CN1586620A - 聚明胶肽注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种聚明胶肽注射液制备方法，该方法包括：a.明胶水解：将明胶用纯水溶解，然后40～90℃用稀酸溶液水解；b.交联并氧化：调pH为8.0～10.0，大致在室温条件下加自选自乙二醛、丁二酸酐、戊二醛或其它缩合剂的缩合剂反应，氧化；c.使用乙醇进行沉淀而纯化分离；d.配制注射液；e.灭菌。还可灯检、包装。该方法技术先进、稳定，可控性好，水解易于控制，提高交联度，小分子交联物与大分子交联物得到较彻底的分离，终所得产物重均分子量在29500－39500道尔顿，最大分子量不超过20万，制备的聚明胶肽注射液符合国家药品标准，经临床使用结果表明，该产品安全、有效。

Description

聚明胶肽注射液及其制备方法

技术领域

本发明涉及聚明胶肽的处理，具体涉及一种以药用明胶为原料生产血浆代用品聚明胶肽注射液及其制备方法。

背景技术

聚明胶肽注射液作为血浆代用品，已经在国内生产和上市多年，该产品广泛应用于各种原因引起的失血、中毒休克等症；具有迅速补充血容量、维持血压的作用。但目前该产品所用的原料存在不同的制备方法，如公开号为CN1387912A的“聚明胶肽注射液制备方法”发明专利申请，该申请公开了以下技术方法1、溶胶：用注射用热水潮早牛骨、猪骨或其他明胶；2、热降解：调牛骨、猪骨或其他明胶水溶液PH值在5.0～6.0之间，升温至110℃～125℃，维持这一温度，测量相对粘度，至相对粘度达到2.0～2.5时，停止加热，快速冷却至30--37℃；3、交联：降解液调PH值至6.5～7.5，维持温度25～35℃，加入明胶蛋白含量为0.7～1.2％的交联剂，觉袢交联1～3小时；4、加入电解质：调PH值7.4～7.6，加入氯化钠、氯化钾和氯化钙电解质，使电解质完全溶解；5、吸附澄清：加入活化后的0.1～1.0％硅藻土，助口入边搅拌，升温至115℃并保温，密封应应釜，降温冷却至35℃，静置；6、将上述静置后的液体用无菌虹吸转到无菌容器中，加入活化的0.1～1.0％硅藻土与活性炭，检测并调PH7.0～7.6，搅拌吸附，然后经4级过滤，分装；7、灭菌。该制备方法存在制备技术落后、可控性差，产品质量不稳定，存在一定的安全隐患，主要缺点在于：1、水解技术主要采用加热水解，需要较高的温度，生产成本较高，同时，因为条件激烈，产生氨基酸、小分子肽等小分子产物较多，增加了交联难度；2、所采用的普通交联技术，交联度低，交联后的小分子多肽极其不稳定，除不能保证为球状结构外，只能在一定程度上控制分子量的大小，但却不能保证其在人体内存留的时间，致使产品临床扩容效果较差，难以保证临床疗效和临床使用的安全性；3、部分交联物的最大分子量超过40万道尔顿，产品大分子物质过多而对人体会造成致敏反应，而且，带负电荷基团不多，在临床使用中易与血管壁粘着或沉积，易引起寒战等不良反应现象的发生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种聚明胶肽注射液及其制备方法，该方法技术先进、稳定，可控性好，应用该方法制备的原料制备的聚明胶肽注射液完全符合国家药品标准，对人体无致敏反应，如无寒战等不良反应，能够延长在血液中存留时间，增加胶体渗透压，维持有效血容量，从而在临床上达到稳定和提升血压的功效，经临床使用结果表明，该产品安全、有效。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明的主要构思是：采用温和的条件水解，使水解易于控制，使水解产生的氨基酸、小分子肽等减少，因而易于交联；改善交联方法，提高交联度；增加交联产物氧化过程，使最终所得的交联产物大分子量不超过20万；增加纯化分离步骤，使小分子交联物与大分子交联物得到较彻底的分离，从而得到重均分子量在29500-39500之间的类似于白蛋白的稳定的球状交联物，所制得的聚明胶肽注射液完全符合国家药品标准，对人体无致敏反应，能够延长在血液中存留时间，增加胶体渗透压，维持有效血容量，从而在临床上达到稳定和提升血压的功效，安全、有效。

本发明提出了一种聚明胶肽注射液制备方法，该方法包括以下步骤：

1、明胶水解：将明胶用纯水溶解，然后40～90℃用稀酸溶液水解；

2、交联并氧化：调pH为8.0～10.0，大致在室温条件下加自选自乙二醛、丁二酸酐、戊二醛或其它缩合剂的缩合剂，反应，然后将所得产物氧化；

3、纯化分离：用乙醇析出沉淀，所得沉淀即为交联的聚明胶肽；

4、配制溶液：将所得固体物质用注射用水溶解，加入等渗物质，调节溶液pH，吸附澄清，得到注射液；

5、灭菌。

还可以包括6、灯检、包装。

更具体说，本发明的方法包括下述步骤：

1、用纯化水将药用明胶溶解，然后在40～90℃用稀酸溶液，优选3-5重量％的稀酸溶液，如盐酸、硫酸或其他无机酸水解，控制水解时间，使水解所得肽链的重均分子量达到10000～15000道尔顿；

2、将上述所得明胶水解产物加入甲酸溶液，使溶液pH为8.0～10.0，在温度10℃～30℃和pH为8.0～10.0条件下，加入缩合剂，如乙二醛、丁二酸酐、戊二醛或其它缩合剂，优选缩合剂的体积占液体总体积的0.5％～2.5％，连续反应，优选2～8小时，氧化所用氧化剂优选过氧化氢，优选其体积占水解溶液体积的2％～5％，氧化反应时间优选3～4小时；

3、将上述液体浓缩至原体积1/4～1/5，加热至100～110℃保温，保温时间优选0.5～2.0小时；

4、冷却至室温，加入乙醇使所得混合溶液中乙醇体积占70～90％，搅拌均匀，静置，回收乙醇，将沉淀真空干燥，还可以粉碎；

5、将上述所得固体药物使用注射用水溶解，配成10％浓度的溶液，用氢氧化钠溶液调节pH值为7.5～8.0，加活性炭搅拌均匀，在70～80℃保温，优选0.5～1.0小时，0.45μm膜过滤，将滤液和注射用水按1∶1体积比混合，加入氯化钾、氯化钙、氯化钠，使溶液中k⁺、ca²⁺、Na⁺浓度达到本品国家药品标准的要求，即k⁺、ca²⁺、Na⁺浓度分别为2.0～4.0μmol/mL、0.2～2.0μmol/mL、139～152μmol/mL，加活性炭搅拌均匀，在70～80℃保温，0.22μm膜过滤，灌装；

6、灭菌，如水浴灭菌、流通蒸气灭菌、热压灭菌或其它灭菌方法；

7、灯检、包装。

上述方法生产包装的聚明胶肽注射液的规格可以是：注射液溶液以毫升为单位，其中聚明胶肽以含氮量计为125ml药液：0.8g氮，即其分装规格可以为每支250ml药液：1.6氮g、500ml药液：3.2g氮。

步骤1，使用稀酸水解技术可使明胶多肽链在温和条件下发生断裂，断裂的多肽链分子量其重均分子量在10000～15000道尔顿之间，从而避免热压水解工艺中，因条件剧烈工艺不稳定，使得氨基酸、小分子肽等小分子产物较多而增加了交联难度；

步骤2，采用适量的乙二醛、适合的PH值、适宜的温度及浓度，让小分子肽链连接成空间球状结构。技术检测结果显示，该技术所获得的产品游离氨基为0.53～0.63，而同类产品游离氨基为0.7～0.8，该技术的使用避免了同类产品因交联不完全而导致在临床应用上扩容效果差的缺点，保证了临床疗效稳定、效果好。将缩合物放入一定浓度的双氧水溶液中，使缩合物中不稳定的结构得到破坏，从而控制缩合物的最大分子量不超过20万道尔顿，增加了产品的稳定性，该氧化技术的应用，避免了同类产品中小分子多肽等大分子物质过多而引起人体致敏反应，如打寒战；应用该氧化技术的同时，能使部分基团氧化成羧基，使本产品冻凝点降低，稳定性得到提高，并使带负电荷基团增多，在临床使用中使其不易与血管壁粘着或沉积；

步骤4所用纯化技术，即使用乙醇分离技术，能够使小分子交联物与大分子交联物得到较彻底的分离，从而得到重均分子量在29500-39500之间的类似于白蛋白的稳定的球状交联物。该产品分子结构模仿人体血浆中白蛋白的球状构造，使其在临床应用中能够延长在血液中存留时间，增加胶体渗透压，维持有效血容量，从而在临床上达到稳定和提升血压的功效。

测量大分子物质的重均分子量方法是已知技术，现有技术中有关此方面的内容有大量描述，本申请中不再一一列举。本发明中测量明胶水解产物或水解产物的交联产物重均分子量的方法，优选采用根据中国药典2000年版二部附录V H记载的照多糖的分子量与分子量分布测定法进行测定。具体而言，①用凝胶色谱柱(TSK-G3000PWXL7.8mm×300mm)，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾7.0g，二水合磷酸氢二钠16.2g，叠氮化钠0.8g，加水4000ml溶解，混匀)为流动相，流速为每分钟0.5ml，柱温35℃，示差折光监测器；②称取5个已知分子量的右旋糖苷分子量对照品(分子量分别为7100、10000、21400、41100和84400)适量，分别用流动相溶解制成每1ml溶液中约含10mg溶质的溶液，吸取上述各对照品溶液20μl，依次分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以不同分子量的对照品与其相应的保留时间计算回归方程；③取待测样品，测定同步骤②，记录分子量分布曲线，再计算待测样品的重均分子量。

本发明还提供了通过上述方法制备的聚明胶肽注射液。

其中，药液明胶为动物的皮、骨、腱与韧带中含有的胶原经部分水解后得到的一种制品，如猪或牛骨明胶，可以从医药商店购买，规格符合国家医药标准，具体如下：

【性状】药液明胶为淡黄色至黄色、半透明、微带光泽的粉粒或薄片；无臭；潮湿后，易为细菌分解；在水中久浸即吸水膨胀并软化，重量可增加5～10倍。药液明胶在热水、醋酸或甘油与水的热混合液中溶解，在乙醇、氯仿或乙醚中不溶。

【鉴别】(1)取药液明胶约0.5g，加水50ml，加热使溶解后，取溶液5ml，加重铬酸钾试液4份与稀盐酸1份的混合液数滴，即生成橘黄色絮状沉淀。(2)取鉴别(1)项下剩余的溶液，加水100ml，摇匀后，加鞣酸试液数滴，即发生浑浊。(3)取本品，加钠石灰后，加热，即发生氨臭。

【检查】酸度  取药液明胶1.0g，加入100ml热水中，充分振摇使溶解，放冷至35℃，依法测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，pH值应为3.6～7.6。

透明度  取药液明胶5.0g，加水90ml使膨胀后，在65～70℃水浴中加热溶解，取出，加水使成100ml，分取5ml，置25ml纳氏比色管中，立即与同体积的对照液(精密量取标准氯化钠溶液30ml，置50ml量瓶中，加硝酸与硝酸银试液各1ml，用水稀释至刻度，在暗处放置5分钟，必要时可用焦糖溶液调色)比较，不得更浑浊。

亚硫酸盐  取药液明胶20g，置长颈圆底烧瓶中，加水50ml，放置使膨胀后，加稀硫酸50ml，即时连接冷凝管，用水蒸气蒸馏，馏液导入过氧化氢试液(对甲基红-亚甲蓝混合指示液显中性)20ml中，至馏出液达80ml，停止蒸馏，馏出液中加甲基红-亚甲蓝混合指示液数滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液显草绿色，并将滴定的结果用空白试验校正，消耗氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)不得过1.0ml。

干燥失重  取药液明胶约1g，置经105℃干燥至恒重的不锈钢或铝制器皿(直径约75mm)中，精密称定，加水10ml，放置，使膨胀后，置水浴上加热溶解，蒸干，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过16.0％(中国药典2000年版二部附录附录VIII L)。

灰分  取药液明胶1.0g，置炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化时，逐渐升高温度至600～700℃，使完全灰化并恒重，遗留灰分不得过2.0％。

重金属  取灰分项下遗留的残渣，加盐酸2ml与硝酸0.5ml，置水浴上蒸干，加水5ml，再蒸干，加醋酸盐缓冲液(pH3.5)5ml与水20ml，温热数分钟，加水适量使成50ml。分取20ml，加水5ml，依法检查(中国药典2000年版二部附录VII H第一法)，含重金属不得过百万分之五十。

砷盐  取药用明胶1.0g，加淀粉0.5g与氢氧化钙1.0g，加水少量，搅拌均匀，干燥后，先用小火炽灼使炭化，再在500～600℃炽灼成灰白色，放冷，加盐酸8ml与水20ml溶解后，依法检查(中国药典2000年版二部附录VIII J第一法)，应符合规定(0.0002％)。

凝冻浓度  取药用明胶1.10g，置称定重量的锥形瓶中，加水80ml，在15～18℃放置2小时，使完全膨胀后，置60℃水浴中加热溶解，取出，称重，加水适量使内容物成100g，置内径13mm的试管中，在0℃冰浴中冷冻6小时，取出，倒置10秒钟，应不流下。

使用本发明方法生产的聚明胶肽注射液通过了黑龙江省药品检验所的检测，依据国家药品标准WS₁-XG-011-2002检验结果如下：

编号	PH	钾μmol/mL	钠μmol/mL	钙μmol/mL	氯μmol/mL	游离氨基	重均分子量(道尔顿)	重金属	装量	澄明度	不溶性微粒	热源	过敏实验	含量测定(标示量)
															1	7.01	3.2	141	1.2	120	0.60	31246	合格	合格	合格	合格	合格	合格	99.86％
2	7.05	3.5	145	1.8	126	0.58	32086	合格	合格	合格	合格	合格	合格	100.04％
															3	7.06	3.0	149	0.8	118	0.58	31879	合格	合格	合格	合格	合格	合格	100.28％

与现有技术相比，本发明方法技术确定，容易控制，其优点具体如下：

对比项目	技术先进性	水解条件	结构改造	最大分子量
					现有技术	落后	剧烈，产生小分子多肽多，交联困难	交联：分子量集中28000左右，游离氨基0.7～0.85，结构改造不完全	大于40万道尔顿，安全性差
本发明	先进	温和，产生小分子多肽少，缩合容易	聚合：分子量集中29500～39500之间，游离氨基0.53～0.63，结构改造完全	小于20万道尔顿，安全性好

通过本发明方法获得的聚明胶肽注射液，重均分子量为29500～39500，游离氨基为0.50～0.65，含氨量3.2g/500ml，其扩容效果与人体白蛋白相当，其胶体渗透压、粘滞度、PH值及电解质均与人体血浆相似，其分子空间结构与人体白蛋白的球形分子结构相似，因此使用本发明方法所得的聚明胶肽注射液在所有的血浆代用品中，具有较好的血液相容性。另外该聚明胶肽注射液还能明显改善微循环和促进组织灌流的效果，扩容效果好，可迅速提高血容量，升高血压，对凝血机制几乎没有影响，无网状内皮系统蓄积，安全性优于其它血浆代用品。

动物试验结果表明，聚明胶肽注射液能够影响血液流变学多项指标，其中对ηb(全血粘度)、ηp(血浆粘度)、HCT(红细胞压积)有较明显的降低，在注射后半小时起效，可持续8小时以上。

在聚明胶肽注射液治疗创伤低血容量性休克的临床试验中，89例患者中抢救成功88例，成功率为98.9％，其中84例(94.4％)于治疗30分钟内恢复血压，4例(4.5％)治疗30～60分钟血压恢复正常，1例因胸主动脉破裂失血而死亡。在治疗闭塞性动脉硬化症64例的临床试验中，总有效率为95.3％。在治疗急性等容血液稀释对脑肿瘤患者肺循环影响的临床试验中，结果表明，与血液稀释前比较，肺循环阻力降低37.7，右室每搏功指数升高18.7％。

一、本发明方法所得聚明胶肽注射液毒理学研究资料

1材料和方法

1.1材料

聚明胶肽注射液由哈尔滨圣泰制药有限公司提供；纯种大耳白家兔、LACA小鼠和Wistar大鼠均由中国人民解放军军事医学科学院提供。

1.2方法

1.2.1急性发热反应  取家兔40只，雄性，随机分成4组，每组10只。实验前测试正常体温3次，隔15min测体温1次，波动不超过0.3℃者供实验用。将实验用家兔按表1的分组剂量经耳缘静脉注射给药。给药后各组家兔分别于3min、5min、10min、20min、30min测肛温1次，并记录。

1.2.2小鼠急性毒性实验  LACA小鼠24只，雌雄各半，体质量18～22g，随机分为4组，每组6只；生理盐水组(NS)及聚明胶肽注射液8ml/kg、10ml/kg、12ml/kg组(低、中、高剂量组)。一次性尾静脉缓慢注射给药，对照组给予同等体积的NS。给药后观察小鼠的活动情况。1天后解剖小鼠进行肉眼观察，取心、肝、脾、肺、肾及胃进行病理学检查。

1.2.3大鼠亚急性毒性实验：Wistar大鼠80只，雌雄各半，体质量为160～180g，随机分为4组：聚明胶肽注射液8ml/kg、10ml/kg、12ml/kg，对照组给予NS(10ml/kg)，尾静脉注射给药，1次/d，连用90d。各组大鼠每14d称体质量1次，观察体质量的变化，据此调整给药剂量，同时对大鼠的饮食量、毛发、行为活动和粪便等进行观察。90d后检查血液生化学各项指标。

2结果

2.1急性发热反应实验结果：家兔耳缘静脉注射给药后各组动物各时点肛温变化见表1。

        表1  聚明胶肽注射液对家兔体温的影响

            W剂量/      t正常/                         t_{注射后升高}/( x±s)℃

组别

            (ml/kg^-1)  ( x±s)℃      0.5h          1h            2h            3h            4h

生理盐水组  10mL/kg     39.28±0.23    0.11±0.04    0.28±0.12    0.22±0.17    0.06±0.01    0.05±0.02

低剂量组    8mL/kg      39.07±0.23    0.14±0.09    0.08±0.02    0.04±0.02    0.15±0.11    0.10±0.02

中剂量组    10mL/kg     39.15±0.23    0.21±0.18    0.11±0.04    0.21±0.46    0.18±0.09    0.13±0.04

高剂量组    12mL/kg     39.10±0.40    0.05±0.02    0.22±0.02    0.25±0.17    0.12±0.05    0.22±0.17

与生理盐水组比较注射后各时间点家兔体温变化P＞0.05。

2.2小鼠急性毒性实验结果：给药后小鼠活动及饮食如常。全部小鼠无一死亡，亦无惊厥、四肢瘫痪、步伐不稳、竖毛、呼吸抑制等中毒症状。病理学检查上述各脏器未见有意义改变。

2.3大鼠亚急性毒性实验结果

血液及生化指标  结果见表2。聚明胶肽注射液各组与对照组相比，肝功能、肾功能、总胆固醇、红细胞计数、白细胞计数等均无显著差异(p＞0.05)。

表2  聚明胶肽注射液(90d)大鼠血液生化指标结果(n＝14， x±s)

                                      聚明胶肽注射液   聚明胶肽注射液    聚明胶肽注射液

检测项              对照组

                                      (小)             (中)              (大)

红细胞(×10¹²/L)   9.21±1.19        9.35±1.10       8.23±1.07        10.2±1.59

白细胞(×10⁹/L)    10.48±1.57       12.40±3.00      14.51±5.26       14.30±3.46

血小板(×10⁹/L)    465.10±117.30    464.5±31.4      558.1±22.30      480.3±56.50

血红蛋白(g/L)       132.5±13.90      150.6±4.10      132.5±13.90      135.0±8.00

胆固醇(nmol/L)      1.93±0.24        1.42±0.27       1.58±0.23        1.50±0.23

总蛋白(g/L)         66.2±3.90        70.8±5.40       69.4±4.70        70.0±5.70

白蛋白(g/L)         33.30±1.40       45.10±2.60      42.00±5.20       39.20±3.20

球蛋白(g/L)         27.80±1.50       25.7±5.50       27.40±5.20       30.5±7.30

丙转氨酶(μ/L)      0.35±0.04        0.29±0.04       0.36±0.09        0.33±0.07

尿素氨(mmol/L)      4.44±0.67        4.32±0.86       5.57±1.21        5.19±1.11

肌酐(μmol/L)       125.53±8.84      134.37±18.56    118.45±46.00     136.14±21.22

3结论

3.1聚明胶肽注射液使用后无发热反应。

3.2聚明胶肽注射液基本无毒性。

3.3聚明胶肽注射液慢性毒性实验中，大鼠血液生化无异常。

二、本发明方法所得聚明胶肽注射液治疗缺血性脑血管病45例临床观察

哈尔滨医科大学第二附属医院自2000年1月～2000年12月采用聚明胶肽注射液(哈尔滨圣泰制药股份有限公司提供)治疗缺血性脑血管病45例，取得较好疗效，现报告如下：

1资料与方法

1.1临床资料

来哈尔滨医科大学第二附属医院住院的缺血性脑血管病人按随机的原则进行分组。①聚明胶肽注射液组(治疗组)45例，其中男性25例，年龄54～75岁，平均62.3岁；女性20例，年龄58～73岁，平均64.6岁；②对照组30例，其中男性19例，年龄51～76岁，平均62.5岁，女性11例，年龄54～73岁，平均63.8岁。两组年龄性别无显著差异。入选标准：符合缺血性脑血管病的发病过程和临床体征，头颅CT确诊脑梗塞或排除出血性脑血管病。

1.2方法

治疗组：治疗前查血流变学，给予聚明胶肽注射液500ml静脉注射，1/日，共7天。对照组则采取活血化瘀，扩血管，营养支持脑神经细胞的治疗。

        表3    45例聚明胶肽注射液治疗疗效

病名          例数    基本治愈(％)  显著进步(％)  进步(％)     无效(％)

TIA           21      5(23.81)      4(19.05)      9(42.86)     3(14.28)

急性脑梗塞    24      10(41.6)      12(50.0)      2(8.33)      0(0)

总计          45      15(33.33)     16(35.56)     11(24.36)    3(6.67)

注TIA为暂时性脑缺血。

1.3疗效评定标准及统计学方法

按全国第四届脑血管病学术会议通过的脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准(1995)，治疗二周后对两组分别判定。基本痊愈：功能缺损评分减少；91％～100％，病残程度为0级，显著进步：功能缺损评分减少46％～90％，病残程度1～3级；进步：功能缺损评分减少18％；无变化：功能缺损评分减少＜17％或增加＜7％；恶化：功能缺损评分增加＞18％或死亡。所测数据均以 x±s表示。聚明胶肽注射液治疗血液流变学各指标前、后对比采用t检验。

    表4  聚明胶治疗前、后血流变检测结果( x±s)

观察指标          治疗前         治疗后            P

全血粘度(低切)    12.68±1.85    9.38±1.85        ＜0.001

全血粘度(高切)    5.76±0.699    4.717±0.430      ＜0.001

红细胞压积(％)    50.14±2.197   45.92±2.426      ＜0.001

纤维蛋白原        3.92±0.37     3.55±0.38        ＜0.001

2结果

本组45例缺血性脑血管病患者经7天聚明胶肽注射液治疗总有效率93.25％，急性脑梗塞有效率100％。而对照组则为64.28％(P＜0.05)，说明有显著差异。聚明胶肽注射液治疗前、后全血粘度(高切，低切)，红细胞压积及纤维蛋白原均具有极显著的差异(P＜0.001)。说明聚明胶肽注射液治疗对血液质和量的改善是迅速而效的。血液稀释后，患者头晕等症状减轻。

具体实施方式

实施例1

1、取100g药用明胶，用550mL纯化水溶解，然后在50℃，用20mL、4％稀盐酸溶液水解2小时，使水解所得肽链的重均分子量为10000～10500道尔顿；

2、向上述所得明胶水解产物加入15mL、2％的甲酸溶液，使溶液pH为9.5，在温度为10℃和pH为9.5条件下，加入10mL缩合剂乙二醛，连续反应5小时，加入10mL的过氧化氢，氧化3小时；

3、将上述液体在真空度为-0.08Mpa、温度为60℃条件下浓缩至130mL，加热至100℃，保温2.0小时；

4、冷却至室温，加入300mL乙醇，搅拌均匀，静置24小时，回收乙醇，将沉淀沉淀在-0.09Mpa、60℃条件下真空干燥；

5、将上述所得固体药物碎末使用900mL注射用水溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为8.0，加0.5g活性炭搅拌均匀，在80℃保温30分钟，0.45μm膜过滤，88mL注射用水，加入氯化钾5.0mg、氯化钙4.6mg和氯化钠98mg，k⁺、ca²⁺、Na⁺浓度分别为3.2μmol/mL、1.2μmol/mL、141μmol/mL，再加入1g的活性炭搅拌均匀，在80℃保温30分钟，0.22μm膜过滤，灌装；

6、用100℃水浴灭菌50分钟；

7、灯检、包装，其分装规格为250ml药液：1.6g氮。

实施例2

1、取500g药用明胶，用1500mL纯化水溶解，然后在80℃，用90mL、6％稀盐酸溶液水解1.5小时，使水解所得肽链的重均分子量为12000～12500道尔顿；

2、向上述所得明胶水解产物加入20mL、4％的甲酸溶液，使溶液pH为8，在温度为30℃和pH为8条件下，加入16mL缩合剂丁二酸酐，连续反应8小时，加入80mL的过氧化氢，氧化4小时；

3、将上述液体在真空度为-0.08Mpa、温度为50℃条件下浓缩至400mL，加热至110℃保温0.5小时；

4、冷却至室温，加入3600mL乙醇，搅拌均匀，静置15小时，回收乙醇，将沉淀沉淀在-0.08Mpa、60℃条件下真空干燥，粉碎；

5、将上述所得固体药物碎末使用3500mL注射用水溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为8.0，加1.5g活性炭搅拌均匀，在70℃保温60分钟，0.45μm膜过滤，再加入3500mL注射用水，23.6mg、氯化钙18.9mg和氯化钠398mg，使k⁺、ca²⁺、Na⁺浓度分别为3.5μmol/mL、1.8μmol/mL、145μmol/mL，加3g的活性炭搅拌均匀，在80℃保温40分钟，0.22μm膜过滤，灌装；

6、用流通水蒸汽灭菌50分钟；

7、灯检、包装，其分装规格为500ml药液：3.2g氮。

实施例3

1、取200g药用明胶，用800mL纯化水溶解，然后在90℃，用50mL、1％稀盐酸溶液水解1.4小时，使水解所得肽链的重均分子量为14500～15000道尔顿；

2、向上述所得明胶水解产物加入40mL、3％的甲酸溶液，使溶液pH为10，在温度为20℃和pH为10条件下，加入24mL缩合剂戊二醛，连续反应3小时，加入45mL的过氧化氢，氧化3小时；

3、将上述液体在真空度为-0.09Mpa、温度为50℃条件下浓缩至原体积的200mL，加热至110℃，保温2.5小时；

4、冷却至室温，加入1600mL乙醇，搅拌均匀，静置30小时，回收乙醇，将沉淀在-0.09Mpa、50℃条件下真空干燥，粉碎；

5、将上述所得固体药物碎末使用1800mL注射用水溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为7.5，加1g活性炭搅拌均匀，在75℃保温50分钟，0.45μm膜过滤，再加入1800mL注射用水，加入氯化钾4.8mg、氯化钙6.2mg和氯化钠201mg，使k⁺、ca²⁺、Na⁺浓度分别为3.0μmol/mL、0.8μmol/mL、149μmol/mL，加2g活性炭搅拌均匀，在75℃保温30分钟，0.22μm膜过滤，灌装；

6、用121℃热压灭菌40分钟；

7、灯检、包装，其分装规格为500ml药液：3.2g氮。

实施例4

1、取300g药用明胶，用1500mL纯化水溶解，然后在70℃，用50mL、6％稀盐酸溶液水解1小时，使水解所得肽链的重均分子量为14500～15000道尔顿；

2、向上述所得明胶水解产物加入60mL、3％的甲酸溶液，使溶液pH为9，在温度为20℃和pH为9条件下，加入8mL缩合剂戊二醛，连续反应10小时，加入45mL的过氧化氢，氧化5小时；

3、将上述液体在真空度为-0.08Mpa、温度为55℃条件下浓缩至350mL，加热至110℃，保温2小时；

4、冷却至室温，加入1400mL乙醇，搅拌均匀，静置24小时，回收乙醇，将沉淀在-0.08Mpa、55℃条件下真空干燥，粉碎；

5、将上述所得固体药物碎末使用2700mL注射用水溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值为7.8，加1.5g活性炭搅拌均匀，在70℃保温70分钟，0.45μm膜过滤，再加入3700mL注射用水，加入氯化钾7.6mg、氯化钙14.5mg和氯化钠296mg，使k⁺、ca²⁺、Na⁺浓度分别为3.3μmol/mL、1.2μmol/mL、148μmol/mL，加3g活性炭搅拌均匀，在75℃保温40分钟，0.22μm膜过滤，灌装；

6、用121℃热压灭菌40分钟；

7、灯检、包装，其分装规格为250ml药液：1.6g氮。

Claims (10)

1、一种聚明胶肽注射液制备方法，该方法包括以下步骤：

a、明胶水解：将明胶用纯水溶解，然后40～90℃用稀酸溶液水解；

b、交联并氧化：调pH为8.0～10.0，大致在室温条件下加自选自乙二醛、丁二酸酐、戊二醛或其它缩合剂的缩合剂，反应，然后将所得产物氧化；

c、纯化分离：用乙醇析出沉淀，所得沉淀即为交联的聚明胶肽；

d、配制溶液：将所得固体物质用注射用水溶解，加入等渗物质，调节溶液pH，吸附澄清，得到注射液；

e、灭菌。

2、如权利要求1的聚明胶肽注射液制备方法，其特征在于，还包括步骤f、灯检、包装。

3、如权利要求1的聚明胶肽注射液制备方法，其特征在于，步骤a中，所用稀酸为盐酸、硫酸或其它无机酸，其浓度为3-5重量％。

4、如权利要求1的聚明胶肽注射液制备方法，其特征在于，步骤b中，缩合剂为乙二醛、丁二酸酐、戊二醛；缩合剂的体积占液体总体积的0.5％～2.5％；加入缩合剂反应2～8小时；氧化所用氧化剂为过氧化氢；加入过氧化氢的体积占反应所得溶液体积的2％～5％；氧化3～4小时。

5、如权利要求1的聚明胶肽注射液制备方法，其特征在于，步骤b后、步骤c前还包括步骤b¹、将上述液体浓缩至原体积1/4～1/5，加热至100～110℃保温，保温时间优选0.5～2.0小时。

6、如如权利要求5的聚明胶肽注射液制备方法，其特征在于，步骤c中，冷却至室温，加入乙醇使所得混合溶液中乙醇体积占70～90％，搅拌均匀，静置，回收乙醇，将沉淀真空干燥，还可以粉碎。

7、如权利要求1的聚明胶肽注射液制备方法，其特征在于，步骤d中，将上述所得固体药物使用注射用水溶解，配成10％浓度的溶液，用氢氧化钠溶液调节pH值为7.5～8.0，加活性炭搅拌均匀，在70～80℃保温，优选0.5～1.0小时，0.45μm膜过滤，将滤液和注射用水按1∶1体积比混合，加入氯化钾、氯化钙、氯化钠，使溶液中k⁺、ca²⁺、Na⁺浓度达到本品国家药品标准的要求，即k⁺、ca²⁺、Na⁺浓度分别为2.0～4.0μmol/mL、0.2～2.0μmol/mL、139～152μmol/mL，加活性炭搅拌均匀，在70～80℃保温，0.22μm膜过滤，灌装。

8、如权利要求1的聚明胶肽注射液制备方法，其特征在于，步骤e中，灭菌为水浴灭菌、流通蒸气灭菌、热压灭菌。

9、如权利要求2的聚明胶肽注射液制备方法，其特征在于，步骤f中，分装规格为聚明胶肽含量以含氮量计是：125ml药液：0.8g氮。

10、一种聚明胶肽注射液，其特征在于，该注射液由以下方法制备：

a、明胶水解：将明胶用纯水溶解，然后40～90℃用稀酸溶液水解；

b、交联并氧化：调pH为8.0～10.0，大致在室温条件下加自选自乙二醛、丁二酸酐、戊二醛或其它缩合剂的缩合剂，反应，然后将所得产物氧化；

c、纯化分离：用乙醇析出沉淀，所得沉淀即为交联的聚明胶肽；

d、配制溶液：将所得固体物质用注射用水溶解，加入等渗物质，调节溶液pH，吸附澄清，得到注射液；

e、灭菌。