JPWO2011122321A1 - ヘパリン結合性蛋白に対する生理活性阻害剤 - Google Patents

Abstract

ヘパリンやヘパラン硫酸などのグリコサミノグリカンの生理学的重要性を解明し、これらの分子の新たな用途を提供することを課題とする。硫酸化糖鎖を有効成分とした、ヘパリン結合性蛋白に対する生理活性阻害剤が提供される。本発明の生理活性阻害剤は例えば抗血管新生剤として利用される。

Description

本発明はヘパリンやヘパラン硫酸などの硫酸化糖鎖の新規用途に関する。詳しくは、硫酸化糖鎖を用いて特定の蛋白の機能を阻害する薬剤及び当該薬剤を用いた予防・治療法に関する。本出願は、２０１０年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１０−０７３９６７号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。

血糖の慢性的上昇や高濃度酸素への急激な暴露により、既存の網膜血管は閉塞を起こす。その血管閉塞部位より網膜血管が硝子体に向かって誤って再生し、結果的に視力低下につながる一連の変化を引き起こす。このようなメカニズムで発症する眼疾患として、糖尿病網膜症や未熟児網膜症が挙げられる。これらの疾患は、ライフスタイルや食生活の変化あるいは新生児医療の発展のため未熟児の救命率が上昇したことよって世界中で患者数が増加している懸案事項である。しかし、発生過程の網膜血管が網膜内に限局しているのに対して、虚血性網膜症では、なぜ網膜血管が硝子体に向かって誘導される傾向が強いのか分かっていない。

へパラン硫酸（HS）プロテオグリカンは、コア蛋白と一つ以上のグリコサミノグリカン（GAG）と呼ばれる特定の配列を有する糖鎖により構成される（非特許文献１）。これらのプロテオグリカンは、膜結合型として全ての細胞の表面、あるいは分泌型として細胞外基質に、普遍的に存在し、重要な生理活性を有する。HSは多くの硫酸基修飾により、強く負に帯電しており、イオン結合を介して様々なへパリン結合蛋白とそのレセプターの相互作用に影響を及ぼす（非特許文献１）。ノックアウトマウスを用いた実験からは、個々のHSプロテオグリカンの役割は、組織特異的な発現プロファイルにある程度依存することが分かってきている（非特許文献２）。一般的には、膜結合型のHSプロテオグリカンは、同じく膜表面で起こるへパリン結合蛋白とそのレセプターの結合を促進する（非特許文献３、４）。しかし、可溶性HSの役割は曖昧である（非特許文献５、６）。環境によって変化し、相反する性質を示すこともある（非特許文献６，７）。可溶性HSが細胞表面に接着し、膜結合型に変化しうることが、役割を一層複雑にしている（非特許文献３）。

例えば、培養液に低濃度の可溶性HSプロテオグリカンを添加すると、メラノーマ細胞に対する血管内皮増殖因子（VEGF-A）の結合が促進される一方、高濃度で添加した場合には逆の現象が認められる（非特許文献８）。可溶性HSのin vivoでの機能を規定することは更に困難である。その理由は、自由に移動可能なHSプロテオグリカンはコア蛋白への依存性が低く、また特定のプロテオグリカンが欠失した場合には他のプロテオグリカンによって補填され得るからである。

前房水は透明な液体であり眼の前房を循環する。前房水は後房内で無色素性毛様体上皮細胞によって産生され、瞳孔を通って前方へと流入し、再吸収される（１分間に約1%の代謝率と考えられている）。前房水中の化学物質含有量は硝子体の化学物質含有量を極めてよく反映したものであるが（非特許文献９）、前者の方が常に低い（非特許文献９、１０）。それは、硝子体から拡散した分子がその前房水濃度の形成に大きな影響を与えているからであると考えられている（非特許文献９、１０）。

血管新生誘導因子（VEGF-A及び塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF））とレセプターとの結合を前房水中の可溶性HSが抑制している可能性が報告された（非特許文献１１）。しかしながら、可溶性HSの生理学的重要性は依然として不明である。

グリコサミノグリカンの1種であるへパリンは、β-D-グルクロン酸あるいはα-L-イズロン酸とD-グルコサミンが1,4結合により重合した高分子であり、HSと比べて硫酸化の度合いが特に高いという特徴がある。しかし、へパリンとHSの両糖鎖には化学的な性質に大きな差はない。一般に、へパリンは抗凝固剤として広く使用されている。しかし、この分子中に多数含まれる硫酸基が負に帯電しているため、種々の生理活性物質と相互作用する。とくに、多くの成長因子に対してそのレセプターとの結合を促進することにより、シグナル増強因子として働くことが知られている。例えば、へパリンには血管新生に重要な役割を果たす塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）の作用を増強する働きがある。この性質を応用し、HSなどのグリコサミノグリカンを分解することにより、癌など血管新生が関与する疾患の進行を抑制する試みがなされている。

Capila,I., and Linhardt,R.J. 2002. Heparin-protein interactions. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41:391-412. Bishop,J.R., Schuksz,M., and Esko,J.D. 2007. Heparan sulphate proteoglycans fine-tune mammalian physiology. Nature 446:1030-1037. Gitay-Goren,H., Soker,S., Vlodavsky,I., and Neufeld,G. 1992. The binding of vascular endothelial growth factor to its receptors is dependent on cell surface-associated heparin-like molecules. J. Biol. Chem. 267:6093-6098. Bernfield,M., Gotte,M., Park,P.W., Reizes,O., Fitzgerald,M.L., Lincecum,J., and Zako,M. 1999. Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans. Annu. Rev. Biochem. 68:729-777. Kato,M., Wang,H., Kainulainen,V., Fitzgerald,M.L., Ledbetter,S., Ornitz,D.M., and Bernfield,M. 1998. Physiological degradation converts the soluble syndecan-1 ectodomain from an inhibitor to a potent activator of FGF-2. Nat. Med. 4:691-697. Nikolova,V., Koo,C.Y., Ibrahim,S.A., Wang,Z., Spillmann,D., Dreier,R., Kelsch,R., Fischgrabe,J., Smollich,M., Rossi,L.H. et al 2009. Differential roles for membrane-bound and soluble syndecan-1 (CD138) in breast cancer progression. Carcinogenesis 30:397-407. Su,G., Blaine,S.A., Qiao,D., and Friedl,A. 2007. Shedding of syndecan-1 by stromal fibroblasts stimulates human breast cancer cell proliferation via FGF2 activation. J. Biol. Chem. 282:14906-14915. Cohen,T., Gitay-Goren,H., Sharon,R., Shibuya,M., Halaban,R., Levi,B.Z., and Neufeld,G. 1995. VEGF121, a vascular endothelial growth factor (VEGF) isoform lacking heparin binding ability, requires cell-surface heparan sulfates for efficient binding to the VEGF receptors of human melanoma cells. J. Biol. Chem. 270:11322-11326. Funatsu,H., Yamashita,H., Noma,H., Mimura,T., Nakamura,S., Sakata,K., and Hori,S. 2005. Aqueous humor levels of cytokines are related to vitreous levels and progression of diabetic retinopathy in diabetic patients. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 243:3-8. Aiello,L.P., Avery,R.L., Arrigg,P.G., Keyt,B.A., Jampel,H.D., Shah,S.T., Pasquale,L.R., Thieme,H., Iwamoto,M.A., Park,J.E. et al 1994. Vascular endothelial growth factor in ocular fluid of patients with diabetic retinopathy and other retinal disorders. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487.

本発明は、ヘパリンやヘパラン硫酸（HS）などのグリコサミノグリカンの生理学的重要性を解明し、これらの分子の新たな用途を提供することを課題とする。

本発明者らは、網膜血管新生における可溶性HS・ヘパリンの役割を明らかにすべく研究を進めた。その結果、動物実験によって、他の体液に比べて眼内液中のHS濃度が高いことが明らかとなった。また、酸素負荷モデル（病的網膜血管新生を誘発したマウス）を用いた検討の結果、当該モデルではHS分解酵素の投与眼において病的な網膜血管新生が顕著に促進される一方で、ヘパリンを同時に投与するとHS分解酵素の作用が完全に阻害される現象を認めた。更なる検討によって、HS・ヘパリンがVEGFに結合してその生理活性を阻害することが明らかとなった。更に、網膜外血管新生を患う糖尿病患者では前房水中のHS濃度が低いことが判明した。以上の結果より、可溶性HSが眼内液中で特有の分布を示し且つ高濃度で存在し、その結果、VEGFに対する内在性の阻害物質として機能していることが示唆された。この知見は、局所においてHSやヘパリンの濃度を調節すればVEGFの生理活性を阻害できること、換言すれば、HS等がVEGFの阻害剤として有効であることを示す。尚、今回明らかとなった知見、即ち、「グリコサミノグリカンであるHSやへパリンを眼内に投与すると病的新生血管が抑制され、逆に内在性のHSを分解すると新生血管が増加すること」は、従来報告されてきたHSやヘパリンの役割から推察できるものと大きく異なる。

更に研究を進め、レーザー誘発脈絡膜新生血管に対するへパリンの効果と作用機序を検討した。その結果、ヘパリンがVEGFやCCL2（chemokine (C-C motif) ligand 2）などの作用を複合的な機序で阻害し、抗新生血管作用及び抗炎症作用を示すことが明らかとなった。この結果は、炎症疾患や血管新生の治療に対して可溶性のグルコサミノグリカンが有効であることを示唆する。

一方、眼内可溶性HSの年齢性変化と増殖性糖尿病網膜症の発生との関係を調べた結果、硝子体中のHS濃度が低いために若年糖尿病者では糖尿病網膜症が重症化しやすいことが示唆された。この結果は、若年糖尿病患者の網膜症（特に増殖性網膜症）が、HS等による治療の最適な標的の一つであることを意味する。

ところで、すでに眼内の新生血管を抑制する薬剤は臨床で使用されている。しかし、もっとも広く使用されている抗VEGF剤の効果は必ずしも十分でない。その理由として、VEGF以外の血管増殖因子の存在が指摘されている。へパリンなどのグリコサミノグリカンはVEGF以外の血管増殖因子（例えばbFGF）にも結合し不活化しうるため、抗VEGF剤と併用した場合に相加的ないし相乗的効果を期待できる。一方、抗VEGF剤は脳梗塞や心筋梗塞などの血管閉塞疾患のリスクを上げる可能性があることから、血管閉塞疾患の患者或いは血管閉塞疾患の罹患リスクの高い者（高齢者、糖尿病患者等）には使用しにくい。対照的に、ヘパリン等を投与した場合にあっては余剰のへパリン等が血液にわずかに吸収されても抗凝固作用を発揮することが予想されることから、このような対象に対しても使用可能である。即ち、抗VEGF剤の投与が不能又は適さない状況下における代替医療を提供できる。

ここで、ヘパリンとHSはともに多数の硫酸基を持ち、強く負に帯電した糖鎖であることから、同様の特徴を持つコンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸、ケタラン硫酸等の硫酸化糖鎖或いはその分解産物もまたVEGFの阻害剤として機能するといえる。一方、ヘパリン等によるVEGFの阻害効果が両分子の結合に基づくこと、当該結合がVEGFに存在するヘパリン結合ドメインを介して生ずること、更には高濃度の可溶性硫酸化糖鎖が細胞表面のヘパラン硫酸に対して競合阻害するというメカニズムが明らかになったこと、からすれば、ヘパリン結合ドメインを持つ各種生体分子に対してもヘパリン等の硫酸化糖鎖による阻害効果を期待できる。即ち、VEGFに限らず、ヘパリン結合ドメインを持つ各種生体分子（成長因子、炎症因子、脂質代謝関連因子、細胞接着因子など）の生理活性を阻害するための手段としてヘパリン等の硫酸化糖鎖が有効であるといえる。
以下に示す本発明は主として上記成果ないし知見に基づく。
[１] 硫酸化糖鎖を含む、ヘパリン結合性蛋白に対する生理活性阻害剤。
[２] 硫酸化糖鎖が硫酸化グリコサミノグリカンである、[１]に記載の生理活性阻害剤。
[３] 硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケタラン硫酸及びこれらのいずれかの分解産物又は修飾体、からなる群より選択される一又は二以上の化合物である、[２]に記載の生理活性阻害剤。
[４] ヘパリン結合性蛋白が成長因子、炎症因子、脂質代謝関連因子又は細胞接着因子である、[１]〜[３]のいずれか一項に記載の生理活性阻害剤。
[５] 成長因子が、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、上皮増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子ファミリー蛋白（FGF）、ミッドカイン、肝細胞増殖因子（HGF）及びベータ型変異増殖因子（TGF-β）からなる群より選択される因子であり、炎症因子が、腫瘍壊死因子α（TNF‐α）、ストロマ細胞由来因子1 (SDF-1)、血小板やT細胞由来の好酸球走化性物質（RANTES）及び単球走化活性因子（MCP-1)を含めたケモカインファミリー蛋白からなる群より選択される因子であり、脂質代謝関連因子が、アネキシンV(Anexin V)、アポリポ蛋白E（APOE）からなる群より選択される因子であり、細胞接着因子が、Lセレクチン（L-selectin）及びPセレクチン(P-selectin)からなる群より選択される因子である、[４]に記載の生理活性阻害剤。
[６] 成長因子が血管新生誘導性の因子である、[４]に記載の生理活性阻害剤。
[７] 血管新生誘導性の因子が、血管内皮細胞増殖因子又は線維芽細胞増殖因子である、[６]に記載の生理活性阻害剤。
[８] 抗血管新生剤である、[６]又は[７]に記載の生理活性阻害剤。
[９] 増殖性糖尿病網膜症、未熟児網膜症、滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、特発性脈絡膜新生血管症、眼虚血症候群、網膜静脈閉塞症、虹彩新生血管症、角膜血管新生、ぶどう膜炎、増殖性硝子体網膜症又は黄斑浮腫の予防又は治療に用いられる、[１]〜[８]のいずれか一項に記載の生理活性阻害剤。
[１０] 血管閉塞疾患の患者又は血管閉塞疾患の罹患リスクが高い者に対して投与される、[９]に記載の生理活性阻害剤。
[１１] 抗VEGF剤を組み合わせてなる、[８]〜[１０]のいずれか一項に記載の生理活性阻害剤。
[１２] 硫酸化糖鎖と抗VEGF剤とを含有する配合剤である、[１１]に記載の生理活性阻害剤。
[１３] 硫酸化糖鎖を含有する第１構成要素と、抗VEGF剤を含有する第２構成要素とからなるキットである、[１１]に記載の生理活性阻害剤。
[１４] 硫酸化糖鎖を含有し、投与時に抗VEGF剤が併用投与される、[１１]に記載の生理活性阻害剤。
[１５] ヘパリン結合性蛋白の異常な発現レベルの上昇及び／又は異常な作用亢進に起因する疾病を罹患する患者又は罹患するおそれのある患者に対して、治療上有効量の硫酸化糖鎖を投与するステップを含む、前記疾病の予防・治療法。

眼内液ではヘパラン硫酸（HS）グリコサミノグリカン（GAG）濃度が高いことを示す図。(A)眼内液中のHSプロテオグリカンのコア蛋白のプロファイル。15日齢のマウスから採取した眼内液をサンプルとしたウエスタンブロットの結果、パールカン（perlecan）、コラーゲンXVIII（collagen XVIII）、シンデカン３（syndecan-3）、シンデカン１（syndecan-1）及びシンデカン２（syndecan-2）にそれぞれ対応するバンドを認めた。(B)眼内液中のHS濃度の経時変化。成体マウス（60日齢、n=5）に比較し、より若いマウス（7日齢又は12日齢、いずれもn=6）ではHSレベルが高い。(C)体液中のHS濃度の比較。17日齢マウス（n=7）及び60日齢マウス（n=5）のいずれにおいても、血漿や尿に比較して眼内液中のHSレベルは高い。(D)酸素負荷モデル（OIR；病的網膜血管新生を誘発したマウス）の網膜伸展標本のGS染色像。酸素に暴露する前（7日齢）、網膜血管は周縁に向かって伸長する（星印）。80%酸素への暴露後（12日齢）、網膜血管は退行・消失する（矢印）。大気条件下に戻すと（17日齢）網膜外新生血管が出現する（新生血管を矢頭で示す）。網膜内血管に比べ網膜外新生血管が強く染色されている。(E)OIRモデルと野生型マウスにおけるHS濃度の比較。両者に差は認められない。ONは視神経を表す。全てのデータは平均±標準誤差（S.E.M.）で示した。 OIRモデルにおける新生血管の成長をHS・ヘパリングリコサミノグリカンが阻害することを示す図。(A)ヘパリナーゼIII（HIII）によるHSグリコサミノグリカンの分解。HIIIは眼内液中のHSをin vivoで87.3％（左、n=5）、in vitroで80.2%（右、n=5）分解した。(B)血管で覆われた網膜面積の測定結果。PBS又はHIIIで処理した8日齢のマウス網膜（n=6）の代表的なGS染色像を示した。網膜全領域に対する血管で覆われた領域の比率を定量した。両者の間に差は認められない。(C-G)12日齢マウスの眼にPBS(C)、HIII(D)、HIII及びヘパリン（HIII+Hep；E）、高濃度HS（HS-hi；F）又はヘパリン（Hep；G）を投与した。17日齢で回収した網膜のGS染色像（代表例）を示す（上段）。下段では新生血管領域（オリジナルイメージでは赤）及び無血管野（オリジナルイメージでは青）を示した。(H-M)新生血管領域（上段）と網膜無血管野（下段）の定量。網膜全体に対する比率（％）として表した。眼をHIII（n=9）、HIII+Hep（n=8）、低濃度HS（HS-lo；n=8）、高濃度HS（HS-hi；n=8）、ヘパリン（Hep；n=7）又はヘパリナーゼI（HI；n=6）で処理した。HIIIで処理した眼では新生血管の増大を認めた(H)。ヘパリンの同時投与によってHIIIの効果が完全に阻害された(I)。高濃度HS(K)又はヘパリン(L)の眼内注射によって血管新生は減少した。一方、低濃度HS(J)又はヘパリナーゼI(M)ではコントロールとの差異は認められない。全てのデータは平均±標準誤差（S.E.M.）で示した。 可溶性ヘパリンが結合したVEGF-Aは不活化される一方、蛋白分解に対して抵抗性を獲得することを示す図。(A)OIRマウスの眼内液中のVEGF-A濃度。野生型マウス（WT）及びOIRモデルについて8日齢、12日齢、14日齢の検体中のVEGF-A濃度を測定した（それぞれn=6）。12日齢のOIR眼に対して(B,C)ヘパリナーゼIII（HIII；n=8）又はヘパリン（Hep；n=7）を投与し、14日齢に採取した眼内液中のVEGF-A濃度を測定した。ヘパリンの眼内注射によってVEGF-Aレベルが顕著に増大した(C)。(D,E) ヒトVEGF-A眼内注射6時間後及び48時間後のマウス眼における分子動態。ヘパリン（片眼当たり20μg）とともにヒトVEGF121アイソフォーム（片眼当たり5 ng）を12日齢のマウスの片眼に注射した。他眼には同量のヒトVEGF121アイソフォームのみを注射した。6時間後（n=6）又は48時間後（n=5）にヒトVEGF特異的ELISAにより眼内液を分析した。ヒトVEGF165を用いて同様の実験も行った。VEGF165とヘパリンを同時投与した眼についてのみ、注射6時間後にヒトVEGF-A濃度が高値を示した(D)。ヒトVEGF-Aを投与していないコントロール眼ではVEGF-Aは検出されなかった（n=6）。(F,G)プラスミンによるVEGF-Aの分解に対するヘパリンのin vitroでの効果。VEGF165(F)及びVEGF121(G)をプラスミン（レーン1及び5；400 ng、レーン2及び6；80 ng、レーン3及び7；16 ng、レーン4及び8；3.2 ng）による分解に供した。分解処理をしていないVEGF165及びVEGF121（矢頭）を基準に評価した。全てのデータは平均±標準誤差（S.E.M.）で示した。 ヘパリン及び眼内液がHUVEC細胞の増殖を抑制することを示す図。(A)HUVECの増殖能に対するヘパリンの影響。VEGF-Aを添加したEG2培地で培養した細胞に様々な濃度でヘパリンを添加した（各データはn=4）。可溶性ヘパリンは濃度依存性にHUVECの増殖能を抑制した。実験は繰り返し行った。(B)培地の違いによるHUVECの増殖能の変化。EG2培地を使用した場合（n=6）にはVEGF-A（10 ng/ml）の添加によってHUVECの増殖能が上昇した。PBS又は眼内液を使用した場合（n=6）にはVEGF-Aによる生存率の上昇は認められない。PBSで培養した場合の増殖能は低い。実験は繰り返し行った。(C)様々な濃度のVEGF-Aを加えて培養した場合のHUVECの増殖能。EG2培地を使用した場合にはVEGF-Aの濃度依存性に増殖能が上昇した（各データはn=4）。一方、眼内液を使用した場合にはVEGF-Aによる増殖能の変化を認めない。ヘパリンを添加しない条件（Aのグラフの場合）又はVEGF-Aを添加しない条件（Cのグラフの場合）に対するODの比率を示した。全てのデータは平均±標準誤差（S.E.M.）で示した。 可溶性HS・ヘパリングリコサミノグリカンが表在性ヘパリンあるいはVEGFR2とVEGF165の結合を阻害することを示す図。(A)VEGF-Aと表在性ヘパリンとの結合。横軸は表在性ヘパリンの量。(B)VEGF-Aと表在性ヘパリンの結合に対する可溶性ヘパリンの影響。一定量の表在性ヘパリン（ウェルの底に共有結合させたヘパリン）に対して可溶性ヘパリンとともにVEGF-Aを添加した。横軸は可溶性ヘパリンの添加量。(C)可溶性HSグリコサミノグリカン又は眼内液（OF）存在下の表在性ヘパリンとVEGF-Aの結合。低濃度（HS-lo；100μg/ml）又は高濃度（HS-hi；1000μg/ml）のHS又はOFによってVEGF-Aと表在性ヘパリンの結合が抑制されている。(D)可溶性VEGF-Aの量と表在性ヘパリンとの結合の関係。様々な濃度のVEGF-AをPBS又はOFに溶解した（横軸はVEGF-A濃度）。OFに溶解した場合のVEGF-Aと表在性のヘパリンの結合曲線は、PBSに溶解した場合の結合曲線を右方偏移したものに回帰した。(E-J) 表在性のVEGFR2(E-G)又はVEGFR1(H-J)へのVEGF165又はVEGF121の結合に対する、OF、可溶性HS又は可溶性ヘパリンの影響。HS-lo、HS-hi、OF(E)及びヘパリン(G)によって、VEGF165とVEGFR2の結合が阻害された。一方、VEGF165又はVEGF121とVEGFR1の結合に対する、HS・ヘパリングリコサミノグリカン又はOFによる阻害効果はわずかであった(H-J)。(B)(C)及び(E-J)ではコントロールに対する相対値を示した。(D)では、３回の実験データをオンラインソフトウエア（http://zunzun.com）で解析し、代表的なデータを示した。その他のデータは、繰り返し実験（n=6）を行った結果の代表的なデータであり、平均±標準誤差（S.E.M.）で示した。*P<0.050 増殖性糖尿病網膜症（PDR）患者の前房水ではHS濃度が低下していることを示す図。(A)健常者の前房水におけるHSコア蛋白のプロファイル。パールカン、コラーゲンXVIII、シンデカン３、シンデカン１及びシンデカン３に相当すると思われる複数のバンドを認める。(B)糖尿病患者の前房水中のHSレベル。非増殖性糖尿病網膜症患者（NPDR、n=7）及び健常者（CONT、n=15）に比べPDR患者（n=16）ではHS濃度が低下している。(C)PDR患者のHS濃度と年齢の散布図及び回帰分析の結果。相関は認められない（R²=0.084）。(D)糖尿病網膜症患者の前房水中におけるVEGF-Aレベル。NPDR患者及びPDR患者の一部にVEGF-Aレベルの上昇を認める。 可溶性VEGFR1により網膜新生血管がほぼ消失することを示す図。12日齢のOIRマウス（n=8）の眼内に可溶性VEGFR1(sVEGFR1; R&D Systeｍs;0.5μg/0.5μl)あるいはPBSを投与した。17日齢で眼を回収しGSで染色した網膜伸展標本を解析したところ、sVEGFR1投与で新生血管は98.0％減少した。無血管野の面積に差はなかった。 ヘパリン眼内投与によりCNV（脈絡膜新生血管）の発生が抑制されることを示す図。（A,B)高濃度のヘパリン（Hep; A）及びPBSで処理した眼。（C-E)CNVのサイズ。PBSで処理した場合を基準とした相対値で示した。低濃度のヘパリン（100μg/ml; C）、高濃度のヘパリン（10000μg/ml; E）及びその間の濃度（1000μg/ml; D）で処理した。 FITCでラベルしたヘパリンの分布を示す図。(A-C)レーザー照射3時間後のFITC-ヘパリンの分布（オリジナルイメージでは緑色）とGS染色（オリジナルイメージでは赤色）。FITC-ヘパリン（矢頭）はレーザー痕周囲の視細胞層（Aの矢印）及びGS陽性網膜血管（B,Cの矢印）に集積した。 単球／マクロファージの遊走に対するヘパリンの効果を示す図。（A,B）レーザー照射及び眼内投与24時間後のGS染色像。レーザー痕周囲のGS陽性細胞は、PBSで処理した眼（B）に比較して、ヘパリン投与眼で減少している（A）。（C,D）レーザー痕内外のGS陽性細胞数の比較。ヘパリン投与眼では、レーザー痕外のGS陽性細胞数が減少している。 可溶性ヘパリンによって培養液中のARPE19由来VEGF及びCCL2が減少することを示す図。（A,B）ヒトRPEの培養液中に分泌されたVEGF及びCCL2の測定。低濃度のヘパリンの添加によってAPRE19由来VEGF量が増加した（A）。高濃度でヘパリンを添加するとVEGF量は低下した（B）。 ヘパリン又はブタ硝子体液による、VEGFとVEGFR2との結合又はCCL2とCCR2との結合の阻害を示す図。（A,B）可溶性ヘパリン又はブタ硝子体液による、VEGFと表面ペパリン又はVEGFR2との相互作用の阻害。（C）VEGFと表面ヘパリンとの相互作用に対する、ヘパリンのサイズの影響。（D,E）ヘパリン又はブタ硝子体液による、CCL2と表面ヘパリン又はCCR2との相互作用の阻害。（F,G）TNF-αと表面ヘパリン又はTNFRsとの相互作用に対しては、ヘパリン又はブタ硝子体液による明らかな阻害効果は認められなかった。 前房水中のHS濃度と硝子体中のHS濃度の相関を示す図。 HS低濃度と若年齢及びVEGFの結合との相関を示す図。(A,B)硝子体中のHS濃度と年齢（A）、硝子体中のVEGF濃度と年齢（B)に関する回帰分析の結果。(C-E)VEGFと表面ヘパリンとの結合実験の結果。

本発明の第１の局面はヘパリン結合性蛋白に対する生理活性阻害剤を提供する。本発明の生理活性阻害剤の有効成分は硫酸化糖鎖である。「硫酸化糖鎖」とは、硫酸基を含有する糖鎖である。糖鎖の組成、分子量などは、ヘパリン結合性蛋白への結合性を示す限り、特に限定されない。典型的には、硫酸化糖鎖として硫酸化グリコサミノグリカン（以下、「GAG」とも呼ぶ）が採用される。「硫酸化グリコサミノグリカン」とは、プロテオグリカンの糖鎖部分を構成する分子であり、通常は直鎖状である。GAGとしてヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸及びケタラン硫酸が知られている。これらのGAGはいずれもウロン酸とアミノ糖で構成される二糖単位の繰り返し構造を有する。これらのGAGを採用する場合、その分子量は例えば数百〜数百万である。分子量の幅が大きいのは、組織浸透性を重視する場合は生理活性を有する最小単位が望ましい一方、滞留性が大切な場合はより大きな分子の薬効が大きいと予測されるからである。分子量の揃った集合体に限らず、分子量が相違する分子が併存した集合体を用いることもできる。また、二種類以上のGAGを併用してもよい。

GAGの分解産物又は修飾体を用いることもできる。ここでの「分解産物」とは、分解の結果、元のGAGに比較して分子量が相対的に小さい分子のことをいう。分解産物を得るための方法は特に限定されない。分解方法として酵素的分解、化学的分解、熱的分解、光学的分解を例示することができる。分解産物の分子量は例えば数百〜数百万である。他方、「修飾体」とはGAGに対して何らかの修飾が施された分子をいう。修飾の例は硫酸化（硫酸基の付加）、保護基の導入、標識化、重合化ないし高分子化である。ここで、本発明の生理活性阻害剤の作用効果は、その有効成分である硫酸化糖鎖が有する、標的（ヘパリン結合性蛋白）に対する結合性に依存する。換言すれば、本発明の生理活性阻害剤が所望の作用効果を発揮するためには、それが含有する硫酸化糖鎖にヘパリン結合性蛋白への結合能が要求される。従って、上記の如き分解又は修飾は当該特性が維持される限度において許容されることになる。尚、GAGの分解産物又は修飾体がヘパリン結合性蛋白に結合するか否かは、ヘパリン結合性蛋白（例えばVEGFやbFGF）を用いた標準的な結合実験で確認できる。

本発明の生理活性阻害剤の標的はヘパリン結合性蛋白である。用語「ヘパリン結合性蛋白」とは、ヘパリンに対する結合性を示し、生理活性を有する蛋白をいう。ヘパリン結合性蛋白の例は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、上皮増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子ファミリー蛋白（FGF）、ミッドカイン、肝細胞増殖因子（HGF）、ベータ型変異増殖因子（TGF-β）等の各種成長因子（増殖因子）、腫瘍壊死因子α（TNF‐α）、ストロマ細胞由来因子1(SDF-1)、血小板やT細胞由来の好酸球走化性物質（RANTES）、単球走化活性因子（MCP-1)を含めたケモカインファミリー蛋白等の各種炎症因子、アネキシンV(Annexin V)、アポリポ蛋白E（APOE）等の脂質代謝関連因子、Lセレクチン（L-selectin）、Pセレクチン(P-selectin)等の細胞接着因子、ラクトフェリンやトランスフェリン等の糖蛋白である。好ましい一態様では、上掲の成長因子の一つ又は二つ以上が標的となる。尚、ヘパリン結合性タンパク質の分類、生理機能に関しては後掲の参考文献１が参考になる。

VEGFはグリア細胞、マクロファージや腫瘍細胞が産生する増殖因子であり、血管新生、炎症、腫瘍増殖、浮腫において重要な役割を果たす。従って、VEGFが標的となる場合、本発明の生理活性阻害剤は抗血管新生剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、抗浮腫剤などとして機能し得る。VEGFはファミリーを形成する。VEGFファミリーにはVEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-D、VEGF-E、胎盤増殖因子（PlGF）-1及びPlGF-2が含まれる。VEGF-AにはVEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206等のアイソフォームが存在する。この中でVEGF165は眼内で産生される主要なVEGFアイソフォームである。従って、本発明を眼疾患の予防・治療に適用する場合にはヘパリン結合ドメインをもたないVEGF121以外のVEGF165を含むすべてのアイソフォームが標的となり得る。

EGFは主に上皮系細胞の成長や増殖、分化に重要な役割を果たす。従って、EGFが標的となる場合、本発明の生理活性阻害剤は上皮系細胞の成長、増殖又は分化阻害剤として機能し得る。

FGFはヘパリンと高親和性を示すポリペプチドである。FGFファミリーにはaFGF（FGF1）、bFGF（FGF2）、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF19等が含まれる。FGFシグナルは発生や分化、代謝調節において重要な役割を果たす。また、FGFシグナルの異常は細胞の癌化の一因となることや、頭蓋骨癒合症、軟骨無形成症、軟骨低形成症などの骨・軟骨疾患の原因となることが知られている。従って、FGFが標的となる場合、本発明の生理活性阻害剤は代謝調節剤やこれらの疾患の予防・治療剤として機能し得る。

ミッドカインはヘパリン結合性の分泌蛋白である（Tomomura, M., Kadomatsu, K., Nakamoto, M., Muramatsu, H., Kondoh, H., Imagawa, K. and Muramatsu, T. (1990) A retinoic acid responsive gene, MK, produces a secreted protein with heparin binding activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 171, 603-609.）。ミッドカインの作用として抗アポトーシス、細胞遊走能、炎症性サイトカイン誘導及び血管新生等が知られている。従って、ミッドカインが標的となる場合、本発明の生理活性阻害剤はアポトーシス促進剤、抗炎症剤、抗血管新生剤などとして機能し得る。

一態様では、本発明の生理活性阻害剤は血管新生誘導性の因子を標的とし、抗血管新生剤として機能する。「血管新生誘導性の因子」の具体例はVEGF（特にVEGF-A）及びFGF（特にbFGF）である。好ましい態様では、VEGF-Aとそのレセプター（VEGFR2）との結合の阻害に硫酸化多糖が有効であるとの知見（後述の実施例を参照）に基づき、VEGF-Aを標的又は標的の一つとした抗血管新生剤が提供される。他の一態様では、bFGFを標的又は標的の一つとした抗血管新生剤が提供される。

抗血管新生剤として提供される場合の本発明は、例えば、増殖性糖尿病網膜症、未熟児網膜症、滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性（新生血管黄斑症）、特発性脈絡膜新生血管症、眼虚血症候群、網膜静脈閉塞症、虹彩新生血管症又は角膜血管新生の予防又は治療に用いられる。また、抗炎症剤としてぶどう膜炎、抗腫瘍剤として増殖性硝子体網膜症、抗浮腫剤として黄斑浮腫が対象となる。即ち、本発明の適用分野の一つは眼科領域であり、血管新生を伴う眼疾患が好適な予防・治療対象となる。ところで、同領域では血管新生や黄斑浮腫を伴う疾患の治療に抗VEGF剤が使用されているが、既存の抗VEGF剤は血管閉塞疾患（脳梗塞や心筋梗塞など）のリスクを上げる可能性のあることが指摘されており、血管閉塞疾患の患者或いは血管閉塞疾患の罹患リスクの高い者（高齢者、糖尿病患者等）には使用し難い状況にある。一方、特に本発明の有効成分となり得るヘパリンには血液抗凝固作用が認められる。従って、この硫酸化糖鎖又はその分解産物・修飾体を有効成分とした場合には、微量の余剰の有効成分が血液に吸収されて抗凝固作用を発揮することが予想されることから、上記の如き対象に対しても有効な抗血管新生剤（あるいは抗炎症剤、抗腫瘍剤、抗浮腫剤）となる。また、VEGF以外の因子の関与があるがために、既存の抗VEGF剤では十分な抗血管新生や抗浮腫効果を得られないという問題も指摘されている。本発明の生理活性阻害剤はヘパリン結合性蛋白を標的とするものであり、ヘパリン結合性蛋白であれば二種類以上を同時に標的とすることができるという特徴を備える。例えば、抗血管新生剤として構成される場合にあっては、VEGFに加え、bFGF等、他の血管新生誘導因子も標的とすることができる。このような構成の本発明によれば、複数の血管新生誘導因子に対する作用を介して高い抗血管新生効果を発揮することができる。

一方、本発明の抗血管新生剤（あるいは抗炎症剤、抗腫瘍剤、抗浮腫剤）を既存の抗VEGF剤と併用し、相加的ないし相乗的効果を発揮させることも可能である。即ち、本発明の一態様では、抗血管新生剤として機能する本発明の生理活性剤を抗VEGF剤と併用する。抗VEGF剤の例はペガプタニブ（商品名：マクジェン（登録商標））、ラニビズマブ（商品名：ルセンティス（登録商標））及びベバシズマブ（商品名：アバスチン（登録商標））である。典型的には、硫酸化糖鎖と抗VEGF剤とを混合した配合剤として本発明の抗血管新生剤が提供されることになる。一方、硫酸化糖鎖を含有する薬剤（第１構成要素）と、抗VEGF剤を含有する薬剤（第２構成要素）とからなるキットの形態で本発明の抗血管新生剤を提供することもできる。この場合、治療期間内に第１構成要素及び第２構成要素が最低１回ずつは投与されることになる。各要素の投与スケジュールは個別に設定することができる。両要素を同時に投与することにしてもよい。ここでの「同時」は厳密な同時性を要求するものではない。従って、両要素を混合した後に対象へ投与する等、両要素の投与が時間差のない条件下で実施される場合は勿論のこと、片方の投与後、速やかに他方を投与する等、両要素の投与が実質的な時間差のない条件下で実施される場合もここでの「同時」の概念に含まれる。

抗VEGF剤を併用する態様は以上のものに限定されず、例えば、有効成分として硫酸化糖鎖を含有する抗血管新製剤とし、それによる治療期間内に抗VEGF剤も投与されるようにしてもよい。

本発明の生理活性阻害剤の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。

製剤化する場合の剤形も特に限定されない。剤形の例は注射剤、点眼剤、点鼻剤錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、外用剤、吸入剤及び座剤である。本発明の生理活性阻害剤には、期待される治療効果（又は予防効果）を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の生理活性阻害剤中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.01重量％〜約95重量％の範囲内で設定する。

本発明の生理活性阻害剤はその剤形に応じて非経口投与（点眼、静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）又は経口投与によって対象に適用される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、点眼と同時に又は所定時間経過後に眼内注射等を行う等）。本発明の生理活性阻害剤はその特性上、特に局所投与に適するが、全身投与による適用を排除するものではない。ドラッグデリバリーシステム（DDS）を利用して標的組織特異的に有効成分が送達されるように投与してもよい。

ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい一態様では本発明はヒトに対して適用される。本発明が適用される典型的な対象は、ヘパリン結合性蛋白の異常な発現レベル上昇及び／又は異常な作用亢進に起因する疾病を罹患する患者又は罹患するおそれのある患者である。即ち、ヘパリン結合性蛋白の機能亢進が原因又は一因となって発症する疾病の患者又は潜在的患者が適用対象となる。ヘパリン結合性蛋白の例は、上記の通り、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、上皮増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、ミッドカイン、肝細胞増殖因子（HGF）、ベータ型変異増殖因子（TGF-β）等の各種成長因子、腫瘍壊死因子α（TNF‐α）、ストロマ細胞由来因子1(SDF-1)、血小板やT細胞由来の好酸球走化性物質（RANTES）、単球走化活性因子（MCP-1)を含めたケモカインファミリー蛋白等の各種炎症因子、アネキシンV(Annexin V)、アポリポ蛋白E（APOE）等の脂質代謝関連因子、Lセレクチン（L-selectin）、Pセレクチン(P-selectin)等の細胞接着因子、ラクトフェリンやトランスフェリン等の糖蛋白である。対象の具体例を示せば、VEGF等の血管新生誘導性の因子の異常な発現によって眼内に異常な血管新生、浮腫を認める患者（例えば増殖性糖尿病網膜症、未熟児網膜症、滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性（新生血管黄斑症）、特発性脈絡膜新生血管症、増殖性硝子体網膜症、ぶどう膜炎、眼虚血症候群、網膜静脈閉塞症、虹彩新生血管症又は角膜血管新生の患者）又は潜在的患者（例えば非増殖性糖尿病症、前増殖性糖尿病網膜症の患者）である。

本発明の生理活性阻害剤の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に患者の症状、年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールとしては例えば１日１回〜数回、２日に１回、或いは３日に１回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。

以上の記述から明らかな通り、本出願は、ヘパリン結合性蛋白の異常な発現レベル上昇及び／又は異常な作用亢進に起因する疾病を罹患する患者又は罹患するおそれのある患者に対して、治療上有効量の硫酸化糖鎖を投与することを特徴とする、当該疾患の予防・治療法も提供する。典型的には、ヘパリン結合性蛋白の異常な発現レベル上昇及び／又は異常な作用亢進が認められる組織又は臓器（即ち、患部又はその近傍である局所）に対して硫酸化糖鎖が投与される。ここでの組織又は臓器の具体例は眼（角膜、前房、硝子体、網膜など）である。

Ａ．VEGFとVEGFレセプターの結合の阻害を介した可溶性へパラン硫酸による眼内病的血管新生の制御
１．方法
（１）動物
ARVO（Association for Research in Vision and Ophthalmology）声明及び名古屋大学医学部のガイドラインに従って全ての動物実験を行った。C57BL/6Jマウスを12時間毎の明暗サイクルで飼育した。酸素誘発網膜症（OIR）を発病させるため、7日齢（P7）マウスを80%酸素（Proox 110、Bio Spherix社）に５日間暴露した後、大気条件下で飼育した（2日〜5日）。続いて、トリブロモエタノールの腹腔内注射による麻酔下、片眼に試薬（0.5μl）、他眼に同量のPBS（Gibco社）を注射した。特に記載しない限り、片眼あたり0.005 UのへパリナーゼIII、ヘパリン（低投与群は5μg、高投与群は50μg）及び0.005 UのヘパリナーゼIを注射することにした（ヘパリナーゼIIIとヘパリンの同時注射の場合には前者を0.005 U、後者を50μg）。実験結果の誤差を最小限に留めるため、各実験に同腹のマウスを使用した。

（２）材料
特に記載しない限り、この研究ではVEGF-AとしてVEGF165アイソフォームを使用した。組換えVEGF165及びVEGF121はPeprpTech社から購入した。ウシ腎臓由来ヘパラン硫酸（HS）グリコサミノグリカンは生化学工業株式会社から購入し、ブタ腸由来非分画ヘパリン、ヘパリナーゼIII、ヘパリナーゼI及びコンドロイチナーゼABCはシグマアルドリッチ社から購入した。屠殺後3時間以内のブタ（8月齢）の眼より眼内液を採取した。フィルター滅菌後、HSの濃度を測定し（63.2μg/ml）、-80℃で保存した。このように調製したブタ眼内液を細胞実験及び結合実験に使用した。

（３）体液をサンプルとしたウエスタンブロット及びELISA
摘出したマウス眼球後極より強膜、脈絡膜及び網膜色素上皮とともに視神経を除去した。露出した網膜を通してピペットの先端を眼内に素早く挿入し、眼内液（硝子体液及び前房水の混合液と予想される）を吸引した（片眼あたり2〜5μL）。マウスの尿は屠殺前に採取し、末梢血は摘出した眼窩より採取した。13000gで5分間の遠心処理によって全血から血漿を分離した。以上のサンプルは分析まで-80℃で保存した。尚、ヒトサンプルの採取及び分析に際しては名古屋大学医学部内の倫理委員会の承認を受けるとともにヘルシンキ宣言の指針に従った。

糖尿病網膜症の患者23名と加齢性白内障患者15名を研究対象とした。蛍光造影眼底撮影における網膜外血管新生の有無を指標として増殖性糖尿病網膜症（PDR、16名）であるか非増殖性糖尿病網膜症（NPDR、7名）であるかを判定し、眼科検査及び眼底写真で結果を確認した。全てのNPDR患者は難治性黄斑浮腫を罹患していた。PDR患者及びNPDR患者の双方において網膜出血及び／又は浸出を認めた。虹彩に血管新生を認めた患者については研究対象から除外した。真性糖尿病を患っていない加齢性白内障患者をコントロールとした。書面による同意を得た後、各患者から手術時に前房水を採取した。

採取した眼内液、尿及び前房水を遠心処理（13000 g、5分間）し、上清を分析に用いた。マウス及びヒトの体液中VEGF-AのレベルはELISAキット（R&D Systems社）で測定した。体液中のHS濃度の測定には生化学工業株式会社製のELISAキットを使用した。また、眼内液或いは前房水を用いたウエスタンブロットの際には、サンプルをヘパリナーゼIII（1 U/ml）及びコンドロイチナーゼABC（2 U/ml）で処理した。サンプルを等量のlaemmliバッファー（Biorad Laboratories社）と混合した後、煮沸し、4〜20%のアクリルアミド濃度勾配ゲル（Biorad Laboratories社）を用いたSDS電気泳動（還元条件下）に供した。i-blot（Invitrogen社）を用い、泳動終了後のゲルから蛋白をポリビニリデンフルオリド膜に転写した。ヘパリナーゼIII処理によって生ずる不飽和構造を認識する抗体（3G10、500倍希釈、生化学工業株式会社）を用いてHSコア蛋白を検出した（参考文献１２）。

（４）HS分解アッセイ
12日齢のマウスの片眼にヘパリナーゼIII（片眼あたり0.005 U）を他眼にPBSを注射した。生後14日の時点で眼内液を採取した後、ELISA（in vivoアッセイ）でHS濃度を測定した。14日齢のマウスから採取した眼内液（1.5μl）をヘパリナーゼIII（0.0025 U）又は等量のPBSと混合し、37℃で終夜インキュベートした。残存するHSグリコサミノグリカンの量をELISA（in vivoアッセイ）で測定した。

（５）フラットマウント（Flatmount）分析
既報の方法（参考文献４９）に若干の修正を加え、フラットマウント分析を行った。概要を説明すると、眼を4%パラホルムアルデヒド（2時間）で固定した後、FITC標識Griffonia simplicifoliaレクチン（GS、血管及びミクログリア／マクロファージのマーカー、100倍希釈、Sigma-Ardrich社）。網膜フラットマウント像を共焦点顕微鏡（ニコン株式会社）で撮影した。

（６）In vitro VEGF-A分解アッセイ
様々な量のマウスプラスミン（3.2, 16, 80, 400 ng）とVEGF165（20 ng）又はVEGF121（20 ng）を、ヘパリン（100μg）の存在下又は非存在下で反応バッファー（100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM Mg Cl₂, 1 mMジチオルレイトール）に添加した。調製したサンプルを37℃で終夜インキュベートした後、ウエスタンブロットに供した。

（７）HUVEC増殖アッセイ
EG2培地（10 ng/mlの表皮成長因子、1μg/mlのヒドロコルチゾン、3ng/mlの塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、1%の非働化ウシ胎仔血清を含む）、PBS又はブタ眼内液内を培地とし、3〜5継代のHUVEC細胞（倉敷紡績株式会社）を96ウェルプレート（5,000細胞／100μl／ウェル）に播種し、37℃でインキュベートした。2時間後、ヘパリン、VEGF-A（倉敷紡績株式会社）又はPBSを培地に添加した。トータルで48時間インキュベートした後、細胞増殖試薬WST-1（Promega社）を添加した。4時間後にホルマザン色素の量（生存細胞の量を反映する）をプレートリーダーで検出した。

（８）In vitro結合アッセイ
エチルカルボジイミド塩酸塩（Pierce Biotechnology）を架橋剤として用い、アミノ酸でコートした96ウェルプレート（タカラバイオ株式会社）にヘパリン（特に記載のない限り10μg／ウェル）、VEGFR1（200 ng／ウェル）又はVEGFR2（200 ng／ウェル）のカルボキシ末端領域を共有結合させた。ブロッキングバッファーを添加した後、VEGF-A（特に記載のない限り200 ng/ml）及びヘパリンの混合液、ヘパラン硫酸又は眼内液（100μl／ウェル）を各ウェルに添加した。その後、4℃で終夜インキュベートした。氷上でプレートを氷PBSで洗浄した後、表在性のヘパリンあるいはVEGFR（VEGFR1又はVEGFR2）に結合したVEGF-Aの量を、ヒトVEGF ELISAキット（R&D Systems社）に含まれる試薬を用いて測定した。操作は添付の説明書に準じ、若干の修正をした。修正点の概要を説明すると、洗浄には氷PBSを使用し、最終の洗浄工程が終了するまで全ての操作を4℃で行った。最後に、プレートリーダーを用いて450nm（基準吸光度は620nm）の吸光度を測定し、各プレートを分析した。

２．結果
＜発生の過程で眼内液中のHS濃度は上昇している＞
生直後のマウス網膜には血管がない。網膜血管は、生後約2週間かけて、視神経から周辺部に向かって放射状に発達し、それに続いて網膜深部に血管網を形成する。我々は、最初に、HSプロテオグリカンのコア蛋白を検出する抗体を用いて、15日齢のマウス眼内液中のコア蛋白の組成を調べた（図1A）（参考文献１２）。マウスの眼内液には複数のコア蛋白が存在した（参考文献１３）。分子量の大きさから、これらのコア蛋白はパールカン、コラーゲンXVIII、シンデカン１、シンデカン２、シンデカン３と推察された（参考文献１４、１５）。これらのコア蛋白の多くは網膜での発現がすでに報告されている（参考文献）１３、１６〜１８。次に、7〜60日齢のマウス眼内液中のHS糖鎖の濃度を、ELISA法を用いて測定した（図1B）。若いマウスでは、HS糖鎖の濃度が非常に高いことが分かった。例えば、生後17日と60日の検体を比較すると、前者は後者の15.8倍の濃度であった。さらに、眼内液における糖鎖の濃度は血漿や尿に比べて極めて高いことが判明した（図1C）。例えば、生後17日では、眼内液中の糖鎖の濃度は、実に血漿の178倍、尿の236倍であった。

7日齢のマウスを80％酸素条件下で5日間飼育すると、視神経周囲の網膜血管網が広く閉塞する（図1D）。これには、網膜によるVEGF-Aの産生低下と酸化窒素の産生を介した酸化ストレスが関与していると考えられている（参考文献１９、２０）。これらのマウスを、再度大気条件（21％酸素）で5日間飼育すると、VEGF-Aの発現が亢進し、網膜外への異常網膜血管新生と閉塞した網膜内血管の再生が起こる（このモデルをOIRと呼ぶ）（参考文献２１〜２３）。OIRは、未熟児の呼吸不全に投与される高濃度酸素により医原性に引き起こされる未熟児網膜症のモデルである。また、OIRは、網膜血管新生の発症のメカニズムの究明やその治療の開発に広く用いられている。そのOIRとコントロールで眼内液中のHS濃度を測定したところ、両群に差はなかった（図1E）。

＜ヘパリン・HSグリサミノグリカンはin vivoで網膜外新生血管の発達を抑制する＞
眼内のHSプロテオグリカンの役割を明らかにするために、HS特異的分解酵素であるヘパリナーゼIIIを用いて、眼内の糖鎖を非特異的に分解する実験を行った。実験に先立ち、ヘパリナーゼIIIの糖鎖分解酵素としての効率について検討した（図2A）。まず、酵素をマウス眼内投与したところ、HS濃度は87.3％低下した。次に、あらかじめ採取した眼内液にヘパリナーゼIIIをin vitroで加えると、HS濃度は80.2％低下した。これらの実験により、ヘパリナーゼIIIの糖鎖分解能が確認されたため、今度は、網膜の血管があまり発達していない、3日齢のマウス眼にヘパリナーゼIIIを注射した。8日齢で、網膜血管発達への影響を検討したところ、コントロール眼に対して有意差は検出できなかった（図2B）。

次に、OIRモデルにおいて、酸素暴露終了直後の12日齢のマウスにヘパリナーゼIIIを投与し、17日齢で網膜血管を評価した。ヘパリナーゼIIIを投与した眼では、病的な網膜新生血管が2.9倍に増加していた（図2D,H）。そして、ヘパリナーゼIIIとヘパリン（ヘパリナーゼIIIにより分解されない糖鎖）を同時に投与すると、酵素の作用が完全に中和されることが明らかになった（図2E,I）。ヘパリンにはコア蛋白はないが、HSと糖鎖の科学的性質に大差はない（参考文献２４）。このことより、HSプロテオグリカンによる血管新生抑制作用は、コア蛋白の種類とは関係なく、糖鎖そのものの作用によるものと推察された。この仮説を、確認するために、コア蛋白を含まない精製したHS糖鎖をOIRに投与した。高濃度のHS（眼内で約12,500μg/ml）を投与すると、網膜外新生血管は64.2％減少した（図2F,K）。一方、より濃度の低いHS（眼内で約1,250μg/ml）を投与した場合、新生血管に対する影響は検出できなかった（図2J）。高濃度のヘパリン（眼内で約12,500μg/ml）を投与した場合は、より大きな血管新生抑制効果（網膜外新生血管の80.8％減少）が安定して得られた（図2G,L）。内在性のヘパリンは、肥満細胞と好塩基球により産生されるが、これらの細胞は硝子体や網膜にはあまり存在しない。したがって、ヘパリンを特異的に分解し、HSには反応しない糖鎖分解酵素であるヘパリナーゼIを眼内に投与したところ、予測どおりその効果は検出できなかった（図2M）。

一方、眼内のヘパリン・HSの投与や分解による、網膜無血管野の面積（網膜内血管再生を反映する）への影響は少なかった（図2H-M）。高濃度のHS投与により無血管野の面積が13.4％減少したが（図2K）、他の分子の投与は影響を与えなかった。

＜ヘパリン投与により眼内液中のVEGF-A濃度は上昇する＞
ヘパリン結合蛋白であるVEGF-Aは、OIRにおいて網膜外血管新生を制御する主要な血管増殖因子である（参考文献２１、２２、２５）。そのことは、VEGF-Aを中和する可溶性VEGFレセプター１（sVEGFR1）をOIRに投与したところ網膜外新生血管がほとんど消失したこと（98％減少）により確認された（図7）。ヘパリン・HSはVEGF-Aのシグナル伝達に影響を与えることが知られている。したがって、これらの糖鎖による血管新生抑制作用のメカニズムを解明するには、VEGF-Aシグナリングとの関連を明らかにする必要がある。そこで、我々は、OIRモデルとコントロールマウスにおいて、眼内液中のVEGF-A濃度を測定した。80％酸素投与中の8日齢と12日齢のOIRモデルでは、VEGF-A濃度はコントロール眼に比べて低下していた（図3A）。しかし、OIRマウスを大気（21％酸素）に戻して飼育すると、VEGF-A濃度は急激に増加し、14日齢ではコントロール眼に対して、9.7倍の濃度であった。この結果は、OIRにおける網膜内VEGF-A産生量の変化に関する過去の報告とよく合致する（参考文献１９、２１、２２）。次に、ヘパリナーゼIIIあるいはPBSを投与した眼でVEGF-A濃度を測定し、比較したところ、両群でVEGF-A濃度に差はなかった（図3B）。一方、ヘパリン投与眼では、PBS投与眼と比較して、眼内液のVEGF-A濃度は11.3倍であった（図3C）。網膜新生血管が減少しているへパリン投与眼において、強力な血管増殖因子であるVEGF-A濃度が逆説的に上昇していたことは、糖鎖によりVEGF-Aが不活化されていることを示している。

＜ヘパリンと結合したVEGF165はプロテアーゼによる分解を受けにくい＞
次に、ヘパリン投与眼でVEGF-Aが上昇するメカニズムを検討した。マウスVEGF-AのアイソフォームであるVEGF164（ヒトではVEGF165）とVEGF120（ヒトではVEGF121）は網膜血管の発生の過程で発現している（参考文献２６）。VEGF164・VEGF165はヘパリン結合ドメインを有する、最も重要な役割を果たすアイソフォームである（参考文献２２、２７）。そのことは、正常なマウス網膜血管網の形成に、VEGF164の存在は必要十分条件であることからも分かる（参考文献２７）。VEGF164・VEGF165はヘパリン結合ドメインを介して細胞表面のHSと結合し、同じく細胞表面にあるVEGFRに容易に作用する。しかし、このアイソフォームには可溶性の分子も存在する。VEGF120・VEGF121にはヘパリン結合ドメインがないため、可溶性分子としてのみ存在する。まず、眼内のVEGF-Aの動態に対するヘパリンの影響を検討するために、マウスの片眼にヒトVEGF-A（VEGF165かVEGF121）を単独投与し、他眼に同量のVEGF-Aアイソフォームをヘパリンとともに投与した。ヒトVEGF-Aを特異的に検出するELISAを用いて、投与6時間後と48時間後で眼内液中の残存ヒトVEGF-A量を両眼で比較した。投与6時間後で、ヘパリンとVEGF165を同時に投与した眼ではVEGF165を単独投与した他眼に比べて、6.38倍のVEGF-Aが検出された（図3D）。一方VEGF121を投与したマウスでは、両眼でVEGF-A濃度に有意差はなかった。投与48時間後では、すべての条件でVEGF-Aは検出されなかった（図3E）。

プラスミンは眼内に存在するセリン蛋白分解酵素であり（参考文献２８）、VEGF-Aを分解することが知られている（参考文献２６、２９）。次に、我々は、ヘパリンと結合したVEGF-Aのプラスミンによる蛋白分解に対する影響を調べた。ヘパリンは、プラスミンによるVEGF165の分解を抑制したが（図3F）、VEGF121の分解には影響を与えなかった（図3G）。これらの結果は、VEGF165とヘパリンの結合により、VEGF165の分解が抑制されることを示している。

＜高濃度の可溶性ヘパリンは血管内皮細胞の増殖能を低下させる＞
次に、可溶性ヘパリン・HSがVEGF-Aの血管増殖因子としての生理活性を低下させるという仮説の真偽を検討した。培養実験は、網膜表面に広がる血管網とそれに接する眼内液の役割を分析するのに適している。そこで、まず、VEGF-Aを介した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の増殖能刺激に対する眼内液と可溶性のヘパリンの影響を調べた。HUVECを血管内皮用の培地（EG2）に一定量のVEGF-Aと様々な濃度のヘパリンを添加して培養した。その結果、HUVECの増殖能はヘパリン濃度依存性に抑制された（図4A）。次に、PBS、EG2、あるいはブタ眼内液を培地とし、VEGF-Aの存在下と非存在下でHUVECを培養した（図4B）。PBS培地ではHUVECの増殖能は殆ど検出できなかった。一方、ブタ眼内液培地では、HUVECの増殖能は検出されたが、EG2培地に比べて劣っていた。また、この実験では、EG2で培養したHUVECのみがVEGF-A刺激に反応した。さらに、眼内液あるいはEG2を培地に、様々な濃度のVEGF-Aを添加し、HUVECを培養した。すると、EG2培地では、VEGF-A濃度依存性にHUVECの増殖能が増加した（図4B）。一方、眼内液培地では、VEGF-A刺激にHUVECは応答しなかった。これらの結果は、眼内液による抗血管新生作用が、可溶性糖鎖によるVEFG-Aシグナリングの抑制によるとの仮説に矛盾しないものであった。

＜可溶性ヘパリンはVEGF-Aと表面ヘパリンの結合を阻害する＞
これまでの実験結果から、可溶性HS・ヘパリンは、VEGF-Aの機能を阻害することにより、抗血管新生作用を発揮すると考えられた。しかし、細胞表面に存在するHSはVEGF-Aと細胞の結合を促進することが知られている（参考文献３、４）。そこで、眼内の可溶性と細胞膜結合型の糖鎖を区別して、それぞれの役割をさらに検討するために、ヘパリンをウェルの底に共有結合させ（表面ヘパリン）、VEGF-Aと表面ヘパリンの分子結合について解析した。まず、ウェルに結合するVEGF-Aの量は表面ヘパリンの量に依存することが確認された（図5A）。次に、一定量の表面ヘパリンとVEGF-Aに様々な濃度の可溶性ヘパリンを加えると、ウェルに結合したVEGF-Aの量は、可溶性ヘパリンの濃度に対して負の相関を示した（図5B）。可溶性HSやブタ眼内液も、同様にVEGF-Aと表面ヘパリンの結合を抑制した（図5C）。さらに、眼内液とPBSをベースに様々な濃度のVEGF-Aを加えて、表面ヘパリンとVEGF-Aの結合曲線を作成し、比較した。すると、眼内液は、VEGF-Aと表面ヘパリンの結合を抑制し、眼内液の結合曲線は、PBSの結合曲線を右方偏移したものに回帰した（図5D）。このことは、眼内液が、VEGF-Aと表面ヘパリンの結合を競合阻害することを示している。

＜可溶性のHS/ヘパリンはVEGF165とVEGFR2の結合を阻害する＞
VEGF-AレセプターにはVEGFR1とVEGFR2がある。VEGR2は血管内皮細胞の増殖や遊走に中心的な役割を果たす（参考文献３０）。一方、VEGFR1はVEGF-AのVEGFR2に対する作用を間接的に制御すると考えられている（参考文献３０）。VEGFR1とVEGFR2はともにヘパリン結合蛋白である（参考文献３１、３２）。我々は、VEGFR1とVEGFR2をそれぞれウェルにコーティングし、VEGF-A（VEGF165あるいはVEGF121）とレセプターの結合に対する、可溶性のHSや眼内液の作用を調べた。その結果、可溶性HSや眼内液は、ともにVEGF165とVEGFR2の結合を阻害したが（図5E）、VEGF121とVEGFR2の結合には影響しなかった（図5F）。可溶性ヘパリンも、VEGF165とVEGFR2の結合を濃度依存性に阻害したが、VEGF121とVEGFR2の結合に対しては、あまり影響を与えなかった（図5G）。一方、VEGF-AとVEGFR1の結合は可溶性のヘパリン、HS、あるいは眼内液のいずれの影響もほとんど受けなかった（図5H-J）。

＜増殖性糖尿病網膜症患者の前房水中のHS濃度は低下している＞
糖尿病網膜症では、VEGF-Aの過剰産生が病的新生血管の存在に大きく関与している（参考文献１０、３３）。また、糖尿病のマウスあるいはラットでは網膜（参考文献３４）、肝臓（参考文献３５、３６）、腎臓で（参考文献３７、３８）、ヒトでも腎臓（参考文献３９〜４１）や骨格筋（参考文献４２）の毛細血管基底膜でHSプロテオグリカンの発現量が低下しているとの報告がある。その原因として、高血糖によるHS合成の低下が考えられている（参考文献３６、４３〜４５）。

まず、我々は、ヒト前房水中のコア蛋白の組成を調べた（図6A）。マウスの眼内液と同様に、ヒト前房水にはパールカン、コラーゲンXVIII、シンデカン１、シンデカン２、シンデカン３が存在すると推察された。次に、網膜新生血管のある増殖性糖尿病網膜症（PDR）、新生血管のない非増殖性糖尿病網膜症（NPDR）、あるいは白内障（コントロール）を有する患者の前房水中のHS濃度を測定した。PDR群の前房水中のHS濃度は、コントロール群の濃度に比べて低かった（図6B）。一方、NPDR群では、HS濃度の低下はなかった。また、PDR群の患者の平均年齢（40.3歳）は、NPDR群（67.0歳）やコントロール群（69.6歳）に比べて低かった。しかし、PDR群あるいはコントロール群の回帰解析では、年齢とHS濃度に有意な相関はなかった（図6C）。前房水中のVEGF-A濃度は、これまでの報告（参考文献１０、３３）と同様な結果であった。PDR群やNPDR群の中にはコントロール群と比してVEGF-A濃度の上昇している検体もあったが、そうでないものもあった。しかし、群間でVEGF-A濃度に統計的有意差はなかった。

３．考察
本研究では、2次元的に広がる網膜血管網に接して眼内液が存在する特殊な環境において、眼内液中の高濃度の可溶性HSが網膜外血管新生に与える影響について調べた。実験の結果からは、ヘパリン・HS糖鎖が細胞表面結合型か、あるいは可溶性であるかによって、血管新生に対して反対の役割を果たしていることが示唆された。原則的には、高濃度の可溶性の糖鎖は細胞表面のHSとVEGF-Aの結合を競合的に阻害すると考えられる。また、VEGF-AとVEGFR2の結合を直接阻害する作用もある。結果として、VEGFR2を介した血管内皮細胞の増殖や遊走が阻害される。VEGFR1とVEGF-Aの結合に対してヘパリンは影響をあまり与えない。その結果、網膜内のVEGFR1シグナリングが相対的に増加することにより、網膜血管を閉塞機序から保護している可能性もある（参考文献４６）。一方、眼内HS・ヘパリン濃度の操作は、発達の過程および網膜血管の再生における、網膜内血管新生には影響を与えなかった。これらの結果より、可溶性HS・へパリンの抗血管新生作用は、血管の網膜外増殖に特異的であると推察され、眼内液の眼内分布とも矛盾しない。

網膜外新生血管を有するPDR群では前房水中のHS濃度が低下していたが、新生血管のないNPDR群では低下していなかった。しかし、PDR患者はNPDR患者やコントロールに比べて有意に若かった。この結果は、PDR患者はNPDR患者よりも一般的に若いという大規模疫学調査の結果に合致する（参考文献４７、４８）。我々の実験結果では、若い年齢と低いHS濃度の両方が網膜外新生血管の存在と関係していた。したがって、若いPDR患者に見られた低いHS濃度が、不良な血糖コントロールに対する生体応答の結果なのか（参考文献３６、４３〜４５）、年齢制の変化の範疇に属するかは明らかではない。これを解決するためには、若い健常人からの検体の採取が必要になるが、残念ながら、前房水は手術的にのみ採取可能であるため、実行は困難である。

一方、ヒト前房水で測定されたHS糖鎖の濃度はマウスやブタの眼内液（前房水+硝子体液）の濃度と比べて低かった。この理由の一つとして、前房水は常に産生・吸収されるため、HSなどの様々な分子が蓄積しにくいということが挙げられる。このことは、前房水の中の分子の濃度が硝子体と比べると常に低いという報告と合致する（参考文献９、１０）。実際、今回の研究結果には含まれていないが、我々が測定した硝子体と硝子体液の混合した検体のHS濃度は、前房水に比べてはるかに高かった。PDR患者の前房水のHS濃度低下の生理的意義は明らかではないものの、眼内の可溶性HS濃度が低値であることは、少なくとも網膜外新生血管が発生しやすい眼内環境になっていることが予測される。

Ｂ．脈絡膜新生血管の縮小とへパリンによるVEGFとCCL2の量的・質的抑制
１．目的・方法
レーザー誘発脈絡膜新生血管に対するへパリンの効果と作用機序を検討した。方法は以下の通りである。即ち、C57BLマウスに放射線を照射後、GFP陽性骨髄細胞を移植した。骨髄移植したマウスあるいは骨髄移植していないマウス眼底にレーザーを照射し、へパリンあるいはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を眼内に注射した。脈絡膜新生血管（CNV）の大きさ、へパリンの分布、CNV内外に侵入した白血球等の炎症細胞の数を定量した。網膜色素上皮細胞(ARPE19)によるVEGF、CCL2、TNF-αの分泌に対するへパリンの影響を検討した。また、VEGF、CCL2、TNF-αとそれぞれのレセプターとの結合に対するへパリンの作用を調べた。

２．結果
以下で詳しく述べるように、高濃度のへパリン眼内投与はCNVの発生を抑制した。また、へパリンは血管組織やレーザー痕の周囲の視細胞層に局在した。CNVの周りに浸潤した炎症細胞はへパリン投与眼で有意に減少していたが、CNV内外のGFP陽性細胞に差はなかった。ARPE19によるVEGFやCCL2の分泌は、高濃度のへパリン存在下では、低濃度のへパリン存在下に比べて、有意に低下していた。分子間結合実験では、へパリンやブタ硝子体液は、VEGFとVEGFR2との結合やCCL2とCCR2との結合をそれぞれ阻害した。

＜眼内へパリン投与はCNVの発生を抑制する＞
3つの濃度でへパリン（100、1000、10000μg/ml）を眼内投与した。1000と10000μg/mlのへパリンはCNVをそれぞれ48％と53％に縮小させた（図８D,E）。一方、100μg/mlでは効果が検出できなかった（図８C）。

＜眼内投与へパリンはレーザー照射部位の周囲に集積する＞
FITCでラベルしたへパリンを眼内に投与して3時間後にその局在を調べた。FITC-へパリンは網膜表面の血管に局在した（図９A-C）。しかし、FITC-へパリンはレーザー痕周囲の視細胞層により強く集積した。レーザー照射後、12時間後あるいは48時間後に組織を調べたところ同様な分布を示した。

＜へパリン投与眼ではCNV周囲の炎症性細胞が減少する＞
CNV周囲の炎症性細胞をレーザー照射24時間後に定量したところ、へパリン投与眼では、その数が明らかに減少していた（図１０A,B）。次に、それらの細胞の由来を調べる為に、GFP陽性骨髄を移植したマウスを用いて同様な実験を行った。へパリン投与眼とコントロール眼では、GFP陽性細胞の数に差はなかった（図１０C,D）。

＜へパリンは網膜色素上皮細胞によるVEGFやCCL2の分泌を低下させる＞
もっとも低濃度のへパリンを培養網膜色素上皮細胞（ARPE19）に投与したところ、培養上清中の血管増殖因子VEGFの濃度が上昇した（図１１A）。しかし、さらにへパリン濃度を高くすると、逆にVEGFの濃度は低下した。炎症性サイトカインTNF-αの存在下でも、同様な結果が得られた。

次に、同じ実験で、培養上清中の白血球遊走因子CCL2の濃度を測定したところ、CCL2濃度はへパリン投与量に依存して低下していた（図１１B）。しかし、TNF-αの存在下では、CCL2の分泌は約4倍になり、へパリンによるCCL2の分泌抑制効果は減少した。

＜大きい分子量へパリンほど、VEGFと表面へパリンの結合抑制作用が大きい＞
VEGFと表面にコートしたへパリンとの結合、或いはVEGFとVEGFR1やVEGFR2との結合に対する可溶性へパリンの影響を検討した。可溶性へパリンはVEGFと表面へパリンやVEGFR2との結合を濃度依存的に減少させる一方、VEGFとVEGFR1との結合には影響しなかった（図１２A,B）。次に可溶性へパリンの分子量とVEGFと表面へパリンの結合阻害作用について検討したところ、分子量依存的に結合阻害作用が増強した（図１２C）。しかし、分子量6620以上では効果に差がなかった。

＜可溶性へパリンは、CCL2とCCR2の結合を阻害する＞
可溶性へパリンやブタ硝子体液は、CCL2と表面にコートしたへパリンとの結合やCCL2とCCR2との結合を濃度依存的に阻害した（図１２D-E）。一方、可溶性へパリンはTNF-αと表面へパリンとの結合やTNF-αとTNFR1やTNFR2との結合には明らかな影響を及ぼさなかった（図１２F,G）。

３．考察
レーザー誘発CNVマウスモデルを用いて、へパリングルコサミノグリカンによる眼内炎症及び血管新生に対する抑制作用を証明した。十分な濃度のへパリンを眼内投与すると、CNVの発生は抑制された。投与されたへパリンは、網膜血管とレーザー痕周囲の網膜内に強く集積し、CNVに直接作用する可能性を示唆した。

へパリンはCNV周囲の炎症細胞の集積を抑制した。骨髄移植マウスを用いた実験からは、へパリンが集積を抑制する炎症細胞は末梢血由来ではなく、主に眼内局所の炎症細胞であることが推察された。インビトロの実験の結果を合わせると、へパリンはCNV周囲の白血球遊走因子であるCCL2の作用を阻害することにより、あるいは網膜色素上皮細胞によるCCL2の分泌を抑制することによりレーザー周囲の炎症を局所的に抑制すると考えられた。また、へパリンは血管増殖因子であるVEGFの作用を阻害し、網膜色素上皮細胞によるVEGFの分泌を低下させることにより抗血管新生作用も示すことが確認された。結論として、眼内へパリンは、VEGF、CCL2など様々なへパリン結合蛋白の作用を複合的な機序で阻害することが分かった。この結果から、可溶性のグルコサミノグリカンは眼内の炎症疾患や血管新生の治療に応用できると考えられる。

Ｃ．眼内可溶性HSの年齢性変化と増殖性糖尿病網膜症（PDR）の発生
１．目的・方法
眼内液中のHSはマウスにおいて病的網膜血管新生を抑制する。眼内HSの低下が増殖性糖尿病網膜症（PDR）の発生を促進するという仮説を検証した。方法は次の通りである。即ち、増殖性糖尿病網膜症(N = 16)、非増殖性糖尿病網膜症(N = 7)、白内障患者(N = 15)から前房水を収集し、前房水中のHSとVEGFの濃度を測定した（図６）。特発性黄斑症の患者の硝子体も同様に分析した。眼内HS濃度とVEGFの結合能の関係を調べた。

２．結果
図６に示したように、増殖性糖尿病網膜症患者(平均年齢40.3歳)における前房水中のHSは非増殖性糖尿病網膜症患者(平均年齢67.0歳；P = 0.003)や白内障患者(平均年齢69.6歳；P = 0.007)に比べて低値であった。一方、糖尿病のない患者の硝子体中のHS濃度は年齢性に増加した（R2 = 0.327; P = 0.020）。同時に、その濃度は、VEGFと表面にコートしたへパリンの結合阻害効率と正の相関があった（R2 = 0.485; P = 0.037）。

＜HS低濃度と若年齢の相関＞
前房水中と硝子体中の多くの分子には濃度の相関があることが知られている。ブタ前房水と硝子体を用いて分析したところ、これらの検体においてHS濃度は有意な相関があることが分かった(R2 = 0.327, P = 0.009、図１３)。

次に、特発性黄斑円孔あるいは特発性網膜前膜の患者の硝子体を使用して、硝子体中のHS濃度と年齢の相関を調べた。回帰分析を行ったところ、ヒトの年齢と硝子体へHS濃度は有意な相関があることが判明した（図１４A）。一方、年齢とVEGF濃度の間に相関はなかった（図１４B）。

＜HS低濃度とVEGFの表面へパリン結合能の相関＞
へパリンをプレート表面にコートし、硝子体と一緒に高濃度のVEGFを投与してVEGFと表面へパリンの結合を測定した。結合したVEGFの量は、ともに投与した硝子体のHSの濃度と負の相関を示した（R2 = 0.485; P = 0.037、図１４C）。一方、硝子体内在性のVEGFや総グリコサミノグリカン量とVEGFの結合量に関連はなかった（図１４D,E）。

３．考察
増殖性糖尿病網膜症患者における前房水中のHSは非増殖性糖尿病網膜症患者に比べて低値であった（図６）。しかし、増殖性糖尿病網膜症患者は他の2群に比べて有意に若かった（図６）。一方、硝子体中のHS濃度は年齢とともに上昇した。このことより、増殖性糖尿病網膜症患者における、眼内HS濃度の低値は年齢性の要素があると考えられる。

インビトロの実験において、低濃度のHSを有する硝子体では、VEGFと表面へパリンの結合が亢進していた。このことより、VEGFが眼内で過剰に産生された場合、低濃度のHSを有する若年者では、VEGFが容易に網膜表面のHSをへパリン結合ドメインを介して結合すると予測される。同様のメカニズムで、若年者ではVEGFが網膜血管に発現しているVEGFR2と結合しやすいと予測される。

以上より、硝子体中のHS濃度が低い若年者では、糖尿病網膜症による網膜虚血下で過剰に産生されたVEGFがより効率的に網膜血管に作用し、網膜血管の硝子体内迷入を引き起こす可能性がある。VEGFの増殖性糖尿病網膜症の病態における中心的な役割を考慮に入れると、本研究の結果は、若年糖尿病者において糖尿病網膜症が重症化しやすいという現象に科学的根拠を与えるものである。

＜参考文献＞
1. Capila,I., and Linhardt,R.J. 2002. Heparin-protein interactions. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41:391-412.
2. Bishop,J.R., Schuksz,M., and Esko,J.D. 2007. Heparan sulphate proteoglycans fine-tune mammalian physiology. Nature 446:1030-1037.
3. Gitay-Goren,H., Soker,S., Vlodavsky,I., and Neufeld,G. 1992. The binding of vascular endothelial growth factor to its receptors is dependent on cell surface-associated heparin-like molecules. J. Biol. Chem. 267:6093-6098.
4. Bernfield,M., Gotte,M., Park,P.W., Reizes,O., Fitzgerald,M.L., Lincecum,J., and Zako,M. 1999. Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans. Annu. Rev. Biochem. 68:729-777.
5. Kato,M., Wang,H., Kainulainen,V., Fitzgerald,M.L., Ledbetter,S., Ornitz,D.M., and Bernfield,M. 1998. Physiological degradation converts the soluble syndecan-1 ectodomain from an inhibitor to a potent activator of FGF-2. Nat. Med. 4:691-697.
6. Nikolova,V., Koo,C.Y., Ibrahim,S.A., Wang,Z., Spillmann,D., Dreier,R., Kelsch,R., Fischgrabe,J., Smollich,M., Rossi,L.H. et al 2009. Differential roles for membrane-bound and soluble syndecan-1 (CD138) in breast cancer progression. Carcinogenesis 30:397-407.
7. Su,G., Blaine,S.A., Qiao,D., and Friedl,A. 2007. Shedding of syndecan-1 by stromal fibroblasts stimulates human breast cancer cell proliferation via FGF2 activation. J. Biol. Chem. 282:14906-14915.
8. Cohen,T., Gitay-Goren,H., Sharon,R., Shibuya,M., Halaban,R., Levi,B.Z., and Neufeld,G. 1995. VEGF121, a vascular endothelial growth factor (VEGF) isoform lacking heparin binding ability, requires cell-surface heparan sulfates for efficient binding to the VEGF receptors of human melanoma cells. J. Biol. Chem. 270:11322-11326.
9. Funatsu,H., Yamashita,H., Noma,H., Mimura,T., Nakamura,S., Sakata,K., and Hori,S. 2005. Aqueous humor levels of cytokines are related to vitreous levels and progression of diabetic retinopathy in diabetic patients. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 243:3-8.
10. Aiello,L.P., Avery,R.L., Arrigg,P.G., Keyt,B.A., Jampel,H.D., Shah,S.T., Pasquale,L.R., Thieme,H., Iwamoto,M.A., Park,J.E. et al 1994. Vascular endothelial growth factor in ocular fluid of patients with diabetic retinopathy and other retinal disorders. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487.
11. Fannon,M., Forsten-Williams,K., Dowd,C.J., Freedman,D.A., Folkman,J., and Nugent,M.A. 2003. Binding inhibition of angiogenic factors by heparan sulfate proteoglycans in aqueous humor: potential mechanism for maintenance of an avascular environment. FASEB J. 17:902-904.
12. David,G., Bai,X.M., Van der,S.B., Cassiman,J.J., and Van den,B.H. 1992. Developmental changes in heparan sulfate expression: in situ detection with mAbs. J. Cell Biol. 119:961-975.
13. Halfter,W., Dong,S., Schurer,B., Osanger,A., Schneider,W., Ruegg,M., and Cole,G.J. 2000. Composition, synthesis, and assembly of the embryonic chick retinal basal lamina. Dev. Biol. 220:111-128.
14. Tumova,S., Woods,A., and Couchman,J.R. 2000. Heparan sulfate chains from glypican and syndecans bind the Hep II domain of fibronectin similarly despite minor structural differences. J. Biol. Chem. 275:9410-9417.
15. Qiao,D., Meyer,K., Mundhenke,C., Drew,S.A., and Friedl,A. 2003. Heparan sulfate proteoglycans as regulators of fibroblast growth factor-2 signaling in brain endothelial cells. Specific role for glypican-1 in glioma angiogenesis. J. Biol. Chem. 278:16045-16053.
16. Inatani,M., Honjo,M., Oohira,A., Kido,N., Otori,Y., Tano,Y., Honda,Y., and Tanihara,H. 2002. Spatiotemporal expression patterns of N-syndecan, a transmembrane heparan sulfate proteoglycan, in developing retina. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 43:1616-1621.
17. Koga,T., Inatani,M., Hirata,A., Inomata,Y., Oohira,A., Gotoh,T., Mori,M., and Tanihara,H. 2003. Expression of glycosaminoglycans during development of the rat retina. Curr. Eye Res. 27:75-83.
18. Inatani,M., and Tanihara,H. 2002. Proteoglycans in retina. Prog. Retin. Eye Res. 21:429-447.
19. Alon,T., Hemo,I., Itin,A., Pe'er,J., Stone,J., and Keshet,E. 1995. Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity. Nat. Med. 1:1024-1028.
20. Brooks,S.E., Gu,X., Samuel,S., Marcus,D.M., Bartoli,M., Huang,P.L., and Caldwell,R.B. 2001. Reduced severity of oxygen-induced retinopathy in eNOS-deficient mice. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 42:222-228.
21. Pierce,E.A., Avery,R.L., Foley,E.D., Aiello,L.P., and Smith,L.E. 1995. Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor expression in a mouse model of retinal neovascularization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92:905-909.
22. Ishida,S., Usui,T., Yamashiro,K., Kaji,Y., Amano,S., Ogura,Y., Hida,T., Oguchi,Y., Ambati,J., Miller,J.W. et al 2003. VEGF164-mediated inflammation is required for pathological, but not physiological, ischemia-induced retinal neovascularization. J Exp. Med. 198:483-489.
23. Smith,L.E., Wesolowski,E., McLellan,A., Kostyk,S.K., D'Amato,R., Sullivan,R., and D'Amore,P.A. 1994. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 35:101-111.
24. Kjellen,L., and Lindahl,U. 1991. Proteoglycans: structures and interactions. Annu. Rev. Biochem. 60:443-475.
25. Ozaki,H., Seo,M.S., Ozaki,K., Yamada,H., Yamada,E., Okamoto,N., Hofmann,F., Wood,J.M., and Campochiaro,P.A. 2000. Blockade of vascular endothelial cell growth factor receptor signaling is sufficient to completely prevent retinal neovascularization. Am J Pathol. 156:697-707.
26. Houck,K.A., Leung,D.W., Rowland,A.M., Winer,J., and Ferrara,N. 1992. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J. Biol. Chem. 267:26031-26037.
27. Stalmans,I., Ng,Y.S., Rohan,R., Fruttiger,M., Bouche,A., Yuce,A., Fujisawa,H., Hermans,B., Shani,M., Jansen,S. et al 2002. Arteriolar and venular patterning in retinas of mice selectively expressing VEGF isoforms. J Clin. Invest 109:327-336.
28. Vaughan-Thomas,A., Gilbert,S.J., and Duance,V.C. 2000. Elevated levels of proteolytic enzymes in the aging human vitreous. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 41:3299-3304.
29. Keyt,B.A., Berleau,L.T., Nguyen,H.V., Chen,H., Heinsohn,H., Vandlen,R., and Ferrara,N. 1996. The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J. Biol. Chem. 271:7788-7795.
30. Ferrara,N., Gerber,H.P., and LeCouter,J. 2003. The biology of VEGF and its receptors. Nat. Med. 9:669-676.
31. Dougher,A.M., Wasserstrom,H., Torley,L., Shridaran,L., Westdock,P., Hileman,R.E., Fromm,J.R., Anderberg,R., Lyman,S., Linhardt,R.J. et al 1997. Identification of a heparin binding peptide on the extracellular domain of the KDR VEGF receptor. Growth Factors 14:257-268.
32. Park,M., and Lee,S.T. 1999. The fourth immunoglobulin-like loop in the extracellular domain of FLT-1, a VEGF receptor, includes a major heparin-binding site. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264:730-734.
33. Funatsu,H., Yamashita,H., Noma,H., Mimura,T., Yamashita,T., and Hori,S. 2002. Increased levels of vascular endothelial growth factor and interleukin-6 in the aqueous humor of diabetics with macular edema. Am. J. Ophthalmol. 133:70-77.
34. Bollineni,J.S., Alluru,I., and Reddi,A.S. 1997. Heparan sulfate proteoglycan synthesis and its expression are decreased in the retina of diabetic rats. Curr. Eye Res. 16:127-130.
35. Kjellen,L., Bielefeld,D., and Hook,M. 1983. Reduced sulfation of liver heparan sulfate in experimentally diabetic rats. Diabetes 32:337-342.
36. Ebara,T., Conde,K., Kako,Y., Liu,Y., Xu,Y., Ramakrishnan,R., Goldberg,I.J., and Shachter,N.S. 2000. Delayed catabolism of apoB-48 lipoproteins due to decreased heparan sulfate proteoglycan production in diabetic mice. J. Clin. Invest 105:1807-1818.
37. Kanwar,Y.S., Linker,A., and Farquhar,M.G. 1980. Increased permeability of the glomerular basement membrane to ferritin after removal of glycosaminoglycans (heparan sulfate) by enzyme digestion. J. Cell Biol. 86:688-693.
38. Kanwar,Y.S., Rosenzweig,L.J., Linker,A., and Jakubowski,M.L. 1983. Decreased de novo synthesis of glomerular proteoglycans in diabetes: biochemical and autoradiographic evidence. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 80:2272-2275.
39. Parthasarathy,N., and Spiro,R.G. 1982. Effect of diabetes on the glycosaminoglycan component of the human glomerular basement membrane. Diabetes 31:738-741.
40. Shimomura,H., and Spiro,R.G. 1987. Studies on macromolecular components of human glomerular basement membrane and alterations in diabetes. Decreased levels of heparan sulfate proteoglycan and laminin. Diabetes 36:374-381.
41. Raats,C.J., Van Den,B.J., and Berden,J.H. 2000. Glomerular heparan sulfate alterations: mechanisms and relevance for proteinuria. Kidney Int. 57:385-400.
42. Yokoyama,H., Hoyer,P.E., Hansen,P.M., Van Den,B.J., Jensen,T., Berden,J.H., Deckert,T., and Garbarsch,C. 1997. Immunohistochemical quantification of heparan sulfate proteoglycan and collagen IV in skeletal muscle capillary basement membranes of patients with diabetic nephropathy. Diabetes 46:1875-1880.
43. van Det,N.F., Van Den,B.J., Tamsma,J.T., Verhagen,N.A., Berden,J.H., Bruijn,J.A., Daha,M.R., and van der Woude,F.J. 1996. Effects of high glucose on the production of heparan sulfate proteoglycan by mesangial and epithelial cells. Kidney Int. 49:1079-1089.
44. Gharagozlian,S., Borrebaek,J., Henriksen,T., Omsland,T.K., Shegarfi,H., and Kolset,S.O. 2006. Effect of hyperglycemic condition on proteoglycan secretion in cultured human endothelial cells. Eur. J. Nutr. 45:369-375.
45. Vogl-Willis, C.A., and Edwards,I.J. 2004. High-glucose-induced structural changes in the heparan sulfate proteoglycan, perlecan, of cultured human aortic endothelial cells. Biochim. Biophys. Acta 1672:36-45.
46. Shih,S.C., Ju,M., Liu,N., and Smith,L.E. 2003. Selective stimulation of VEGFR-1 prevents oxygen-induced retinal vascular degeneration in retinopathy of prematurity. J Clin. Invest 112:50-57.
47. Klein,R., Klein,B.E., Moss,S.E., Davis,M.D., and DeMets,D.L. 1984. The Wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. II. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years. Arch. Ophthalmol. 102:520-526.
48. Klein,R., Klein,B.E., Moss,S.E., Davis,M.D., and DeMets,D.L. 1984. The Wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. III. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is 30 or more years. Arch. Ophthalmol. 102:527-532.
49. Kaneko,H., Nishiguchi,K.M., Nakamura,M., Kachi,S., and Terasaki,H. 2008. Characteristics of bone marrow-derived microglia in the normal and injured retina. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 49:4162-4168.

本発明の薬剤によればヘパリン結合性蛋白の生理活性を阻害できる。この特徴を活かし、本発明は、例えば、血管新生阻害剤として利用される。具体的な適用例として、血管新生を伴う眼疾患である増殖性糖尿病網膜症、未熟児網膜症、滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性（新生血管黄斑症）、特発性脈絡膜新生血管症、増殖性硝子体網膜症、ぶどう膜炎、眼虚血症候群、網膜静脈閉塞症、虹彩新生血管症又は角膜血管新生の予防・治療が想定される。本発明の薬剤は、既存の抗血管増殖因子薬（例えば抗VEGF薬）に代わる医薬としての利用価値も有する。特に、血管閉塞疾患のリスクを高めるために抗VEGF薬を使用が適さない場合など、既存の抗血管増殖因子薬が使用し難い状況下において代替医療を提供することが期待される。また、治療効果の増強を図るために抗血管増殖因子薬と併用されることも想定される。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (15)

1. 硫酸化糖鎖を含む、ヘパリン結合性蛋白に対する生理活性阻害剤。
2. 硫酸化糖鎖が硫酸化グリコサミノグリカンである、請求項１に記載の生理活性阻害剤。
3. 硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケタラン硫酸及びこれらのいずれかの分解産物又は修飾体、からなる群より選択される一又は二以上の化合物である、請求項２に記載の生理活性阻害剤。
4. ヘパリン結合性蛋白が成長因子、炎症因子、脂質代謝関連因子又は細胞接着因子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生理活性阻害剤。
5. 成長因子が、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、上皮増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子ファミリー蛋白（FGF）、ミッドカイン、肝細胞増殖因子（HGF）及びベータ型変異増殖因子（TGF-β）からなる群より選択される因子であり、炎症因子が、腫瘍壊死因子α（TNF‐α）、ストロマ細胞由来因子1(SDF-1)、血小板やT細胞由来の好酸球走化性物質（RANTES）及び単球走化活性因子（MCP-1)を含めたケモカインファミリー蛋白からなる群より選択される因子であり、脂質代謝関連因子が、アネキシンV(Anexin V)、アポリポ蛋白E（APOE）からなる群より選択される因子であり、細胞接着因子が、Lセレクチン（L-selectin）及びPセレクチン(P-selectin)からなる群より選択される因子である、請求項４に記載の生理活性阻害剤。
6. 成長因子が血管新生誘導性の因子である、請求項４に記載の生理活性阻害剤。
7. 血管新生誘導性の因子が、血管内皮細胞増殖因子又は線維芽細胞増殖因子である、請求項６に記載の生理活性阻害剤。
8. 抗血管新生剤である、請求項６又は７に記載の生理活性阻害剤。
9. 増殖性糖尿病網膜症、未熟児網膜症、滲出型加齢黄斑変性、近視性黄斑変性、特発性脈絡膜新生血管症、眼虚血症候群、網膜静脈閉塞症、虹彩新生血管症、角膜血管新生、ぶどう膜炎、増殖性硝子体網膜症又は黄斑浮腫の予防又は治療に用いられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生理活性阻害剤。
10. 血管閉塞疾患の患者又は血管閉塞疾患の罹患リスクが高い者に対して投与される、請求項９に記載の生理活性阻害剤。
11. 抗VEGF剤を組み合わせてなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の生理活性阻害剤。
12. 硫酸化糖鎖と抗VEGF剤とを含有する配合剤である、請求項１１に記載の生理活性阻害剤。
13. 硫酸化糖鎖を含有する第１構成要素と、抗VEGF剤を含有する第２構成要素とからなるキットである、請求項１１に記載の生理活性阻害剤。
14. 硫酸化糖鎖を含有し、投与時に抗VEGF剤が併用投与される、請求項１１に記載の生理活性阻害剤。
15. ヘパリン結合性蛋白の異常な発現レベルの上昇及び／又は異常な作用亢進に起因する疾病を罹患する患者又は罹患するおそれのある患者に対して、治療上有効量の硫酸化糖鎖を投与するステップを含む、前記疾病の予防・治療法。

Images