともにインキュベートすることにより、ガラクトシル化した。８糖アルジトール生成物Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１ −３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１ −６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃ−オール２５をＨＰＡＥＣで精製した（図１４Ａ）。数回の反応で４００ｎｍｏｌの２５をえた。２４の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルと比較すると、２５のスペクトルのアノマー領域は、４．４８０ｐｐｍと４．４６５ｐｐｍに２つの新しい１プロトン二重線を示した（図１５Ａ）。本発明者らが先に行なった部分的にガラクトシル化された２４の割り当てによれば（ Maah eimo,H.ら，FEBS Lett．349:55-59(1994)）、これらはそれぞれ残基７と８に割り当てることができる（表記規則については図１３を参照のこと）。末端ＧｌｃＮＡｃ残基５および６のＨ−３およびＨ−４共鳴も、β１，４ガラクトシル化の特徴（Whitfield,D.M.ら，Can.J.Chem.68:942-952(1990)）である劇的な低磁場シフトを受ける（表６）。興味深いことに、ＧｌｃＮＡｃ残基３のＨ−１とＨ− ２も、末端ＧｌｃＮＡｃ残基がガラクトシル化されると、わずかな高磁場シフトを受ける。ジシアロ１０糖アルジトール２６ジシアリル１０糖アルジトール２６を合成するために、２５のバッチ４つ（各１００ｎｍｏｌ）を３７ＥＣで１７時間、２μｍｏｌのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃおよびα２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を含有する２５μｌのヒト胎盤ミクロソームとともにインキュベートした。つぎにその反応混合物をモノＱ５／５カラムでのイオン交換クロマトグラフィー（図１４Ｂ）で分画し、ジシアリルオリゴ糖と同様に溶出する生成物（２６）をスーパーデックス７５クロマトグラフィーで脱塩した。この物質のＮＭＲスペクトル（図１５Ｂ）は、それぞれ２．７５６ｐｐｍと１．８００ｐｐｍにＮｅｕＡｃのアキシアルＨ−３とエクアトリアルＨ−３のシグナルを示し、両シグナルの面積は２プロトンに相当した。これらの化学シフトはα２，３結合したＮｅｕＡｃに特有であるが（KamerlingおよびVliegenthart，Biological Magnetic Resesonance，BerlinerおよびReuben編、第１０巻、Plenum Press，ニューヨークおよびロンドン(1992)，１〜２８７頁）、２．７１ｐｐｍまたは１．７４ｐｐｍには何のシグナルも検出されず、α２，６結合したＮｅｕＡｃは試料中に検出しうる量で存在しないことが示された。ガラクトース７および８のＨ−３共鳴の大きな低磁場シフト（表６）からも、ＮｅｕＡｃ残基が末端ガラクトースにα２，３結合していることが確認される（Ichikawa,Y.ら，J.Am.Chem.Soc．114:9283-9298(1992))。ガラクトース２の共鳴は事実上影響を受けなかったので、コアのβ１，３結合ガラクトースはシアリル化されなかった（Oehrlein,R.ら，Carbohydr.Res．244:149-159(1993)）。したがってこのＮＭＲデータによれば、この物質の構造はＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃ−オール２６である。４回の反応で、３５７ｎｍｏｌの２６をえた。表６３００Ｋでの糖１９〜２８の¹Ｈ化学シフト糖の番号および特記事項については図１３を参照のこと。 a）n.d.測定不能ジシアリル１０糖アルジトール２６のモノ−およびジ−フコシル化によるアルジトール２７および２８の合成２６の試料３４７ｎｍｏｌを、７００ｎｍｏｌのＧＤＰ−Ｆｕｃと６２５μＵのヒト乳汁α１，３フコシルトランスフェラーゼとを用いるトランスフェラーゼ反応に供した。その反応混合物を３７℃で６４時間インキュベートし、その混合物をスーパーデックス７５カラムに通すことによって反応を停止した。フコシル化の程度をＮＭＲで調べたところ、５．０８６ｐｐｍと５．１１７ｐｐｍの２つの二重線（付加されたフコースのＨ−１共鳴）の積分値から、分枝のうちの一方は１００％フコシル化されたが、他方は約４０％しかフコシル化されていないことがわかった（非掲載）。ジフコシル化された物質の量を最大にするため、その混合物を、６００ｎｍｏｌのＧＤＰ−Ｆｕｃと５４０μＵの上記酵素を用いる２回目のフコシルトランスフェラーゼ反応に供した。つぎに、えられたモノ−およびジ−フコシル化アルジトールの混合物をＨＰＡＥＣで分画したところ、ジ− およびモノ−フコシル化された生成物、それぞれ２８（１２５ｎｍｏｌ）と２７（６０ｎｍｏｌ）に相当する２つのピークが現われた（図１４Ｃ）。フコシル化された糖アルジトール２７および２８の¹Ｈ−ＮＭＲによる特徴づけモノフコシル化された物質のスペクトル（図１５Ｃ）のアノマー領域を２６のもの（図１５Ｂ）と比べると、５．１１６ｐｐｍに新しい１プロトン二重線が現われ、一方、ジフコシル化された物質のスペクトル（図１５Ｄと図１７）は５．１１７と５．０８６に２つの二重線を示した。これらは付加されたフコースのＨ−１共鳴である。モノフコシル化されたグリカンの構造は、部分的にフコシル化されたＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１− ３（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃからえたＮＭＲデータ（この場合、３−結合側鎖に結合したフコースのＨ−１は５，１１６ｐｐｍで共鳴するが、６−結合側鎖に結合しているものはより高磁場で共鳴する）と比較することによって確認された。したがって、このモノフコシル化グリカン中のフコース（５．１１６ｐｐｍ）はＧｌｃＮＡｃ残基５にα１−３結合していると結論した。フコースが実際に３−結合側鎖に結合したことは、β１，３結合ＧｌｃＮＡｃ（５）のＨ−１共鳴がわずかに低磁場シフトし、β１，６結合ＧｌｃＮＡｃ（６）のＨ−１シグナルが変化しなかったことによってもわかった。ガラクトース７とＮｅｕＡｃ９の構造レポーター基シグナルも化学シフトに小さな変化を生じるが、残基８および１０のものは変化しない。これらのデータは、モノフコシル化された物質の構造がグリカン２７であることを立証している。ジフコシル化された物質２８では、ＧｌｃＮＡｃ残基６（第２のフコースが結合する残基）のＨ−１シグナルがほとんどシフトしない（４．６０６ｐｐｍ対４．６０８ｐｐｍ）のに対して、コアＧｌｃＮＡｃ（３）は４．５６１ｐｐｍから４．５５２ｐｐｍに高磁場シフトする（表６）。しかし、２番目の付加フコースが残基６に結合したことは、ＧｌｃＮＡｃ残基３および６のほかのプロトンの割り当てによって確かめられた（図１６と図１７）。化学シフトを２６のものと比較すると、ＧｌｃＮＡｃ３のＨ−２も多少高磁場側にシフトしているのに対して、ＧｌｃＮＡｃ６のＨ−２、Ｈ−３およびＨ−４は、α１−３フコシル化に特有の大きな低磁場シフト（Ichikawa,Y.ら，J.Am.Chem.Soc．114:92 83-9298(1992);Wormald,M.R.ら，Biochem.Biophys.Res.Commun．180:1214-1221( 1991)）を受ける。モノフコシル化された物質中のフコースは残基５に結合したことがわかっているので、２８の末端ガラクトース７および８のＨ−１共鳴を割り当てることもできた。実施例９Ｌ−セレクチン媒介性リンパ球接着のアルジトール阻害（太字の番号は図１３中のグリカン構造に対応する）０個、１個または２個の末端シアリルＬｅ^Xモチーフを持つＯ−グリコシド分枝状オリゴ糖（実施例８に記載のグリカン２６、２７および２８）を、腎臓同種移植片を拒絶する尿細管周辺毛細管内皮に対するＬ−セレクチン依存性リンパ球接着の阻害剤として調べた。同系交配のＷＦ（ＲＴ１^V）系統とＤＡ（ＲＴ１^a）４系統の１０〜１２週齢ラットを、実施例１に記述したように、移植とリンパ球接着アッセイに使用した。結合アッセイは、異なる日に行なった３回の実験からなる。各実験では、所定の濃度の糖類の存在下に、拒絶性腎臓の３つの独立した切片とともにリンパ球をインキュベートし、インキュベートしたものすべてから２０個の独立した視野を分析した。２つのシアリルＬｅ^X決定基を持つ１２糖アルジトール２８は、０．１５μＭのＩＣ₅₀を持ち、拒絶性ラット腎臓の内皮に対するＬ−セレクチン依存性リンパ球接着の有効な阻害剤であることがわかった（図１８）。同時に、３−結合側鎖のみがフコシル化されているグリカン２７はこれよりかなり弱い阻害剤であり、どちらのフコースも持たないグリカン２６は事実上阻害活性を持たなかった。これらの結果は、正味の電荷が２価シアリルＬｅ^Xグリカン類のＬ−セレクチンに対する増大した親和性の説明にはならないことを示しているが、それと同時に、既に示されているように（Turunen,J.P.ら，J.Exp.Med．182(4):1133-1141(1995 );Imai,Y．ら，Glycobiology 2:373-381(1992);Mulligan,M.S.ら，Nature 364 :149-151(1993)）、フコース部分がセレクチンに対するオリゴ糖の結合に重要であることをも強調している。Ｅ−セレクチンに対する高い親和性は、既に２価シアリルＬｅ^Xグリカン（DeFrees,S.A.ら，J.Am.Chem.Soc．115:7549-7550(1993); DeFrees,S.A.ら，J.Am.Chem.Soc．117:66-79(1995)）と、ＢＳＡと結合したシアリルＬｅ^X（Welply,J.K.ら，Glycobiology 4:259-265(1994)）で実証されており、またＬ−セレクチンについては２価および４価シアリルＬｅ^X構築物（Turunen e,J.P.ら，J.Exp.Med．182(4):1133-1141(1995)）で実証されている。２価および多価オリゴ糖の増大した阻害力の物質的根拠はまだ明らかでない。セレクチンはマルチマーとして出現するのではないかといわれているが（Rosen およびBertozzi,Curr.Opin.Cell Biol．6:663-673(1994);Ushiyama,S.ら，J.Bio l.Chem．268:15229-15237(1993)）、これは多価リガンドの高い親和性の説明となりうる。しかしグリカン２８では、２つのシアリルＬｅ^X決定基が１単糖部分のみで隔てられているので、マルチマー型タンパク質が細胞表面に並んで存在するのだとすれば、それらのシアリルＬｅ^X 決定基がマルチマー型タンパク質の異なるサブユニットに独立して結合できる可能性は低い。一方、３糖ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃと特異的に結合するＢ細胞シアル酸結合タンパク質ＣＤ２２は、非共有結合的なオリゴマーを形成し、その１価３糖よりも類似する２価グリカンに対して有意に高い親和性を持つ（Powell,L.D.ら，J.Biol.Chem．270:7523-7532(1995)）。最近の研究では、ＤｅＦｒｅｅｓらが、ガラクトースによって連結された２つのシアリルＬｅ^X基の位置異性体によるＥ−セレクチン媒介性接着の阻害を研究し、３，６−結合したシアリルＬｅ^Xダイマーが最も強力な阻害剤であることを発見した（DeFrees,S.A.ら，J.Am.Chem.Soc．117:66-79(1995)）。著者らはその結合親和性の増大を小さいと考えたが、Ｇｒａｖｅｓらが指摘しているように、Ｅ−セレクチンのｘ線構造はリガンドとしてのダイマー型シアリルＬｅ^Xを排除するものではない（Graves,B.J.ら，Nature 367:532-538(1994)）。３−結合側鎖にフコースを持つ１価シアリルＬｅ^Xウンデカマー２７の阻害能力は、至適濃度で１価シアリルＬｅ^X４糖１（実施例２に記載）と同じだった（図１８）。このことは、グリカンのサイズが増大しても、自動的にＬ−セレクチンに対する親和性が増大するわけではないことを示している。１価の６−結合シアリルＬｅ^X基を持つ２７の位置異性体の阻害能はわかっていない。原則として、２価グリカン２８では主として６−結合シアリルＬｅ^X基がセレクチンに結合し、親和性の増大は単に２つの分枝の相違を反映しているに過ぎないのかもしれない。Ｅ−セレクチンリガンドＥＳＬ−１のＮ−グリカンはその結合に必要であると最近報告されているが（Steegmaler，M.ら，Nature 373:615-620(1995)）、Ｌ− およびＰ−セレクチンの生物学的リガンドはほとんどがＯ−グリカンである（Sc himizuおよびShaw,Nature 366:630-631(1993)）。Ｌ−セレクチンの糖タンパク質リガンドは、近接したシアリル化Ｏ−結合型オリゴ糖を多数保持しており（La sky,L.A.ら，Cell 69:927-938(1992);Baumhueter,S.ら，Science 262:436-438(1 993);Berg,E.L.ら，Nature 366:695-698(1993);Norgard,K.E.ら，J.Biol.Chem． 268:12764-12774(1993)）、これらは分枝状ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン骨格と同様の方法で、セレクチンに末端シアリルＬｅ^X基を提示する。ここでは、１２糖アルジトール２８の阻害能を、還元されたＯ−グリコシドコア配列を欠くＯ−グリカン４（実施例２に記載）の阻害能と比較した。２８は４よりいくらか良好な阻害剤のようであったから、このコア配列はＬ−セレクチンに対する親和性を増大させるのかもしれない。２８では２つのシアリルＬｅ^X基のフコース残基とガラクトース残基のＮＭＲシグナルが異なる化学シフトを持つのに対して、２つのシアリルＬｅ^X基をガラクトースのエチルグリコシドに結合した場合は、その分枝どうしの相違がきわめて小さい（DeFrees,S.Aら，J. Am.Chem.Soc．117:66-79(1995)）ということは注目に値する。これは２８の近位部分が末端シアリルＬｅ^X基の特性に影響を与えることを示している。したがって２８のコア構造は、Ｌ−セレクチンに対する親和性を増大させるが、その結合に直接関与する必要はない。完全なシアリルＬｅ^X含有Ｏ−グリカンの阻害効力がＬ−セレクチン依存性リンパ球接着モデルで調べられたのは、これが初めてである。本発明者らは、２価シアリルＬｅ^XＯ−グリカンが、一方または両方のフコースを欠くその類似体よりも、有意に優れた阻害剤であることを立証した。実施例１０ｓＬＥＸによるｓＬｅｘ陽性腫瘍転移の治療炭水化物含有分子は、自己免疫疾患、炎症状態、消化性潰瘍、感染性疾患および癌を含む多くの疾患状態に関連づけられている。実際、ヒト腫瘍細胞上の表面炭水化物分子の変化に基づいて、黒色腫、神経膠腫、神経芽腫、乳房癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌および腎臓癌を含む多くの腫瘍タイプについて、ヒト糖タンパク質「癌抗原」を同定することが可能になっている。炭水化物結合タン４パク質のレクチンファミリーのある要素は、乳房癌患者における転移と短い生存期間の両方に強く関連づけられている。レクチンが結合するその炭水化物分子の末端糖は、Ｎ−アセチルガラクトサミンであると同定されている。さらに、それと同じＮ−アセチルガラクトサミン糖は、前立腺癌細胞、胃癌細胞および結腸直腸癌細胞を含むいくつかのほかの腫瘍タイプにも認められており、それらはそれぞれに転移の増大または生存率の減少と関連づけられている（Hughes ,S.,Scrip,１９９４年４月，２８〜３１頁）。ほかの研究は、結腸癌腫細胞系が一定のセレクチンにシアリルルイスｘおよびシアリルルイスａオリゴ糖を介して接着することを明らかにしている（Majuri,M.-L.ら，Int.J.Cancer 63:551-559 (1995);Majuri,M.-L.ら，Biochem.Biophys.Res.Comm．182(3):1376-1382(1992) ）。したがって、本発明の合成多価ｓＬｅｘ含有ポリラクトサミンを使用して、ｓＬｅｘ陽性腫瘍細胞の転移を阻害することができる。簡単に述べると、そのような腫瘍があると診断された患者を、多価ｓＬｅｘ（たとえば４価ｓＬｅｘ２２糖類）を含む組成物で治療する。この組成物は、天然のｓＬｅｘに対するｓＬｅｘ陽性腫瘍細胞の結合を阻止することによりｓＬｅｘ陽性腫瘍細胞の転移を阻害するに足る用量で、薬学的に許容しうる賦形剤中に含まれる。有効なレベルの本発明の組成物を、その状態が充分に改善されるまで、血清濃度がほぼナノモル濃度〜マイクロモル濃度の範囲になるような方法で投与する。患者に投与する場合、本組成物は、それを経口投与、非経口投与、経鼻投与、腸投与または直腸投与に適合させるような任意の方法で、従来の製薬上の慣行に従い、薬学的に許容しうる賦形剤またはビヒクル（たとえば等張食塩水など）を使って製剤化される。この薬剤の投薬レベルは、セレクチンの阻止、とくにその患者における腫瘍細胞のＬ−セレクチン媒介性接着の阻止による抗転移効果を提供するに足りるだろう。「有効なレベル」の本発明組成物とは、その治療を受ける患者に何らかの改善が与えられるようなレベルを意味する。本発明の薬学的組成物は、患者の天然セレクチン（とくにＬ−セレクチン）がその患者内の当該セレクチンの生物学的標的（具体的にはｓＬｅｘ陽性腫瘍細胞）に結合するのを（完全にまたは部分的に）中和するに足る量で投与される。本発明のセレクチン結合性炭水化物および組成物の投与量と投与法は、癌関連傷害を治療する臨床分野の通常の技術を持つ者によって容易に決定されうる。一般的には、本発明組成物の投与量は、使用する合成炭水化物のタイプ、年齢、健康状態、治療される医学的状態、併用治療があればその種類、治療の頻度、望まれる効果の性質、組織損傷の程度、性別、症状の持続時間、もしあれば反適応症、および個々の医師によって調節されるべきその他の可変的要因などといった点に依存して変動するだろう。所望の結果をうるために、所望する投与量を１回でまたは複数回で投与することができる。実施例１１ｓＬｅｘによる感染の治療抗感染薬としてのｓＬｅｘの使用は、すべてのホ乳類細胞の表面にオリゴ糖が存在し、細菌、ウイルスそのほかの感染性微生物が、それらの細胞への侵入にそのオリ４ゴ糖を利用するという観察結果に基づく（Hughes,S.,Scrip,１９９４年４月，２８〜３２頁）。たとえば、ヒトシアリルルイスｘ抗原は、ヒトにおける感染性心内膜炎の原因であるストレプトコッカス・ガロリチカス（Streptococcus gallolyticus ）の細胞表面上に高度に発現する（Hirota,K.ら，Lancet 347:760(1996);Hirota ,K.ら，FEMS Immunol. & Med.Microbiol．12:159-164(1995)）。したがって、特定のタイプのオリゴ糖を体内に注入することは、特定の感染性疾患に対して考えうる１つの治療法である（Hughes,S.,Scrip,１９９４年４月，２８〜３２頁）。オリゴ糖が従来の抗感染薬に対して持つ利点の一つは、それが感染性疾患の治療とともに予防にも有効だということである。これに対し、感染症予防薬としての抗生物質の使用は、耐性の発生につながりうる。さらに、オリゴ糖は細菌を殺すのではなく、単にそれらがヒト組織に結合するのを阻害するに過ぎないので、オリゴ糖は耐性生物の増殖に有利な選択圧を提供しないだろう（Hughes,S.,Scrip, １９９４年４月，２８〜３２頁）。本発明の合成多価ｓＬｅｘ含有ポリラクトサミンは、感染性疾患の治療または予防に使用できる。簡単に述べると、そのような感染であると診断された患者を、多価ｓＬｅｘ（たとえば４価ｓＬｅｘ２２糖）を含む組成物で治療する。この組成物は、感染性微生物（たとえば細菌）が対応する（たとえば内皮）細胞表面上の対応するオリゴ糖に結合するのを阻止するに足る用量で、薬学的に許容しうる賦形剤中に含まれる。その組成物を、その状態が充分に改善されるまで、血清濃度がほぼナノモル濃度〜マイクロモル濃度の範囲になるような方法で与える。患者に投与する場合、本発明の組成物は、それを経口投与、非経口投与、経鼻投与、腸投与または直腸投与に適合させるような任意の方法で、従来の製薬上の慣行に従い、薬学的に許容しうる賦形剤またはビヒクル（たとえば等張食塩水など）を使って製剤化される。この薬剤の投薬レベルは、セレクチンの阻止、とくにその患者におけるＬ−セレクチン媒介性接着事象の阻止による抗感染効果を提供するに足りるだろう。「有効なレベル」の本発明組成物とは、その治療を受ける患者に何らかの改善が与えられるようなレベルを意味する。本発明の薬学的組成物は、患者の天然セレクチン（とくにＬ−セレクチン）がその患者内の当該セレクチンの生物学的標的（具体的には内皮細胞）に結合するのを（完全にまたは部分的に）中和するに足る量で投与される。本発明のセレクチン結合性炭水化物および組成物の投与量と投与法は、感染性疾患を治療する臨床分野の通常の技術を持つ者によって容易に決定されうる。一般的には、本発明組成物の投与量は、使用する合成炭水化物のタイプ、年齢、健康状態、治療される医学的状態、併用治療があればその種類、治療の頻度、望まれる効果の性質、組織損傷の程度、性別、症状の持続時間、もしあれば反適応症、および個々の医師によって調節されるべきそのほかの可変的要因などといった点に依存して変動するだろう。所望の結果を得るために、所望する投与量を１回でまたは複数回で投与することができる。本明細書で引用したすべての資料は参考文献として本明細書の一部を構成する。上述の説明は特定の好ましい実施態様に関するが、本発明がそれらに限定されないことは理解されるだろう。当業者は、開示した実施態様には様々な変更を施しうること、またそのような変更は本発明の範囲に包含されると解釈されることに気づくだろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１０月２日（１９９７．１０．２）【補正内容】請求の範囲 1．直鎖状ポリラクトサミン骨格（ＬａｃＮａｃ）_nからなる合成オリゴ糖であって、ｎが１以上であり、かつ残基間結合がβ１−３’および／またはβ１−６’ であり、２またはそれより多くのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１−３）ＧｌｃＮａｃエピトープがβ１−３’結合および／またはβ１−６’結合により結合される合成オリゴ糖。 2．２つのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１−３）ＧｌｃＮａｃエピトープからなる請求の範囲第１項記載の合成オリゴ糖。 3．４つのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１−３）ＧｌｃＮａｃエピトープからなる請求の範囲第１項記載の合成オリゴ糖。 4．ポリラクトサミン骨格（ＬａｃＮａｃ）_nからなる合成オリゴ糖であって、ｎが１以上であり、かつ残基間結合がβ１−３’および／またはβ１−６’であり、２またはそれより多くのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１−３）ＧｌｃＮａｃエピトープがβ１−３’合および／またはβ１−６’合により結合され、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−オール配列を含むＯ−グリコシドコアを有する合成オリゴ糖。 5．２つのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１−３）ＧｌｃＮａｃエピトープからなる請求の範囲第４項記載の合成オリゴ糖。 6．請求の範囲第１項乃至第５項のいずれか１つに記載のオリゴ糖からなる薬学的に許容しうる組成物。 7．ポリラクトサミン骨格（ＬａｃＮａｃ）_nからなる合成オリゴ糖であって、ｎが１以上であり、かつ残基間結合がβ１−３’および／またはβ１−６’であり、２またはそれより多くのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１３）ＧｌｃＮａｃエピトープがβ１−３’結合および／またはβ１−６’結合により結合される合成オリゴ糖からなる薬学的組成物を患者に投与することからなる該患者の炎症状態を予防または治療する方法。 8．前記患者が、組織の拒絶、器官の拒絶、関節炎、感染、皮膚病、炎症性腸疾患および自己免疫疾患からなる群より選ばれた状態であると診断されたかまたは前記状態を発現する危険を有する患者である請求の範囲第７項記載の方法。 9．前記状態が組織の拒絶または器官の拒絶である請求の範囲第７項記載の方法。 10．前記状態が慢性関節リウマチである請求の範囲第７項記載の方法。 11．前記状態が慢性腸疾患である請求の範囲第７項記載の方法。 12．前記患者が動物である請求の範囲第７項記載の方法。 13．前記患者がヒトである請求の範囲第７項記載の方法。 14．ポリラクトサミン骨格（ＬａｃＮａｃ）_nからなる合成オリゴ糖であって、ｎが１以上であり、かつ残基間結合がβ１−３’および／またはβ１−６’であり、２またはそれより多くのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１− ３）ＧｌｃＮａｃエピトープがβ１−３’結合および／またはβ１−６’結合により結合される合成オリゴ糖からなる薬学的組成物を投与することからなる、移植される組織または器官の拒絶を防ぐ方法。 15．前記器官が、心臓、肺または腎臓からなる群より選ばれる請求の範囲第１４項記載の方法。 16．前記移植される組織が皮膚である請求の範囲第１４項記載の方法。 17．前記移植される組織／器官が、骨髄、角膜、膵臓および小腸からなる群より選ばれる請求の範囲第１４項記載の方法。 18．ポリラクトサミン骨格（ＬａｃＮａｃ）_nからなる合成オリゴ糖であって、ｎが１以上であり、かつ残基間結合がβ１−３’および／またはβ１−６’であり、２またはそれより多くのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１− ３）ＧｌｃＮａｃエピトープがβ１−３’結合および／またはβ１−６’結合により結合される合成オリゴ糖を含む薬学的組成物を患者に投与することからなる該患者の異常な炎症状態における白血球の有害な遊走を阻止する方法。 19．ポリラクトサミン骨格（ＬａｃＮａｃ）_nからなる合成オリゴ糖であって、ｎが１以上であり、かつ残基間結合がβ１−３’および／またはβ１−６’であり、２またはそれより多くのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１３）ＧｌｃＮａｃエピトープがβ１−３’結合および／またはβ１−６’結合により結合される合成オリゴ糖からなる薬学的組成物を患者に投与することからなる該患者の細菌性感染を予防または治療する方法。 20．前記細菌性感染が連鎖球菌性である請求の範囲第１９項記載の方法。 21．前記患者が動物である請求の範囲第１９項記載の方法。 22．前記患者がヒトである請求の範囲第１９項記載の方法。 23．ポリラクトサミン骨格（ＬａｃＮａｃ）_nからなる合成オリゴ糖であって、ｎが１以上であり、かつ残基間結合がβ１−３’および／またはβ１−６’であり、２またはそれより多くのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１− ３）ＧｌｃＮａｃエピトープがβ１−３’結合および／またはβ１−６’結合により結合される合成オリゴ糖からなる薬学的組成物を患者に投与することからなる該患者の腫瘍転移を予防または治療する方法。 24．腫瘍がｓＬｅｘ陽性である請求の範囲第２３項記載の方法。 25．腫瘍が乳房癌、前立腺癌、胃癌および結腸直腸癌からなる群より選ばれる請求の範囲第２３項または第２４項記載の方法。 26．前記患者が動物である請求の範囲第２３項記載の方法。 27．前記患者がヒトである請求の範囲第２３項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＺ

Claims

【特許請求の範囲】 1. ポリラクトサミン骨格（ＬａｃＮａｃ）_nからなる合成オリゴ糖であって、ｎが１以上であり、かつ残基間結合がβ１−３’および／またはβ１−６’であり、２またはそれより多くのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１− ３）ＧｌｃＮａｃエピトープがβ１−３’結合および／またはβ１−６’結合により結合される合成オリゴ糖。 2. ２つのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１−３）ＧｌｃＮａｃエピトープからなる請求の範囲第１項記載の合成オリゴ糖。 3. 前記オリゴ糖がＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ−オール配列を含むＯ−グリコシドコアを有する請求の範囲第１項または第２項記載の合成オリゴ糖。 4. ４つのＮｅｕＮａｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃ１−３）ＧｌｃＮａｃエピトープからなる請求の範囲第１項記載の合成オリゴ糖。 5. 前記ポリラクトサミン骨格が分枝状である請求の範囲第１項乃至第４項記載の合成オリゴ糖。 6. 前記ポリラクトサミン骨格が直鎖状である請求の範囲第１項、第２項または第４項記載の合成オリゴ糖。 7. 請求の範囲第１項乃至第６項のいずれか１つに記載のオリゴ糖からなる薬学的に許容しうる組成物。 8. 請求の範囲第７項記載の組成物を患者に投与することからなる該患者の炎症状態を予防または治療する方法。 9. 前記患者が、組織の拒絶、器官の拒絶、関節炎、感染、皮膚病、炎症性腸疾患および自己免疫疾患からなる群より選ばれた状態であると診断されたかまたは前記状態を発現する危険を有する患者である請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記状態が組織の拒絶または器官の拒絶である請求の範囲第８項記載の方法。 11．前記状態が慢性関節リウマチである請求の範囲第８項記載の方法。 12．前記状態が慢性腸疾患である請求の範囲第８項記載の方法。 13．前記患者が動物である請求の範囲第８項記載の方法。 14．前記患者がヒトである請求の範囲第８項記載の方法。 15．移植をうける患者に請求の範囲第７項記載の組成物を投与することからなる、移植される組織または器官の拒絶を防ぐ方法。 16．前記器官が、心臓、肺または腎臓からなる群より選ばれる請求の範囲第１５項記載の方法。 17．前記移植される組織が皮膚である請求の範囲第１５項記載の方法。 18．前記移植される組織／器官が、骨髄、角膜、膵臓および小腸からなる群より選ばれる請求の範囲第１５項記載の方法。 19．請求の範囲第７項記載の組成物を患者に投与することからなる該患者の異常な炎症状態における白血球の有害な遊走を阻止する方法。 20．請求の範囲第７項記載の組成物を患者に投与することからなる該患者の細菌性感染を予防または治療する方法。 21．前記細菌性感染が連鎖球菌性である請求の範囲第２０項記載の方法。 22．前記患者が動物である請求の範囲第２０項記載の方法。 23．前記患者がヒトである請求の範囲第２０項記載の方法。 24．請求の範囲第７項記載の組成物を患者に投与することからなる該患者の腫瘍転移を予防または治療する方法。 25．腫瘍がｓＬｅｘ陽性である請求の範囲第２４項記載の方法。 26．腫瘍が乳房癌、前立腺癌、胃癌および結腸直腸癌からなる群より選ばれる請求の範囲第２４項または第２５項記載の方法。 27．前記患者が動物である請求の範囲第２４項記載の方法。 28．前記患者がヒトである請求の範囲第２４項記載の方法。