SK39498A3 - Synthetic multivalent slex containing polylactosamines and methods for use - Google Patents
Synthetic multivalent slex containing polylactosamines and methods for use Download PDFInfo
- Publication number
- SK39498A3 SK39498A3 SK394-98A SK39498A SK39498A3 SK 39498 A3 SK39498 A3 SK 39498A3 SK 39498 A SK39498 A SK 39498A SK 39498 A3 SK39498 A3 SK 39498A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- patient
- selectin
- slex
- glycan
- glcnac
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Opísané sú syntetické oligosacharidy obsahujúce polylaktózamínovú kostru (LacNac)n, kde n > 1 a väzby medzi zvyškami sú β 1-3' a/alebo βΐ -6', na ktorú sú dva alebo viac NeuNaca2-3Gaipi-4(Fucl-3)GlcNac epitopy naviazané βΐ -3' a/alebo β 1 -6' väzbami, ich použitie * ' na blokovanie väzby lymfocytov na zodpovedajúce oligosacharidy na povrchu endotelu, a tak na redukciu alebo zmiernenie nežiaducej zápalovej odpovede a použitie takých konštruktov pri iných chorobných stavoch charakterizovaných väzbou selektínu, ako je bakteriálna infekcia a metastatické nádory.
Syntetické polylaktózamíny obsahujúce multivalentný sLEX a metódy ich použitia
Oblasť. techniky
Predkladaný vynález je zameraný na nové kompozície a ich použitie v liečbe zápalových odpovedí. Presnejšie, vynález je zameraný na nové syntetické oligosacharidové konštrukty, najmä na poly-N-acetyllaktózamíny s naviazanými mnohopočetnými sLEX a na ich použitie na blokovanie väzby lymfocytov na zodpovedajúce oligosacharidy na povrchu endotelu a tak na redukciu alebo zmiernenie nežiadúcej zápalovej odpovedi a iných chorobných stavov charakterizovaných väzbou lymfocytov. Ďalej je vynález zameraný na použitie nových sacharidov pre blok bakteriálnej adherencie na endotel a tak na prevenciu a/alebo liečbu bakteriálnych infekcií. Ďalšie použití predkladaného vynálezu spočíva v oblasti protinádorovej terapie, kde je metastázovanie sLEX-pozitívnych tumorov inhibované týmito glykánmi.
Doterajší stav techniky
Bunková adhézia sprostredkovaná selektínmi
Migrácia bielych krviniek z krvi do oblastí patologických stavov v tele sa nazýva zápalová kaskáda. Deje bunkovej adhézie sú umožnené špecifickou väzbou leukocytov na endotel ciev, ktoré sú v blízkosti zápalového inzultu; proti takým adhéziám pôsobí cievne strihové sily a vysoký stupeň prietoku, ktorý pôsobí na udržanie leukocytov v cirkulácii a napomáhajú presunu leukocytov do požadovaného miesta.
Migrácie leukocytov behom zápalovej odpovedi sa účastnia štyri rodiny cievnych adhéznych molekúl: (1) rodina integrínov, (2) receptory rodiny integrínov, imunoglobulínová rodina, (3) rodina selektínov a (4) receptory rodiny selektínov, špecializované uhíovodany sialomucínovej adhéznej rodiny.
Selektíny sú tiež známe ako lektínové bunkové adhézne molekuly (LEC-CAM). Selektíny sa klasifikujú do troch skupín: L-selektín (LECAM-1, LAM-1, gp90MEL, Leu-8, TQ-1, CD62L a DREG) je exprivovaný na rôznych leukocytoch a je konštitutívne; exprivovaný na lymfocytoch, monocytoch, neutrofiloch a eosinofÍloch. E-selektín (LECAM-2, CD62E a ELAM-1) je exprivovaný na endotele aktivovanom zápalovými mediátormi. P-selektín (GPM-140, PADGEM, LECAM-3 a CD62P) je skladovaný v alfagranulách doštičiek a vo Weibel-Paladeových telieskach endoteliálnych buniek a je tiež exprivovaný na endotele aktivovanom zápalovými stimulmi. Zdá sa, že všetky členy selektínovej rodiny sprostredkujú bunkovú adhéziu cez rozpoznávanie uhlovodanov.
Súčasný koncept extravazácie leukocytov je založený na postupnom účinku niekoíkých adhéznych molekúl umiestnených na povrchu leukocytov a endotelu. Extravazácia lymfocytov je iniciovaná interakciou členov selektínovej rodiny s ich receptorovými náprotivkami obsahujúcimi oligosacharid. Na prehlad doterajších znalostí o adhézii lymfocytov pozri napr. Springer, T. A., Annu. Rev. Physiol. 57: 827 - 872 (1995).
Všetky selektíny sa viažu na sialyl Lewis x (neuNAca23Gaipi-3(Fucal-3)GlcNAc (sLEx alebo sLex) a sialyl Lewis a(neuNAca2-3Gaipi-3(Fucal-4)GlcNAc (sLEa alebo sLea) rovnako ako na príbuzné uhiovodanové sekvencie (Bertozzi C., Chemistry and Biology, 2: 703 - 708 (1995)). Na L-selektínu dependentné rozpoznávanie predchádza normálnej extravazácii lymfocytov do periférnych lymfatických uzlín (Gallatin, W.M., et al., Náture, 303: 30 - 34 (1983)) a do miesta zápalu (Ley, K. et al., Blood 77: 2553 - 2555 (1991)), kde obidva tieto deje sú narušené pri L-selektín deficientných myší (Arbones, M.L et al., Immunity 1: 247 - 260 (1994)).
V súčasnosti sú známe tri glykoproteínové ligandy pre L-selektín: GlyCAM-1, CD34 a MAdCAM-1. Presné štruktúry biologických ligandov pre L-selektín nie sú dosiaľ známe, ale základné uhľovodanové epitopy majú niektoré spoločné štrukturálne vlastnosti. Sú to O-glykozidicky viazané oligosacharidy mucínového typu s N-acetyllaktózamínovou kostrou, ktorá je 3N-sialyzovaná alebo 3N-sulfátovaná, 3-fukozylovaná a niekedy 6- alebo 6N-sulfátovaná na distálnom N-acetyllaktózamínovom konci.
Multivalenčnosť sacharidových ligandov zvyšuje väzbu selektínu. Posledné štúdie ukázali, že schopnosť oligosacharidu inhibovať adhéziu leukocytov sprostredkovanú L-selektínom sa zvyšuje so zvyšujúcim sa počtom sialyl LEX skupín (Turunen,
J.P. et al., J. Exp. Med. 182(4): 1133 - 1141 (1995)), a že multivalentný sialyl, LEX sú najmä účinné ako inhibítory E-selektínu (DeFrees, S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 115:
7549 - 7550 (1993); Welply, J.K. et al., Glycobiology 4: 259
- 265 (1994); DeFrees S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 66
- 79 (1995)). Polylaktózamínová kostra ligandu P-selektínu PSGL-1 je rozvetvená a obsahuje niekoľko fukóz (Wilkins P.P. et al., J. Biol. Chem. 271: 18732 - 18742 (1996)) a prítomnosť mnohonásobne fukozylovaných a mnohonásobne sulfátovaných glykánov v GlyCAM-1 (Hemmerich, S. et al., J. Biol. Chem. 270: 12035 - 12047 (1995)) naznačuje, že tiež jednotlivé prirodzené uhľovodanové ligandy pre selektíny môžu byt multivalentné.
Veľké množstvo endoteliálnych buniek v periférnych miazgových uzlinách exprivuje sialyl Lewis x a sialyl Lewis a (sLex a sLea) epitopy (Paavonen and Renkonen, Am. J. Pathol. 141: 1259 - 1264 (1992); Munro, J.M. et al., Am. J. Pathol.
141: 1397 - 1408 (1992); Sawada, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193: 337 - 347 (1993)), čo sú časti receptorov pre L-selektín. Endoteliálne bunky v niekoľkých iných lokalitách sú sLea a sLex negatívne, ale zápalová stimulácia môže indukovať skôr negatívny endotel k expresii týchto oligosacharidových štruktúr de novo (Turunen J. et al., Eur. J. Immunol.
24: 1130 - 1136 (1994)). Bolo ukázané, že kultivované endoteliálne bunky môžu generovať aspoň sLex, pretože majú niekoľko funkčných a2,3 sialyl- a al,3 fukozyltransferáz, enzýmov, ktoré sa účastnia generovania sLex z (poly)laktózamínov (Majuri, M et al., Eur. J. Immunol. 24: 3205 - 3210 (1994)).
Veľa štúdií naznačilo, že selektíny sú zahrnuté vo veľkom množstve akútnych a chronických zápalových stavov v mnohých tkanivách. Bolo naznačené, že môžu byt navrhnuté liečiva, ktoré by narušila škodlivú migráciu leukocytov, ktoré poškodzujú tkanivo v mnohých abnormálnych zápalových stavoch.
Avšak, iba veľmi vysoké koncentrácie (v ráde mM) monomérnych cukrov s nábojom blokujú adhéziu. Bolo ukázané, že špecifická sada polyvalentných, aniónových cukrov, ako je fukoidín (polymér fukóza-4-sulfátu) a polyfosfomanánový ester bunkovej steny kvasiniek (PPME) blokujú túto adhéziu v koncentráciách v ráde nM (Stoolman, L.M. et al., J. Celí. Biol. 99: 1535 - 1540 (1984)). Okrem toho, bolo opísané, že oligosacharidy odvodené od sLEx štruktúry majú protizápalovú aktivitu. Ako pri forme obsahujúcej kyselinu sialovú (sLEx), tak pri sulfátovej (sulfo-LEX) forme tohto oligosacharidu bola opísaná protizápalová aktivita in vivo (Lásky, L.A. Annu. Rev. Biochem.
64: 113 - 139 (1995) ; Mulligan, M.S. et al., Náture 364: 149 151 (1993); Mulligan, M.S. et al., J. Exp. Med. 178: 623 - 631 (1993); Buerke, M. et al., J. Clin. Invest. 91: 1140 - 1148 (1994) a Nelson, R.M. et al., J. Clin. Invest. 91: 1157 - 1166 (1993)).
Pretože lymfocytárne infiltrácia je zásadná pre akútnu rejekciu orgánového transplantátu (Renkonen, R. et al., Celí Immunol. 77: 188 - 195 (1983)), je analýza regulácie migrácie lymfocytov do štepu významná. Bolo ukázané, že peritubulárny kapilárny endotel (PTCE) v obličkových transplantátoch začína exprivovat sLex de novo a viaže zvýšené množstvo lymfocytov behom rejekcie (Turunen J. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994)).
U.S. patent č. US 5352670 od Venot et al. opisuje metódu enzymatickej syntézy α-sialyzovaného oligosacharidového glykozidu pri použití sialyltransferázy, analógu CMP-sialovej kyseliny ako donoru kyseliny sialovej a oligosacharidového glykozidu ako akceptorovej molekuly, majúcej βθ3ΐ(1-3)β61σΝΑσ alebo βΘ3ΐ(1-4)βΘΙοΝΑο disacharid na neredukujúcom konci.
Medzinárodná patentová prihláška č. W095/03059 (Gaeta et al.) opisuje syntetický sacharid, ktorý obsahuje dve glykozidicky viazané sLex skupiny, ktoré sú užitočné v blokovaní bunkovej adhézie, najmä inhibíciou väzby E-selektínu. Tieto sLex obsahujúce oligosacharidy sú syntetizované na galaktózovej kostre.
Oblasť vynálezu
Rozpoznanie L-selektínu na bunkovom povrchu uhľovodanovými ligandami spôsobuje prilipnutie lymfocytov na kapilárny endotel v mieste zápalu. Pretože tento primárny kontakt je bezpodmienečne nutný na extravazáciu leukocytov do tkaniva, je inhibícia voľnými oligosacharidmi schopnými kompetície s prirodzenými ligandami L-selektínu atraktívnou terapeutickou voľbou.
Rozpoznaním významu kontroly abnormálnych zápalových stavov a pri uvedomení si potreby liekov toto sprostredkujúcich syntetizovali vynálezcovia oligosacharidy, ktoré sú schopné inhibovať odpovedi sprostredkované selektínmi. Tieto štúdie vyvrcholili identifikáciou nových oligosacharidov, ktoré blokujú väzbu lymfocytárneho L-selektínu na zodpovedajúce oligosacharidy na endoteliálnom povrchu a klinickou liečbou navrhnutou pre redukciu zápalu v dôsledku podania takých oligosacharidov pacientovi, ktorý potrebuje takú liečbu.
V súlade s tým je vynález zameraný na syntetické oligosacharidy, najmä na divalentné sLex a tetravalentné sLex oli gosacharidy a na iné sLex obsahujúce oligosacharidy z vyššou multivalenciou, významne bez prirodzených nečistôt, a na kom pozície, ktoré ich obsahujú. Syntetické oligosacharidy podľa predkladaného vynálezu obsahujú lineárnu alebo rozvetvenú polylaktózamínovú kostru (LacNac)n, kde N>1 a kde sú väzby medzi zvyškami β1-3' a/alebo β1-6', na ktorou sú naviazané NeuNaca2-3Ga^l-4(Fucl-3GlcNac (sLEx) epitopy β1-3' a/alebo β1-6’ väzbami, kde znamená: NeuNac: kyselina sialová, Gal:
Ί galaktóza, Fuc: fukóza, GlcNac: N-acetylglukózamín. Také oligosacharidy sú schopné viazať selektínové molekuly, ktoré sú na vonkajšom povrchu lymfocytov, najmä L-selektín, a tak brániť väzbe lymfocytov na zodpovedajúce oligosacharidy pre selektín na endoteliálnom povrchu.
Vynález je ďalej zameraný na tetravalentný sLex glykán rozvetvené polylaktózamínové kostry. V porovnaní s monovalentným sLex tetrasacharidom je poskytnutý 100-násobne silnejší inhibítor L-selektínom sprostredkovanej adhézie lymfocytov na endotel pri rejekcii srdcových a obličkových transplantátov pri potkanoch.
Vynález je ďalej zameraný na tetravalentný sLex glykán, ktorý má sLex zvyšky na lineárnej polylaktózamínovéj kostre. Tetravalentný sLex glykán majúci lineárnu kostru troch LacNac zvyškov je silným inhibítorom L-selektínom sprostredkovanej bunkovej adhézie.
Vynález je ďalej zameraný na oligosacharidy spĺňa niekoíko charakteristík ligandov L-selektínu: konkrétne, dodekamérne O-glykozidické jadro 2 typu oligosacharidu alditolu s rozvetvenou polylaktózamínovou kostrou majúcou dve distálne a2,3' sialyzované a al,3 fukozylované N-acetyllaktózamínové skupiny (sialyl Lewis x, sialyl Lex). V tomto predvedení môže byt NeuNaca2-3Gaipi-4(Fucl-3)GlcNac (sLEx) epitop viazaný β1-3'-, β1-6'- alebo β1-6- väzbou na disacharid alditol. Mono-fukozylovaný alditol (tzn. monovalentný sialyl Lex) signifikantne inhibuje od L-selektínu závislú väzbu lymfocytov a difukozylovaný dodekasacharid alditol (tzn. divalentný sialyl Lex) je veími silný inhibítor (IC5Q, inhibičné koncentrácie zabraňujúce 50% väzby = 0,15 μΜ).
Vynález je tiež zameraný na metódu pre enzymatickú syntézu takých oligosacharidov a alditolov.
Vynález je ďalej zameraný na metódu inhibicie selektinom sprostredkovanej väzby lymfocytov na povrch endotelu, osobitne L-selektínom sprostredkované väzby, ale tiež E- a P- selektinom sprostredkované väzby, podaním oligosacharidovej kompozície podlá predkladaného vynálezu, vrátane hore uvedených enzymaticky syntetizovaných alditolov, najmä tam, kde je taká adhézna reakcia medzi lymfocytmi a endoteliálnymi bunkami asociovaná s chronickým alebo akútnym zápalom, ktorý vedie k rejekcii transplantátu, artritíde, reumatoidnej artritíde, infekcii, dermatitíde, zápalovým črevovým chorobám a autoimunitným ochoreniam.
Vynález je ďalej zameraný na metódu prevencie a/alebo liečby bakteriálnych infekcií podaním oligosacharidovej kompozície podľa predkladaného vynálezu.
Vynález je ďalej zameraný na liečbu rakoviny podaním oligosacharidovej kompozície podľa predkladaného vynálezu.
Vynález je ďalej zameraný na metódu blokovania alebo narušenia škodlivej migrácie leukocytov do miesta patogénnej expozície pri akýchkoľvek zápalových stavoch.
Opis obrázkov na pripojených výkresoch
Obrázok 1 (panely a-1): väzba lymfocytov na endoteliálne štruktúry v normálnom a v transplantovanom srdcovom tkanivu v Stamper-Woodruffovom teste. Mikrofotografie boli urobené tak, aby lymfocyty (guľaté a čierne) boli v ohnisku a tkanivo pod nimi (šedá) bolo mierne mimo ohnisko. Naviazané lymfocyty sú označené malými čiernymi šípkami. Panel (a) ukazuje, že iba veľmi malý počet lymfocytov je naviazaný na endokard v normálnych srdciach. V (b) syngénnych štepoch, rovnako ako v (c) (alograftoch) je počet naviazaných lymfocytov tiež veľmi nízky. Rovnaké pozorovanie bolo vykonané v arteriolách; na tieto štruktúry v (d) normálnych srdciach prakticky neadherujú lymfocyty a väzba v (e) syngénnych štepoch a (f) alograftoch je tiež veľmi nízka. Na venuly (označené prerušovanou čarou) z (g) normálnych sŕdc a (h) syngénnych štepov adheruje len málo lymfocytov, ale na venuly v (i) alograftoch adheruje zvýšené množstvo lymfocytov. Na vnútrosvalové kapiláry adheruje len málo lymfocytov v (j) normálnom tkanivu, rovnako ako v (k) syngénnych štepoch. Panel (1) ukazuje, že tu je jasné zvýšenie adhézie lymfocytov na vnútrosvalové kapiláry pri alograftoch. Na tomto panele je možné vidieť veľké množstvo priečnych a pozdĺžnych rezov vnútrosvalovými kapilárami a iba niekoľko lymfocytov adherujúcich k týmto štruktúram je označené šípkami. Všimnite si, že na všetkých paneloch sú tiež niektoré lymfocyty adherujúce priamo na myokard a neležiacich na akýchkoľvek endoteliálnych štruktúrach (sú označené bielymi šípkami na paneloch a a 1).
Obrázok 2: Účinok rôznych enzymaticky syntetizovaných rozvetvených oligosacharidových konstruktov na adhéziu lymfocytov a endotel alograftu. I keď oligosacharidy sLex rodiny redukujú väzbu lymfocytov, inhibičná kapacita tetravalentných sLex je významne vyššia ako inhibičná kapacita iných sLex oligosacharidov. Všetky sLN postrádajúce fukózu boli bez efektu. Je prezentovaný priemer a SEM jedného reprezentatívneho pokusu z troch.
Obrázok 3 (panely a-d): Expanzia 500 MHz 1H-NMR spektra dvojanténových glykánov. A) Glykán 2. B) Glykán 3. C) Glykán 4. D) Zmes glykánov 5 a 6. Intenzita ľavej expanzie je dvoj10 násobkom intenzity pravej. HOD a ssb označujú pozície reziduálneho signálu vody a jej spinového vedľajšieho zväzku, v príslušnom poradí. Signály označené hviezdičkou vychádzajú z nečistoty prítomnej v deuterizovanej vode. Indikátorové línie na obrázku sú umiestnené v hodnotách chemického posunu špecifikovaných signálne multiplety. Presné hodnoty chemického posunu pozri v tabuľke 3.
Obrázok 4 (panely a-c): Chromatografická analýza fukozyltransferázových produktov glykánu 3. A) HPAE-PAD chromatografia produktu z kompletnej reakcie. Stĺpec ukazuje, ako bol glykán 4 odoberaný. PAD odpoveď je ukázaná ako neprerušovaná čara, Na-acetátový gradient ako prerušovaná čara. B) HPAE-PAD chromatografia z čiastočnej reakcie. Piky označené Dl, D2 a D3 reprezentujú sacharid 4, zmes sacharidov 5 a 6 a sacharid 3, v príslušnom poradí. C) Papierová chromatografia súčasného β-galaktozidázového a β-Ν-acetylhexózaminidázového trávenia zmesi desialyzovaných sacharidov 5 a 6. Chromatografia bola vykonaná s vrchnou fázou (4:1:5) n-butanol-kyselina octovávoda na Whatman III Chr papieri, ako to opisuje Niemela, R. et al., Glycoconjugate J. 12: 36-44, (1995)). Šípky A a B ukazujú elučné pozície Ga^l-4(Fucal-3)61σΝΑσβ1-66η1β-4β1σΝΑσ a Ga^l-4(Fucal-3)GlcNAc β1-303ΐβ-461οΝΑσ, v príslušnom poradí.
Obrázok 5 (panely a-b): Chromatografická analýza medziproduktov a konečných produktov v syntéze glykánu 9. A) Iónová výmenná chromatografia na MonoQ 5/5 HR-kolóne sacharidov získaných z a2,3-sialyltransferázovej reakcie 7. Šípky označené Zero, Mono, Di a Tri označujú elučné pozície GlcNAc, 3'-sialyllaktózy, disialyzovaného a trisialyzovaného oligosacharidového markeru, v príslušnom poradí. UV-absorbancia pri 214 nm je reprezentovaná tlstou čarou a NaCl gradient prerušovanou čarou. Stĺpec ukazuje materiál odobraný ako tetrasialo sacharid 8.
B) HPAE-PAD chromatografia fukozyltransferázových produktov sacharidu 8. piky označené TI, T2 a T3 reprezentujú tetra, tri a difukozylové produkty 8, v príslušnom poradí. Chvostovanie pikov sa prisudzuje katalyzovanej 2-epimerizácii redukujúceho konca GlcNA sacharidov. PAD odpoveď je ukázaná ako neprerušovaná línia, Na-Acetatový gradient ako prerušovaná línia.
Obrázok 6 (panely a-c): Expanzia 500 MHz 1H-NMR spektra tetraanténových glykánov. A) Spektrum sacharidu 7. B) Spektrum sacharidu 8. C) Spektrum sacharidu 9. Signály označené hviezdičkou vychádzajú z nečistoty prítomnej v deuterizovanej vode. Intenzita lávej expanzie je dvojnásobkom intenzity pravej expanzie. Línie na obrázku označujú chemický posun signálneho multipletu. Presné hodnoty chemického posunu pozri v tabuľke 4.
Obrázok 7 (panely a-b): Hmotnostná spektrometria (MALDI-MS) desialyzovaných tetraanténových oligosacharidov. A) Hmotnostné spektrum desialyzovaného sacharidu z piku TI, obrázok 5B. B) Hmotnostné spektrum desialyzovaného sacharidu z piku T2, obrázok 5B.
Obrázok 8: Účinok enzymaticky syntetizovaných sLex (prázdne symboly) a sLN (plné symboly) oligosacharidov na adhéziu lymfocytov na endotel obličkového štepu. Prázdne koliesko (o): mono sLex (glykán 1), plné kolieska (·): mono sLN, prázdne štvorčeky (□) di SLex (glykán 4), plné štvorčeky () di sLN (glykán 5), prázdne trojuholníčky (Δ) tetra sLes (glykán 9, plné trojuholníčky (▲) tetra sLN (glykán 8). Lymfocyty blokujúca kapacita tetravalentného sLex bola jasne vyššia ako ostatných sLex oligosacharidov. Je prezentovaný priemer z troch pokusov, SEM nikdy nepresiahla 10 %; pre prehľadnosť nie je uvedená.
Obrázok 9: Nárys spôsobu syntézy tetravalentného sialyl Lewis x sacharidu 17 s lineárnou kostrou a ďalej Lewis x sacharidu 18 z glykánu 12.
Obrázok 10: A. Aniónová výmenná (Mono Q) chromatografia glykánu 16. B. HPAE-PAD chromatografia glykánu 17, izolovaného zo syntetizačnej zmesi gélovou filtráciou. Hlavný pik eluujúci v 8 min. reprezentuje glykán 17, zatiaľ čo o piku v 12 min. sa súdi, že obsahuje jeho ManNac analóg s redukujúcim koncom. Posledný uvedený je pravdepodobne tvorený bázou-katalyzovanou epimerizáciou na C2 redukujúceho konca Glc-NAc glykánu 17 a/alebo prekurzorov. Žiadny oligosacharid eluujúci v 15 - 17 minúte, v očakávanej oblasti elúcie trifukozylových analógov glykánu 17, nebol pozorovaný.
Obrázok 11: Expanzia 1H-NMR spektra glykánu 16. Panel B: 1H-NMR spektrum glykánu 17. Rezonancie označené hviezdičkou (*) vychádzajú z neznámych nečistôt.
Obrázok 12: Od L-selektínu závislá väzba lymfocytov na endotel rejektovaných transplantátov srdca u potkanov v prítomnosti syntetických oligosacharidov. Je prezentovaný priemer + SEM jedného reprezentatívneho pokusu z troch vykonaných. Tetravalentný sialyl Lewis glykány 9 a 17 inhibovali adhéziu lymfocytov silne, s hodnotami IC5Q okolo 1 nM. Nefukozylované analógy 8 a 16 nemali žiadne inhibičné vlastnosti.
Obrázok 13: Štruktúra sacharidov alditolovej série a označenie monosacharidových zvyškov.
Obrázok 14 (panely A-C). Chromatografická analýza sacharidov po glykozyltransferázových reakciách. Čísla pikov označujú sacharidy v tabuíke 6. A. Analýza produktov glykozyltransferázovej reakcie sacharidu 24 HPAEC s 60 mM NaOH ako eluentu. Sú ukázané vypočítané pozície non-, mono-, a digalaktozylovaných produktov. B. Analýza reakčnej zmesi po sialyltransferázovej reakcii sacharidu 25 aniónovou výmenou chromatografiou na Mono Q kolóne. Disialyldekasacharid 26 bol získaný ako hlavný produkt. Ďalšie dva piky v oblasti oligosacharidov s nábojom sú CMP (a) a NeuAc (b). C. Separácia mono a difukozylovaných sacharidov (27 a 28, v príslušnom poradí) vzniknutých z fukozyltransferázovej reakcie 26 pomocou HPAEC. Lineárny gradient NaAc bol aplikovaný od 100 mM NaOH, 25 mM NaAc v minúte 0 do 100 mM NaOH, 100 mM NaAc v minúte 20.
Obrázok 15 (panely A-D): Rozloženie ^H-NMR spektra sacharidov 25 (panel A), 26 (B), 27 (C) a 28 (D). Rezonancie označené hviezdičkou sú neuhíovodanového pôvodu.
Obrázok 16: Časť TOSCY spektra O-glykozidického divalentného alditolu 28 (spin-lock čas 80 ms). Z rozloženia ukazujúceho korelačné piky medzi anomérnymi a neanomérnymi protónmi GlcNA zvyškov, je pre väčšinu protónov jasný posun dolu spôsobený fukozyláciou zvyškov pre GlcNA zvyšky 5 a 6, ale nie pre zvyšok 3.
Obrázok 17: DQFCOSY spektrum divalentného sLex O-glykán alditolu 28 použitého na zostavenie presahujúcich 1H-NMR rezonancií.
Obrázok 18: Účinok enzymaticky syntetizovaných oligosacharidových konštruktov na adhéziu lymfocytov na peritubulárny kapilárny endotel rejektovaného obličkového alograftu.
Použité symboly sú: prázdne štvorčeky (o) O-glykán nesúci dve sialyl LacNAc jednotky 26, prázdne trojuholníčky (Δ) monovalentný sialyl Lex O-glykán 27, prázdne kolieska (o) divalentný sialyl Lex glykán 28, plné trojuholníčky (a) monovalentný sialyl Lex tetrasacharid 1, plné kolieska (·) divalentný sialyl Lex glykán 4. Divalentný oligosacharid O-glykozidického typu alditol 28 bol jasne najúčinnejším inhibítorom v porovnaní s monovalentným analógom 27 bez fukózového zvyšku v 6-viazanom rameni. Súčasne, glykán 26 nenesúci žiadnu fukózu, neinhiboval väzbu lymfocytov vôbec. Sacharid 4, postrádajúci redukovanú O-glykozidickú jadrovú sekvenciu 28, bol o niečo slabším inhibítorom ako 28, čo ukazuje, že o-glykozidická jadrová sekvencia môže byt tiež významná pre väzbu. Je ukázaný priemer + SEM reprezentatívneho pokusu z troch nezávislých pokusov.
Predkladaný vynález sa týka nových oligosacharidov a farmaceutický prijateľných kompozícií, ktoré ich obsahujú, a ich použitia v terapeutickej metóde na liečbu akútnych alebo chronických zápalových stavov. Syntetické oligosacharidy podlá predkladaného vynálezu obsahujú lineárnu alebo rozvetvenú polylaktózamínovú kostru (LacNac)n, kde N>1 a kde sú väzby medzi zvyškami β1-3' a/alebo β1-6', na ktorú sú naviazané NeuNaca23Ga^l-4(Fucl-3GlcNac (sLEx) epitopy β1-3' a/alebo β1-6' väzbami, kde znamená: NeuNac: kyselina sialová, Gal: galaktóza Fuc: fukóza, GlcNac: N-acetylglukózamín. Také oligosacharidy sú preferovane multiméry monovalentných sLex, a najmä divalentné a tetravalentné multiméry sLex, ako je to znázornené v tabuľke 2 a na obrázkoch 9 a 13. V preferovanom rozpracovaní je syntetický oligosacharid tetravalentný sLex konštrukt 22sacharidu ako je to ukázané v tabuľke 2 a na obrázku 9.
Syntéza takých multimérnych foriem sLex je dosiahnutá chemickými a/alebo enzymatickými prostriedkami. Napríklad, konštrukcia monovalentného sLex tetrasacharidu, divalentného sLex dekasacharidu a tetravalentného sLex 22-sacharidu majúca rozvetvenú polylaktózamínovou kostru môže byt vykonaná pri použití N-acetyllaktózamínu, hexasacharidu Gaipi-4GlcNAcpi6(Gal81-4GlcNAc81-3)Galpl-4GalNAc (Wilkman, A. et al., Carbohydrate Res. 226: 155 - 174 (1993)) a tetradekasacharidu 03ΐβ1-301σΝΑθβ1-6(Ga^l-4GlcNAcpi-3)Gal31-4Glc ΝΑθβ1-6- , (03ΐβ1-461σΝΑσβ1-6(03ΐβ1-σΐθΝΑθβ1-3)σ3ΐβ1-Ο1σΝΑσβ1-3)03ΐβ1-4 GlcNAc (Seppo, A. et al., Bioch. 34: 4655 - 4661 (1995)) ako akceptorov pre mono-, di- a tetravalentné sLex sacharidy, v príslušnom poradí (pozri tiež príklad 2). Akceptory sú najskôr a2,3 sialyzované ich inkubáciou do vyčerpania s CMP-NeuNAc a a2,3 sialyltransferázou z ludskej placenty. Izolované, plne sialyzované sacharidy sú potom al,3 fukozylované do vyčerpania GDP-fukózou a čiastočne prečisteným prípravkom ludskej mliečnej al,3 fukozyltransferázy ako to opisuje Natunen, J. et al., Glycobiol. 4: 577 - 583 (1994)) (tu uvedené ako odkaz). Velkosti vzorky sú hodnotené UV absorpciou proti vonkajšiemu N-acetylglukózamínu. Charakterizácia konštruktov bola urobená iónovou výmennou chromatografiou a 1D 1H NMR spektroskopiou pri 500 MHz. Tetravalentné sLex 22-sacharidy majúce lineárnu polylaktózamínovú kostru môžu byt získané syntézou v piatich krokoch vychádzajúcich z oktamérneho polylaktózamínu LacNA σβΙ-3’(01σΝΑοβ1-6')Ε3σΝΑσβ1-3'(01οΝΑοβ1-6')LacNAc (kde LacNAc je disacharid Ga^l-4GlcNAc) najskôr jeho predĺžením v β1,3-GlcNAc transferázovej reakcii. Izolovaná sacharidová zmes je podrobená reakcii katalyzovanej βΙ,δ-GlcNAc transferázou z žalúdočnej sliznice ošípaných. Vzniknutý oligosacharid je potom premenený βΐ,4-galaktozyltransferázovou reakciou na rozvetvené usporiadanie siedmich LacNac jednotiek, ktoré sú ďalej sialyzované a fukozylované na tetravalentný sLex sacharid (pozri tiež príklad 6).
Predkladaný vynález sa tiež týka enzymatickej syntézy oligosacharidových alditolov, ktoré majú niektoré charakteristické rysy L-selektínových ligandov, a ktoré sú schopné pôsobiť ako inhibítory väzby L-selektínu na ligand. V tomto rozpracovaní môžu byť NeuNAca2-3Ga^l-4(Fucl-3)GlcNac(sLex) epitopy naviazané β1-3'-, β1-6'- alebo β1-6- väzbou na disacharid alditol. Také alditoly sú preferovane multiméry monovalentných sLex, a najmä divalentné multiméry sLex ako je to znázornené na obrázku 13. V osobitne preferovanom rozpracovaní je alditol dodekamérny oligosacharid alditol s O-glykozidickým jadrom 2 typu s rozvetvenou polylaktózamínovou kostrou majúcou dve distálne a2,3N sialyzované a al,3 fukozylované N-acetyllaktózamínové skupiny (sialyl Lewis x, sialyl Lex) ak je to znázornené na obrázku 13. Štruktúra každého sacharidu v priebehu syntézy z disacharidu Ga^l-3GalNAc na dodekasacharid alditol bola stanovená niekolkými metódami vrátane 1- a 2- rozmerovej l-H-NMR spektroskopie. Posledný krok syntézy, al,3 fukozylácie 6-viazaného ramena, prebiehal pomaly a bol asociovaný so znateľným posunom v H-l rezonancii GlcNAc zvyšku v rozvetvenej N-acetyllaktózamínovej jednotke.
Po analýze niekoľkých štrukturálnych rysov ligandov pre selektín bolo rozhodnuté syntetizovať sialyzované O-glykozidické polylaktózamínové alditoly s žiadnym, jedným, alebo dvoma al,3 viazanými fukózovými zvyškami na sialyzovaných N-acetyllaktózamínových zvyškoch. Vynálezcovia tu opisujú enzymatickú syntézu vhodných deka- až dodekasacharidov, ich štrukturálnu charakterizáciu chromatografiou a 1- a 2- rozmerovou ^H-NMR, a ich použitie ako inhibítorov pre L-selektínom sprostredkovanú väzbu lymfocytov na endotel na dobre dokumen17 tovanom modele rejekcie obličkového transplantátu u potkanov (Renkonen, R. et al., Am. J. Pathol. 137: 643 - 651 (1990); Turunen, J.P. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994))
Konečný produkt syntézy a jeho analógu bez jedného alebo obidvoch fukózových zvyškov boli testované ako inhibítory L-selektínom sprostredkovanej interakcie lymfocyt-endotel v rejekcii potkanieho transplantátu obličky. Zatial čo nefukozylovaný O-glykozidický oligosacharid alditol nemal žiadnu inhibičnú aktivitu, monofukozylovaný alditol (tzn. monovalentný sialyl Lex) signifikantne zabraňoval väzbe a difukozylovaný dodekasacharid alditol (tzn. divalentný sialyl Lex) bol velmi silný inhibítor (IC50, inhibičná koncentrácia brániaca 50 % väzby = 0,15 μΜ).
Okrem multivalenčnosti sa zdá, že Gaipi-3GalNAc-ol sekvencia O-glykozidického jadra zvyšuje afinitu glykánu k L-selektínu. Toto bolo naznačené paralelnými inhibičnými pokusmi, kde boli disialyzované a difukozylované rozvetvené polylaktózamínové dekasacharidy, podobné divalentnému dodekasacharidu alditolu, ale bez redukovaného O-glykozidického jadra, menej účinnými inhibítormi (IC50 = 0,5 μΜ) akož O-glykozidický dodekasacharid alditol. Tak v jednom určitom preferovanom rozpracovaní vynálezu alditol obsahuje Gaipi-3GalNAc-ol sekvenciu v O-glykozidickom jadre.
Nefukozylovaný O-glykozidický konštrukt 26 (čísla disacharidov - obrázok 13) nemal žiadnu inhibičnú aktivitu, zatial čo monofukozylovaný (27) bránil 37 % väzby lymfocytov závislej od L-selektínu v koncentrácii 0,5 μΜ. Difukozylovaná molekula (28) bola velmi silným inhibítorom (IC50 = 0,15 μΜ). Preto, prítomnosť mnohopočetných sialyl Lex epitopov na distálnom konci zvyšuje afinitu sacharidu k L-selektínu. Okrem toho, skôr syntetizovaný divalentný sialyl Lex glykán (4), postrádajúci proximálnu Gaipi-3GalNAc-ol sekvenciu zlúčeniny 28, ukázal v paralelnom pokusu menšiu inhibičnú kapacitu ako alditol 28.
V metóde liečby zápalu podlá predkladaného vynálezu je pacientovi (zvierati a najmä človeku), ktorý potrebuje takú liečbu, podaná účinná dávka syntetického uhlovodanu podlá predkladaného vynálezu, obyčajne vo farmaceutický prijatelnej kompozícii. Pacientovi môže tiež byt podaná kompozícia obsahujúca zmes multivalentných foriem, najmä účinnú zmes divalentných a tetravalentných sLex zlúčenín ukázaných v tabulke 2 a na obrázku 9 a 13. Také farmaceutické kompozície môžu ďalej obsahovať žiadúce prísady, ako sú napríklad protilátky alebo ich konjugáty, ktoré rozpoznávajú a viažu sa na leukocytárny L-selektín, takže pôsobí v súlade s a zvyšujú účinnosť syntetických uhlovodanov podlá predkladaného vynálezu.
Zápalovými stavmi sa rozumejú fyziologické alebo patologické stavy, ktoré sú sprevádzané zápalovou odpoveďou. Také stavy zahŕňajú, ale nie sú obmedzené, tkanivové/orgánové trans plantácie ako sú kožné štepy, rejekcie obličky, srdca, plúc, pečene, kosťovej drene, rohovky, slinivky, tenkého čreva, artritída, infekcie, dermatóza, zápalové črevné ochorenia a auto imunitné ochorenia.
Zápalové stavy môžu byt chronické alebo akútne, a môžu byť centralizované v tkanivu, ktorý exprivuje receptor pre L-selektín buď konštitutívnym, alebo indukovatelným spôsobom. Ako je tu ukázaná, tkanivá, ktoré inak neexprivujú receptor pre L-selektín, môžu byt indukované na jeho expresiu za istých fyziologických stavov. Napríklad, ako je tu ukázané, sLex expresia je indukovaná na kapilárnom endotelu akútne rejektova19 ných orgánových transplantátov a táto de novo expresia sLex priťahuje lymfocyty z cirkulácie do transplantátov, čo vyvoláva zápal a rejekciu. Napriek tomu, metóda podľa vynálezu blokuje väzbu lymfocytárneho L-selektínu na zodpovedajúce oligosacharidy na povrchu endotelu.
Termínom významne bez nečistôt sa rozumie, že multivalentný sLex je prečistený na taký stupeň, že neobsahuje žiadne, alebo prijateľné hladiny, nežiadúcich alebo postrádateľných substancií, ktoré boli prítomné v priebehu in vitro alebo in vivo syntézy uvedeného multivalentného sLex.
Termíny liečba alebo liečenie zahŕňajú podanie syntetických oligosacharidov podľa predkladaného vynálezu subjektu za účelmi, ktoré zahŕňajú profylaxiu, zmiernenie, prevenciu alebo liečbu ochorení sprostredkovaných dejmi selektínovej adhézie, najmä dejmi L-selektínom sprostredkovanej adhézie.
Taká liečba nemusí nutne úplne zmierniť zápalovú odpoveď.
Ďalej, taká liečba môže byt použitá spolu s inými tradičnými spôsobmi liečby na redukciu zápalových stavov, ak sú odborníkom v odbore známe.
Metódy podľa predkladaného vynálezu môžu byt poskytnuté ako preventívna liečba pred detekciou, napríklad, zápalového stavu, takže bráni rozvoju takého stavu u pacienta s vysokým rizikom vzniku takého stavu, ako sú napríklad pacienti po transplantácii.
Pri podaní ľudskému alebo zvieraciemu pacientovi môže byt kompozícia podľa predkladaného vynálezu formulovaná akýmkoľvek spôsobom, ktorý ju robí vhodnú na orálne, parenterálne, vrátane intramuskulárneho, intravenózneho alebo subkutánneho, intracisternálne, intravaginálne, intraperitoneálne, lokálne, vrátane práškov, mastí, alebo kvapiek, nazálne, vrátane sprejov, lokálne, enterálne alebo rektálne podanie. Tak môže byt činidlo napríklad vo forme injekovateľnej formulácie, aerosólovej formulácie, suspenzie, roztoku, disperzie, emulzie, sterilného prášku, zálievky, apod. Činidlo môže byt formulované s farmaceutický prijateľnými prísadami, nosičmi, rozpúšťadlami alebo vehikulami, napr. izotonickým fyziologickým roztokom, etanolom, polyolom, polyetylénglykolom, glycerolom a podobne, podľa bežnej farmaceutickej praxe. Velkosť dávky činidla bude dostatočná na dosiahnutie protizápalového účinku spôsobeného blokovaním selektínom, a najmä L-selektínom sprostredkovaných adhéznych dejov u pacienta.
Pevné dávkové formy na orálne podanie zahŕňajú kapsuly, tablety, pilulky, prášky a granuly. V pevných dávkových formách môže byť aktívna zlúčenina zmiešaná s aspoň jednou inertnou obvyklou prísadou, plnidlom alebo extenderom, spojivom, zvlhčovacím činidlom, dezintegrujúcim činidlom, činidlom spomaľujúcim rozpúšťanie, zvlhčujúcim činidlom, adsorbentom, klzným činidlom, a/alebo tlmivým činidlom. Pevné dávkové formy ako sú tablety, dražé, kapsuly, pilulky a granuly môžu byt pripravené s poťahmi a plášťom. Aktívne zlúčeniny môžu tiež byt v mikroenkapsulovanej forme s jednou alebo viacerými prísadami .
Kvapalné dávkové formy na orálne podanie zahŕňajú farmaceutický prijateľné emulzie, roztoky, suspenzie, sirupy a elixíry. Okrem aktívnych zlúčenín môžu kvapalné dávkové formy obsahovať inertné riedidlá bežne používané v odbore ako je voda alebo iné rozpúšťadla, solubilizačné činidlá a emulzií ikátory.
Okrem takých inertných riedidiel môže kompozícia tiež obsahovať prísady, ako sú zvlhčujúce činidlá, emulzifikačné alebo suspendujúce činidlá, sladidlá, príchuti a voňavé látky.
Suspenzia môžu okrem aktívnych zlúčenín obsahovať suspendujúce činidlo.
Kompozície podľa predkladaného vynálezu môžu byt tiež podané vo forme lipozómov. Ako je v odbore známe, lipozómy sú všeobecne odvodené od fosfolipidov alebo od iných lipidových substancií. Lipozómy sú tvorené mono alebo multilamelárnymi hydrátovanými kvapalnými kryštálmi, ktoré sú dispergované vo vodnom médiu. Môže byt použitý akýkoľvek netoxický, fyziologicky prijateľný a metabolizovateľný lipid schopný tvorby lipozómov. Predkladané kompozície vo forme lipozómov môžu obsahovať okrem syntetických multivalentných sLex obsahujúcich polylaktózamínov podľa predkladaného vynálezu stabilizujúce činidlá, konzervačné činidlá, prísady a podobne. Preferovanými lipidmi sú fosfolipidy a fosfatidylcholíny (lecitíny), ako prirodzené, tak syntetické. Metódy tvorby lipozómov sú v odbore dobre známe.
Kompozície a metódy podľa predkladaného vynálezu sú vhodné na liečbu akýchkoľvek stavov, na ktorých sa účastní selektínom, a najmä L-selektínom sprostredkovaná adhézia, ktorá zvyšuje zápalovú reakciu. Tak je činidlo použiteľné na liečbu stavov zahŕňajúcich, ale bez obmedzenia, septický šok, chronické zápalové ochorenia ako je psoriáza, a reumatoidná artritída a reperfúzne poškodenie, ktoré sa vyskytuje po srdcových príhodách, mŕtvici, a orgánových transplantáciách, traumatický šok, multiorgánové zlyhanie, automimunitné ochorenie, astma, zápalové črevné ochorenia, rejekcia tkaniva, artritída, infekcia, najmä lokálna infekcia, dermatózy apod. V každom prípade je účinné množstvo zlúčenín podlá predkladaného vynálezu podané buď samostatne, alebo ako súčasť farmaceutický prijateľnej kompozície pacientovi, ktorý potrebuje takú liečbu. Je tiež známe, že môže byť pacientovi, ktorý potrebuje takú liečbu, podaná kombinácia zlúčenín.
Bolo ukázané, že bunková adhézia spôsobená sLex a sLea má úlohu pri metastazovaní určitých nádorov. V súlade s tým je ďalším použitím predkladaného vynálezu protinádorová liečba, kde môže byt metastazovanie sLex pozitívnych nádorov inhibované týmito glykánmi.
V inej realizácii sú účinné dávky kompozícií podľa predkla daného vynálezu podané preto, aby poskytli terapeutický prínos proti sekundárnym škodlivým účinkom zápalov.
Účinným množstvom kompozície podľa predkladaného vynálezu sa rozumie množstvo, ktorým je dosiahnutá určitá úľava u pacienta, ktorému je liečba podaná. Abnormálnymi zápalovými stavmi u hostiteľa sa rozumejú stavy, keď stupeň zápalu u subjektu presahuje normu pre subjekt, ktorý je zdravý, alebo presahuje požadovaný stupeň. Sekundárnym tkanivovým poškodením alebo toxickými účinkami sa rozumejú tkanivové poškodenia alebo toxické účinky, ktoré sa vyskytujú v inak zdravých tkanivách, orgánoch a bunkách v dôsledku prítomnosti nadbytočných selektínom, a najmä L-selektínom sprostredkovaných adhéznych dejov, vzniknutých v dôsledku primárnych stimulov kadekoľvek v tele.
V metódach podľa predkladaného vynálezu vedie infúzia kompozícií podľa predkladaného vynálezu k zmenšeniu schopnosti selektín exprivujúcich leukocytov prilipnúť a tak sa pripojiť na endotel, čo bráni alebo inhibuje adherenciu takých buniek v mieste zápalu a lokalizovanému poškodeniu endotelu, a tak bráni nežiadúcemu pohybu leukocytov alebo presunu do poškodeného tkaniva alebo buniek.
V súladu s tým poskytujú farmaceutické kompozície podlá predkladaného vynálezu kompozície obsahujúce syntetické uhlovodany a alditoly podlá predkladaného vynálezu, v množstve dostatočnom na antagonizáciu (úplnú alebo čiastočnú) prirodzeného selektínu pacienta, a najmä L-selektínu, väzbou na prirodzené ciele takého selektínu u takého pacienta, a špecificky väzbou na endoteliálne bunky.
Oligosacharidy podlá predkladaného vynálezu môžu byt konjugované, buď chemicky alebo metódami genetického inžinierstva, na fragmenty alebo na iné činidlá, ktoré zamierujú také zlúčeniny, ktoré sa viažu na selektín, do požadovaného miesta účinku. Alternatívne, iné zlúčeniny môžu byt konjugované, buď chemicky alebo genetickým inžinierstvom, na oligosacharidy podlá predkladaného vynálezu tak, že posilňujú alebo dodávajú ďalšie vlastnosti takým oligosacharidom alebo kompozíciám, ktoré ich obsahujú, najmä vlastnosti, ktoré zvyšujú schopnosť zlúčenín spôsobiť zmiernenie toxických účinkov spôsobených adhéziou, alebo navádzajú odplavenie zlúčenín z krvi, alebo spôsobujú iné výhodné vlastnosti.
Množstvo a režimy podania oligosacharidov viažucich sa na selektín a kompozícií obsahujúcich oligosacharidy podlá predkladaného vynálezu môže byt lahko určené odborníkmi v klinickom odbore liečby zápalových ochorení ako je artritída, tkanivové poškodnie a rejekcia tkaniva. Všeobecne, dávka kompozície podlá predkladaného vynálezu sa bude velmi líšiť v závislosti od úvah ako je: typ použitého syntetického uhlovodanu, vek, zdravotný stav, typ liečeného ochorenia, typ súčasnej liečby, pokiaľ je dajaká, frekvencia liečby a charakter požadovaného účinku, rozsah tkanivového poškodenia, trvanie príznakov, a kontraindikácie, pokiaľ sú dajaké, a od iných okolností upravovaných jednotlivým lekárom. Požadovaná dávka môže byt podaná v jednej alebo vo viacerých aplikáciách na získanie požadovaného výsledku. Farmaceutické kompozície obsahujúce oligosacharidy podľa predkladaného vynálezu, ako je tetravalentný sLex 22-sacharid, alebo difukozylovaný dodekasacharid alditol, môžu byt dodané v jednotkovej dávkovej forme.
Farmaceutické kompozície obsahujúce syntetické oligosacharidy podľa predkladaného vynálezu môžu byt podané v akomkoľvek vhodnom farmaceutickom nosiči pre podanie. Môžu byt podané v akejkoľvek forme, ktorá bude spôsobovať profylaktickú, paliatívnu, preventívnu alebo terapeutickú liečbu stavov sprostredkovaných selektínom, a najmä L-selektínom, u ľudí a u zvierat. Pri definovaní, výraz spôsob liečby ochorenie a podobné výrazy, ako sa používa aj v špecifikáciách a nárokoch, znamená tiež spôsob prevencie takého ochorenia.
Spôsob podľa predkladaného vynálezu je užitočný na prevenciu alebo rejekciu zápalu transplantovaného tkaniva alebo orgánov akéhokoľvek typu, napríklad srdca, pľúc, obličiek, kožných štepov, tkanivových štepov, apod.
Kompozície podľa predkladaného vynálezu môžu obsahovať sterilné vodné alebo nevodné rozpúšťadlá, suspenzie a emulzie, najmä pokiaľ sú určené na parenterálne podanie. Príklady nevodných rozpúšťadiel sú propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinné oleje, rybí olej a injekovatelné organické estery. Vodné nosiče zahŕňajú vodu, roztoky voda-alkohol, emulzie, suspenzie, vrátane fyziologického roztoku a tlmených medicinálnych vehikul vrátane roztoku chloridu sodného, Ringerovho roztoku obsahujúceho laktózu, alebo fixovaných olejov. Intravenózne vehikulá zahŕňajú roztoky tekutín a živín, elektrolytové roztoky, ako sú tie, ktoré sú založené na Ringerovej dextróze, a podobne.
Kompozície podľa predkladaného vynálezu môžu byť podané pomocou pomp, alebo vo forme so spomaleným uvoľňovaním, najmä tam, kde je primárne poškodenie skôr predĺžené alebo oddialené, ako akútne. Napríklad, primárne poškodenie je často skôr predĺžené alebo oddialené u infekcie alebo výronu, kde sa poškodenie tkaniva alebo svalov objavuje (alebo perzistuje) niekoľko dní po primárnej infekcii alebo poškodení. Molekuly viažuce selektín podľa predkládaného vynálezu môžu byt tiež podané do špecifických orgánov vo vysokých koncentráciách pomocou vhodne zavedených katétrov, alebo podaním takých molekúl ako súčasti chimerických molekúl (alebo komplexov), ktoré sú zamerané na cieľové špecifické orgány.
Podanie formy so spomaleným uvoľňovaním je vhodné pri tých pacientoch, kde sú indikované opakované injekcie po dlhý čas. Napríklad, je žiadúce podať kompozíciu podľa predkladaného vynálezu vo forme so spomaleným uvoľňovaním tam, kde sú spôsoby podľa predkladaného vynálezu použité na liečbu genetických alebo chronických zápalových ochorení, ktoré sú spôsobené selektínmi, preto, aby sa maximalizoval komfort pacienta.
Kompozície podľa predkladaného vynálezu môžu byt použité v dávkových formách ako sú tablety, kapsuly, prášok vo vreckách, alebo kvapalné roztoky na orálne podanie, pokiaľ nie je biologická aktivita aktívneho multimérneho uhľovodanu zničená procesom trávenia a pokiaľ charakteristiky zlúčeniny umožňujú absorpciu v čreve.
Farmaceutické kompozície podlá predkladaného vynálezu sú vyrábané známym spôsobom, ako je napríklad bežné miešanie, granulovanie, výroba dražé, rozpúšťanie, lyofilizácia alebo podobné procesy. Kompozície podlá predkladaného vynálezu nachádzajú uplatnenie v kontrole zápalového fyziologického poškodenia, ako akútneho, tak chronického. Kompozície podlá predkladaného vynálezu bránia maximálnemu účinku telu vlastných mechanizmov pre rozpoznávanie selektínom sprostredkovanej adhézie.
V intravenóznej dávkovej forme majú kompozície podlá predkladaného vynálezu dostatočne rýchly nástup účinku na to, aby boli použitelné na akútne zvládnutie potenciálneho tkanivového poškodenia.
Ďalej, verzie s nižšou účinnosťou sú užitočné pri zvládnutí stredne ťažkých alebo chronických selektínom sprostredkovaných zápalových ochorení.
Akútna rejekcia orgánového transplantátu je charakterizovaná ťažkou lymfocytárnou infiltráciou. Bolo už skôr opísané, že alterácie endotelu štepu vedú k zvýšenému presunu lymfocytov do štepu. Tu uvedené príklady ukazujú, že selektín, a najmä L-selektín, je indukovaný v dôsledku takého štepu v tkanivu a tiež že lymfocyty adherujú k endotelu rejektovaných transplantátov srdca, ale nie k endotelu syngénnych štepov alebo normálnych sŕdc analyzovaných in vitro Stamper-Woodruffovým väzbovým testom. Enzymaticky bolo syntetizovaných niekolko členov sLex rodiny a bola analyzovaná ich schopnosť blokovať adhéziu lymfocytov na srdcový endotel. Monovalentný sLex (tetramer), divalentný sLex (dekamer) a tetravalentný sLex (22-mer) všetky signifikantne redukovali väzbu lymfocytov, ale inhibícia te27 ι
travalentným sLex konštruktom bola jasne lepšili ako pri ostaI tných členoch sLex rodiny. Najdôležitejšie1 kontrolné oligosacharidy, sialyl laktózamíny (sLN) bez fukózy) ale s rovnakým
I nábojom ako členy sLex rodiny, nemali žiadny účinok, na väzbu lymfocytov. « í
I t
Ďalej, sú tu opísané metódy syntetizovania sialyzovaných O-glykozidických polylaktózaminových alditolov; ktoré sú účinnými inhibítormi L-selektínom sprostredkovanej: väzby lýmfoi cytov na endotel. Konkrétne, difukozylovaný dodekasacharid alditol (divalentný sLex) inhibuje 50 % väzby v koncentrácii 0,15 μ.Μ. Divalentný sLex alditol obsahuje :Gaipi-3GalNAc-ol sekvenciu v O-glykôzidickom jadre o ktoré sa súdi, že zvyšuje afinitu glykánu k L-selektínu. j
Nasledujúce príklady reprezentujú najskôr syntézu komplexu oligosacharidov v dostatočných množstvách .(ako je to opísané v príkladoch) tak, že je možné rutinne uskutočňovať typy pokusov opísané v tejto prihláške. Predkladaný vynález prekonáva v tomto ohíade skoršie ťažkosti.
Nasledujúce príklady sú mienené ako ilustrácia predkladaného vynálezu a nie sú v žiadnom ohlade.limitujúce.
' I
I
Príklady rozpracovania vynálezu
Príklad 1
Zvieracie modely pre L-selektínom sprostredkovanú rejekciu transplantátu a test inhibície adhézie
Rejekcia transplantátu je zápalový proces charakterizovaný lymfocytárnou infiltráciou. Skoršie pozorovania ukázali, že peritubulárny kapilárny endotel (PTCE) je miestom vstupu lymfocytov do rejektovaného renálneho alotransplantátu. Behom rejekcie začínajú PTCE exprivovat sialyl Lewis x de novo a viažu lymfocyty mechanizmom významne závislým od L-selektínu. Preto, inhibícia interakcie lymfocyt-endotel oligosacharidovými ligandami L-selektínu ponúka atraktívnu alternatívu pre prevenciu zápalu a rejekcie. Už skôr bolo ukázané, že počet lymfocytov infiltrujúcich štep sa dramaticky zvyšuje behom akútnej rejekcie z normálnej hodnoty okolo 5x10 na viac ako 30X106.
Zvieracie modely rejekcie srdcových a obličkových transplantátov využívajú inbredné WF (RT1V) a DA (RTla) kmene potkanov, ktoré sa chovajú v kolónii a sú riadne testované na vnútrokmeňový príjem transplantátov, rovnako ako na absenciu vnútrokmeňovo zmiešanej lymfocytárnej kultúry. DA transplantáty WF príjemcom sú alotransplantáty, WF štepy WF a DA štepy DA slúžia ako syngénne kontroly. Zvieracie modely sú podrobnejšie opísané v (Renkonen, R. et al., Transplantation 47: 577 - 579 (1989); Renkonen, R. et al., Am. J. Pathol. 137:
643 - 651 (1990); Turunen J.P. et al., Transplantation 54: 1053 - 1058 (1992); Turunen, J.P. et al., Eur. J. Immunol.
24: 1130 - 1136 (1994); Turunen, J.P. et al., J. Exp. Med., 182: 1133 - 1142 (1995)).
Stamper-Woodruffov test väzby
Malé časti odobraných syngénnych (DA do DA a WF do WF), alogénnych (DA do WF) transplantátov boli umiestnené do Tissue Tek média (Lab-Tek Production, Naperville, 111.) a boli rýchlo zmrazené v kvapalnom dusíku. 8 μπι silné zmrazené rezy boli pripravené behom jednej hodiny pred použitím rezov v teste väzby lymfocytov na endotel (Renkonen, R. et al., Transplantation 47: 577 - 579 (1989); Renkonen, R. et al., Am. J. Pathol. 137: 643 - 651 (1990); Turunen J.P. et al., Transplantation 54: 1053 - 1058 (1992); Turunen, J.P. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994); Turunen, J.P. et al., J. Exp. Med., 182: 1133 - 1142 (1995)).
Jednotlivé bunkové suspenzie lymfocytov mezenteriálnych lymfatických uzlín boli vyrobené mechanickou dezintegráciou v RPIM 1640 médiu (Gibco, Grand Island, NY) doplnenom HEPES (25 mm) a 0,5% fetálnym telacím sérom a bunky boli presiate cez sito s pórmi veíkosti 50 μπι. Viac ako 99% buniek boli lymfocyty a populácia lymfocytov sa skladala z 80-90% CD-3 pozitívnych T buniek, 50-60% CD-4 pozitívnych T buniek, 25-35% CD8-pozitívnych T buniek a 10-20% CD19 pozitívnych B buniek, ako bolo analyzované prietokovou cytometriou a imunoperoxidázovým farbením z cytocentrifugovaných prípravkov.
3x10° buniek v 100 μπι média bolo umiestnených na povrch tkanivových rezov pri použití krúžku z vosku na zabránenie úniku kvapaliny. Rezy boli horizontálne rotované na trepačke pri 60 rpm počas 30 minút pri +4°C. Po inkubácii bolo médium opatrne odstránené absorpčným papierkom a rezy boli fixované v 1,5% chladnom glutaraldehyde cez noc. Rezy boli farbené tionínom počas 30 minút. Nadbytok tionínu bol opatrne vypláchnutý v PBS a rezy boli umiestnené do PBS-glycerolu (1:1) alebo do Aquamount Mountant, (BHD Limited, Poole, England). Z týchto prípravkov sa určil počet lymfocytov naviazaných na rôzne štruktúry. Z každej vzorky bolo analyzovaných aspoň 10-20 polí s vysokou početnosťou, pričom každá skupina obsahovala 3-4 zvieratá.
Extravazácia lymfocytov behom rejekcie srdcového transplantátu
Endotel v tkanivových rezoch pripravených z alotransplantátov viazal signifikantne viac lymfocytov v porovnaní s endotelom v rezoch pripravených zo syngénnych transplantátov normálnych sŕdc (tabuľka 1, obrázok 1).
Tabulka 1: Počet in vitro adherujúcich lymfocytov na jedno mikroskopické pole pri veľkom zväčšení v normálnom srdci a v syngénnych alebo alogénnych srdcových transplantátoch v deň 3 po transplantácii. Je prezentovaný priemer a SEM siedmich nezávislých pokusov.
Normálny
Celková oblasť | 47,4 | ± 4,3 |
Endokard | 0,1 | ± 0,1 |
Arterioly | 0,1 | ± 0,1 |
Venuly | 5,2 | ± 0,4 |
Syngenne transplantáty | Alogenne transplantáty |
71,1 + 5,6 | 151,6 + 16,1 |
2,1 + 0,7 | 2,8 + 1,3 |
2,1 + 0,1 | 1,6 ± 0,7 |
7,6 ± 0,5 | 12,2 + 1,6 |
Medzisvalové kapiláry
Myokard
23,8 + 3,1 42,7 + 3,8 17,3 + 0,0 16,6 + 1,1
119,4 + 12,4 15,6 + 1,9
Keď bolo anatomické umiestnenie analyzované podrobnejšie, bol endotel rozdelený do niekoľkých kategórií podlá veľkosti cievnych štruktúr: (i) endokard, (ii) arterioly, (iii) venuly a (iv) medzisvalové kapiláry. Adhézia lymfocytov bola testovaná v týchto rôznych kompartmentoch a bolo zistené, že behom rejekcie je zvýšená v medzisvalových kapilárach a venulách (tabulka 1, obrázok 1). Bola tu konštantná nízka základná hladina väzby lymfocytov na myokard vo všetkých srdcových vzorkách.
Špecifickosť adhézie lymfocytov na endotel bola demonštrovaná niekoľkými spôsobmi: i) prakticky nebola prítomná v syngénnych štepoch alebo v normálnych neošetrených srdciach (tabulka 1), ii) nebola ovplyvnená pôvodom adherujúcich lymfocytov (tzn. ako DA, tak WF bunky adherovali rovnako dobre na DA a WF štepy (údaje nie sú ukázané) a iii) bola inhibovaná ošetrením tkanivových rezov sialydázou pred pridaním lymfocytov .
Zvýšená väzba lymfocytov na endotel alotransplantátov obličiek
V Stamper-Woodruffovom teste sa väzba lymfocytov na endotel alotransplantátu zvýšila 4x v porovnaní so syngénnymi transplantátmi alebo kontrolnými obličkami. Väčšina naviazaných lymfocytov v alotransplantátoch bola umiestnená na peritubulárnom kapilárnom endotele (PTCE), zatial čo na endotel väčších ciev a glomerulov v alotransplantátoch neadherovalo signifikantne viac lymfocytov ako na rovnaké štruktúry v syngénnych transplantátoch alebo v normálnych obličkách. Adhézia lymfocytov na PTCE behom rejekcie transplantátu bola z väčšej časti závislá od L-selektínu Súčasne vykazovali PTCE rejektovaných obličiek morfologické rysy podobné endotelu lymfatických uzlín a začínali reagovať de novo s anti sLex mAb a L-selektín-IgG fúznym proteínom (Renkonen, R. et al., Am. J. Pathol. 137: 643 - 651 (1990); Turunen, J.P. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994)).
Testovanie nových molekúl inhibujúcich adhéziu
Všetky nové oligosacharidové konštrukty podía predkladaného vynálezu boli testované na schopnosť inhibovať adhéziu lymfocytov na endotel transplantátov srdca a obličiek potkanov, pri ktorých prebiehala akútna rejekcia, čo sú modely, kde hrá L-selektín zásadnú úlohu. Oligosacharidy boli rozpustené vo väzbovom tlmivom roztoku a lymfocyty boli inkubované v týchto roztokoch počas 30 minút pri +4°C. Potom boli lymfocyty v sacharidových roztokoch pridané do Stamper-Woodruffovho väzbového tlmivého roztoku bez ďalšieho premývania a test bol vykonaný tak, ako je to opísané hore.
Príklad 2
Syntéza a charakterizácia syntetických glykánov majúcich rozvetvenú polylaktózamínovú kostru (Tučné vytlačené číslovanie zodpovedá glykánovým štruktúram v tabuíke 2)
Materiály a metódy
Akceptorové sacharidy
N-acetyllaktózamín (Gaipi-4GlcNAc) bol získaný od firmy Sigma. Glykány 2 a 7 boli syntetizované enzýmovou in vitro syntézou ako je to opísané (Renkonen, 0 et al. Biochem. Celí Biol. 68; 1032 - 1036 (1990); Seppo, A. et al., Biochemistry 34: 4655 - 4662 (1995)).
Enzýmové prípravky
Éudské placentárne mikrozómy, obsahujúce a2,3-sialyltransferázovú aktivitu (van den Eijnden and Schiphorst, J. Biol. Chem. 256: 3159 - 3162 (1981)) boli pripravené nasledujúcim spôsobom: 100 g čerstvej ludskej placenty bolo homogenizovaných v 500 ml chladného 0,1 M Tris-maleínanu, pH 6,7 pri +4°C. Homogenát bol centrifugovaný pri 3400 g pri +4°C počas 30 minút a supernatant bol ďalej centrifugovaný pri 200000 g pri +4°C počas 60 minút. Mikrozómová peleta bola suspendovaná v 10 ml 0,1 M Tris-maleínanu, pH 6,7 za zisku suspenzie obsahujúcej 80 mg/ml proteínu (Bradford, M.M. Anál. Biochem. 72: 248 - 254 (1976)).
al,3/4-fukozyltransferáza bola extrahovaná z ludského mlieka pri použití SP-Sephadex C-50 ako je to opísané (Eppenberger-Castori, S. et al., Glycoconjugate J. 6: 101 - 114 (1989)). Z 1 1 ohriateho mlieka bolo získaných 100 ml fukozyltransferázy. Pool bol koncentrovaný na 5 ml pri použití Amicon ultrafiltračného prístroja opatreného membránou s hraničnou hodnotou 30 kDa. Tento prípravok obsahoval 8 mU/ml celkovej fukozyltransferázy a 0,79 mg/ml proteínu.
Transferázové reakcie α2,3-sialyltransferázová reakcia bola vykonaná v 100 μΐ 0,1 M Tris-maleínanu, pH 6,7 obsahujúceho oligosacharidový akceptor zodpovedajúci 100-200 nmol akceptorových miest (tzn. neredukujúcich koncových galaktózových zvyškov), desaťnásobný nadbytok CMP-NeuNAc a 25 μΐ ľudských placentárnych mikrozómov obsahujúcich a2,3 sialyltransferázovú aktivitu. Reakčné zmesi boli inkubované 12 - 18 hodín pri 37°C a reakcie boli ukončené pridaním 100 μΐ vody a zahriatím vo vodnom kúpeli s vriacou vodou 2 minúty. Zrážajúci sa proteín sa odstránil centrifugáciou, supernatant a preplachovacia kvapalina boli lyofilizované a oligosacharidy boli prečistené zo zmesi gélovou filtráciou na Superdex 75 HR kolóne, al,3/4-fukozyltransferázové reakcie boli vykonané tak, ako je to opísané (Palcic, M.M. et al., Carbohydr. Res. 190: 1-11 (1989)) a ukončené boli gélovou filtráciou na Superdex 75 HR kolóne.
Trávenie glykozidázou
Na sialydázové reakcie bolo 1-4 nmol oligosacharidov rozpustených v 16 μΐ 0,1 M tlmivom roztoku octanu sodného, pH 5,0. Reakcia bola zahájená pridaním 40 mU (4 μΐ) sialydázy z Artrobacter ureafaciens (Boehringer), reakčná zmes bola inkubovaná počas 16 hodín pri 37“C a reakcia bola ukončená gélovou filtráciou na Superdex 75 kolóne.
Na súčasné β-Ν-acetylhexózaminidázové a β-galaktozidázové reakcie bolo 1-20 nmol oligosacharidu rozpustených v 30 μΐ tlmivého roztoku citrátu sodného pH 4,0. Reakcia bola zahájená pridaním 150 mU (2,4 μΐ) β-Ν-acetylhexózaminidázy zo semien fazule jack bean (Sigma) a 100 mU (15 μΐ) β-galaktozidázy (Sigma) do reakčnej zmesi. Po inkubácii (16 hodín pri 37°C) bola reakcia ukončená zahriatím vo vriacom vodnom kúpeli počas 3 minút.
Chromatografické metódy
Aniónová výmenná chromatografia s vysokým pH s pulznou amperometrickou detekciou (HPAEC-PAD) na (4 x 250 mm) Dionex CarboPac PA-1 kolóne bola vykonaná tak, ako je opísané (Helin, J. et al., Carbohydr. Res. 266: 191 - 209 (1995)). Kolóna bola eluovaná rýchlosťou 1 ml/minútu a bola ekvilibrovaná východiskovým tlmivým roztokom pred injekciou vzorky. Frakcie s maximami boli odoberané manuálne a boli neutrálizované ihneď pridaním 0,5 objemov chladnej 0,4 kyseliny octovej a boli sušené vákuovou centrifugáciou. Sušený materiál bol odsolený kvapalinovou chromatografiou s vysokou rozlišovacou schopnosťou (HPLC) gélovou filtráciou na Superdex 75 kolóne.
Aniónová výmenná chromatografie na MonoQ (5/5) kolóne (Pharmacia) bola urobená pri použití LKB 2150 HPCL pumpy a LKB 2152 HPCL kontrolného systému opatreného nízkotlakým miešacím systémom. Kolóna, kalibrovaná vodou, bola eluovaná rýchlosťou 1 ml/minútu, najskôr izokraticky vodou a potom lineárnymi gradientmi NaCl ako je to ukázané na obrázku 5. Eluát bol monitorovaný Kratos Spectroflow 757 UV monitorom pri 214 nm alebo 205 nm. Mono-, di- a trisialyzované markéry ukázané na obrázku 5 boli NeuNAa2-3Galpl-4GlcNAc (Oxford Glycosystems), NeuNAa2663ΐβ1-401σΝΑσβ1-2Μ3ηα1-6(NeuNAa2-6Ga^l-4GlcNAcpl-2Manal-3)Ma^l-4GlcNAc a ΝεηΝΑοα2-603ΐβ1-401οΝΑοβ1-2Μ3ηα1-6 (NeuNAa2303ΐβ1-4σΐθΝΑοβ1-4(ΝβηΝΑα2-603ΐβ1-401οΝΑθβ1-2)Manal-3GlcNAc, v príslušnom poradí. Posledné dva boli dary od Dr. Gerard Strecker (University of Lille, France).
HPLC gélová filtračná chromatografie na Superdex 75 HR (10/30) kolóne (Pharmacia, Sweeden) bola urobená pri použití LKB 2150 HPCL pumpy. Kolóna bola vyplachovaná pri 1 ml/minútu pri použití 50 mM NH^HCO-j na potlačenie iónových výmenných účinkov kolóny. Výtok bol monitorovaný Spectra-Physics 8450 UV monitorom pri 214 nm alebo pri 205 nm. Množstvo sacharidu v každom piku bolo hodnotené z plochy pikov vzhľadom na externý štandard (GlcNAc alebo NeuNAc), keď bol braný do úvahy počet karbonylových skupín v každom piku. Presnosť kvantifikácie bola hodnotená ako lepší ako + 20%.
NMR spektroskopia
Pred NMR analýzou boli oligosacharidové vzorky opakovane rozpustené v 99,96% D20 (C.I.L., MA, USA) a lyofilizované. Nakoniec boli vzorky rozpustené v 99,996% D20 a filtrované cez filter s nylonovou membránou. 1H-NMR spektrum bolo zaznamenávané pri použití Varian-Unity-500 spektrometru operujúceho pri protónovej frekvencii 500 MHz. Teplota sondy bola určená na 23’C alebo 27’C. Nosič frekvencie bol umiestnený na vrch reziduálneho H2O/HDO signálu a potlačenie rozpúšťadla bolo vykonané použitím modifikovanej WEFT sekvencie. Hodnoty chemického posunu sú vyjadrené v ppm stupnici s ohľadom na vnútornú acetónovú signálnu sadu k 2,225 ppm. Jednotlivé monosacharidové zvyšky sú označené horným indexom ukazujúcim kratším nedvojznačným spôsobom glykozidickej väzby medzi monosacharidom a redukujúcim koncom glykánu.
Hmotnostná spektroskopia
Hmotnostná spektrometria s desorpciou matrice laserom (MALDI-MS) nederivatizovaných oligosacharidov bola vykonaná LASERMAT prístrojom (Finnigan MAT Ltd., U.K.). Operačné pod37 mienky a postupy boli modelované podlá práce Karasa (Karas and Hillenkamp, Anál. Chem. 60: 2299-2301 (1988)). Vzorka bola rozpustená v 50 mM 2,5-dihydroxy kyseline benzoovej (v acetonitrile/vode 70:30 podlá objemu) a 1 μΐ zmesi obsahujúcej 10-30 pmol oligosacharidu bol aplikovaný na štandardný ciel z nehrdzavejúcej oceli. Kvapka sa nechala zaschnút do mikrokryštalickej formy pred vložením do prístroja. Oligomanóza 9 (MangGlcNAc2; Mw = 1884; zdroj: tyreoglobulín ošípaných) od Oxford Glycosystems, U.K., bola použitá na vonkajšiu kalibráciu.
Tabulka 2: Štruktúra syntetických medziproduktov a produktov predkladanej štúdie
Glyfean | v , Štruktúra. |
1 - - — | 3Galpl-4GlcNAc NeuNAcal^Fucal·/^ |
X | GalpI-4GIcNAcPl\^ 3GaiPl-4GlcNAcPl Gaipi-JGlcNAcPl^' |
3 | .3Gaipi^O.cNAcPK^0elplT4GlcNAc CU C£t~ 3Gaipi-lGIcNAcPl/ NeuNAcaž·^ |
4 | 3Gaipi-4GlcNAcPl\ NcuNAca2 Fučal/3 Gaipi-4GIcNAc 3Gaipi-4GlcNAcpr NeuNAca2/Z Fučal/3 |
5 | 3GalpI-4GlcNAcpl\ NeuNAca2 Fučal/3 ^GaiPl-4GlcNAc 3Galpl-4GlcNAcPr NcuNAcaŽ^ |
6 , Λ | 3Gaipi-4GlcNAcpl\ NcuNAcctf 6Galpl-4GlcNAc 3Gaipi-4GlcŇAcpr NcuNAcaž^ Fučal/3 |
M | GaiPl-4GlcNAcpl\ . Galpl-4GIcNAcpl. Gaipi-4GlcNAcpr 3 Galpl-4GlcNAc GalpI-4GlcNAcPl\ . / . ® Galpl-4GIcNAcPl Galpl-4G!cNAcpl / |
8 | /3Gaipi-4GlcNAcpl\ ^'‘^^Oa.pwO.cNAcP.Jo^1-401^^^ '^JOdQWOlcNAcPlx 6 /3 Gaipi-4GIcNAc NeuNAca2 jGaiPl—4GlcNAcPl /3GalPl-4GlcNAcPlz' NcuNAco2 |
9 | 3Gaipi-4GIcNAcpi\ NeuNAca2 Fučal3 3 GaiPl-4GlcNAcPl ^GaiPl-AGlcNAcpK \ NeuNAca2 Fucal^3 $GaiPl-4GlcNAc /3Gaipi-4GlcNAcpl\ / NeuNAca2 Fučal3 „Galpl-4GlcNAcPi JGaipi-4GlcNAcplx J NeuNAca2 Fučal-3 |
10 | 3Gaipi-4GlcNAcPl\ NcuNAca2 J GaiPl-4GlcNAcPl ^3GaIpl-4GIcNAcpl ' \ NeuNAca2 Fučal-3 $GaiPl-4GlcNAe >3GaiPi-4GIcNAcpl\ / NeuNAca2 Fucal^3 *GaiPl-4GlcNAepr /3Gaipi-4GlcNAcpi ' NcuNActíFucal*3 |
11 | .3GaiPl-4GlcNAcPl\ NeuNAca2 Fucaľ3 · 3 GaIpl-4GlcNAcPl ^3Gaipi-4GlcNAcplx \ NeuNAca2 Fučal*3 ÍGaiPl-4GlcNAc y3GaiPl-4GlcNAcpl\ / NeuNAca2 ' J GaiPl^GlcNAcpf JGalPl-AGÍcNAcPl/ NeuNAco2 Fučal3 |
Enzymatická syntéza oligosacharidov
Enzymaticky boli syntetizované oligosacharidy reprezentujúce mono- a oligovalentné sialyl Lewis x glykány (sLex), rovnako ako ich analógy bez fukózy (sialyl LN) na pokusy bunkovej adhézie. Syntéza obsahovala použitie skôr generovanej poly-N-acetyllaktózamínovej kostry (Renkonen, O. et al., Biochem. Celí. Biol., 68: 1032 - 1036 (1990); Seppo, A. et al., Biochemistry 34: 4655 - 4662 (1995)), ktorá bola konvertovaná do mono-, di-, a tetravalentných sLex glykánov 1, 4 a 9 =(štruktúra je uvedená v tabulke 2) pri použití reakcie a2, 3-sialylácie a al,3-fukozylácie. Glykán 9 reprezentuje najväčší čistý oligosacharid takto konštruovaný z monosacharidového prajmeru. Podobne ako iné produkty syntézy bol dôkladne analyzovaný pri použití mnohých techník vrátane NMR-spektroskopie a hmotnostej spektrometrie. Všetky fukózové zvyšky boli prenesené skôr na sialyzované, ako na proximálne a vnútorné Gaipi-4GlcNAc zvyšky glykánov 3 a 8, ako bolo predpokladané (Niemela, R. et al., Glycoconjugate J. 12: 36-44 (1995)), ale jedna z štyroch sialyzovaných Galpl-4GlcNAc jednotiek reagovala ovela pomalejšie ako ostatné, čo viedlo k tvorbe trifukozylovaného medziproduktu (buď glykánu 10 alebo 11) v neočakávane čistej forme..
Syntéza monovalentného sLex glykánu 1
Glykán 1 bol pripravený z Gaipi-4GlcNAc enzymatickou a2,3-sialyzáciou nasledovanou enzymatickou al,3-fukozyláciou ako to bolo opísané (de Vrieš et al., FEBS Lett., 330: 243 - 248 (1993)). Prečistený produkt bol charakterizovaný 1H-NMR nukleárnou magnetickou rezonančnou (NMR) spektroskopiou pri 500 MHz a bolo pozorované spektrum identické k prv pozorovanému (údaje nie sú ukázané) (Balí et al., J. Am. Chem. Soc.
114: 5449 - 5451 (1992); de Vrieš et al., FEBS Lett., 330:
243 - 248 (1993)) .
Syntéza glykánu 3
Enzymatické generovanie bianténového glykánu 3 bolo opísané skôr (Renkonen, O. et al., Biochem. Celí. Biol., 68: 1032 - 1036 (1990). Teraz boli na jeho distálne Gal31-4GlcNAc jednotky pripojené a2,3-viazané kyseliny sialové. Glykán 2 (100 nmol) bol inkubovaný s CMP-NeuNAc a a2, 3-sialyltransferázou prítomnou v mikrozómoch ľudskej placenty a vzniknutá zmes bola frakcionovaná aniónovou výmennou HPLC. Frakcie (85 ml) eluované ako disialyzovaný oligosacharidový markér boli odoberané, lyofilizované, odsolené gélovou filtráciou a podrobené NMR analýze.
1H-NMR spektrum disialyzovaného produktu (obrázok 3B, pre hodnoty chemického posunu pozri tabuľku 3) ukazuje, že je prezentovaný glykán 3. V porovnaní so spektrom glykánu 2 (obrázok 3A, tabuľka 3) je pridanie dvoch NeuNAc ukázané signálmi NeuNAc H-3ax a H-3eq, dvoch ekvivalentov pri 2,757 a 1,799 ppm, v príslušnom poradí (obrázok 3B). H-l signály akce ptorových zvyškov JGal a Gal sú posunuté smerom dolu +0,081 a +0,079 ppm, v príslušnom poradí, a nové signály dvoch ekvivalentov sa objavujú pri 4,117 ppm; sú priradené k H-3 a2, 3-sialyzovaných galaktóz. Tieto signály značiacich skupín sú charakteristické pre α2,3-sialyzáciu distálnych galaktóz (Vliegenthart, J.F.G. et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 41: 209 - 374 (1983); Kamerling and Vliegenthart, Biol. Magn. Res. 10: 1 - 287 (1992); Machytka, D. et al., Carbohydr. Res. 254: 289 - 294 (1994).
Syntéza glykánu 4
Vzorka glykánu 3 (75 nmol) bola inkubovaná s GDP-Fuc a ludskou mliečnou al-3-fukozyltransferázou. MonoQ iónová výmenná chromatografia reakčnej zmesi dávala vznik piku eluujúceho ako disialyzovaný markérový oligosacharid (nie je ukázané). Tento materiál bol podrobený HPAE chromatografii za zisku jediného hlavného piku (74 nmol, obrázok 4A). Tento materiál eluuje skôr ako východiskový materiál alebo monofukozylovaný produkt získaný v čiastočnej reakcii (pozri dalej), čo naznačuje, že predstavuje difukozylovaný produkt (Hardy, M.R. and Townsend, R.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3289 - 3293 (1988) ) .
^H-NMR spektrum difukozylovaného produktu (obrázok 3C, tabuľka 3) ukazuje, že dve fukózy boli prenesené na akceptor, za zisku glykánu 4. H-l signály fukóz rezonovali pri 5,117 ppm a 4,078(a)/5,091(β) ppm (3FucH-l a 6FucH-l, v príslušnom poo z:
radí). V glykáne 4 boli tiež H-l signály Gal a °Gal posunuté (-0,027 a -0,028 ppm, v príslušnom poradí) v porovnaní so zodpovedajúcimi signálmi v glykáne 3. Oproti tomu, H-l signál roz vetvenej galaktózy bol prakticky nezmenený, čo ukazuje, že GlcNAc na redukujúcom konci nebol fukozylovaný. Toto potvrdzuje a rozširuje naše predchádzajúce údaje ukazujúce, že Gaipi-4GlcNAc zvyšky polylaktózamínov tvoriace vetvenie nie sú za použitých podmienok fukozylované (Niemela et al., Glycoconjugate J. 12: 36 - 44 (1995)).
Syntéza glykánov 5 a 6
Bola tiež uskutočnená čiastočná fukozyltransferázová reakcia glykánu 3 pri použití obmedzenia reakčného času a množstva GDP-(14C)Fuc donoru. HPAE-chromatografia reakčnej zmesi (obrázok 4B) ukázala piky Dl a D3, ktoré eluujú ako difukozylovaný produkt 4 a nezreagovaný akceptor 3, v príslušnom poradí; pik medziproduktu D2 predstavuje zmes monofukozylovaných produktov 5 a 6. Na zistenie zloženia bola D2 zmes desialyzovaná a potom inkubovaná s β-Ν-acetylglukózaminidázou a β-galaktozidázou, ktoré narušili nefukozylované vetvenia (Kobata, A., anal. Biochem. 100: 1-14 (1979)), ale fukozylované ramená nechali intaktné (tzn. horný konár desialyzovaného 5 a dolný konár desialyzovaného 6 zostali intaktné). Vzniknutá zmes izomerických pentasacharidov bola nakoniec separovaná papierovou chromatografiou (obrázok 4C) (Niemela et al. , Glycoconjugate J. 12: 36 - 44 (1995)). Údaje ukázali, že pik D2 predstavuje 1:3 zmes 5 a 6. NMR-spektrum piku D2 ukázalo silný Fuc H-l signál pri 5,117 ppm a slabý signál pri 5, 078/5, 091 ppm, čo umožňuje jednoznačné priradenie zodpovedajúcich signálov v glykáne 4 (tabulka 3). Už skôr sme ukázali, že okrem 3 je tiež dvojanténový glykán 2 al, 3-fukozylovaný v čiastočnej reakcii preferovane v 1,3viazanom rameni za použitých podmienok (Niemela et al., Glycoconjugate J. 12: 36-44 (1995)).
Tabuľka 3: 1H-NMR chemické posunya signálov štrukturálnych reportérových skupín syntetických glykánov 2-4 a 6.
1 | Glyfea'n | ||||
e* | protón | 2 | 3 | 4 | 6 |
GlcNAc | H-l | 5.209/4.72S | 5.215/4.726 | 5.215/4.712 | 5.214/4.724 |
Gal | H-l | 4.457/4.455 | 4.459 | 4.454 | 4.455 |
H-4 | 4.151 | 4.142 | 4.135 | N.D. | |
’GlcNAc | H-l | 4.700/4.69í | 4.699/4.69Í | 4.706 | 4.708/4.69/ |
GlcNAc | H-l | 4.624/4.61? | 4.612/4.606 | 4.607 | 4.612/4.60í |
JGal | H-l | 4.478 | 4.559 | 4.532 | 4.533 |
H-3 | N.D. | 4.117 | 4.088 | N.D. | |
‘Gal | H-l | 4.463/4.46' | 4.544 | 4.516 | 4.545 |
H-3 | N.D. | 4.117 | 4.088 | N.D. | |
’NeuNAc | H-3ax | 2.757 | 2.762 | 2.764 | |
H-3eq | 1.799 | 1.796 | 1.797 | ||
‘NeuNAc | H-3ax | 2,757 | 2.762 | 2.755 | |
H-3eq | 1.799 | 1.796 | 1.801 | ||
’Fuc | H-l | - | 5.117 | 5.117 | |
H-5 | • | 4.819 | N.D. | ||
H-6 | 1.663 | 1.667 | |||
‘Fuč | H-l | 5.078/5.091 | - | ||
H-5 | 4.819 | - | |||
H-6 | - | 1.663 | - |
a Chemické posuny sú uvedené v stupnici ppm s ohľadom na vnútorný acetónový signálny sad pri 2,225 ppm. Pokial sú pre rezonanciu uvedené dve hodnoty oddelené zlomkovou čiarou, potom označujú α/β anoméry uvažovanej molekuly.
b Na presné určenie monosacharidových zvyškov pozri oddiel materiály a metódy.
N.D. Nie je určené
Syntéza glykánu 8
Enzymatické generovanie tetraanténového glykánu 7 bolo opísané skôr (Seppo, A. et al., Biochemistry 34: 4655 - :4662 (1995); teraz boli na jeho distálne Ga^l-4GlcNAc jednotky pripojené terminálne a2,3-NeuNAc. Vzorka 7 (7 nmol) bola inkubovaná s CMP-NeuNAc a a2,3-sialyltransferázou a spracovaná ako je uvedené hore. Iónová výmenná chromatografia na MonoQ kolóne (obrázok 5A) dávala minoritný produkt eluujúci ako trisialooligosacharidový markér, zatial čo hlavný produkt (59 nmol) eluoval pomalejšie.
1H-NMR spektrum hlavného produktu potvrdilo jeho totožnosť ako zlúčeniny 8 (obrázok 6B, tabulka 4). V porovnaní so spektrom akceptorového glykánu 7 (obrázok 6A) ukazuje spektrum 8 jasne prenos štyroch ekvivalentov NeuNAc v a2,3-väzbe. Zistenie NeuNAc H-3ax signálu pri 1,803 ppm a H-3eq signálu pri 2,756 ppm, štyroch ekvivalentov obidvoch, ukazuje, že novo pripojené NeuNAc zvyšky sú opravdu v a2,3-väzbe (Vliegenthart, J.F.G. et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 41: 209 - 374 (1983); Kamerling and Vliegenthart, Biol. Magn. Res. 10: l
- 287 (1992); Machytka, D. et al., Carbohydr. Res. 254: 289
- 294 (1994). Toto je podporené zistením charakteru štvrtého piku pri 4,119 ppm, ktorý môže byt priradený k H-3s predposledných galaktóz. Charakteristicky sú H-l signály predposledných galaktóz tiež posunuté o +0,080 ppm dolu pri zlúčenine 3, čo bezpečne určuje akceptorové miesta v molekulách.
Tabuíka 4: 1H-NMR chemické posuny3 signálov štrukturálnych reportérových skupín syntetických glykánov 7-9.
1- | Glytŕan | |||
b | protón | 7' | 8 | 9 |
GlcNAc | H-l | 5.207/4.725 | 5.210/4.721 | 5.210/4.72' |
Gal | H-l | 4.459 | 4.460 | 4.456 |
’GlcNAc | H-l | 4.705 | 4.703 | 4.709 |
‘GlcNAc | H-l | 4.626 | 4.620' | 4.623' |
3Gal | H-l | 4.459 | 4.460 | 4.456 |
‘Gal | H-l | 4.445 | 4.445 | 4.440 |
34+wG1cNAc | H-l | 4.697 | 4.689 | 4.695 |
ť,3GlcNAc | H-l | 4.638 | 4.620' | 4.604' |
‘‘GlcNAc | H-l | 4.614 | 4.598' | 4.556' |
’wGal | H-l | 4.480 | 4.559 | 4.534 |
H-3 | N.D. | 4.119 | 4.089 | |
‘^•‘Ga! | H-l | 4.464 | 4.544 | 4.517 |
H-3 | N.D. | 4.119 | 4.089 | |
NeuNAc | H-3ax | 2.756 | 2.762 | |
H-3eq | * | 1.803 | 1.798 | |
3-*«fuc | H-l | - | - | 5.118 |
H-6 | - | - | 1.668 | |
*’*+*3Fuc | H-l | - | - | 5.084 5.077z |
H-6 | - | - | 1.668 |
Chemické posuny sú uvedené v stupnici ppm s ohíadom na vnútornú acetónovú signálnu sadu pri 2,225 ppm. Pokial sú pre re zonanciu uvedené dve hodnoty oddelené zlomkovou čiarou, potom označujú α/β anoméry uvažovanej molekuly.
Na presné určenie monosacharidových zvyškov pozri oddiel materiály a metódy.
Μ c Údaje z (27) d'e Určenie môže byt zamenené.
f G/^fucH-I a 6/3fuCh-i signály nemôžu byt určené samostatne.
N.D. Nie je určené.
Syntéza glykánu 9
Glykán 8 bol inkubovaný s GDP-Fuc a al,3fukozyltransferázou z ludského mlieka. Reakčná zmes bola frakcionovaná HPAE chromatografiou (obrázok 5) a boli získané dva hlavné piky eluujúce skôr ako východiskový materiál. Pik TI bol určený ako tetrasialo-tetrafuko-glykán 9, zatial čo pik T2 predstavoval takmer čistý jediný izomér tetrasialo-trifuko-glykánov. Vedľajší pik T3 bol pokládaný za zmes tetrasialo-difuko-glykánov.
TI glykán bol desialyzovaný sialidázou z A. ureafaciens a potom bol podrobený súčasnému ošetreniu β-galaktozidázou a β-Ν-acetyhexózaminidázou. Gélová filtrácia nasledovaná HPAE-chromatografiou ukázala, že desialyzovaný TI zostal intaktný (údaje nie sú ukázané). Tieto údaje určujú, že v TI boli prítomné štyri fukózy, naviazané na sialyzované Ga^l-4GlcNAc jednotky v neredukujúcich koncoch akceptorového glykánu 8. Preto TI sacharid predstavuje glykán 9.
^H-NMR spektrum TI sacharidu (obrázok 6C; tabulka 4) potvrdilo, že sú prítomné štyri α-viazané fukózy. Toto môže byt pozorované ako štyri Fuc H-l signály pri 5,119 ppm (dva ekvivalenty), 5,084 ppm a 5,076 ppm (vždy jeden ekvivalent), v príslušnom poradí, a ako Fuc H-6 signál pri 1,668 ppm (12 ekvivalentov). Fuc H-5 signál pri asi 4,81 ppm nemohol byt presne umiestnený a zmeraný vzhladom na niekolko prekrytov s reziduálnym HDO pikom. V H-l signáloch galaktóz v glykáne 8 boli iba predposledné, sialyzované zvyšky posunuté pri fuko48 zylácii. Tieto posuny (-0,025 ppm pre 3,3Gal + 3,6Gal a
-0,027 ppm pre 6,3Gal + 6,6Gal) potvrdzujú, že fukozylácia a sialyzácia probehla iba na distálnych Gaipi-4GlcNAc jednotkách 7. Nedetekovali sme žiadne známky a2.6 väzby NeuNAc v glykánoch 8 alebo 9. I pokiaľ malé množstvá a2,6-NeuNAc v 8 unikli z našej NMR analýzy, mala by byt eliminovaná z tetrafukozylovaného glykánu 9 vzhľadom na svoje neschopnosti stáť sa fukozylovanými (Paulson, J.C. et al., J. Biol. Chem.
253: 5617 - 5624 (1978)).
Charakterizácia syntetických glykánov predstavujúcich 10 alebo 11
Väčšina z T2 materiálu (obrázok 6C, tabuľka 4) predstavovala jediný izomér, kde chýbala Fuc v jednom distálnom konáti, ale v ostatných troch bola prítomná. V porovnaní so spektrom glykánu 9 bol Fuc H-l signál pri 5,084 ppm u T2 sacharidu silne redukovaný. Pri glykáne 9 je tento signál priradený H-l fukózy naviazanej buď 6'^GlcNAc, alebo ®,3GlcNAc. V súlade s tým predstavuje T2 sacharid buď glykán 10, alebo glykán 11 v takmer čistej forme.
Počet Fuc zvyškov v desialyzovaných TI a T2 sacharidoch bol potvrdený hmotnostnou spektrometriou s desorpciou matrice (MALDI-MS). Desialyzovaný TI sacharid (obrázok 7A) ukázal jediný pik s m/z = 3183 Da (počítané pre Fuc4Hex7HexNAc7+NA+)3183 Da), zatiaľ čo desialyzovaný ukázal jediný pik s m/z =
3035 Da (počítané pre Fuc3Hex7HexNAc7+NA+)3035 Da).
Príklad 3
Všetky enzymaticky syntetizované oligosacharidy sialyl Lewis x typu inhibujú adhéziu lymfocytov na endotel rejektovaných srdcových transplantátov
Rejekcia srdcových transplantátov je charakterizovaná ťažkou infiltráciou štepu lymfocytmi (Renkonen, R. et al., Celí. Immunol. 77: 188 - 195, (1983); Hayry, P. et al., Immunol. Rev. 77: 85 - 142 (1984); Turunen, J.P. et al., Transplantation 54: 1053 - 1058 (1992)). Táto prihláška ukazuje, že srdcový endotel, ktorý neexprivuje sLea a sLex pri normálnych zvieratách, môže byt indukovaný tak, že exprivuje tieto oligosacharidové epitopy behom epizód rejekcie transplantátu. Táto de novo expresia sialyzovaných Lewis oligosacharidov vedie k zvýšenej adhézii lymfocytov na endotel spôsobom závislým od sLea, sLex a L-selektínu. Endotel odmietnutých srdcových štepov, ale nie endotel normálnych sŕdc alebo syngénnych štepov, sa farbí priamo L-selektín-IgG fúznym proteínom.
Inhibícia adhézie lymfocytov na srdcový endotel behom epizód akútnej rejekcie oligosacharidmi bola vyšetrovaná pri použití rodiny oligosacharidov syntetizovaných enzymatickou syntézou v príklade 2: monovalentného sLex tetrasacharidu (1), divalentného sLex dekasacharidu (4) a tetravalentného sLex 22-mérneho oligosacharidu (9) a ich nefukozylovaných sialyl laktózamínových analógov (3, 8). Lymfocyty boli preinkubované 30 minút s rôznymi koncentráciami oligosacharidov a potom boli umiestnené do Stamper-Woodruffovho väzbového testu bez ďalšieho premytia. Tieto oligosacharidy nemenili signifikantne väzbu lymfocytov na syngénne štepy, ktorá bola len o niečo vyššia ako väzba na normálne srdcové tkanivo (tabulka 1 a údaje nie sú ukázané). Na druhú stranu, všetky členy sLex rodiny boli účinné v inhibícii adhézie lymfocytov na srdcový endotel, ale tetravalentný sLex bol jasne najlepší v porovnaní s ostatnými sLex oligosacharidmi (obrázok 2). súčasne, nefukozylované sialyl-laktózamínové glykány boli bez efektu.
Výsledky ukazujú, že tetravalentný sLex (22-merny oligosacharid) je najlepší v inhibícii L-selektín závislej adhézie lymfocytov na srdcový endotel v porovnaní s di- alebo monovalentnými oligosacharidmi (deka- a tetramermi, v príslušnom poradí). Oproti tomu, sLN oligosacharidy nemali žiaden účinok na adhéziu lymfocytov. Dohromady tieto údaje ukazujú, že zvýšenie endotelovej expresie sLea a sLex je zásadné pre vznik lymfocytárneho zápalu závislého od L-selektínu v rejektovaných srdcových alograftoch, a že oligosacharidy môžu inhibovat tento proces.
Príklad 4
Multivalentné sLex-oligosacharidy sú vysoko afinitné inhibítory adhézie lymfocytov (Čísla uvedené tučné zodpovedajú glykánovým štruktúram v tabulke 2)
Pri použití zvieracieho modelu opísaného v príklade 1 boli obličkové štepy odobrané 3 deň po transplantácii, keď prebieha akútna rejekcia. Lymfocyty boli, alebo neboli, vopred ošetrené počas 30 minút rôznymi oligosacharidovými konštruktmi a boli pridané do Stamper-Woodruffovho testu väzby. Po 30 minútach testu väzby boli nenaviazané bunky vypláchnuté a bol určený počet naviazaných buniek. Ako je vidieť z obrázku 8, všetky a2, 3-kyselinu sialovú- a al,3-fukózu obsahujúce polylaktózamíny (tzn. mono-, di- a tetravalentné sLEx, štruktúry 1, 4 a 9, v príslušnom poradí) boli schopné inhibovat signifikantne väzbu lymfocytov na PTCE. Adhézia lymfocytov sa znížila o 39 % pôsobením 0,5 μΜ monovalentného sLex (1), a IC50 hodnoty pre di- a tetravalentný sLex (4 a 9) boli 1 μΜ a < 0,05 μΜ, v príslušnom poradí. V najúčinnejšej použitej koncentrácii inhiboval glykán 9 adhéziu lymfocytov z viac ako 73 %, čo je o niečo lepšie ako 60% inhibícia získaná v rovnakom teste pri použití funkčne aktívnej anti-L-selektínovej protilátky HRL-1 (Turunen, J. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1130 - 1136 (1994)).
Žiadna zo štruktúr bez fukózy, tzn. sialyllaktózamínov a glykánov 3 a 8, ani nefunkčná anti-L-selektínová protilátka, neinhibovali adhéziu lymfocytov, čo naznačuje zásadnú úlohu fukózy v tomto teste. Tetravalentný glykán 9 bol jasne najúčinnejší inhibítor, čo naznačuje, že sa môže viazať na niekolko molekúl L-selektínu na povrchu lymfocytov.
Už skôr bolo ukázané, že tento test merí predovšetkým adhéziu závislú od L-selektínu. al,3-viazané fukozylové zvyšky predstavujú základný štrukturálny rys inhibičných sacharidov vo väzbovom teste. Tento rys je tiež charakteristikou oligosacharidov schopných väzby na L-selektín (Foxall, C. et al.,
J. Celí. Biol. 117: 895 - 902 (1992); Imai, Y. et al., Glycobiology 2: 373 - 381 (1992)). I keď nie je možné vylúčiť úlohu na E- a P- selektínu závislej adhézie v tomto teste, nie je pravdepodobné, že by prebiehala, pretože použité lymfocyty boli sLex negatívne.
Medzi syntetickými sLex glykánmi bol tetravelentný 9 jasne najsilnejším inhibítorom adhézie lymfocytov (IC5Q< 50 nM). Rozmedzie dávky sLex glykánov použité v tejto štúdii boli 1000-násobne nižšie ako je opísané v literatúre pre monovalentný sLex a rekombinantné selektíny fixované na mikrotitračné platne (Foxall, C. et al., J. Celí. Biol. 117:
895 - 902 (1992)). Pravdepodobne nemôžu byt dva použité testy (Stamper-Woodruffov a fixované rekombinantné selektíny na platne) priamo porovnávané medzi sebou, pretože väzbové sily sú rôzne (Varki, A., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7390 - 7397 (1994)).
Vysoká afinita glykánu 9 preL-selektín je veími pravdepodobne generovaná mnohopočetnosťou väzbových sLex epitopov.
Toto vedie k možnosti, že sa jedna molekula 9 môže viazať v Stamper-Woodruffovom teste na niekoľko uhíovodany rozpoznávajúcich domén (CRD) L-selektínu na povrchu lymfocytov. Zasieťovanie L-selektínových CRD na bunkovom povrchu môže prebiehať bez ohľadu na monomér-oligomérový status proteínu. I monomérne receptory imobilizované interakciou s inými povrchovými zložkami sa môžu stáť zasieťovanými na bunkovom povrchu s jednotlivými hemaglutíninovými trimérmi v intaktných chrípkových vírusoch pomocou bivalentných sialozidov (Glick, G.D. et al., J. Biol. Chem. 266: 23660 - 23669 (1991)).
Potenciálny význam má tiež dĺžka sacharidových reťazcov naviazaných na sLex determinanty dohromady v glykáne 9. sLex epitopy v 9 sú viazané dohromady reťazcami skladajúcimi sa z až piatich monosacharidových jednotiek. Okrem toho, všetky tieto reťazce obsahujú aspoň jednu 61οΝΑοβ1-6β3ΐ väzbu dodávajúcu nim mimoriadnu dĺžku a flexibilitu. Je predstaviteíné, že dĺžka a flexibilita medziúsekov sacharidového reťazca pripojených na väzbové epitopy zvyšuje možnosť väzby na mnohých miestach 9, čo vedie k zasieteniu lektínových domén L-selektínu.
Významné zvýšenie inhibičnej účinnosti 9 bolo pozorované pokiaí bolo 5 μΜ primárneho roztoku riedené (obrázky 2 a 8).
Toto naznačuje, že 5 μΜ množstvo tetravalentného ligandu sa môže viazať na molekuly L-selektínu najmä monovalentným spôsobom, zatiaí čo pravdepodobnosť viacmiestnej väzby 9 sa zvyšuje s riedením ligandu. Pokiaí reprezentuje skutočné alebo funkčné oligoméry (napr. monoméry, ktoré sú spojené medzi sebou inými zložkami bunkového povrchu), potom sa L-selektín zdá byť menej dostupným pre PTCE väzbu v stave obsahujúcom multivalentne naviazané inhibítory, ako univalentne naviazané inhibítory. Existuje niekoiko príkladov multivalentných sacharidových ligandov, ktoré majú významne vysoké afinity pre vhodné lektíny naviazané na membránu. Klasická práca Lee et al. (Lee, R.T. et al., Biochemistry 23: 4255 - 4261 (1984); Lee, R.T. et al., Biochemistry 28: 8351 - 8358 (1989)) ukazuje, že oligomérne lektíny viažu multivalentné sacharidy s významne vysokou afinitou. Bolo ukázané inde, že tetravalentný oligosacharid1 obsahujúci štyri distálne Galal-3Gal zvyšky účinne inhibuje adhéziu myších spermií na vajíčko, zatial čo analogický monovalentný pentasacharid Galal-3Gaipi-4GlcNAcpi-3Gaipi-4GlcNAc nie (Litscher, E. et al., Biochemistry 34: 4662- (1995)). Bolo tiež pozorované, že oligovalentné sLex ligandy E-selektínu sú lepšie inhibítory adhézie, ako monovalentný sLex (DeFrees, S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 115: 7549 - 7550 (1993); Welpy,
J.K. et al., Glycobiol. 4: 259 - 265 (1994)), ale predkladaná práca je prvou demonštráciou zvýšenej účinnosti multivalentných ligandov v inhibícii adhézie lymfocytov v modelovom systému závislom od L-selektínu.
Syntetický glykán 9 inhibuje L-selektínom sprostredkovanú adhéziu v Stamper-Woodruffovom teste väzby predkladaných pokusov v zaznamenaní hodne nízkych koncentrácií. Údaje z pokusov in vivo injekcie s potkanmi a mačkami tiež demonštrujú hodnoty nízkych koncentrácií sLex v inhibícii krátkodobého P-selektínom sprostredkovaného zápalu (Mulligan, M.S. et al., J. Exp. Med. 178: 623 - 631 (1993); Mulligan, M.S. et al., Náture 364: 149
- 151 (1993); Buerke, M. et al., J. Clin. Invest. 93: 1140
- 1148 (1994)). I dlhodobé (48 h) zápalové odpovedi môžu byt inhibované kontinuálnou infúziou anti-L-selektínovej mAb zvierati. Zaujímavé je, že sa pri týchto zvieratách nevyvíjali zmeny v diferenciálnom počtu leukocytov periférnej krvi (Arbones, M.L. et al., Immunity 1: 247 - 260 (1994); Pizcueta and Luscinskas, Am. J. Pathol. 145: 461 - 469 (1994)).
Enzymatická syntéza oligosacharidu (glykán 9 a glykán 17) opísaná v príkladoch 2 a 6, v príslušnom poradí, znamená najčistejšie glykány, ako boli syntetizované z východiskových monosacharidov. Okrem toho, glykán 9, tetravalentný, tetraanténový sLEx je najlepší inhibítor adhézie lymfocytov na endotel v modele, ktorý je z hlavnej časti závislý od L-: selektínu, čo naznačuje, že L-selektín môže účinkovať ako funkčný oligomér na povrchu lymfocytov.
Rozsah dávok monovalentného sLex glykánu použitý v tejto štúdii bol 1000-krát nižší ako je opisované pre inhibíciu väzby medzi solubilným rekombinantným L-selektínom a imobilizovanými sLex glykolipidmi (Foxall, C. et al., J. Celí. Biol. 117: 895
- 902 (1992)). Samozrejme, údaje z dvoch štúdií nemôžu byt priamo porovnávané (Varki, A., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7390
- 7397 (1994)). Zaujímavé je, že údaje získané v pokusoch väzby vykonaných s lymfocytmi a rejektovaným endotelom potkaních sŕdc (Turunen, J.P. et al., J. Exp. Med. 182(4): 1133
- 1141 (1995)) so sacharidmi 1, 4 a 9 boli dosť podobné údajom, ktoré sú predkladané. Podobnosť pravdepodobne odráža rozhodujúce interakcie medzi sacharidmi a L-selektínom na povrchu lymfocytov v obidvoch sadách pokusov.
Údaje z pokusu injekcie in vivo vykonaných na potkanoch a na mačkách tiež ukazujú hodnoty nízkych koncentrácií monovalentných sLex v inhibícii krátkodobého zápalu sprostredkovaného L-selektínom (Buerke, M. et al., J. Clin. Inv. 93:
1140 - 1148, (1994); (Mulligan, M.S. et al., J. Exp. Med. 178:623 - 631 (1993); Mulligan, M.S. et al., Náture 364: 149
- 151 (1993)). I dlhodobé (48 h) zápalové odpovedi môžu byť inhibované kontinuálnou infúziou anti-L-selektínovej mAb zvieratám. Zaujímavé je, že ani tieto zvieratá, ani L-selektínknock-outované myši nevykazovali alterácie v diferenciálnom počtu leukocytov periférnej krvi (Arbones, M.L. et al., Immunity 1: 247 - 260 (1994); Pizcueta and Luscinskas, Am. J. Pathol. 145: 461 - 469 (1994)).
Príklad 5
Liečba pacientov sLex
Pacient, u ktorého bol diagnostikovaný zápalový stav, je liečený kompozíciou obsahujúcou multivalentný sLex, napríklad tetravalentný sLex 22-sacharid. Kompozícia je vo farmaceutický prijatelnej prísade v dávke dostatočnej na blokovanie väzby lymfocytov na zodpovedajúce oligosacharidy na povrchu endotelových buniek. Kompozícia je podávaná v takom režime, že je dosiahnutá sérová koncentrácia v rade nanomolov až mikromolov, kým nie je stav dostatočne zmiernený.
Pri podaní pacientovi je kompozícia formulovaná akýmkolvek spôsobom, ktorý ju robí vhodnou na orálne, parenterálne, nazálne, enterálne alebo rektálne podanie, s farmaceutický prijatelnými prísadami alebo vehikulmi, napríklad izotonickým salinickým roztokom, v súladu s bežnou farmaceutickou praxou. Dávka činidla bude dostatočná na spôsobenie protizápalového účinku blokovaním selektínom, a najmä L-selektínom zprostredkovaných dejov adhézie u pacienta.
Kompozície a metódy podlá predkladaného vynálezu sú vhodné na liečbu akýchkoľvek stavov obsahujúcich adhéziu na selektín, a najmä L-selektín, sprostredkované zvýšené zápalové reakcie.
Tak je činidlo užitočné na liečbu takých stavov, ako je rejekcia tkaniva, artritída, infekcia, najmä lokálna infekcia, dermatózy, zápalové črevné choroby, autoimunitné ochorenia apod.
Účinnou hladinou kompozície podía predkladaného vynálezu sa rozumie hladina, pri ktorej je dosiahnuté určité zmiernenie obťaží u pacienta, ktorému je taká liečba podávaná. Abnormálnym zápalovým stavom u pacienta sa rozumie stupeň zápalu, ktorý presahuje normu pre normálny zdravotný stav subjektu, alebo presahuje žiadúcu hladinu. Sekundárnym tkanivovým poškodením alebo toxickými účinkami sa rozumejú tkanivové poškodenia alebo toxické účinky, ktoré sa vyskytnú v inak zdravých tkanivách, a ich bunkách, z dôvodov prítomnosti nadbytočných selektínom, a najmä L-selektínom, spôsobených adhéznych dejov, vrátane dejov spôsobených primárnymi stimulmi kadekolvek v tele.
Pri infúzii kompozícií podlá predkladaného vynálezu pacientovi sa predpokladá, že povedie k zmenšeniu schopnosti leukocytov exprivujúcich selektín prilipnúť a tak sa pripojiť na endotel, čo bráni alebo inhibuje adhéziu takých buniek v mieste zápalu a lokalizuje poškodenie endotelu, a tak bráni nežiadúcemu presunu leukocytov alebo ich toku do postihnutých tkanív alebo buniek.
V súlade s tým sú farmaceutické kompozície podlá predkladaného vynálezu podané v množstve dostatočnom na antagonizáciu (plnú alebo čiastočnú) prirodzeného selektínu pacienta, a najmä L-selektínu, väzbou na biologické ciele takého selektínu u takého pacienta, a najmä na endotelové bunky.
Množstvo a režimy pre podanie uhlovodanov viažucich selektín a kompozícií podlá predkladaného vynálezu môže byť lahko určené odborníkmi v klinickom odbore liečby zápalových ochorení ako je artritída, tkanivové poškodenie alebo rejekcia tkaniva. Všeobecne, dávka kompozície podlá predkladaného vynálezu sa bude velmi líšiť podlá nasledujúcich okolností: typu použitého syntetického uhlovodanu, veku, zdravotného stavu, liečeného ochorenia, typu súčasnej liečby, pokial je nejaká, frekvencie liečby a charakteru požadovaného účinku, rozsahu poškodenia tkaniva, pohlavia, trvania príznakov, a kontraindikácií,: pokial sú nejaké, a od iných okolností, ktoré budú upravené ošetrujúcim lekárom. Požadovaná dávka môže byť podaná v jednom alebo vo viacerých aplikáciách na získanie požadovaného výsledku.
Príklad 6
Syntéza a charakterizácia tetravalentného sLex glykánu majúceho lineárnu polylaktózamínovú kostru (Návrh spôsobu syntézy využitého v prezentovanom príklade je ukázaný na obrázku 9 a tučné vytlačené číslice zodpovedajú štruktúram glykánu na obrázku 9)
Materiál a metódy
Syntéza oktasacharidového glykánu 12
Na hexasacharid LacNAcpi-3'LacNAcpi-3'LacNAc boli pripojené dva βΐ,β-viazané GlcNAc konáre jeho inkubáciou s UDPGlcNAc a centrálne účinkujúcou pi,6-GlcNAc transferázou, prítomnou v séru potkana (Gu et al., J. Biol. Chem., 267: 2994 - 2999 (1992)). Vzniknutý glykán 12 bol prečistený chromato58 grafiou a rozsiahle charakterizovaný degradačnými pokusmi, rovnako ako ^H-NMR a MALDI-TOF hmotnostnou spektrometriou.
1H-NMR spektroskopia
Pred NMR pokusmi boli sacharidy dvakrát lyofilizované z 2H2O a potom boli rozpustené v 600 ml 2H2O (99,996%, Cambridge Isotope Laboratories, Woburn, MA, USA). NMR pokusy boli uskutočnené na Varian Unity 500 spektrometri pri 23°C. Pri snímaní protónového spektra bola použitá modifikácia WEFT sekvencie (Hard et al., Eur. J. Biochem., 209: 895 - 915 (1992)). 1H chemické posuny boli vztiahnuté k acetónu, 2,225 ppm.
Hmotnostná spektrometria s desorpciou matrice laserom/s preletovým analyzátorom
MALDI-TOF hmotnostná spektrometria bola vykonaná spôsobom pozitívnej reflexie iónov za ožiarenia dusíkovým laserom (337 nm) a 2,5-dihydroxybenzoovou kyselinou ako matricou s Finnigan Vision 2000 preletovým analyzátorom (Thermo BioAnalysis, Ltd., Hemel Hempstead, UK) pracujúcim pri 5 kV urýchľovacím napätím a s 4 kV po urýchlení na detektore. Bola použitá vonkajšia kalibrácia. Hmotnostné stanovenia sú uvedené ako priemerné hmotnostné hodnoty, pokiaľ to nie je uvedené inak.
Transferázové reakcie
Reakcie s žalúdočnou pi,6-GlcNAc transferázou ošípaných (Pilier et al., J. Biol. Chem. 259: 13385 - 13390 (1984)), ľudskou mliečnou βΐ,4-galaktozyltransferázou (Brew et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59: 491 - 497, (1968)), ľudskou sérovou pi,3-GlcNAc transferázou (Yates and Watkins, Carbohydr. Res., 120: 251 - 268 (1983)), ludskou placentárnou a2, 3-sialyltransferázou (Nemansky and van den Eijnden, Glycoconjugate J. 10: 99 - 108 (1993)) a ludskou mliečnou al,
3-fukozyltransferázou (Eppenberger-Castori et al., Glycoconjugate J. 6: 101 - 114, (1989); Natunen et al., Glycobiology, 4: 577 - 83 (1994)) boli vykonané v podstate tak, ako to bolo opísané skôr (Maaheimo et al., Eur. J. Biochem., 234: 616 - 625 (1995)).
Chromatografické metódy
Gélová vylučovacia chromatografia na Superdex 75 HR (Pharmacia, Sweden) bola urobená na dvoch následných kolónach (10 x 300 mm) premývaných rýchlosťou 0,5 ml/min vodou (neutrálne sacharidy) alebo 0,05 M NH4HCO3 (sacharidy obsahujúce kyselinu sialovú). Výtok bol monitorovaný pri 214 nm a oligosacharidy boli kvantifikované proti externým GlcNAc a Neu5Ac.
Pre aniónovú výmennú chromatografiu bola MonoQ (5/5) kolóna (Pharmacia) vyplachovaná rýchlosťou 1 ml/minútu, najskôr izokraticky vodou počas 4 minút a potom lineárnym gradientom 0 až 0,05 M NaCl počas viac ako 8 minút a nakoniec lineárnym gradientom 0,05 až 0,5 M NaCl počas viac ako 8 minút.
Aniónová výmenná chromatografia s vysokým pH s pulznou amperimetrickou detekciou (HPAEC-PAD) bola urobená na (4 x 250 mm) Dionex CarboPac PA-1 kolóne pri prietoku 1 ml/minútu, najskôr izokraticky 100 mM octanom sodným v 100 mM NaOH počas 5 minút a potom lineárnym gradientom 100 až 200 mM octanu sodného v 100 mM NaOH počas viac ako 55 minút. Získané frakcie boli neutralizované 0,4 M vodnou kyselinou octovou a odsolené pri použití gélovej vylučovacej chromatografie na Superdex HR 75.
Trávenie exoglykozidázami
Na štepenie sialydázou A. ureafaciens (Boehringer Mannheim, Germany) boli vzorky sacharidov inkubované cez noc s 80 mU enzýmu v 40 μΐ 100 mM octanu sodného, pH 5,0. Inkubácia s β-galaktozidázou zo semien jack bean bola uskutočnená ako to bolo opísané skôr (Renkonen et al., Glycoconjugate J., 6: 129 - 140 (1989)). V paralelných β-galaktozidázových reakciách bol disacharid (3H)Galbl-4GlcNAc úplne degradovaný za uvoľnenia (3H)Gal.
Enzymatická syntéza tetravalentného sLex glykánu majúceho lineárnu polylaktózamínovú kostru (glykán 17)
Syntéza s piatimi krokmi bola započatá od oktamérneho polylaktózamínu Ε3θΝΑσβ1-3'(01οΝΑοβ1-6')LacNAcβl-3'(GlcNAc βΙ-δ'^οΝΑσ (12).
Oktasacharid 12 (150 nmol) bol najskôr predĺžený v βΐ3-GlcNAc transferázovej reakcii. Nonasacharid 13 a akýsi nezreagovaný 12 boli izolované ako zmes pomocou Superdex 75 HR chromatografie a boli podrobené reakcii katalyzovanej βΐ, 6-GlcNAc transferázou z žalúdočnej sliznice ošípaných. Vzniknutý oligosacharid mal päť zložiek v hmotnostnej spektrometri! s desorpciou laserom/ionizačným preletovým analyzátorom (MALDI-TOF), od GlcNAc7Gal3 (48%) a GlcNAc6Gal3 (23%) do GlcNAc4Gal2 (2,6%). Komplexná zmes bola generovaná β-galaktozidázovou a β-Ν-acetyl-glukózaminidázovou aktivitou o ktorej je známe, že je prítomná v surovom βΙ,ό-GlcNAc transferázovom extrakte z žalúdočnej sliznice ošípaných (Helin et al, FEBS Lett., 335: 280 - 284 (1993)). Superdex 75 HR chromatograf ia zmesi produktu dávala dva dobre separované piky (nie je ukázané). Podlá MALDI-TOF hmotnostnej spektrometrie mal hlavný pik, eluujúci v 60,94 minúte, dve hlavné zložky:
(M + Na)+ m/z 1949,5 (65%) reprezentujúce GlcNAc7Gal3 (kalk. m/z 1949,8) a (M + Na)+ m/z 1746,7 (30%) representujúce GlcNAc6Gal3 (kalk. m/z 1746,6). Najviac zastúpený ión v molekulárnom iónovom regióne hmotnostného spektra vedľajšieho piku v 62,94 minúte mal (M + Na)+ m/z 1380,5 (monoizotopický), čo naznačuje, že obsahoval najmä (70%) GlcNAc5Gal2 (kalk. monoizotopicky m/z 1380,5). Málo zastúpené piky monoizotopických m/z 1177,4, 1542,5 a 1746,0 mohli byt priradené k GlcNAc4Gal2, GlcNAc5Gal3 a GlcNAc6Gal3, v príslušnom poradí (kalk. monoizotopické hodnoty m/z 1177,4, 1542,6 a 1745,6). Na Superdex HR 75 bola separácia medzi glykánom 14 a GlcNAc5Gal3, postrádajúcim dva GlcNAc zvyšky, okolo dvoch minút.
βΐ,4-galaktozyltransferázová reakcia premenila 14 na 15, rozvetvenú skupinu siedmich LacNAc jednotiek. Superdex 75 HR chromatografia ukázala dobre vytvarovaný oligosacharidový pik, objavujúci sa o 2,2 minúty skôr ako akceptor 5 (nie je ukázané) Na Biogel P-4 kolónach tiež spomaľovali štyri ďalšie galaktózové zvyšky migráciu oligosacharidu rovnako ako dva ďalšie GlcNAc zvyšky (Yamashita et al., Methods Enzymol., 83: 105 - 126 (1982)). MALDI-TOF hmotnostné spektrum galaktozylovaného oligosacharidu ukázalo signály pri m/z 2598,1, určené ako (M + Na)+ GlcNAc7Gal7, glykán 15, (kalk. m/z 2598,4) (65%) a m/z 2233,0, určené ako (M + Na)+ GlcNÄCgGalg, (kalk. m/z 2233,0) (35%).
α2,3-sialyltransferázová reakcia premenila 15 na 16; koncentrát 16 bol izolovaný pri použití gólovej vylučovacej chromatografie na Superdex 75 HR (nie je ukázané). Na ďalšie prečistenie bol koncentrát podrobený aniónovej výmennej chromatografii na MonoQ-kolóne (obrázok 10A). Glykán 16 sa v tomto pokuse správal podobne ako izomérny tetrasialo glykán 9, opísaný v príklade 2. Po odsolení na Superdex 75 HR bolo získaných 45 nmol prečisteného glykánu 16. ^H-NMR spektrum glykánu 16 (obrázok 11A a tabuľka 5) potvrdili jeho štruktúru. ·
Malá vzorka glykánu 16 bola podrobená HPAE-PAD chromatograf ii na Dionex kolóne CarboPac PA-1. Objavil sa v 43 minúte (nie je ukázané), v pozícii ekvivalentnej pozícii izomérnej tetrasialo zlúčeniny 8 opísanej v príkladu 2.
al,3-fukozyltransferázová reakcia premenila glykán 16 (38 nmol) na tetravalentný sLex sacharid 17. Predbežné prečistení 17 bolo vykonané chromatografiou na Superdex 75 HR. Nasledujúca HPAE chromatografia na CarboPac PA-1 kolóne dávala 8 ako dobre utvorený pik objavujúci sa v 8 minúte (obrázok 10B). Prítomnosť štyroch fukozylových zvyškov dramaticky redukovala afinitu glykánu 17 k CarboPac PA-1, v porovnaní s glykánom 16. O tomto javu je známe, že je charakteristický pre fukozylované sacharidy (Hardy, M.R. and Townsend, R.R., Carbohydr. Res. 188: 1-7 (1989)). Paralelné pokusy s tetravalentným glykánom 9 (pozri tabuľku 2) ukázali, že 1 nmol vzoriek glykánov 9 a 17 chromatografovali spoločne na CarboPac PA-1 v 9 minútach; trifukozylovaný analóg glykánu 9 (glykán 10 opísaný v príklade 2) sa objavil v týchto pokusoch oveľa neskoršie v 16 minúte. Odsolenie na Superdex 75 HR kolóne dalo zisk 24 nmol glykánu 17.
Tabuľka 5 1H-NMR chemické posuny štrukturálnych reportérových skupín glykánov 16 a 17 pri 23“C.
Glykán
Zvyšok | n:oa | Protór | i 16 | 17 |
GlcNAc | 1 (a) | H-l | 5.214 | 5.214 |
GIcNAc | 1 (P) | H-I | 4.725 | 4.713 ŕ |
Gal | 2,5,11 | H-l | 4.458 | 4.452 |
H-4 | 4.143 | 4.133 | ||
GlcNAcb) | 3 | H-l | 4.691 | 4.684/4.687 |
GlcNAcb) | 4 | H-l | 4.606/4.612 | 4.603 |
GIcNAc | 8,14 | H-l | 4.691 | 4.696 |
GIcNAc | 9,15 | H-l | 4.620 | 4.603 |
Gal | 6,12,18 | H-l | 4.544 | 4.517 |
Gal | 17 | H-l | 4.558 | 4.533 |
6,12,17,18 | H-3 | 4.119 | 4.089 | |
Fuc | 7,13,20 | H-l | - | 5.076 |
H-5 | - | 4.820 | ||
H-6 | - | 1.166 | ||
Fuc | 19 | H-l | - | 5.119 |
H-5 | - | 4.820 | ||
H-6 | - | 1.166 | ||
Ncu5Ac | 10,16,21,22 | H-3ax | 1.803 | 1.798 |
H-3«j | 2.756 | 2.762 |
a)
Číslovanie zvyškov je nasledujúce:
u Fučalz „ κώΑ==ι/:ι“’ι;3 01ίίίΑ'’ι\, ’
Fucok Jaalpl-cQlcNAeGl^ ΝθώΑ=«Χ·1ί,Λ0“Α'ι1'/ “ a Fucatz n
|Gdpi-4GlcNAc |GalpMGlcNAcp/
Dve uvedené hodnoty chemického posunu vychádzajú zo signálov reprezntujúcich a- a β-pyranozické formy glykánu.
Štrukturálna charakterizácia glykánu 17 1H-NMR spektrum glykánu 17 (obrázok 11B a tabulka 5) potvrdilo štruktúru. Popri redukujúcom konci GlcNAc sú viditelné H-l signály troch βΐ,3-viazaných GlcNAc zvyškov pri 4,684 - 4, 696 ppm a sú spojené s H-l signálmi troch βΐ,6-viazaných GlcNAc r jednotiek pri 4,603 ppm. Šesť GlcNAc zvyškov sa viaže na tri galaktózy, ktoré javia H-4 rezonanciu pri 4,133 ppm, charakte* ristický chemický posun pre H-4 galaktózy, ktorá je disubstituovaná GlcNAc jednotkami v pozíciách 3 a 6 (Koenderman et al., Eur. J. Biochem., 166: 199 - 208 (1987)). H-l región galaktózy ukazuje signály troch rozvetvujúcich sa galaktóz pri 4,452 ppm, ktoré náležia sialyzovaným galaktózam troch βΐ, 6-viazaných sLex determinantov pri 4,517 ppm a βΐ,3-viazaným sLex pri 4,533 ppm. H-3 signály týchto galaktóz sú charakteristicky (Kamerling and Vliegenthart, Biological Magnetic Resonance, Berliner and Reuben, vydavatelia, zväzok 10, Plénum Press, New York and London (1992), str. 1 - 287)) pri 4,089 ppm. Horizontálna a vertikálna H-3 rezonancia Neu5Ac pri 2,762 a 1,798 ppm, v príslušnom poradí, potvrdzujú prítomnosť štyroch ekvivalentov a2,3-viazaných Neu5Ac (Kamerling and Vliegenthart, Biological Magnetic Resonance, Berliner and Reuben, vydavatelia, zväzok 10, Plénum Press, New York and London (1992), str. 1 - 287)). Signály metylových protónov pri 2,04 ppm zodpovedajú prítomnosti 11 N-acetylových skupín. H-l fukózového zvyšku v βΐ,3-viazanej sLex determinante rezonuje pri 5,119 ppm, zatial čo H-l troch βΐ,6-viazaných sLex jednotiek rezonuje pri 5,076 ppm. H-5 a H-6 signály fukóz rezonovali charakteristicky (de Vrieš et al., FEBS Lett., 330: 243 - 248 (1993); Vliegenthart et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem.
41; 209 - 374 (1983)) pri 4,820 a 1,166, v príslušnom poradí. Integrály H-l a H-6 protónov ukázali prítomnosť štyroch fukóz.
Prítomnosť štyroch fukózových zvyškov v glykáne 17 bola potvrdená degradačnými pokusmi a nasledujúcou MALDI-TOF hmotnostnou spektrometriou. Vzorka glykánu 17 (2 nmol) bola ošetrená sialidázou z Arthrobacterium ureafaciens. Odsolená reakčná zmes bola podrobená MonoQ chromatografii, ktorá ukázala, že bol tvorený 1 nmol neutrálneho asialo-oligosacharidu 18.
V MALDI-TOF hmotnostnom spektre glykánu 18 bol hlavný (M+Na)+ pik reprezentujúci 80% polylaktózamínových signálov, pozorovaný pri m/z 3182,8 (počítané pre Fuc4Gal7GlcNAc7, 3182,9).
Dve menšie zložky, viditelné v spektru, sa správali ako Fuc3Gal7GlcNAc7 (12%) a Fuc3GalgGlcNAc6 (8%). Menšie signály môžu predstavovať degradačné produkty vytvorené behom desialyzácie alebo hmotnostnéj spektrometrie, pretože opakovaná HPAE-PAD chromatografia intaktného 8 na CarboPac PA-1 zlyhala pri odhalení akéhokolvek množstva materiálu eluujúceho v 16 minúte, okolo očakávanej pozície Neu5Ac4Fuc3Gal7GlcNAc7.
Glykán 18 odolával ošetreniu β-galaktozidázou zo semien jack bean. Nezmenené MALDI-TOF hmotnostné spektrum malo Fuc4Gal7GlcNAc7 (M+Na)+ signál (kalk. m/z 3182,9) ako hlavnú zložku, meranú pri m/z 3182,8 pred a pri m/z 3183,2 po ošetrení Rezistencia na β-galaktozidázu je charakteristická pre koncové Galb-l(Fucal-3)GlcNAc sekvencie (Kobata, Anal. Biochem., 100: 1-14 (1979)). Preto, všetky fukózové zvyšky glykánu 17 boli naviazané na distálne umiestnené, sialyzované N-acetyllaktózamínové jednotky. Údaje potvrdili a rozšírili skoršie zistenia ukazujúce, že al,3-fukozyltransferázy z íudského mlieka nereagujú s LacNAc zvyškami, ktoré majú vetvenie v 6'-pozícii (Niemela, R. et al., Glycoconjugate J., 12: 36 - 44 (1995);
Maaheimo H. et al., Eur. J. Biochem., 234: 616 - 625 (1995); Seppo, A. et al., Glycobiology, 6: 65-71 (1996)).
Príklad 7
Tetravalentné sLex glykány, odvodené od lineárnej alebo od rozvetvenej polylaktózamínovej kostry, ako inhibítory adhézie lymfocytov na endotel závislej od L-selektínu
Transplantácia a testy adhézie lymfocytov =
Desat až dvanásť týždňov starí potkania inbredných WF (RT1V) a DA (RTla) kmeňov boli použití na transplantácie a testy adhézie lymfocytov ako boli opísané v príklade 1. Test väzby sa skladal z troch pokusov vykonaných v troch rôznych dňoch. Každý pokus obsahoval inkubáciu lymfocytov s šiestimi jednotlivými rezmi rejektovaného srdca v prítomnosti sacharidov v daných koncentráciách.
Inhibícia adhézie lymfocytov sprostredkovanej L-selektínom
V paralelných pokusoch bola porovnávaná kapacita tetravalentných sLex glykánov 9 a 17 a nefukozylovaných analógov glykánu 8 a 16 v inhibícii adhézie lymfocytov závislej od L-selektínu na srdcový endotel behom akútnej rejekcie. Lymfocyty boli vopred inkubované 30 minút s rôznymi koncentráciami oligosacharidov a boli potom použité vo Stamper-Woodruffovom teste väzby v inkubačnom médiu ako je to opísané v príklade 1
Dva sLex nesúce glykány 9 a 17 boli účinné v inhibícii adhézie lymfocytov na aktivovaný srdcový epitel, keď IC50 hodnoty boli okolo 1 nM pre obidva sLex glykány (obrázok 12). Rozhodujúce kontrolné sacharidy 8 a 16, majúce rovnaký náboj, rovnakú celkovú štruktúru a približne rovnakú velkost, ale zbavené fukóz, nemenili väzbu lymfocytov vzhladom na základnú hodnotu. Tieto údaje naznačujú že ako rozvetvené, tak lineárne tetravalentné sLex glykány sú mimoriadne účinné v inhibícii adhézie lymfocytov na endotel závislej od L-selektínu tak redukujú zápal asociovaný s rejekciou.
Biologické vlastnosti glykánu 17 s lineárnou kostrou sa podobali vlastnostiam izomérneho glykánu 9 s rozvetvenou kostrou. Obidva tieto glykány boli velmi silnými antagonistami L-selektínu v Stamper-Woodruffovom pokusu adhézie: Glykán 17 javil silný inhibičný efekt pod 0,5 nM a glykán 9 bol rovnako silný antagonista L-selektínu (pozri obrázok 12). Zaznamenania hodné je, že obidva 17 a 9 vykazovali vysokoafinitnú väzbu na L-selektín. Toto je analogické s údajmi (Crottet et al., Glycobiology 6: 191 - 208 (1996)), ktoré ukazujú, že podsady mucínov rôzneho pôvodu sú vysoko afinitné ligandy selektínu. Samozrejme, ani jedinečné kostrové skupiny, ani striktne definované väzbové determinanty nie sú nutné na vysoko afinitné rozpoznávanie L-selektínu. Skôr sú významné zoskupenia sLex/ sLea príbuzných determinantov, ktoré sú správne prítomné na kostrách polylaktózamínového alebo polypeptidového charakteru. V predkladaných príkladoch boli aktivity glykánov 17 a 9 úplne závislé od prítomnosti intaktných sLex sekvencií vo väzbových determinantoch; prítomnosť al,3-viazaných fukózových zvyškov nebola na rozpoznávanie nutná.
Tu opísané nízke nanomolárne koncentrácie sLex glykánov sú o niekolko radov nižšie ako inhibičné koncentrácie monovalentných sLex. Iné bežné vysoko afinitné inhibítory L-selektínu zahŕňajú mucíny endotelového a iného pôvodu (Baumhueter, S., et al., Science 262: 436 - 438, (1993); Berg, E.L. et al., Náture 366: 695 - 698 (1993); Crottet, P. et al., Glycobiology
6: 191 - 208 (1996); Hemmerich, S. et al., Biochemistry 33:
4820 - 4829 (1994); Hemmerich, S. et al., J. Biol. Chem., 270: 12035 - 12047 (1995); hemmerich, S. and Rosen, S.D., Biochemistry 33: 4830 - 4835 (1994); Imai, Y. and Rosen, S.D. Glycoconjugate J. 10: 34 - 39 (1993); Imai, Y. et al., J. Celí. Biol. 113: 1213 - 1222 (1991); Lásky, L.A. et al., Celí 69: 927 938 (1992)). Zaujímavé je, že O-viazané oligosacharidy uvoľňované z týchto mučínov bázickým borohydridom nevykazovali akúkoľvek detekovateľnú väzbu na L-selektín v pokusoch afinitnej chromatografie (Crottet, P. et al., Glycobiology 6:-191
- 208 (1996)). Údaje predkladaného vynálezu však ukazujú, že oligosacharidy správnej štruktúry môžu byt rozpoznávané L-selektínom s vysokou afinitou.
Vysoká biologická aktivita glykánov 17 a 9, pri porovnaní s monovalentným sLex, je spôsobená ich multivalenciou. Multivalentné sLex glykány krížne viažu dve alebo niekoľko molekúl L-selektínu, o ktorých je známe, že sú zoskupené na vrcholoch mikroklkov lymfocytov (Hasslen, S.R. et al., Histochem. J. 27: 547 - 554 (1995); von Andrian et al., Celí 82: 989 - 999 (1995)) Segmentálna flexibilita L-selektínu je nápomocná v prezentácii domén rozpoznávajúcich uhlovodan (Rosen, S.D. and Bertozzi,
C.R. Cur. Opin. Celí. Biol., 6: 663 - 673 (1994)), čo umožňuje tvorbu krížnych väzieb cez susedstvo jednotlivých sLex determinantov v danej molekule ligandu. Proximálne konce dvoch sLex determinantov 9, napríklad, sú od seba vzdialené najčastejšie len 2 nm, i v maximálne roztiahnutej konformácii polylaktózamínovej kostry (Renouf, D.V. and Hounsell, E.F. Int. J. Biol. Macromol. 15: 37 - 42 (1993)). Avšak, vysoko afinitná väzba na bunkové povrchy bola pozorovaná sa solubilnom monomérnom P-selektíne (Ushiyama, S. et al., J.Biol. Chem., 268: 15229
- 15237 (1993)) a E-selektíne (Hensley, P. et al., J. Biol.
Chem. 269: 23949 - 23958 (1994)), čo ukazuje, že multivalen69 tné sLex glykány získavajú svoju vysokú afinitu väzbou na dve rôzne miesta v L-selektínovom monoméru. Okrem toho, nové údaje (Malhotra, R. et al., Biochem. J. 314: 297 - 303 (1996)) naznačujú, že interakcia L-selektínu a jeho endotelových ligandov vyžaduje obsadenie ako sLex rozoznávajúceho miesta (CRS), tak odlišného susedného väzbového miesta rozoznávajúceho acidické determinanty (ARS). Toto usporiadanie bude podobné dráhe obsahujúcej tyrozín sulfátové zvyšky bezprostredne susediace so sialyzovanými oligosacharidmi, ktorá generuje rozpoznávanie P-selektínu v PSGL-1 (Sako, D. et al., Celí 83: 323 - 331 (1995); Wilkins, P.P. et al., J. Biol. Chem. 270: 22677 - 22680 (1995)). Preto, tetravalentné sLex glykány 17 a 9 sa viažu na monomérny L-selektín dvoma spôsobmi, špecifickou väzbou medzi jednou sLex determinantou a CRS, a menej špecifickou väzbou medzi kyselinou sialovou a iným sLex zvyškom v ligande a ARS L-selektínu. Toto umožňuje, aby aj čiastočne fukozylované deriváty terásialoglykánu 16, napríklad, boli dobrými inhibitormi adhézie. Bez ohladu na spôsob väzby sú sacharidové antagonisty L-selektínu, doložené príkladmi glykánov 17 a 9, silnými protizápalovými liečivami, pretože sú oveia menej antigénne, ako mucíny alebo neoglykoproteínové ligandy selektínov (Welply, J.K. et al., Glycobiology, 4:
259 - 265 (1994)) .
Okrem procesov sprostredkovaných L-selektínom inhibujú glykány 17 a 9 adhézny fenomén sprostredkovaný inými selektínmi. Napríklad, údaje Nelsona a kol. (Nelson, R.M. et al., Blood 82: 3253 - 3258 (1993)) ukazujú, že adhézia závislá od E-selektínu môže byť aj účinejšie inhibovaná sLex sacharidmi, ako procesy sprostredkované L-selektínom.
Príklad 8
Syntéza a charakterizácia oligosacharidových alditolov (Tučné vytlačené číslice zodpovedajú štruktúram glykánov na obrázku 13)
Materiál a metódy
Enzýmy
Žalúdočná βΐ,6-N-acetylglukózaminyltransferáza ošípaných (EC 2.4.1.148), hovädzia mliečna βΐ,4-galaktozyltransferáza (EC 2.4.1.90), ludská sérová βΐ,3N-acetylglukózaminyltransferáza (EC 2.4.1.149), ludská placentárna a2,3-sialyltransferáza a ludská mliečna al,3/4-fukozyltransferáza.
Sacharidy a monosacharidové nukleotidy
Ga^l-3GalNAc, UDP-GlcNAc, UDP-Gal, CMP-NeuAc a GDP-Fuc boli získané od firmy Sigma, St. Louis, MO, USA.
NeuAca2-3Ga^l-4( Fucal-3)GlcNAc (sialyl Lex) a NeuAca23Ga^l-4 (Fucal-3 ) 01οΝΑοβ1-3 (NeuAca2-3Ga^l-4 (Fucal-3 )σΐοΝΑοβ16)Gaipi-4GlcNAc 4 boli syntetizované in vitro ako je to opísané v príklade 2.
Transferázové reakcie
Reakcia s žalúdočnou β1,6 N-acetylglukosaminyltransferázou ošípaných (EC 2.4.1.148) (Seppo, A. et al., Biochem.
Celí. Biol. 68: 44 - 53 (1990)), hovädzou mliečnou β1,471 galaktozyltransferázou (EC 2.4.1.90) (Sigma) (Brew, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59: 491 - 497 (1968)) a ľudskou sérovou β1,3 N-acetylglukózaminyltransferázou (EC 2.4.1.149) (Seppo, A. et al., Biochem. Celí. Biol. 68: 44 - 53 (1990)), boli vykonané v podstate tak, ako je to uvedené v citovaných odkazoch.
Použité ľudské placentárne mikrozómy, obsahujúce a2, 3-sialyltransferázovú aktivitu, boli pripravené ako je to opísané v príklade 2. Transferázové reakcie boli vykonané v 50 μΐ tlmivom roztoku, inkubáciou 100 nmol sacharidu (zodpovedajúcich 200 nmol akceptorových miest) s 2 μπιοί CMP-NeuAc a 25 μΐ ľudských placentárnych mikrozómov pri 37’C počas 17 hodín. Reakcia bola ukončená zahriatím v kúpeli s vriacou vodou počas 5 minút. Zrážajúci sa proteín bol odstránený a kombinovaný supernatant a výplachy boli lyofilizované.
al,3/4-fukozyltransferáza (8 mU/ml celkovej fukozyltransferázy; 0,79 mg/ml proteínu) bola extrahovaná z ľudského mlieka ako je to opísané v príklade 2 a transferázová reakcia bola vykonaná ako je to opísané (Palcic, M.M. et al., Carbohydr.
Res. 190: 1-11 (1989)).
Redukcia tetrasacharidu Gaipi-4GlcNAcpi-6(Gaipi-3)GalNAc (22) bola vykonaná s NaBh4 v podstate ako je to opísané (Rasilo and Renkonen, Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 363: 89 - 93 (1982)). Úplnosť reakcie bola kontrolovaná podrobením sacharidu bez boritanu ^H-NMR.
Ί2
Chromatograf ické metódy
Gélová vylučovacia chromatografia na kolóne Bio-Gel P-2 (Bio-Rad. Richmond, CA, USA) (1 x 144 cm) alebo na Bio-Gel P-4 (1 x 145 cm) bola urobená s 0,02% vodným NaN3·
Gélová vylučovacia chromatografia na Superdex 75 HR (10 x 300 mm) Pharmacia, Sweden) bola urobená vodou (neutrálne sacharidy) alebo 0,05 M NH4HCO3 (sacharidy obsahujúce kyselinu sialovou). Výtok bol monitorovaný pri 205 alebo 214 nm a= oligo sacharidy boli kvantifikované proti externým GlcNAc a NeuAc.
Aniónová výmenná chromatografia s vysokým pH s pulznou amperimetrickou detekciou (HPAEC-PAD) bola vykonaná na (4 x 250 mm) Dionex CarboPac PA-1 kolóne pri prietoku 1 ml/minútu. Neutrálne sacharidy boli chromatografované ako to bolo skôr opísané (Maaheimo, H. et al., FEBS Lett. 349: 55 - 59 (1994)). Sialyzované sacharidy boli eluované lineárnym gradientom NaAc od 100 mM NaOH, 25 mM NaAc v minúte 0 do konečného zloženia 100 mM NaOH, 100 mM NaAc v minúte 20. Odobrané frakcie boli neutrálizované 0,4 M kyselinou octovou a odsolené Superdex chromatograf iou.
Aniónová výmenná chromatografia na MonoQ (5/5) kolóne (Pharmacia) bola vykonaná nasledujúcim spôsobom: kolóna bola eluovaná izokraticky 1 ml/minútu vodou počas 4 minút, potom lineárnym gradientom NaCl do koncentrácie 0,05 M v 12 minúte a potom lineárnym gradientom NaCl do konečnej koncentrácie 0,5 M v 20 minútach. Výtok bol monitorovaný pri 214 nm.
^H-NMR spektroskopia
Pred NMR pokusmi boli sacharidy dvakrát lyofilizované z 2H2O a potom boli rozpustené v 600 μΐ 2H2O (99,996 atóm %, Cambridge Isotope Laboratories, Woburn, MA, USA). NMR pokusy boli vykonané na Varian Unity 500 spektrometri pri 300 °K. Pri snímaní ID protónového spektra bola použitá modifikácia WEFT sekvencie (Hard et al., Eur. J. Biochem., 209: 895 - 915 (1992)). Prekrývajúce sa rezonancie boli stanovené pomocou DQFCOSY (Marion and Whthrich, Biochem. Biophys. Res. Commun.
117: 967 - 974 (1985)) a TOCSY (Bax and Davis, J. Mag. Reson.
65: 355 - 360 (1985)). Pre tieto pokusy bola typicky odobraná matrica s 4k x 512 bodmi a 90° posun sine-bell hmotnostnej funkcie bol použitý v obidvoch dimenziách pred Fourierovou transformáciou. Medzi snímaním bol použitý relaxačný odklad 1 sekunda a, v TOSCY, boli použité spin-lock časy medzi 80 a 300 ms (MLEV-17). ·*·Η chemické posuny boli vztiahnuté k internému acetónu, 2,225 ppm.
Syntéza oligosacharidu alditolu
Hexasacharid alditol Θ1σΝΑσβ1-3(GlcNAcpi-6)Galpl-4GlcNAcpi-6 (Ga^l-3)GalNAc-ol 24 bol syntetizovaný ako to bolo opísané skôr (Maaheimo, H. et al., FEBS Lett. 349: 55 - 59 (1994)).
Oktasacharid alditol 25
Hexasacharid alditol 24 bol galaktozylovaný inkubáciou s ludskou mliečnou β1-4 galaktozyltransferázou a 4-násobným molárnym nadbytkom UDP-Gal. Oktasacharidový alditolový produkt Ga^l-461σΝΑσβ1-3 (ϋ3ΐβ1-461σΝΑθβ1-6 )Ga^ 1-4σΐθΝΑθβ1-6 (Ga^l-3 )GalNAc-ol 25 bol prečistený HPAEC (obrázok 14A). Z niekoľkých reakcií bolo získaných 400 nmol 25. Pri porovnaní ^H-NMR spe- 74 ktra 24 ukazoval anomérny región spektra 25 dva nové jednoprotónové dublety pri 4,480 a 4,465 ppm (obrázok 15A). Na základe našich predošlých stanovení čiastočne galaktozylovaného 24 (Maaheimo, H. et aí., FEBS Lett. 349: 55 - 59 (1994)) môžu byt tieto stanovené ako zvyšky 7a 8, v príslušnom poradí (pozri obrázok 13 pre systém označení). H-3 a H-4 rezonancia distálnych GlcNAc zvyškov 5 a 6 tiež vykazujú dramatický posun dolu (tabulka 6), ktorý je charakteristický pre β1,4 galaktozyláciu (Whitfield, D.M. et al., Can. J. Chem. 68: 942 - 952 (1990)). Zaujímavé je, že H-l a H-2 GlcNAc zvyšku 3 vykazovali mierny posun hore po galaktozylácii distálnych GlcNAc zvyškov.
Disialodekasacharid alditol 26
Na syntézu disialodekasacharidu alditolu 26 boli štyri vsádzky 25 po 100 nmol inkubované pri 37°C počas 17 hodín s 2 μιηοΐ CMP-NeuAc a 25 μΐ iudských placentárnych mikrozómov obsahujúcich a2,3 sialyltransferázovú aktivitu. Reakčná zmes bola potom frakcionovaná iónovou výmennou chromatografiou na MonoQ 5/5 kolóne (obrázok 14B) a produkt eluujúcu ako disialyl oligosacharid (26) bol odsolený Superdex 75 chromatografiou. NMR spektrum tohto materiálu (obrázok 15B) ukázalo signály horizontálneho a vertikálneho H-3 NeuAc pri 2,756 a 1,800 ppm, v príslušnom poradí, kedy oblasť obidvoch signálov zodpovedá dvom protónom. Tieto chemické posuny sú charakteristické pre a2,3 viazané NeuAc (Kamerling and Vliegenthart, Biological Magnetic Resesonance, Berliner nad Reuben, vydavatelia, zväzok 10, Plénum Press, New York and London (1992), str. 1 - 287), zatial čo žiadne signály neboli detekované pri 2,71 alebo 1,74 ppm, čo ukazuje, že žiadne detekovatelné množstvo a2,6 viazaných NeuAc nebolo prítomné vo vzorke. Tiež značný posun H-3 rezonancií galaktóz 7 a 8 dolu (tabulka 6) potvrdzuje, že NeuAc zvyšky sú a2,3 viazané na distálne galaktózy (Ichikawa,
Y. et al., J. AM. Chem. Soc. 114: 9283 - 9298 (1992)). Pretože rezonancia galaktózy 2 nebola vôbec zmenená, nebola β1,3 viazaná galaktóza jadra sialyzovaná (Oehrlein, R. et al., Carbohydr. Res. 244: 149 - 159 (1993)). Tak, podlá NMR-údajov je štruktúra tohto materiálu ΝθηΑοα2-303ΐβ1-401σΝΑοβ1-3(NeuAca2-3 03ΐβ1-46ΐσΝΑσβ1-6)Ga^l-4 01σΝΑσβ1-6(03ΐβ1-3)GalNAc-ol 26. Zo štyroch reakcii bolo získaných 357 nmol 26.
Ί&
Tabulka 6: 1H-chemické posuny sacharidov 19 - 28 pri 300 K
Zvyšok Protón Sacharid
20 21 22 23 24 25 26 ~ ’27 2B
Hl | 5.216( a)/4893(8) | 5.197(0}/4.864(3) | 6.196( a)/4.664(0) | 3.795 | 3.793 | 3.794 | 1792 | 1793 | ad* | 1794 |
Hľ | - | • | 3.735 | 3.732 | 1732 | 3.732 | 1733 | aď | 1735 | |
H2 | 4277( o)/1989(8) | 4.286(a)/1972(3) | 4567(0)/1974(3) | 4392 | 45S3 | 4593 | 4X33 | 4.393 | 4392 | 4X92 |
K3 | 4.032(0)/1861(0) | 4.020( e)/38S0(B) | 4.020( o)/3.BSO(3) | 4.062 | 4.062 | 4.062 | 4.062 | 4.062 | aď | 4,063 |
H4 | 4.248(0)/4.181(0) | 4.214( 0)/4.148(3) | 4515(o)/4.147(3) | 3.467 | 1465 | 3.461 | 3.462 | 3.463 | 1462 | 1464 |
H5 | 4.140(0)/1712(3) | 4528( a)/1799(3) | 4533(0)/1768(3) | 4581 | 4580 | 4584 | 4584 | 4584 | 4XB4 | 4X81 |
H6 | 3.738(o)/179(3) | 4.011(0)/3.82(3) | 4.011(0)/182(3) | 3.933 | 1930 | 1933 | 3.S31 | 1931 | aď | 1926 |
Hff | 3.76((, | 3.774(0)/3.71(3) | 1780( a)/176(3) | 1683 | 3.637 | 3.667 | 1683 | 3.683 | aď | 1682 |
H, | 4.493 / 4.437 | 4.489/4.431 | 4.488/4.431 | 4.466 | 4.466 | 4.466 | 4.465 | 4.463 | 4.463 | 4.463 |
K2 | 3X24 | 1520 | 1523/1522 | 3X61 | 3X62 | 1562 | 3X63 | 3X65 | aď | 3X67 |
K3 | 1621 | 3.625/3.614 | 3.621/3.614 | 3.667 | 3.672 | 3.671 | 3.670 | 1670 | aď | S868 |
K4 | 3.912 | 1914/3X07 | 1912/1907 | 3X02 | 3X02 | 1903 | 1901 | 1904 | aď | 3.900 |
Hl | 4X70/4X64 | 4833/4.587 | 4X61 | 4X56 | 4.566 | 4X60 | 4.561 | 4X60 | 4X52 | |
H2 | 3.704 | 1759 | 1755 | 1757 | 1788 | 1780 | 1776 | aď | 1762 | |
H3 | 3X43 | 1704 | 1696 | 3.682 | 1696 | 3.696 | 1699 | aď | 1700 | |
H4 | 3.436 | 1719 | 1696 | 3X95 | 3.842 | 1645 | 1839 | aď | 1848 | |
H5 | 1485 | 1602 | 1599 | 1666 | 1599 | 1595 | 1597 | aď | 1596 | |
HS | 1748 | 1837 | 1998 | 3X95 | 1986 | 1967 | 1966 | aď | 3X85 | |
Hff | 1926 | 1992 | 3X31 | 1820 | 1824 | 3X23 | 1823 | aď | 1821 | |
Hl | 4.472 | 4.471 | 4.458 | 4.450 | 4.451 | 4.455 | 4.451 | 4.450 | ||
H2 | 1541 | 1538 | 3X84 | 3X73 | 3871 | 1568 | aď | 3857 | ||
K3 | 1669 | 1661 | 3.724 | 3.710 | 3.710 | 1711 | aď | 1701 | ||
H4 | 1929 | 1927 | 4.450 | 4.138 | 4.144 | 4.140 | aď | 4.134 | ||
H5 | 1729 | 172 | ad. | ad. | ad. | aď | aď | aď | ||
H6 | 174 | 176 | aď | ad. | ad. | aď | aď | aď | ||
Hl | 4.684 | 4.679 | 4.700 | 4.69$ | 4.701 | 4.703 | ||||
K2 | 1756 | 3.760 | 3800 | 1800 | aď | 1963 | ||||
H3 | 3X67 | 3X67 | 173 | ad. | aď | 1678 | ||||
H4 | 3.474 | 1474 | 1739 | 173 | aď | 3X17 | ||||
H5 | 1437 | 3.437 | 1581 | 1583 | aď | 1568 | ||||
H6 | 189a | 190, | 1960 | 1965 | aď | 196 | ||||
Hff | 1781 | 1761 | 3856 | 1866 | aď | 1897 | ||||
Hl | 4X85 | 4.618 | 4.608 | 4.607 | 4.606 | |||||
K2 | 1680 | 1724 | 1736 | aď | 3X07 | |||||
K3 | 1547 | 170 | ad. | ad. | 1886 | |||||
H4 | 1427 | 1710 | 1711 | aď | 1941 | |||||
H5 | 1452 | 1591 | 3X91 | aď | 1532 | |||||
H5 | 1916 | 3X75 | 3X75 | aď | 1999 | |||||
Hff | 1740 | 3827 | 1840 | aď | 1880 | |||||
Hl | 4.480 | 4857 | 4.528 | 4X32 | ||||||
H2 | 1542 | 3X71 | aď | ax?s | ||||||
K3 | 1665 | 4.116 | aď | 4.090 | ||||||
H4 | 1926 | 1960 | aď | 1334 | ||||||
Hl | 4.465 | 4842 | 4842 | 4816 | ||||||
K2 | 3X46 | 3X73 | aď | 3.S9S | ||||||
Hl | 1665 | 4.116 | aď | 4.060 | ||||||
H4 | 3.926 | 1960 | aď | 1334 | ||||||
K3ax | 2.756 | 2.760 | 2.762 | |||||||
H3oq | 1.800 | 1.794 | 1.796 | |||||||
H4 | 1689 | aď | 1684 | |||||||
KS | 1849 | aď | 1651 | |||||||
HS | 1638 | aď | 1660 | |||||||
H7 | 3X93 | aď | 1597 | |||||||
H8 | 1822 | aď | 3X97 | |||||||
. H9 | 1875 | aď | 1877 | |||||||
-Hff | 1645 | aď | 1648 | |||||||
-.K3ut | 2.756 | 2.764 | 2.762 | |||||||
—«•q | 1X00 | 1.801 | 1.796 | |||||||
K4 | 1689 | aď | 1684 | |||||||
HS | 1849 | aď | 3X51 | |||||||
H8 | 1636 | aď | 1660 | |||||||
H7 | 1533 | aď | 3897 | |||||||
HS | 3892 | aď | 1897 | |||||||
H9 | 3X75 | ad | 1677 | |||||||
Hff | 1645 | aď | 1848 | |||||||
Hl | 5.116 | 1117 | ||||||||
H2 | aď | 1678 | ||||||||
K3 | aď | 1901 | ||||||||
K4 | aď | 1783 | ||||||||
H5 | 4X19 | 4819 | ||||||||
HS | 1.167 | 1.187 | ||||||||
Hl | 5.006 | |||||||||
M | 1687 | |||||||||
H3 | 1889 | |||||||||
m | 1779 | |||||||||
HS | 4X16 | |||||||||
HS | 1.187 |
Čísla sacharidov a označenie pozri na obr. 13 a) N.D. - nie je určené
Mono- a difukozylácia disialyldekasacharidu alditolu 26 na alditoly 27 a 28
347 nmol vzorka 26 bola podrobená transferázovej reakcii so 700 nmol GDP-Fuc a 625 μυ ľudskej mliečnej al,3 fukozyltransferázy. Reakčná zmes bola inkubovaná pri 37°C počas 64 hodín a reakcia bola ukončená behom zmesi cez Superdex 75 kolónu. Keď bol stupeň fukozylácie študovaný NMR, ukázala integrácia dvoch dubletov pri 5,086 a 5,117 ppm (H-l rezonancia nových fukóz), že 100 % jedného z glykánu bolo fukozylovaných, ale že iba 40 % druhého bolo fukozylovaných (nie je ukázané). Na maximalizáciu množstiev difukozylovaného materiálu bola zmes podrobená druhému kolu fukozyltransferázovej reakcie s 600 nmol GDP-Fuc a 540 μυ enzýmu. Vzniknutá zmes mono- a difukozylovaných alditolov bola potom frakcionovaná HPAEC a boli získané dva piky zodpovedajúce di- a monofukozylovaným produktom 28 (125 nmol) a 27 (60 nmol), v príslušnom poradí (obrázok 14C).
Charakterizácia fukozylovaných sacharidov alditolov 27 a 28 1H-NMR
V porovnaní s 26 (obrázok 15B) ukazuje anomérny región spektra monofukozylovaného materiálu (obrázok 15C) jeden nový protónový dublet pri 5,116 ppm, zatial čo spektrum difukozylovaného materiálu (obrázky 15D a 17) ukazuje dva dublety pri 5,117 a 5,086. Tieto sú H-l rezonancie nových fukóz. Štruktúra monofukozylovaného glykánu bola stanovená porovnaním s NMR údajmi z čiastočne fukozylovaného NeuAca2-3Gaipi-4GlcNAcpi3(NeuAca2-3Gaipi-4GlcNAcpi-6)Gaipi-4GlcNAc, kde H-l fukózy naviazané na 3-viazané rameno rezonuje pri 5,116 ppm, zatiaľ čo fukózy naviazané na 6-viazané rameno rezonuje pri vyššom poli. Preto sa usúdilo, že fukóza v prezentovanom monofukozylovanom glykáne (5,116 ppm) je al-3 viazaná na GlcNAc zvyšok
5. To, že fukóza bola skutočne viazaná na 3-viazané rameno, bolo tiež ukázané miernym posunom rezonancie H-l pri β1,3 viazanom GlcNAc (5), zatial čo H-l signál β1,6 viazaného GlcNAc (6) bol nezmenený. Štrukturálne signály reportérových skupín galaktózy 7 a NeuAc 9 tiež vykazovali malé zmeny v chemickom posune, zatial čo signály zvyškov 8 a 10 boli nezmenené. Tieto údaje určujú štruktúru monofukozylovaného materiálu ako glykán 27. j
V difukozylovanom materiáli 28 je H-l signál GlcNAc zvyšku
6, na ktorý sa viaže druhá fukóza, takmer bez posunu (4,606 vs. 4,608 ppm), zatial čo rovnaký signál GlcNAc (3) vykonal posun hore, z 4,561 na 4,552 ppm (tabulka 6). Druhá nová fukóza bola naviazaná na zvyšok 6, avšak bola určená stanovením iných protónov GlcNAc zvyškov 3 a 6 (obrázky 16 a 17). Porovnanie chemických posunov s posunmi pri 26 ukázalo, že i keď tiež H-2 GlcNAc 3 mal posun na o niečo vyššie pole, H-2, H-3 a H-4 GlcNAc 6 vykonali značný posun dolu charakteristický pre al-3 fukozyláciu (Ichikawa, Y. et al., J. AM. Chem. Soc. 114: 9283 - 9298 (1992); Wormald, M.R. et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 180: 1214 - 1221 (1991)). Skutočnosť, že fukóza v monofukozylovanom materiáli je naviazaná na zvyšok 5, je tiež možné stanoviť H-l rezonanciami distálnych galaktóz a 8 v 28.
Príklad 9
Inhibícia adhézie lymfocytov sprostredkovanej L-selektínom alditolom (Tučné vytlačené čísla zodpovedajú štruktúram glykánov na obrázku 13)
O-glykozidické, rozvetvené oligosacharidy majúce 0, jeden alebo dva terminálne sialyl Lex motívy (glykány 26, 27 a 28 opísané v príklade 8) boli študované ako inhibítory adhézie lymfocytov závislé od L-selektínu na peritubulárny kapilárny endotel rejektovaných alotransplantátov obličiek.
Desať až dvanásť týždňov starí potkania inbredných WF (RT1V) a DA (RTla) kmeňov boli použití na transplantácie a testy adhézie lymfocytov ako boli opísané v príklade 1. Test väzby sa skladal z troch pokusov vykonaných v troch rôznych dňoch. Každý pokus obsahoval inkubáciu lymfocytov s tromi jednotlivými rezmi rejektovanej obličky v prítomnosti sacharidov v daných koncentráciách; dvanásť jednotlivých polí bolo analyzovaných zo všetkých inkubácií.
Dodekasacharid alditol 28 majúce dve sialyl Lex determinanty sa ukázal byť účinným inhibítorom adhézie lymfocytov závislej od L-selektínu na endotel rejektovaných potkaních obličiek s IC50 0,15 μΜ (obrázok 18). Súčasne, glykán 27, s len 3-viazaným rameňom fukozylovaným, bol oveľa slabší inhibítor, zatiaľ čo glykán 26, postrádajúci obidve fukózy, prakticky nemal inhibičnú aktivitu. Zatiaľ čo tieto výsledky naznačujú, že náboj samotný nie je vysvetlením pre zvýšenú afinitu divalentných sialyl Lex glykánov pre L-selektín, podtrhávajú tiež význam fukózové skupiny v oligosacharidoh viažucich sa na selektíny, ako to bolo ukázané skôr (Turunen, J.P. et al., J. Exp. Med. 182(4): 1133 - 1141 (1995); Imai, Y. et al., Glycobiology 2: 373 - 381 (1992); Mulligan, M.S. et al., Náture 364: 149 - 151 (1993)). Vysoká afinita pre E-selektín bola skôr démon80 štrovaná pre divalentný sialyl Lex glykány (DeFrees, S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 115: 7549 - 7550 (1993); DeFrees, S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 66 - 79 (1995)) a s BSA konjugovaným sialyl Lex (Welply, J.K. et al., Glycobiology 4: 259
- 265 (1994)), a pre L-selektin s di- a tetravalentnými sialyl Lex konštruktmi (Turunen, J.P. et al., J. Exp. Med. 182(4):
1133 - 1141 (1995)).
Fyzikálny základ zvýšeného inhibičného potenciálu dia multivalentných oligosacharidov je stále otvorenou otázkou.
selektínoch sa predpokladá, že sa vyskytujú ako multiméry (Rosen, S.D. and Bertozzi, C.R. Cur. Opin. Celí. Biol., 6:
663 - 673 (1994); Ushiyama, S. et al., J. Biol. Chem. 268:
15229 - 15237 (1993)), čo môže vysvetľovať vyššiu afinitu multivalentných ligandov. V glykáne 28, však sú dva sialyl Lex determinanty separované len jednou monosacharidovou skupinou a vďaka tomu je nepravdepodobné, že by sa mohli viazať nezávisle na rôzne podjednotky multimérneho proteínu, pokiaľ sú prezentované vedľa seba na povrchu bunky. Na druhú stranu, väzbový proteín pre kyselinu sialovú pri B-bunkách, CD22, ktorý sa viaže špecificky na trisacharid NeuAca2-6Gaipi-4GlcNAc, tvorí nekovalentné oligoméry, a má signifikantne vyššiu afinitu pre analogický divalentný glykán ako pre monovalentný trisacharid (Powel, L.D. et al., J. Biol. Chem. 270: 7523
- 7532 (1995)).
V novej práci študovali DeFrees et al., inhibíciu E-selektínom sprostredkovanej adhézie pomocou pozičných izomérov dvoch sialyl Lex skupín viazaných galaktózou a zistili, že 3,6-viazaný sialyl Lex dimér je najúčinnejším inhibítorom (DeFrees, S.A. et al., J. AM. Chem. Soc. 117: 66 - 79 (1995)).
Ako uvádza Graves et al., rôntgenová štruktúra E-selektínu nevylučuje dimérickú formu sialyl Lex ako ligand, i keď autori považujú zvýšenie väzbovej aktivity za malé (Graves, B.J. et al., Náture 367: 532 - 538 (1994)).
Inhibičná schopnosť monovalentného sialyl Lex undekameru 27, majúceho fukózu v 3- viazanom rameni, bola rovnaká ako pri monovalentnom sialyl Lex tetrasacharide 1 (opísaného v príklade 2) pri optimálnej koncentrácii (obrázok 18). Toto ukazuje, že zvýšenie velkosti glykánu nezvyšuje automaticky afinitu pre L-selektín. Inhibičná schopnosť pozičného izoméru 27, majúceho monovalentnú 6-viazanú sialyl Lex skupinu, nie je známa; principiálne je možné, že v divalentnom glykáne 28 sa hlavne 6-viazaná sialyl Lex skupina viaže na selektín a zvýšená afinita jednoducho odráža rozdiel medzi dvoma konármi.
Hoci bolo nedávno opísané, že N-glykány E-selektínového ligandu ESL-1 sú nutné pre väzbu (Steegmaler, M. et al., Náture 373: 615 - 620 (1995)), väčšina biologických ligandov pre L- a P-selektíny sú O-glykány (Schimizu and Shaw, Náture 366: 630 631 (1993)). Glykoproteínové ligandy pre L-selektín majú velké množstvo blízko seba umiestnených sialyzovaných O-viazaných oligosacharidov (Lásky, L.A: et al., Celí 69: 927 - 938 (1992); Baumhueter, S: et al., Science 262: 436 - 438 (1993); Berg,
E.L. et al., Náture 366: 695 - 698 (1993); Norgard, K.E. et al., J. Biol. Chem. 268: 12764 - 12774 (1993)), ktoré prezentujú distálne sialyl Lex skupiny selektínu spôsobom podobným rozvetvenému poly-N-acetyllaktózamínovému skeletu.
Tu bola inhibičná schopnosť dodekasacharidu alditolu 28 porovnávaná so schopnosťou glykánu 4 (opísaného v príklade 2), ktorý nemá redukovanú sekvenciu O-glykozidického jadra (obrázok 18). Pretože sa 28 javil ako o niečo lepší inhibítor ako 4, môže sekvencia jadra zvyšovať afinitu pre L-selektín. Je pozoruhodné, že pri 28 mali NMR signály fukózových a galaktózových zvyškov dvoch sialyl Lex skupín rôzne chemické posuny, zatial čo rozdiel medzi ramenami bol veimi malý, keď boli dve sialyl Lex skupiny naviazané na etylglykozid galaktózy (DeFrees, S.A. et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 66 - 79 (1995)). Toto naznačuje, žé proximálna časť 28 ovplyvňuje vlastnosti distálnych sialyl Lex skupín. V súlade s tým, jadrová štruktúra 28 nie je priamo zahrnutá vo väzbe, hoci zvyšuje afinitu pre L-selektín.
Toto je poprvýkrýt, keď bola testovaná účinnosť kompletných sialyl Lex obsahujúcich O-glykánov v modele adhézie; lymfocytov závislej od L-selektínu. Vynálezcovia stanovili, že divalentný sialyl Lex O-glykán je signifikantne lepší inhibítor ako analóg postrádajúci jednu alebo obidve fukózy.
Príklad 10
Liečba sLex pozitívnych nádorových metastáz sLex
Molekuly obsahujúce uhlovodany boli predpokladané pri mnohých ochoreniach, vrátane autoimunitných ochorení, zápalových stavov, peptických vredov, infekčných ochoreniach a nádorov. Okrem toho, zmeny v povrchových uhiovodanových molekulách na ludských nádorových bunkách umožňujú identifikáciu ludských glykoproteínov - nádorových antigénov pre veía typov nádorov, vrátane melanómov, gliómov, neuroblastómov a karcinómov prsníka, slinivky brušnej, plúc, prostaty a obličiek. Jeden člen lektínovej rodiny väzbových proteínov pre uhiovodany bol silne asociovaný ako s metastázami, tak so skráteným časom prežitia u pacientov s karcinómom prsníka. Koncový cukor na uhiovodanovéj molekule, na ktorý sa lektín viaže, bol identifikovaný ako N-acetylgalaktózamín. Okrem toho, rovnaký N-acetylgalaktózamínový cukor bol nájdený na niekolkých iných typoch nádorov, vrátane karcinómu prostaty, žalúdku a kolore83 ktálneho karcinómu, a bol asociovaný so zvýšeným metastázovaním a redukovaným prežívaním vo všetkých prípadoch (Hughes,
S. Scrip. Máj 1994, str. 28 - 31). iné štúdie ukázali, že bunkové línie karcinómu čreva adherujú na určité selektíny cestou sialyl Lewis x a sialyl Lewis a oligosacharidov (Majuri, M.L. et al., Int. J. Cancer 63: 551 - 559 (1995); Majuri,
M.-L. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 182(3): 1376 - 1382 (1992)).
V súlade s tým môžu byť syntetické polylaktózamíny obsahujúce sLex podlá predkladaného vynálezu použité na inhibíciu metastazovania sLex pozitívnych nádorových buniek. Stručne, pacient, pri ktorom bol diagnostikovaný taký nádor, je liečený kompozíciou obsahujúcou multivalentný sLex, napríklad tetravalentný sLex 22-sacharid. Kompozícia je vo farmaceutický prijateľnej prísade v dávke dostatočnej na inhibíciu metastáz sLex pozitívnych nádorových buniek blokovaním väzby nádorových buniek na prirodzené sLex. Dostatočná dávka kompozície je daná v takom režime, že je dosiahnutá sérová koncentrácia v rade nanomolov až mikromolov, kým nie je stav dostatočne zmiernený.
Pri podaní pacientovi je kompozícia formulovaná akýmkoľvek spôsobom, ktorý ju robí vhodnou na orálne, parenterálne, nazálne, enterálne alebo rektálne podanie s farmaceutický prijateľnou prísadou alebo vehikulom, napr. s izotonickým fyziologickým roztokom, v súladu s bežnou farmaceutickou praxou. Dávka činidla bude dostatočná na spôsobenie anti-metastatického účinku blokovaním selektínom, a najmä L-selektínom sprostredkovanej adhézie nádorových buniek u pacienta.
Účinnou hladinou kompozície podlá predkladaného vynálezu sa rozumie hladina, ktorou je dosiahnuté určité zlepšenie u pacienta, ktorému je táto liečba podaná.
Farmaceutické kompozície podlá predkladaného vynálezu sú podané v množstve dostatočnom na antagonizovanie (úplné alebo čiastočné) natívneho selektínu pacienta, a najmä L-selektínu, väzbou na biologické ciele ako je selektín u takého pacienta, a špecificky na sLex pozitívne nádorové bunky.
Množstvo a režimy podania uhlovodanov viažucich selektín a kompozícií podlá predkladaného vynálezu môže byť lahko určené odborníkmi v klinickom odbore terapie nádorov. Všeobecne:, dávka kompozície podlá predkladaného vynálezu sa bude velmi líšiť podlá: typu použitého syntetického uhlovodanu, veku, zdravotného stavu, liečeného ochorenia, typu súčasnej liečby, pokial je nejaká, frekvencie liečby a charakteru požadovaného účinku, rozsahu tkanivového poškodenia, pohlavia, trvania príznakov, a kontraindikácií, pokial sú nejaké, a podlá iných okolností a úvahy ošetrujúceho lekára. Požadovaná dávka môže byť podaná v jednej alebo vo viacerých aplikáciách na získanie požadovaného výsledku.
Príklad 11
Liečba infekcie sLex
Použitie sLex ako protiinfekčnej látky je založené na pozorovaní, že oligosacharidy sú prítomné na povrchu všetkých cicavčích buniek a že sú využívané baktériami, vírusami a inými infekčnými mikroorganizmami na vstup do týchto buniek (Hughes, S. Scrip. Máj 1994, str. 28 - 32). Napríklad, ludský sialyl Lewis x antigén je značne exprivovaný na povrchu Streptococcus gallolyticus, ktorý spôsobuje u ludí infekčnú endokarditídu (Hirota, K. et al., Lancet 347: 760 (1996); Hirota, K. et al., FEMS Immunol and Med. Microbiol. 12: 159 - 164 (1995). Tak, zaplavenie tela jedným určitým typom oligosacharidu je jedným možným terapeutickým prístupom pre určitú infekčnú chorobu (Hughes, S. Scrip. Máj 1994, str. 28 - 32). Jednou výhodou, ktorú majú oligosacharidy pred konvenčnými anti-infekčnými liečivami je, že sú účinné v prevencii, rovnako ako v terapii infekčných ochorení. Oproti tomu, použitie antibiotík v profylaxii infekcie môže viesť k vzniku rezistencie. Okrem toho, pretože oligosacharidy nezabíjajú baktérie, ale inhibujú ich väzbu na ludské tkanivo, nepôsobia žiadny selekčný tlak na rast rezistentných mikroorganizmov (Hughes, S. Scrip.=Máj 1994, Str. 28 - 32).
Syntetické polylaktózamíny obsahujúce sLex podlá predkladaného vynálezu použité na liečbu alebo prevenciu infekčných ochorení. Stručne, pacient, u ktorého bolo diagnostikované také infekčné ochorení je liečený kompozíciou obsahujúcou multivalentný sLex, napríklad tetravalentný sLex 22-sacharid. Kompozícia je vo farmaceutický prijatelnej prísade v dávke dostatočnej na blokovanie infekčného mikroorganizmu, napr. baktérie, z väzby na zodpovedajúce oligosacharidy na zodpovedajúcim, napr. endotelovom, povrchu buniek. Kompozícia je daná v takom režime, že je dosiahnutá sérová koncentrácia v radu nanomolov až mikromolov, kým nie je stav dostatočne zmiernený.
Pri podaní pacientovi je kompozícia formulovaná akýmkolvek spôsobom, ktorý ju robí vhodnou na orálne, parenterálne, nazálne, enterálne alebo rektálne podanie s farmaceutický prijatelnou prísadou alebo vehikulom, napr. s izotonickým fyziologickým roztokom, v súladu s bežnou farmaceutickou praxou. Dávka činidla bude dostatočná na spôsobenie anti-infekčného účinku blokovaním selektínom, a najmä L-selektínom sprostredkovaných adhéznych dejov u pacienta.
Účinnou hladinou kompozície podľa predkladaného vynálezu sa rozumie hladina, ktorú je dosiahnuté určité zlepšenie u pacienta, ktorému je táto liečba podaná.
Farmaceutické kompozície podľa predkladaného vynálezu sú podané v množstve dostatočnom na antagonizovanie (úplné alebo čiastočné) natívneho selektínu pacienta, a najmä L-selektínu, väzbou na biologické ciele ako je selektín u takého pacienta, a najmä na endotelové bunky.
Množstvo a režimy podania uhľovodanov viažucich selektín a kompozícií podľa predkladaného vynálezu môže byť ľahko určené odborníkmi v klinickom odbore terapie nádorov. Všeobecne, dávka kompozície podľa predkladaného vynálezu sa bude veľmi líšiť podľa: typu použitého syntetického uhlovodanu, veku, zdravotného stavu, liečeného ochorenia, typu súčasnej liečby, pokial je nejaká, frekvencie liečby a charakteru požadovaného účinku, rozsahu tkanivového poškodenia, pohlavia, trvania príznakov, a kontraindikácií, pokiaľ sú nejaké, ä podľa iných okolností a úvahy ošetrujúceho lekára. Požadovaná dávka môže byť podaná v jednej alebo vo viacerých aplikáciách na získanie požadovaného výsledku.
Všetky zmieňované odkazy sú v prihláške uvedené ako odkaz.
I keď predchádzajúci opis opisuje určité preferované rozpracovania, malo by byť jasné, že predkladaný vynález nie je nimi obmedzený. Odborníkom v odbore bude jasné, že môže byt uskutočnených veľa modifikácií opísaných rozpracovaní a že tiež modifikácie spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu.
PATENTOVÉ NÁROKY
1. Syntetický oligosacharid obsahujúci polylaktózaminovú
Claims (27)
1. Syntetický oligosacharid obsahujúci polylaktózaminovú kostru (LacNac)n, kde n>l a väzby medzi zvyškami sú β1-3' a/alebo β1-6', na ktorú sú dva alebo viac NeuNaca2-3Gaipi-4(Fucl-3)GlcNac epitopy naviazané βΐ-3' a/alebo β1-6' väzbami.
2. Syntetický oligosacharid podľa nároku 1 obsahujúci dva
NeuNaca2-3Gaipi-4(Fucl-3)GlcNac epitopy.
3. Syntetický oligosacharid podľa nárokov 1 alebo 2, kde uvedený oligosacharid má O-glykozidické jadro obsahujúce Gaipi3GalNAc-ol sekvenciu.
4. Syntetický oligosacharid podľa nároku 1 obsahujúci štyri NeuNaca2-3Gaipi-4(Fucl-3)GlcNac epitopy.
5. Syntetický oligosacharid podľa nárokov 1 až 4, kde uvedená polylaktózamínová kostra je rozvetvená.
6. Syntetický oligosacharid podľa nárokov 1, 2 alebo 4, kde uvedená polylaktózamínová kostra je lineárna.
7. Farmaceutický prijateľná kompozícia obsahujúca oligosacharid podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 6.
8. Spôsob prevencie alebo liečby zápalových stavov u pacienta, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie kompozície podľa nároku 7 uvedenému pacientovi.
pôvodné nároky sacharid obsahujúci polylaktózamínovú kostru (LacNac)n, kde n>l a väzby medzi zvyškami sú β1-3' a/alebo β1-6', na ktorú sú dva alebo viac NeuNaca2-3Ga^l-4(Fucl-3)GlcNac epitopy naviazané β1-3' a/alebo β!-6' väzbami, uvedenému pacientovi.
8. Spôsob podlá nároku 7, vyznačujúci sa t ý m, že u uvedeného pacienta bolo diagnostikované, alebo je riziko vzniku ochorenia vybraného zo skupiny skladajúcej sa z tkanivovej rejekcie, orgánovej rejekcie, artritídy, infekcie, dermatózy, zápalového črevného ochorenia a autoimunitného ochorenia.
9. Spôsob podlá nároku 7, vyznačuj úci sa t ý m, že uvedeným ochorením je tkanivová alebo orgánová rejekcia.
10. Spôsob podlá nároku 7, vyznačuj úci sa t ý m, že uvedeným ochorením je reumatoidná artritída.
11. Spôsob podlá nároku 7, vyznačujúci sa t ý m, že uvedeným ochorením je chronické ochorenie čreva.
12. Spôsob podlá nároku 7, vyznačuj úci sa t ý m, že uvedeným pacientom je zviera.
13. Spôsob podlá nároku 7, vyznačuj úci sa t ý m, že uvedeným pacientom je človek.
14. Spôsob ochrany pred rejekciou transplantovaného tkaniva alebo orgánu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie farmaceutickej kompozície obsahujúcej syntetický oligosacharid obsahujúci polylaktózamínovú kostru (LacNac)n, kde n>l a väzby medzi zvyškami sú β1-3' a/alebo β1-6', na ktorú sú dva alebo viac NeuNaca2-3Gaipi-4(Fucl-3)GlcNac epitopy naviazané β1-3’ a/alebo β1-6' väzbami, uvedenému pacientovi, ktorý dostal uvedený transplantát.
15. Spôsob podlá nároku 14, vyznačujúci sa t ý m, že uvedený orgán je vybraný zo skupiny skladajúcej sa zo srdca, plúc alebo obličiek.
16. Spôsob podlá nároku 14, vyznačuj úci sa t ý m, že uvedeným transplantovaným tkanivom je koža.
17. Spôsob podlá nároku 14, vyznačuj úci sa t ý m, že uvedené transplantované tkanivo/orgán je vybrané zo skupiny skladajúcej sa z kosťovej drene, rohovky, slinivky brušnej a tenkého čreva.
18. Spôsob blokovania škodlivej migrácie leukocytov u abnormálnych zápalových stavov u pacienta, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie farmaceutickej kompozície obsahujúcej syntetický oligosacharid obsahujúci polylaktózamínovú kostru (LacNac)n, kde n>l a väzby medzi zvyškami sú β1-3' a/alebo β1-6', na ktorú sú dva alebo viac NeuNaca23Gaipi-4(Fucl-3)GlcNac epitopy naviazané βΐ-3' a/alebo βΐ-6' väzbami, uvedenému pacientovi.
19. Spôsob prevencie alebo liečby bakteriálnej infekcie u pacienta, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie farmaceutickej kompozície obsahujúcej syntetický oligosacharid obsahujúci polylaktózamínovú kostru (LacNac)n, kde n>l a väzby medzi zvyškami sú β1-3' a/alebo β1-6', na ktorú sú dva alebo viac NeuNaca2-3Ga^l-4(Fucl-3)GlcNac epitopy naviazané β1-3' a/alebo β1-6' väzbami, uvedenému pacientovi.
20. Spôsob podlá nároku 19, sa t ý m, že uvedenou bakteriálnou koková infekcia.
vyznač infekciou je u j ú c i strepto
21. Spôsob podlá nároku 19, vyznačujúci sa t ý m, že uvedeným pacientom je zviera.
22. Spôsob podlá nároku 19, vyznačujúci sa t ý m, že uvedeným pacientom je človek.
23. Spôsob prevencie alebo liečby nádorových metastáz u pacienta, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie farmaceutickej kompozície obsahujúcej syntetický oligosacharid obsahujúci polylaktózamínovú kostru (LacNac)n, kde n>l a väzby medzi zvyškami sú β1-3' a/alebo β1-6', na ktorú sú dva alebo viac NeuNacot2-3Ga^l-4(Fucl-3 )GlcNac epitopy naviazané β1-3' a/alebo β1-6' väzbami, uvedenému pacientovi.
24. Spôsob podlá nároku 23, vyznačujúci sa t ý m, že uvedený nádor je sLex pozitívny.
25. Spôsob podľa nárokov 23 alebo 24, v y z n čujúci sa tým, že uvedený nádor je vybraný zo skladajúcej sa z karcinómu prsníka, prostaty, žalúdku a čreva a konečníku.
a skupiny tlstého
26. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujú sa t ý m, že uvedeným pacientom je zviera.
27. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujú sa t ý m, že uvedeným pacientom je človek.
01-621-98-Če
1/18
Obrázok 1
2/18 jV % naviazaných lymfocytov
Tetra sLN
-—B—· Di sLN
Mono sLN
Tetra sLex
DI sLex
Mono sLex
Obrázok 2
Obrázok 3
PPm
4/18
PAD odpoveď t HlV [NaOAc] / mM
Obrázok 4
5/18
500
- 250
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US462395P | 1995-09-29 | 1995-09-29 | |
US786795P | 1995-12-01 | 1995-12-01 | |
PCT/FI1996/000513 WO1997012892A1 (en) | 1995-09-29 | 1996-09-27 | SYNTHETIC MULTIVALENT sLEX CONTAINING POLYLACTOSAMINES AND METHODS FOR USE |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK39498A3 true SK39498A3 (en) | 1999-01-11 |
Family
ID=26673254
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK394-98A SK39498A3 (en) | 1995-09-29 | 1996-09-27 | Synthetic multivalent slex containing polylactosamines and methods for use |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5965544A (sk) |
EP (1) | EP0874861A1 (sk) |
JP (1) | JP2000507993A (sk) |
AU (1) | AU713078B2 (sk) |
CA (1) | CA2231073A1 (sk) |
CZ (1) | CZ89098A3 (sk) |
HU (1) | HUP9900058A2 (sk) |
NO (1) | NO981361L (sk) |
PL (1) | PL325873A1 (sk) |
SK (1) | SK39498A3 (sk) |
WO (1) | WO1997012892A1 (sk) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6204431B1 (en) | 1994-03-09 | 2001-03-20 | Abbott Laboratories | Transgenic non-human mammals expressing heterologous glycosyltransferase DNA sequences produce oligosaccharides and glycoproteins in their milk |
US6841543B1 (en) * | 1996-01-31 | 2005-01-11 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of inhibiting production of T helper type 2 cytokines in human immune cells |
EP0926154B1 (en) * | 1996-07-23 | 2010-01-27 | Seikagaku Corporation | Novel lactosamine oligosaccharides and process for the preparation thereof |
JP2001515912A (ja) | 1997-09-05 | 2001-09-25 | グリシム オサケ ユキチュア | 合成二価sLex含有ポリラクトサミン類および使用法 |
US7018637B2 (en) * | 1998-02-23 | 2006-03-28 | Aventis Pasteur, Inc | Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines |
SE9904581D0 (sv) * | 1999-12-15 | 1999-12-15 | A & Science Invest Ab | A novel helicobacter pylori-binding substance and use thereof |
AU2001261534A1 (en) * | 2000-05-11 | 2001-11-20 | The Burnham Institute | The meca-79 antigen and related methods |
WO2002000879A2 (en) * | 2000-06-28 | 2002-01-03 | Glycofi, Inc. | Methods for producing modified glycoproteins |
AU2001287422A1 (en) * | 2000-08-22 | 2002-03-04 | National Research Council Of Canada | Synthesis of complex carbohydrates |
US20050026866A1 (en) * | 2002-08-02 | 2005-02-03 | Pawelek John M. | Agents and methods for treatment of disease by oligosaccharide targeting agents |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5079353A (en) * | 1987-12-02 | 1992-01-07 | Chembiomed, Ltd. | Sialic acid glycosides, antigens, immunoadsorbents, and methods for their preparation |
AU8007791A (en) * | 1990-06-15 | 1992-01-07 | Cytel Corporation | Intercellular adhesion mediators |
US5211937A (en) * | 1990-07-30 | 1993-05-18 | Glycomed Incorporated | Method of determining a site of inflammation utilizing elam-1 ligands |
US5352670A (en) * | 1991-06-10 | 1994-10-04 | Alberta Research Council | Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides |
CA2110797C (en) * | 1991-06-10 | 2001-02-20 | Andre P. Venot | Modified sialyl lewis x compounds |
WO1993015098A1 (en) * | 1992-01-31 | 1993-08-05 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Lewis-type sugar chain derivative |
JPH0686684A (ja) * | 1992-05-26 | 1994-03-29 | Monsanto Co | シアロ抱合体の合成 |
US5591835A (en) * | 1992-06-29 | 1997-01-07 | Glycomed Incorporated | Substituted lactose derivatives |
US5426178A (en) * | 1993-03-31 | 1995-06-20 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Synthesis of anti-inflammatory compounds, and novel trisaccharides useful in the synthesis of anti-inflammatory compounds |
EP0697880B1 (en) * | 1993-05-03 | 2001-08-22 | Genentech, Inc. | Inhibition of leukocyte adhesion |
US5409817A (en) * | 1993-05-04 | 1995-04-25 | Cytel, Inc. | Use of trans-sialidase and sialyltransferase for synthesis of sialylα2→3βgalactosides |
US5374541A (en) * | 1993-05-04 | 1994-12-20 | The Scripps Research Institute | Combined use of β-galactosidase and sialyltransferase coupled with in situ regeneration of CMP-sialic acid for one pot synthesis of oligosaccharides |
EP0698031A4 (en) * | 1993-05-14 | 1997-07-09 | Cytel Corp | SIALYL LEx ANALOGS AS INHIBITORS OF CELLULAR ADHESION |
AU7083594A (en) * | 1993-07-02 | 1995-01-24 | Nippon Shinyaku Co. Ltd. | Galactosylmoranoline derivative |
US5559103A (en) * | 1993-07-21 | 1996-09-24 | Cytel Corporation | Bivalent sialyl X saccharides |
AU7467394A (en) * | 1993-08-23 | 1995-03-21 | Nippon Shinyaku Co. Ltd. | Galactosylmoranoline derivative |
EP0671409A3 (de) * | 1994-03-11 | 1996-06-12 | Hoechst Ag | Malonsäurederivate mit antiadhäsiven Eigenschaften. |
HUT77345A (hu) * | 1994-04-29 | 1998-03-30 | Texas Biotechnology Corporation | E-szelektin, P-szelektin vagy L-szelektin szialil-Lewis x-hez vagy szialil-Lewis a-hoz kapcsolódását gátló mannopiranoziloxi-bifenil származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények |
-
1996
- 1996-09-27 CA CA002231073A patent/CA2231073A1/en not_active Abandoned
- 1996-09-27 CZ CZ98890A patent/CZ89098A3/cs unknown
- 1996-09-27 WO PCT/FI1996/000513 patent/WO1997012892A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-09-27 EP EP96931833A patent/EP0874861A1/en not_active Withdrawn
- 1996-09-27 PL PL96325873A patent/PL325873A1/xx unknown
- 1996-09-27 JP JP9513991A patent/JP2000507993A/ja active Pending
- 1996-09-27 SK SK394-98A patent/SK39498A3/sk unknown
- 1996-09-27 HU HU9900058A patent/HUP9900058A2/hu unknown
- 1996-09-27 US US08/722,573 patent/US5965544A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-27 AU AU70872/96A patent/AU713078B2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-03-25 NO NO981361A patent/NO981361L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL325873A1 (en) | 1998-08-17 |
JP2000507993A (ja) | 2000-06-27 |
CA2231073A1 (en) | 1997-04-10 |
NO981361D0 (no) | 1998-03-25 |
AU7087296A (en) | 1997-04-28 |
CZ89098A3 (cs) | 1998-09-16 |
WO1997012892A1 (en) | 1997-04-10 |
HUP9900058A2 (hu) | 1999-04-28 |
US5965544A (en) | 1999-10-12 |
AU713078B2 (en) | 1999-11-25 |
EP0874861A1 (en) | 1998-11-04 |
NO981361L (no) | 1998-05-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69217491T2 (de) | Verfahren zur enzymatischen herstellung von alpha-sialylierten oligosaccharid-glykosiden | |
Sabesan et al. | Combined chemical and enzymatic synthesis of sialyloligosaccharides and characterization by 500-MHz and proton and carbon-13 NMR spectroscopy | |
US5374655A (en) | Methods for the synthesis of monofucosylated oligosaccharides terminating in di-N-acetyllactosaminyl structures | |
Renkonen et al. | Synthesis of a new nanomolar saccharide inhibitor of lymphocyte adhesion: different polylactosamine backbones present multiple sialyl Lewis x determinants to L-selectin in high-affinity mode | |
HU216312B (hu) | Eljárás szelektinreceptorhoz szelektíven kötődő vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására | |
WO1993018787A1 (en) | Trans-sialidase and methods of use and making thereof | |
Seppo et al. | Synthesis of a tetravalent sialyl Lewis x glycan, a high-affinity inhibitor of L-selectin-mediated lymphocyte binding to endothelium | |
US5965544A (en) | Synthetic multivalent sLex containing polylactosamines and methods for use | |
Bouhours et al. | A novel glycosphingolipid expressed in pig kidney: Galα1-3Lewisx hexaglycosylceramide | |
US6191271B1 (en) | Synthetic divalent sLex containing polylactosamines and methods for use | |
CA2110997A1 (en) | Methods for the synthesis of monofucosylated oligosaccharides terminating in di-n-acetyllactosaminyl structures | |
CA2118522A1 (en) | Time dependent administration of oligosaccharides glycosides related to blood group determinants having a type i or type ii core structure in reducing inflammation in a sensitized mammal arising from exposure to an antigen | |
EP0850244B1 (en) | Toxoplasma gondii glycoconjugates | |
Kościelak | ABH blood group active glycoconjugates from human red cells. | |
de Vries et al. | Biosynthesis of sialyl-oligomeric-Lewisx and VIM-2 epitopes: site specificity of human milk fucosyltransferase | |
EP0783508A1 (en) | The oligosaccharide structure of a ligand for e and p selectin | |
Yoon et al. | Synthesis of four novel trisaccharides by induction of loose acceptor specificity in Galβ31→ 4 transferase (EC 2.4. 1.22): Galp (β1→ 4) Glcp (X) Glc where X= β1→ 3: β1→ 4: β1→ 6: α1→ 4 | |
EP0919563A2 (en) | Synthetic Core 2-Like Branched Structures as Ligands for Selectins | |
Vicari et al. | Immunochemical studies on blood groups. XLV. Structures and activities of oligosaccharides produced by alkaline degradation of a blood group substance lacking A, B, H, Lea, and Leb specificities | |
Kitazume-Kawaguchi | Polysialylated glycoproteins found in sea urchin eggs | |
Veyrieres | The Synthesis of Blood Group I and i Active Oligosaccharides | |
Pykäria et al. | THE ACCEPTOR AND SITE SPECIFICITY OF 3FUCOSYLTRANSFERASE V. | |
IE912650A1 (en) | Inhibitors of fucosyltransferase and their uses |