CN107970243B - 一种去甲氯氮平的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种化合物治疗细菌葡萄糖醛酸酶导致的疾病的药物中的用途，该化合物为N‑Desmethylclozapine、及其代谢产物或该化合物在药学上可接受的盐。以上化合物均可以用于癌症的治疗、也可以缓解伊立替康引起的腹泻，非甾体类抗炎药导致的胃肠道溃疡，或调节其他经由细菌葡萄糖醛酸酶代谢的药物疗效与副作用，以及由细菌葡萄糖醛酸酶引起的相关病症。

Description

一种去甲氯氮平的新用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及化合物N-Desmethylclozapine的新用途，具体而言，该化合物作为细菌β葡萄糖醛酸酶抑制剂及其应用。

背景技术

通过细菌β-葡萄糖醛酸酶，胃肠道中的微生物从葡萄糖醛酸化的化合物中夺走糖基用于能量供应，导致多种药物或其代谢产物从非毒性状态转化为毒性状态，从而影响药物的代谢和毒副作用^[1,2]。细菌β-葡萄糖醛酸酶影响的症状包括伊立替康导致的迟发性腹泻，以及非甾体类抗炎药导致的胃肠道溃疡等^[3,4]。

伊立替康(Irinotican，CPT-11)，商品名开普拓(Camptosar)，是临床上常用的抗肿瘤化疗药物之一，其主要靶点为I型DNA拓扑异构酶。自1996年上市以来，伊立替康广泛应用于结直肠癌，肺癌，脑肿瘤以及耐药性白血病和淋巴癌的治疗，并被列为治疗转移性结直肠癌的一线治疗药物。多年的临床应用发现，肠毒性是伊立替康主要的剂量限制性副作用之一，表现为迟发性腹泻，通常在病人使用药物24小时以后出现，主要特征包括不可预知性、高发病率及一定程度的致死率。统计数据表明，在接受伊立替康治疗的病人中高达88％的比例出现腹泻症状，其中20-30％的病人出现3-4级严重腹泻(CTCAE分级)，约3.5％的病人因严重腹泻引发的并发症而死亡^[5,6]。相当数目的病人因腹泻必须减少用药剂量甚至停止用药，迄今为止尚无有效治疗手段。

虽然近年来已发展出多种“第二代伊立替康”，如ONIVYDE(又称MM-398,PEP02,或nal-IRI,MerrimackPharmaceuticals,Inc.)，一种伊立替康脂质体配方胶囊于2015年被美国FDA批准上市；PEG-SN38(连接聚乙烯的SN38，BelrosePharma Inc.)在临床三期实验阶段。尽管这些“新型伊立替康”提高了生物可利用度和药效，但是腹泻仍是难以克服的剂量限制性副作用。

腹泻发生机制与伊立替康的代谢途径具有密切关系。CPT-11的主要代谢场所为肝脏，CPT-11首先经羧酸酯酶(carboxylesterase，CES)脱去二哌啶基团生成活性代谢产物SN-38；随后在葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyl-transferase,UGT)的催化下SN-38接受糖基化修饰进一步转化成非活性代谢产物SN-38G^[7]。SN-38是伊立替康的主要活性代谢产物，对DNA拓扑异构酶的抑制能力是原药CPT-11及非活性代谢产物SN-38G一百倍以上，对快速分裂的肿瘤细胞具有极强的杀伤力^[8]。CPT-11及代谢产物部分进入血液循环，其余部分随胆汁排入肠腔。研究发现，肠道中富含的共生细菌将非活性代谢产物SN-38G作为能量来源之一，由细菌的β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，β-GUS)脱去SN-38G的糖基以供给自身的能量，将其重新活化成SN-38，从而导致肠腔中毒性化合物SN-38浓度极大增加，杀伤肠上皮细胞并造成肠粘膜不可逆转的损伤，最终导致了迟发型腹泻的产生^[3,9]。因此选择性抑制肠道内细菌β-GUS酶的活性，可直接降低SN-38的局部浓度并保护肠道组织，从根本上预防和治疗迟发性腹泻。

细菌β-GUS酶以四聚体形式存在，小分子化合物结合在酶的催化口袋，与细菌酶特有的一段17个氨基酸残基组成的loop结构具有较强的相互作用。由于这段loop区域在人的同源蛋白β-GUS中相应区域序列及结构区别明显，与细菌酶特有loop结构的结合使得该系列化合物可选择性抑制细菌中的β-GUS，对哺乳动物的β-GUS则无明显影响^[3]。动物实验结果表明，细菌β-GUS抑制剂inhibitor 2可降低腹泻的发生率，延长动物的存活时间，进一步验证了该靶点的安全性和有效性。基于酶活性的高通量筛选方法发现了一系列β-GUS抑制剂^[3,10]。但是，由于全新开发的化合物本身的毒理和药学性质尚不清楚，与CPT-11联合使用以后的安全性和药效更加难以评估，因此与临床应用仍存在较大差距。

发明内容

本发明采用整合虚拟筛选与实验测定的方法发现N-Desmethylclozapine可选择性抑制细菌葡萄糖醛酸酶。由于N-Desmethylclozapine是已知药物，已在人体中使用，其安全性及药学性质明确，可快速进入临床实验，用于缓解伊立替康引起的腹泻，或调节其他经由细菌葡萄糖醛酸酶代谢的药物疗效与副作用，以及由细菌葡萄糖醛酸酶引起的相关病症。

本发明提供一种化合物A用于制备治疗细菌葡萄糖醛酸酶导致的疾病的药物中的用途，所述化合物A为式I化合物、式I化合物的代谢产物或式I化合物在药学上可接受的盐。

本发明所述疾病优选为为腹泻、胃肠毒性或其他由于细菌葡萄糖醛酸酶所致的病症。所述腹泻包括但不限于是由化疗药物引起；所述胃肠毒性包括但不限于非甾体类抗炎药引起。

本发明所述化疗药物包括但不限于伊立替康或其活性代谢物7-乙基-10羟基喜树碱，或其他以喜树碱类化合物及其衍生物为主要有效成分的药物。

本发明所述式I化合物和一种或多种药学上可接受的载体组成药物组合物。

本发明还提供一种化疗药物和化合物A在制备治疗肿瘤的联合用药中的用途，所述化合物A为式I化合物、式I化合物的代谢产物或式I化合物在药学上可接受的盐。

本发明所述化疗药物包括但不限于为伊立替康或其活性代谢物7-乙基-10羟基喜树碱，或其他以喜树碱类化合物及其衍生物为主要有效成分的药物。所述化合物A和一种或多种药学上可接受的载体组成药物组合物，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或其他可制备的剂型。所述肿瘤包括结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、脑肿瘤、耐药性白血病、淋巴癌、前列腺癌、肺癌或膀胱癌中的一种或多种。

本发明以药物重定位为基本策略，采用计算机模拟方法对药物分子的有效性进行先期评估，并采用生物学实验方法测活，发现了N-Desmethylclozapine为有效的细菌β-GUS酶选择性抑制剂，其酶学水平IC₅₀值分别为0.0389±0.0080μM(图1)；其细胞水平IC₅₀值分别为0.0105±0.0026μM(图2)；对哺乳动物来源的β-GUS酶在100μM的浓度下无明显作用，表明了其良好的选择性(图3)；同时化合物对大肠杆菌的生长无明显影响，表明化合物无明显细胞毒性，可在不杀死大肠杆菌的情况下抑制其β-GUS酶的活性(图4)。

适当剂量的N-Desmethylclozapine可用于选择性抑制细菌β-GUS酶，从而影响通过细菌β-GUS酶代谢的药物的药效及副作用，治疗由细菌β-GUS酶引发的病症。例如N-Desmethylclozapine与CPT-11或其他喜树碱类衍生物药物联合使用，可用于降低肠毒性，缓解腹泻副作用，并有可能提高抗肿瘤效果。

由于N-Desmethylclozapine是已知药物，已在人体中使用，其安全性及药学性质明确，可快速进入临床实验，用于缓解伊立替康引起的腹泻，或调节其他经由细菌葡萄糖醛酸酶代谢的药物的疗效与副作用，以及其他由细菌葡萄糖醛酸酶引起的相关病症。

附图说明

图1：N-Desmethylclozapine在蛋白水平上对细菌β-GUS酶抑制能力的IC₅₀图。N-Desmethylclozapine在蛋白水平上具有良好的细菌β-GUS酶抑制效果，其IC₅₀值为0.0389±0.0080μM。

图2：N-Desmethylclozapine在细胞水平上对细菌β-GUS酶抑制能力的IC₅₀图。N-Desmethylclozapine在细胞水平具有良好的细菌β-GUS酶抑制效果，其IC₅₀值分别为0.0105±0.0026μM。

图3：N-Desmethylclozapine在100μM浓度下对哺乳动物来源的Bovine taurusβ-GUS酶无明显抑制活性。使用100μM浓度的N-Desmethylclozapine测试其对哺乳动物来源的Bovine taurusβ-GUS酶活性，发现化合物对哺乳动物来源的β-GUS酶无明显的抑制效果。

图4：N-Desmethylclozapine对细菌的细胞毒性实验。其中黑色、深灰色和浅灰色柱状分别表示采用1％DMSO溶液、100μM天冬甜素以及10μM浓度天冬甜素分别与大肠杆菌共孵育的结果。结果表明化合物对大肠杆菌的生长无明显影响，表明化合物无明显细胞毒性，可在不杀死大肠杆菌的情况下抑制其β-GUS酶的活性。

具体实施例

试验例

一、N-Desmethylclozapine对细菌葡萄糖醛酸酶抑制活性测定

1.实验方法

1.1基于受体的虚拟筛选

首先采用

软件包中的蛋白准备模块Protein Preparation Wizard对细菌β-GUS酶的晶体结构(PDB：3LPF)进行处理，包括修正键级，添加氢原子及部分电荷。删除所有的结晶水分子，将整个体系基于OPLS-2005力场进行优化，当RMSD值达到

时优化终止。采用

9.0中的Ligprep 2.5模块对已知药物分子库LOPAC和Microsource Spectrum电子版分子文件进行预处理，包括去重、去除盐离子和无机物，在pH＝7.4条件下产生化合物的可能离子化状态和互变异构体，对于未确定手性中心的手性化合物产生各种可能手性的低能化合物结构，在缺省条件下，每个分子最多产生32个立体异构体，最后得到大约5万个化合物构象。首先采用GlideSP模式进行对接和打分，保留所有小分子结合模式。在文献报道中，活性分子基本包含两个明显的药效团特征：与GLU413形成氢键，与PHE365形成疏水相互作用。对于对接产生的前1万个小分子结合模式，采取药效团特征作为筛选条件，选出与GLU413形成氢键，并与PHE365形成疏水相互作用的结合模式，最后挑选并购买了部分化合物进行实验活性测定。

1.2细菌葡萄糖醛酸酶酶学水平测活步骤

将4mg/ml细菌β-GUS(300,000×125pM)采用50mM HEPES缓冲液(pH7.4with0.017％Triton x-100)稀释至1×125pM，底物4MUG采用50mM HEPES(pH7.4)溶解稀释为312.5μM。具体操作步骤为：1)向96孔板(黑板)加入20μl的待测化合物；2)加入40μl GUS酶(125pM)；3)加入40μl底物(4MUG，312.5μM)；4)室温孵育30分钟,加入40μl1MNa2CO3终止反应；5)在EnVision(PerkinElmer USA)多功能酶标仪上进行荧光检测：激发波长335nm，发射波长460nm。其中不加化合物的孔板作为阳性对照，不加酶的孔板作为阴性对照。

1.3哺乳动物来源葡萄糖醛酸酶酶学水平测活步骤

具体步骤同细菌葡萄糖醛酸酶酶学水平活性测试实验，其中酶更换为哺乳动物来源的Bovine taurusβ-GUS酶，其终浓度为1nM。

1.4细胞水平GUS酶活性测试实验

将空质粒pGex-4T-1转化到E.coli(DH5α)中，37℃，LB(100μM氨比西林)中培养过夜。然后1/100扩大培养到OD600至0.6，8000rpm离心5分钟。用50mMHEPES(100μM氨比西林，pH7.4)清洗沉淀两次，浓缩沉淀的OD600至1.0，此菌液将替换GUS酶用于实验检测。反应在37℃进行2h，缓冲液采用50mMHEPES(pH7.4)，其他实验步骤与数据处理均与GUS酶实验相同。

1.5细菌细胞毒性实验

采用GUS细胞实验所用大肠杆菌菌液进行细胞毒性实验。选用待测化合物终浓度100μM和10μM(1％DMSO)两个浓度进行细胞毒性实验。向96孔板中加入待测化合物20μL和菌液80μL，1％DMSO作为对照组，37℃反应2h，然后每孔中加入CellCounting Kit-8(Dojindo,Japan)10μL，混匀。在37℃分别反应5分钟，30分钟，60分钟，随后用多功能酶标仪(ThermoScientific,USA)测490nm的吸光度。

2.实验结果

测定了N-Desmethylclozapine在蛋白水平上针对细菌β-GUS以及哺乳动物来源的β-GUS酶活性，以及化合物在细胞水平上针对细菌β-GUS酶的活性，和化合物的细胞毒性。

在蛋白水平上抑制细菌β-GUS活性的IC₅₀曲线如图1所示。N-Desmethylclozapine在蛋白水平上具有良好的细菌β-GUS酶抑制效果，其IC₅₀值为0.0389±0.0080μM。

在细胞水平上抑制细菌β-GUS酶的IC₅₀曲线如图2所示。N-Desmethylclozapine在细胞水平上具有良好的细菌β-GUS酶抑制效果，其IC₅₀值分别为0.0105±0.0026μM。

使用100μM浓度的N-Desmethylclozapine测试其对哺乳动物来源的β-GUS酶活性，发现该化合物对哺乳动物来源的β-GUS酶无明显的抑制效果(图3)。

使用10μM，100μM浓度的N-Desmethylclozapine与大肠杆菌共孵育，对大肠杆菌的生长无明显影响，说明该化合物无明显细胞毒性，可在不杀死大肠杆菌的情况下抑制其β-GUS酶的活性(图4)。

二、N-Desmethylclozapine缓解伊立替康导致的小鼠腹泻实验

CT-26细胞系被用来构建小鼠肿瘤模型。选取6-8周的雌性Balb/cJ小鼠18只，在小鼠后背部位置皮下注射细胞的PBS悬浮液。10天左右以后，小鼠的肿瘤达到约500mm³(肿瘤体积用公式π/6×a²×b计算，其中a为肿瘤的短轴，b为肿瘤的长轴)。然后将小鼠随机分为三组进行给药：(1)对照组，接受同等体积的腹腔注射蒸馏水，以及1％DMSO溶液灌胃(总共约100μL，每天两次)；(2)CPT-11给药组，腹腔注射CPT-11，剂量为50mg/kg,以及1％DMSO溶液灌胃(总共约100μL，每天两次)；(3)CPT-11加N-Desmethylclozapine联合用药组，腹腔注射CPT-11，剂量为50mg/kg,以及N-Desmethylclozapine溶液灌胃(总共约100μL，每天两次)，剂量为10mg/kg。为获得小鼠腹泻模型，其中CPT-11给药组以及联合用药组连续注射9天CPT-11；联合用药组从CPT-11注射前一天开始口服N-Desmethylclozapine，到CPT-11注射结束后，再继续口服给药两天，然后结束给药。分别观察对照组，CPT-11给药组，和CPT-11加N-Desmethylclozapine联合用药组的腹泻状况，记录小鼠的体重以及肿瘤大小。

实验结果显示，CPT-11给药组小鼠血样腹泻发生率为83.33％，而CPT-11加N-Desmethylclozapine联合用药组血样腹泻的发生率为33.33％，联合用药比单一使用CPT-11有明显的改善腹泻发生率的作用。此外，联合用药组体重下降情况与单一的CPT-11给药组比也有明显的改善(P<0.05)。同时，联合用药组与单一的CPT-11给药组在抑制肿瘤大小效果方面无明显差异。

Claims (3)

1.化合物A在制备减轻伊立替康或其活性代谢物7-乙基-10羟基喜树碱引起的腹泻药物中的用途，其特征在于，所述化合物A为式I化合物

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物A和一种或多种药学上可接受的载体组成药物组合物。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂或其他可制备的剂型。

Images