CN105504001A

CN105504001A - 一种利用发光法快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法

Info

Publication number: CN105504001A
Application number: CN201610039610.1A
Authority: CN
Inventors: 林向民; 姚祖杰; 林文雄
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2036-01-21
Also published as: CN105504001B

Abstract

本发明提供一种利用发光法快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB536的大肠杆菌ER2738，然后在添加C4-AHL分子、四环素、氨苄青霉素、X-gal/IPTG的平皿中筛选出可见光下显蓝色、激发光下不发或者发弱生物荧光的细菌克隆；然后将该噬菌体扩增，添加上述物质的平板中划线培养，通过抑制生物发光的方法验证QSI功能，最后测序获得特异QSI多肽序列。本发明步骤简单，只需要3天至一周左右的时间，就可以获得多个QSI候选多肽，因此具有非常明显的优势。

Description

一种利用发光法快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法

技术领域

本发明涉及基因工程与适体技术，公开了针对筛选细菌群体感应抑制物的噬菌体展示技术。具体而言，特指一种筛选细菌群体感应抑制物的技术，该方法同样也适用于AI-1等长、短链N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)的群体感应分子抑制物的筛选。本发明中涉及的噬菌体展示技术可适用于例如噬菌体抗体库、环肽、线性多肽等带有随机文库的任何噬菌体文库。涉及的宿主菌为可以被噬菌体文库侵染的雄性F’细菌，例如ER2738、DH5αF’、XL1-Blue等，涉及的载体为可感应QS分子导致细菌发光的载体，例如pSB536、pJBA130、pREC-FF等。属于病原微生物预防与控制领域。

背景技术

当前病原细菌的耐药形势非常严峻，单纯的药物-靶点模式的抗生素研发从长远看无法解决细菌迅速突变导致耐药的问题，因此，一些以细菌特有生理功能为靶点的新型抑菌药物正引起研究人员的广泛关注。例如消除细菌生物膜生成、抑制细菌群体感应以及抗体靶向抑制耐药菌的策略，为新型药物开发提供了新的思路。

细菌的群体感应（QS,quorumsensing）是指细菌根据自身细胞密度变化进行基因表达调控的群体行为，研究发现，自然界中大部分的细菌都存在QS现象，它不仅控制细菌的生物发光，还与生物被膜和孢子生成、毒素分泌、质粒转移以及包括抗生素在内的第二代谢产物合成紧密相关。目前已知的细菌QS系统，可以根据分泌的化学信号分子性质（又称为自诱导物，AI,autoinducer）分为以下4类：一类信号分子为AI-1，是N-酰基高丝氨酸内酯类（AHLs）及其衍生物,广泛分布在革兰氏阴性细菌中并具有种属特异性。以费氏弧菌为例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并扩散到细胞外，当细胞密度增加到一定阈值时，AHLs与LuxR家族蛋白结合，从而使LuxR族蛋白与DNA上的调控元件结合，起始转录LuxCDABEG，启动生物发光过程；第二类是由LuxS家族蛋白形成的自诱导物AI-2，其主要成分为呋喃酮酰硼酸酯。另外两类是在革兰氏阳性细菌中独有的寡肽类分子AIP（Autoinducingpeptide）以及目前机制还尚未完全清楚的肾上腺素/去甲肾上腺素信息系统（AI-3）信号分子。

为了检测QS分子，目前研发了多种检测不同类型QS分子的报告菌株（Quorumsensingbiosensors）。例如大肠杆菌的pSB536质粒上带有嗜水气单胞菌群体感应系统ahyRI’和生物发光基因luxCDABE，当添加入短链AHLs分子后，AhyR蛋白感应QS分子，激活ahyI’启动子，从而启动LuxCDABE蛋白，使细菌生物发光。

由于QS在细菌的生命活动中所起的重要作用，抑制细菌群体感应并不影响细菌的生长，但却可以减少生物膜的生成、影响细菌毒素的分泌并且很难产生耐药性，因此，开发针对QS相关基因或者其分泌的信号小分子物质的抑制物，称之为群体感应抑制剂（QSI，quorumsensinginhibitor）或者群体感应淬灭（QQ，quorumquenching），是一个具有广阔应用潜力的抑菌策略，也是今后新型抗生素替代品的理想化合物来源，成为当前药物开发研究的热点。

发明内容

关于群体感应抑制剂（QSI分子）的筛选，目前主要集中在对AHLs和AI-2的抑制上。QSI的来源可以大致分为4种，一种是从环境中提取的天然QSI分子。例如从海洋红藻Deliseapulchra、海洋珊瑚Euniceaknighti、大蒜等天然物质中提取的AHLs和呋喃酮类物质；一种是根据信号分子的结构，人工设计和合成其相似结构分子，以达到与QS分子竞争底物但又不激活活性的目的；还有一种是利用表达QS分子降解酶的方法；此外，还有利用QS筛选特异抗体或者适体的方法。以上四种是当前获得QSI的主要来源，但是都存在一些问题：植物等来源的样品成份复杂，QSI前期的提取、鉴定和纯化过程繁琐而且还受到样品纯度与温度、地域等不确定因素的限制；人工设计合成与抗体筛选不仅需要专业的化学合成与结构分析背景，还要考虑到样品制备过程的繁琐程度，专业的设备、中间产物毒性与污染评估以及样品纯度等一系列问题。

这些问题制约着QSI分子筛选的进一步发展，急需一种能快速、高通量地筛选出高效QSI分子的新方法。因此，本发明所要解决的技术问题是：建立一种简单、快速地筛选抑制不同类型QS分子特异性多肽的技术。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本专利项目中，申请者将噬菌体展示随机肽库与QS感应菌株相结合的方法来筛选QSI分子。噬菌体展示随机肽库（Phagedisplay），是将一段长度大约为15-36bp的随机核苷酸序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因内，外源短肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。理论上,7个随机氨基酸序列可产生约20⁷种多肽序列，可以作为“人工抗体”，筛选出能特异性结合靶物质的多肽。该技术一般采用生物淘选（Biopanning）的方法来筛选抗原表位，其基本技术流程大致为：将靶蛋白或物质包被固定在聚乙烯平板中，再加入噬菌体展示肽库与之特异性结合，经过多轮的清洗和筛选后，获得与靶物质结合较紧密的噬菌体克隆，最终确认特异的短肽序列。但由于本专利研究的靶物质是N-酰基高丝氨酸内酯类（AHLs）以及呋喃酮酰硼酸酯等小分子物质，很难直接包被在平板上进行富集，因此本专利中采用一个与传统生物淘选方法完全不同的特异多肽筛选策略。主要原理是如图2所示：QS生物发光感应菌株与噬菌体随机肽库孵育侵染，在添加入相应抗生素、特异QS分子和X-gal诱导孵育平板长菌。在自然光下，没有被噬菌体侵染的细菌不显蓝色，噬菌体侵染的细菌显蓝色；荧光照射下，具有抑制QS功能的特异多肽因抑制生物发光基因启动子的表达而发生GFP荧光或者生物发光，而非特异多肽则发光。然后将候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的QSI多肽。

本发明所要解决的问题是通过以下技术途径来实现的：如图3所示，本发明公开了一个利用M13噬菌体展示随机肽库筛选QSI多肽的方法。以QS分子C4-AHL感应载体pSB536为例，利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB536的大肠杆菌ER2738，然后在添加C4-AHL分子、四环素、氨苄青霉素、X-gal的平皿中筛选出可见光下显蓝色、激发光下不发或者发弱生物荧光的细菌克隆。然后将该噬菌体扩增，添加上述物质的平板中划线培养，通过抑制生物发光的方法验证QSI功能，最后测序获得特异QSI多肽序列。

具体方法包括如下：

pSB536质粒由诺丁汉大学MatthewFletcher教授馈赠而来并于本实验室保存，热激转化于大肠杆菌ER2738感受态细胞中，验证后保存并命名为ER536。

（1）将QS分子C4-AHL感应质粒pSB536转导入大肠杆菌ER2738菌株，获得ER536菌株,从划线平板中挑取该单菌落并接种到到5ml添加有20μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37^oC、250rpm振荡过夜，以2%接种量转接到LB培养基中，然后在200rpm条件下振荡至对数生长中期并以1:10000稀释于液体LB培养基中待用；

（2）将噬菌体肽库放置冰上化冻，取10μL稀释到990μL无菌水中，再分别将步骤（1）中待用的200μL菌液与10μL噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5min；吸取上述所有预混液加入3mL、45^oC温浴已融化的含有0.7wt.%琼脂粉的上层琼脂培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素和10μMC4-AHL、1.5wt.%琼脂粉的IPTG/X-galLB下层琼脂培养基平板上；等待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37^oC培养箱中静置培养12-16h；

（3）利用化学发光成像技术，将过夜平板分别在可见光、白光和生物发光光源下拍照比对，分析比较存在差异的噬菌斑个体；

（4）选取在可见光中呈蓝色，白光中可见而在生物发光中不发光或者明显变暗的克隆以及对照，培养在添加有LB液体培养基中，37^oC、250rpm振荡过夜；然后在添加有20μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素和10μMC4-AHL的IPTG/X-galLB固体培养基上划线，37^oC培养箱中静置培养12-16h，进行进一步验证；最后，将目的菌斑失活后，测序获得目标物。

所述的IPTG/X-galLB下层琼脂培养基或IPTG/X-galLB固体培养基配方为：将1.25gIPTG、1gX-gal溶于25mL二甲基甲酰胺的母液按0.1%添加至已融化的含有1.5wt.%琼脂粉的LB培养基中。

所述的上层琼脂培养基为LB培养基中添加0.7wt.%琼脂粉，LB培养基为5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，pH=7.4-7.6，1000mL。

本发明的优点在于：本发明中使用的方法在原理上与现有筛选QSI的策略几乎完全不同，首先它利用随机文库筛选获得特异性多肽序列，在实验室中就可以获得结果，不需要从自然界的众多生物中去筛选，这样就省去了选材盲目、样品处理步骤繁琐、结果无法预知、最终抑制物的结构和性质很难分离鉴定等问题；其次，和目前仅有的利用噬菌体抗体文库筛选群体感应抑制多肽的方法相比，也有很大的不同。目前的文库筛选方法，是先用QS分子化学修饰生成半抗原，然后免疫动物并构建特异性抗体噬菌体文库，最后进行传统的生物淘洗方法寻找特异性抗体。该方法需要复杂的化学结构背景，半抗原的构建还取决于QS分子自身的化学结构。而本发明适用于任何已知道基因调控背景的AI-1类型QS元件。同时，以往方法共有的问题是，步骤繁琐，耗时长，需找一个QSI至少需要花费1个月至半年以上的时间。本发明步骤简单，只需要3天至一周左右的时间，就可以获得多个QSI候选多肽，因此具有非常明显的优势。

附图说明

图1.本专利中筛选细菌群体感应抑制剂(QSI)多肽的原理示意图。

图2.本专利中筛选细菌群体感应抑制剂(QSI)多肽的试验流程图。

图3.以C4-AHLQSI分子筛选为例，图示筛选结果。(A)和(B)C7C噬菌体肽表达文库与携带pSB536的ER2738侵染后在自然光(A)、白光(B)和生物发光(C)下差异比较，筛选到的命名为Y10的感染噬菌体的细菌在添加QS分子培养皿中，在自然光下正常生长，但在激发光下不发生物荧光。

图4.所筛选噬菌斑的进一步验证。非特异性对照噬菌斑Y60和筛选的特异性噬菌斑Y10接菌过夜后，在添加相应抗生素、IPTG和C4-AHL分子的固体培养基中划线，37^oC孵育过夜后，在白光（A）和生物发光（B）照射下的变化情况。序号1-4分别是携带pSB536质粒的大肠杆菌JM109、携带pSB536质粒的大肠杆菌ER2738、携带pSB536质粒的大肠杆菌ER2738被选择的特异噬菌体(编号为Y10)感染、携带pSB536质粒的大肠杆菌ER2738被非特异噬菌体(编号为Y60)感染后的生长情况。

具体实施方式

具体方法包括如下：

实施例1

1.材料方法

实验材料QuorumSensing检测质粒pSB536和E.coliJM109（SIMONSWIFTet,1997）宿主菌为本实验室保存，ER2738宿主菌、噬菌体环7肽库Ph.D.-C7C^TMPhageDisplayPeptideLibraryKit购自美国NewEnglandBiolabs纽英伦生物技术有限公司；抗生素四环素、氨苄青霉素购于Sigma公司，其他的相关试剂及培养基分别购于中国国药集团化学有限公司与英国OXOID公司。引物合成和序列测定由上海立菲生物技术有限公司完成；C4-AHL分子购自Cayman公司,货号10007898，N-butyryl-L-Homoserinelactone，50mg。

IPTG/X-gal下层琼脂LB培养基或IPTG/X-galLB固体培养基制备方法为：称取1.25gIPTG、1gX-gal溶于25mL二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1%添加到LB培养基中；所述LB培养基：5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，pH=7.5，1000mL。

实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实验步骤

（1）首先，将实验室所保存的含有pSB536质粒菌株利用碱裂解法提取该质粒，经琼脂糖凝胶电泳以及核酸浓度、纯度检测后保存于-20^oC备用；同时将噬菌体环7肽库试剂盒中的侵染所用宿主菌ER2738利用氯化钙法制备感受态（参考分子克隆实验指南第四版）；然后取出核酸含量为100ng的pSB536质粒运用热激转化法将该质粒转导入所制备的ER2738感受态中；最终验证结果后保存并命名为ER536。以上该步骤的实施，有效的提高了本实验筛选的过程中噬菌体对宿主菌侵染能力，故将QS分子C4-AHL感应质粒pSB536转导入大肠杆菌ER2738菌株尤为必要。取平板挑取单菌落ER536接种至5ml含有终浓度为20μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37^oC，250rpm振荡过夜；翌日，取过夜菌以1:200转接到LB培养基中，然后在200rpm条件下振荡至对数生长中期并以1:10000稀释于液体LB培养基中待用；

（2）然后，将噬菌体C7C环肽文库（NEB公司）放置冰上化冻，取出10μL稀释至990μL无菌水中，再分别将步骤（1）稀释后待用的200μL菌液与该稀释后工作浓度10μL的噬菌体肽库轻轻混匀，置于室温条件下孵育4min；接着吸取上述预混液加入45^oC温浴已融化的含有琼脂粉0.7wt.%的上层琼脂3mL培养基中，迅速充分混匀并倾倒至含有终浓度为20μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素和10μMC4-AHL的IPTG/X-gal下层固体LB培琼脂培养基平板上；等待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37^oC培养箱中静置培养14h；

（3）利用化学发光成像技术，将过夜平板分别在可见光、白光和生物发光等光源下拍照比对，分析比较存在差异的噬菌斑个体；如图3所示，选取在可见光中呈蓝色，白光中可见而在生物发光中不发光或者明显变暗的克隆，以图3为例，图3A、3B、3C平板分别为在可见光下所呈的蓝色透明噬菌斑，在白光下可见以及在生物发光中变暗乃至不发光的侵染菌落平板，箭头所标示出筛选可得一个存在明显差异噬菌斑个体，并将其命名为Y10；与此同时，再同一平板中挑取未存在差异噬菌斑为阴性对照，即对照噬菌斑在可见光下呈蓝色，且在白光下及生物发光下均可见；将存在差异与非差异的对照噬菌斑挑取，接种至终浓度为20μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增培养，37^oC，250rpm振荡过夜；

为进一步验证，用接种环沾取步骤3中所提到的过夜培养的菌株，在分别在含有终浓度为20μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素以及10μMC4-AHL的IPTG/X-gal固体LB培养基上“Z型”划线，并置于37^oC恒温培养箱中静置培养14h。结果如图4所示：将固体平板背面划分4个区域分别标记为1、2、3、4，其中1号为对照组，即为实验所保存未改造的检测菌株，2号也为对照组，即本专利所提及改造后的便于侵染的检测菌株，3号为实验组，即以所筛选到的Y10噬菌体侵染菌株为例，4号为对照组，即未存在差异噬菌斑的阴性对照；从以上验证结果可以看出，从平板所获得的差异性噬菌斑在划线验证后任然存在较好的差异效果。最后，将这些验证后目的噬菌斑扩增后失活，送至北京金唯智测序公司测序，以进行进一步生物验证分析。

综上所述，利用QS感应菌株的生物发光可以被QSI抑制的特点，结合噬菌体随机文库展示技术进行QSI的筛选，解决传统噬菌体文库展示方法中，小分子物质化学结构复杂，难以固定的难题，可以迅速、大规模地筛选针对各种不同类型QS分子的QSI；同时，根据QSI多肽的空间结构，可以为研究与QS分子相互作用的天然蛋白三维构象预测提供参考依据。因此，本专利具有理论与实际运用的多重优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种利用发光法快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于：利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带质粒pSB536的大肠杆菌ER2738，然后在添加C4-AHL分子、四环素、氨苄青霉素、X-gal/IPTG的平皿中筛选出可见光下显蓝色、激发光下不发或者发弱生物荧光的细菌克隆；然后将该噬菌体扩增，添加上述物质的平板中划线培养，通过抑制生物发光的方法验证群体感应抑制剂功能，最后测序获得特异群体感应抑制剂多肽序列。

2.根据权利要求1所述的一种利用发光法快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于：具体方法包括如下：

3.根据权利要求1所述的一种利用发光法快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于：所述的IPTG/X-galLB下层琼脂培养基或IPTG/X-galLB固体培养基配方为：将1.25gIPTG、1gX-gal溶于25mL二甲基甲酰胺的母液按0.1%添加至已融化的含有1.5wt.%琼脂粉的LB培养基中。

4.根据权利要求1所述的一种利用发光法快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于：所述的上层琼脂培养基为LB培养基中添加0.7wt.%琼脂粉，LB培养基为5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，pH=7.4-7.6，1000mL。