CN109294964B

CN109294964B - 用于高通量筛选细菌群体感应淬灭剂的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109294964B
Application number: CN201811201042.6A
Authority: CN
Inventors: 张力群; 张俊威
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: CN109294964A

Abstract

本发明公开了一种用于高通量筛选细菌群体感应淬灭剂的试剂盒及其应用。本发明首先保护一种特异DNA分子，具有两个功能片段，功能片段甲和功能片段乙；功能片段甲用于表达traR基因；traR基因编码TraR蛋白；功能片段乙自上游至下游依次包括如下元件：tra box调控元件和β‑内酰胺酶基因。本发明还保护一种用于筛选群体感应淬灭剂的试剂盒，包括以上任一所述质粒和宿主菌。宿主菌为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)N5，保藏登记号为CGMCC No.16312。所述试剂盒可用于筛选群体感应淬灭剂。本发明可以为动、植物病害的防治提供新的材料，同时也为新型农药的开发提供依据。

Description

用于高通量筛选细菌群体感应淬灭剂的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于高通量筛选细菌群体感应淬灭剂的试剂盒及其应用。

背景技术

群体感应(Quorum Sensing,QS)是细菌的一种调控机制，指细菌通过感应特定信号分子的浓度来感知周围环境中自身或其它细菌的数量，并调整相关基因的表达以适应环境的变化。多种病原细菌的QS系统调控致病因子的表达，如Ti质粒的接合转移、胞外多糖的产生、植物细胞壁降解酶的产生等。因此，QS系统可以作为细菌病害防治的新靶点。对细菌QS调控机制的干扰和破坏称为群体感应淬灭(Quorum Quenching,QQ)。目前研究较多的群体感应淬灭剂包括群体感应信号降解酶和群体感应抑制化合物。群体感应淬灭剂不以杀死或抑制病原细菌生长为目的，而是通过干扰病原微生物致病因子的正常表达，特异性地抑制病原菌的致病性，从而达到防治病害的目的。与传统化学药剂防治相比，这种淬灭群体感应机制对病原菌生长压力小，不易产生抗药性，对环境影响小。其中，群体感应信号降解酶基因已成功转入植物中，转基因植物对果胶杆菌引起的软腐病已表现出明显的抗性，显示出群体感应淬灭在防治植物细菌病害方面的潜在应用价值。

目前，已报道多种群体感应淬灭剂筛选报告系统，如以β-半乳糖苷酶作为报告的Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4)筛选系统、以紫色色素作为报告Chromobacterium violaceum CV026筛选系统、以生物发光作为报告Escherichia coli(pSB401)筛选系统和以毒性基因sacB作为报告的QSIS1筛选系统等。随着宏基因组学和化学合成技术的进步，待筛选基因组文库和化合物库不断增加提出了对高通量筛选体系的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于高通量筛选细菌群体感应淬灭剂的试剂盒及其应用。

本发明首先保护一种特异DNA分子，具有两个功能片段，功能片段甲和功能片段乙；功能片段甲用于表达traR基因；traR基因编码TraR蛋白；功能片段乙自上游至下游依次包括如下元件：tra box调控元件和β-内酰胺酶基因。所述DNA分子中，功能片段甲和功能片段乙可以采用相同方向，也可以采用相反方向。

本发明还保护一种DNA分子组合。DNA分子组合包括DNA分子甲和DNA分子乙；DNA分子甲中具有功能片段甲；DNA分子乙中具有功能片段乙；功能片段甲用于表达traR基因；traR基因编码TraR蛋白；功能片段乙自上游至下游依次包括如下元件：tra box调控元件和β-内酰胺酶基因。

以上任一所述TraR蛋白如序列表的序列3所示。

以上任一所述traR基因如序列表的序列1第3830至4534位核苷酸所示。

以上任一所述tra box调控元件如序列表的序列2第1至46位核苷酸所示。

以上任一所述β-内酰胺酶基因编码序列表的序列4所示的β-内酰胺酶。

以上任一所述β-内酰胺酶基因如序列表的序列2第93至953位核苷酸所示。

具有以上任一所述特异DNA分子的特异质粒均属于本发明的保护范围。所述质粒具体可为序列表的序列1所示的环形质粒(报告质粒pBA7P)。

本发明还保护一种质粒组合，由质粒甲和质粒乙组成；质粒甲中具有以上任一所述DNA分子甲；质粒乙中具有以上任一所述DNA分子乙。

本发明还保护一种重组菌，是将以上任一所述特异质粒导入宿主菌得到的。

本发明还保护一种用于筛选群体感应淬灭剂的试剂盒，为试剂盒甲或试剂盒乙；所述试剂盒甲包括以上任一所述质粒和宿主菌；所述试剂盒乙包括所述重组菌。

所述宿主菌为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)N5，已于2018年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.16312。

本发明还保护以上任一所述特异DNA分子、以上任一所述DNA分子组合、以上任一所述特异质粒、以上任一所述质粒组合、以上任一所述重组菌或以上任一所述试剂盒的应用，为筛选群体感应淬灭剂。

所述应用中，借助待测物、报告菌、3OXO-C6-HSL和头孢硝噻酚反应后的颜色变化进行判断；如果显示淡黄色，说明待测物为或候选为群体感应淬灭剂；如果显示红色，这说明待测物为或候选为非群体感应淬灭剂。

以上任一所述群体感应淬灭剂为抑制群体感应系统的化合物。群体感应抑制化合物可通过抑制信号分子合成、阻止信号分子与受体蛋白结合等方式抑制群体感应系统。

以上任一所述群体感应淬灭剂为具有降解群体感应信号功能的物质(例如群体感应信号降解酶)。

所述群体感应信号可为酰化高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)。酰化高丝氨酸内酯类化合物可为N-3-羟基辛酰-DL-高丝氨酸内酯、N-己酰-L-高丝氨酸内酯、N-3-羰基己酰-DL-高丝氨酸内酯、N-3-羰基辛酰-DL-高丝氨酸内酯或N-3-羰基十二酸-L-高丝氨等。

本发明提供的试剂盒可用于筛选多种群体感应信号分子降解酶基因或抑制剂。采用本发明提供的试剂盒进行筛选，在单人手工操作条件下，一天内筛选转化子或者化合物可达1000个以上，适合群体感应信号降解酶基因和群体感应抑制化合物的高通量筛选。采用本发明提供的试剂盒进行筛选，灵敏度高、操作简单、反应结果容易观察，且筛选效率高、反应时间短、适合高通量筛选。我国幅员辽阔，微生物资源丰富，采用本发明提供的试剂盒可对不同地域不同环境条件下微生物中群体感应淬灭酶基因资源进行挖掘，同时该方法也适用于挖掘化合物文库中的群体感应抑制剂。新型群体感应淬灭剂的发现有利于丰富生防机制的内容，拓宽生物防治的研究层面，为细菌病害防治提供新的材料。本发明可以为动、植物病害的防治提供新的材料，同时也为新型药物的开发提供依据。

附图说明

图1为实施例2的步骤1的结果。

图2为实施例2的步骤2的结果。

图3为实施例2的步骤3的结果。

图4为实施例3的结果。

图5为实施例4的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

液体ABM培养基：20×盐溶液5mL、20×缓冲液5mL、10g/100mL甘露醇水溶液2mL、无菌水88mL。20×盐溶液：NH₄Cl 20g/L、KCl 3g/L、MgSO₄·7H₂O 6g/L、CaCl₂·2H₂O 0.2g/L、FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，余量为水，pH＝7.2。20×缓冲液：NaH₂PO₄ 23g/L、K₂HPO₄ 60g/L，余量为水，pH＝7.0。

液体LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L，余量为水，pH＝6.5。

C6-HSL，全称为N-己酰-L-高丝氨酸内酯，英文全称为N-hexanoyl-L-homoserinelactone，sigma，货号为56395。3OXO-C6-HSL，全称为N-3-羰基己酰-DL-高丝氨酸内酯，英文全称为N-(β-Ketocaproyl)-DL-homoserine lactone，sigma，货号为K3255。3OH-C8-HSL，全称为N-3-羟基辛酰-DL-高丝氨酸内酯，英文全称为N-(3-Hydroxyoctanoyl)-DL-homoserine lactone，sigma，货号为61698。3OXO-C8-HSL，全称为N-3-羰基辛酰-DL-高丝氨酸内酯，英文全称为N-(3-Oxooctanoyl)-DL-homoserine lactone，sigma，货号为O1639。3OXO-C12-HSL，全称为N-3-羰基十二酸-L-高丝氨酸内酯，英文全称为N-(3-Oxododecanoyl)-L-homoserine lactone，sigma，货号为O9139。

实施例中的溶液，如无特殊说明，溶剂均为水。上述高丝氨酸内酯化合物均溶解于甲醇。

实施例1、报告质粒和宿主菌的获得

一、群体感应信号报告质粒的构建

群体感应信号报告质粒，又称为报告质粒pBA7P，为序列表的序列1所示的环形质粒。

报告质粒pBA7P中具有两个功能片段，功能片段甲和功能片段乙。功能片段甲用于表达traR基因(traR基因如序列表的序列1第3830至4534位核苷酸所示，编码序列表的序列3所示的TraR蛋白)。功能片段乙自上游至下游依次包括如下元件：trabox调控元件(包括复合体结合区和启动子功能区)和β-内酰胺酶基因。tra box调控元件如序列表的序列2第1至46位核苷酸所示。β-内酰胺酶基因如序列表的序列2第93至953位核苷酸所示(编码序列表的序列4所示的β-内酰胺酶)。

TraR蛋白与酰化高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)结合形成复合体，tra box调控元件与复合体结合后促进启动子功能，从而启动β-内酰胺酶基因的表达。β-内酰胺酶可以催化显色底物(头孢硝噻酚)的内酰胺键断裂，报告反应体系由黄色变为红色，筛选容易观察。

二、宿主菌的构建

Agrobacterium tumefaciens NTL4，简称菌株NTL4，自身具有一定的内酰胺酶活性。将菌株NTL4接种至液体ABM培养基进行培养，加入头孢硝噻酚后反应体系由黄色变为淡红色，不利于筛选系统的有效工作。

以菌株NTL4为出发菌，进行Tn5随机突变，通过大量筛选，获得一株突变菌。将该突变菌命名为菌株N5，全称为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)N5。将菌株N5接种至液体ABM培养基进行培养，加入头孢硝噻酚后反应体系颜色保持黄色不变，可以有效进行筛选。

根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)N5，已于2018年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.16312。

实施例2、出发菌、宿主菌和重组菌的性能比较

将报告质粒pBA7P导入菌株NTL4，得到重组菌甲。

将报告质粒pBA7P导入菌株N5，得到重组菌乙。

检测供试菌(菌株NTL4、菌株N5、重组菌甲或重组菌乙)的性能，具体步骤如下：

1、将供试菌接种至液体ABM培养基，28℃、160rpm振荡培养至OD_600nm≈0.4；取96孔板，试验孔每孔加入190μL菌液和10μL 250μg/mL头孢硝噻酚溶液，观察体系颜色。照片见图1，重组菌甲和菌株NTL4的体系颜色均为淡红色，重组菌乙和菌株N5的体系颜色均为黄色。

2、将重组菌乙接种至液体ABM培养基，28℃、160rpm振荡培养至OD_600nm≈0.4；取96孔板，试验孔每孔加入190μL菌液和10μL 1μM 3OXO-C8-HSL溶液，对照孔每孔加入190μL菌液和10μL无菌水，振荡混匀后28℃静置培养2h，然后每孔加入10μL250μg/mL头孢硝噻酚溶液，振荡混匀，28℃静置培养10min后观察体系颜色。照片见图2。结果表明：信号分子3OXO-C8-HSL诱导β-内酰胺酶表达，降解头孢硝噻酚，试验孔报告体系的颜色由淡黄色变为红色，对照孔中则呈淡黄色。该报告体系颜色差异明显，容易观察，适用于高通量筛选。

3、将重组菌乙接种至液体ABM培养基，28℃、160rpm振荡培养至OD_600nm≈0.4；取96孔板，每孔加入190μL菌液和10μL信号分子溶液，振荡混匀后28℃静置培养2h，然后每孔加入10μL 250μg/mL头孢硝噻酚溶液，振荡混匀，28℃静置培养10min后观察体系颜色。信号分子为：C6-HSL、3OXO-C6-HSL、3OH-C8-HSL、3OXO-C8-HSL或3OXO-C12-HSL。信号分子溶液中，信号分子浓度分别为1、10、100、1000、10000或100000pM。照片见图3。重组菌乙对多种类型AHLs群体感应信号分子敏感，其中对3OXO-C8-HSL的灵敏度达10pM。

实施例3、基因组文库中群体感应信号降解酶基因的高通量筛选

一、基因组文库的构建

从土壤中分离得到一株细菌，将其命名为菌株D12，该菌株具有降解3OXO-C8-HSL信号分子的功能。

1、提取菌株D12的基因组DNA，用限制性内切酶Sau3AI进行部分酶切，回收30kb-40kb的片段。

2、用限制性内切酶BamHI和ScaI双酶切黏粒载体pLAFR5，回收酶切产物中的DNA分子。

3、将步骤1回收的片段与步骤2回收的DNA分子连接，纯化连接产物，然后利用噬菌体包装蛋白(Epicentre,Cat.No.MP5120)对连接产物进行包装，得到包装产物。

4、大肠杆菌DH5α接种于含10mM MgSO₄和0.2％麦芽糖的液体LB培养基(pH7.2)，37℃、140rpm振荡培养至OD_600nm＝0.8-1.0，然后转染步骤3得到的包装产物，得到转染产物。

5、将转染产物在含15μg/mL盐酸四环素(Tetracycline hydrochloride，上海生工生物工程有限公司，货号为A100422)的LB平板上37℃培养24h，每个菌落即为一个转化子。

二、筛选转化子报告菌的培养

1、将报告质粒pBA7P导入菌株N5，得到重组菌，命名为报告菌。将报告菌接种至含30μg/mL硫酸庆大霉素(Gentamycin sulfate，上海生工生物工程有限公司，货号为A620217)和50μg/mL硫酸卡那霉素(Kanamycin sulfate，上海生工生物工程有限公司，货号为A600286)的液体ABM培养基中，28℃、160rpm振荡培养至OD_600nm≈0.4，即为报告菌菌液。

2、取96孔板，每孔加入150μL液体LB培养基(pH6.5)，然后每孔接种1个转化子，37℃静置培养24h。将含有已知降解酶基因(aidH基因)的粘粒pLJ20(Mei et al.,2010)的转化子作为阳性对照。将含有黏粒载体pLAFR5的转化子作为阴性对照。

3、取完成步骤2的96孔板，每孔加入50μL 3OXO-C8-HSL溶液，混匀，37℃静置培养5h-6h。

3OXO-C8-HSL溶液：用液体LB培养基(pH6.5)配制400nM 3OXO-C8-HSL溶液。

4、取新的96孔板，每孔加入190μL步骤1得到的报告菌菌液，然后每孔加入10μL完成步骤3的菌液，混匀，28℃静置培养2h。

5、取完成步骤4的96孔板，每孔加入10μL 250μg/mL头孢硝噻酚溶液，混匀，28℃静置培养10min，观察孔中颜色变化。若孔中显示淡黄色，说明该转化子可能具有降解信号分子活性，可做进一步验证；若孔中显示红色，这说明该转化子不具有降解信号分子的活性。反应产物在490nm处具有吸收峰，使用酶标仪对显色后的结果进行定量分析。

以1500个转化子(约42.3Mbp基因组)为例，得到一个阳性转化子(见图4中黑色箭头标注)。经测序比对，该转化子含有与已报道的降解酶基因(aiiB基因)高度相似的群体感应淬灭酶基因(核苷酸一致性为81.7％，氨基酸序列一致性为93.0％)。发现的新基因如序列表的序列6所示，编码序列表的序列5所示的蛋白质。

实施例4、群体感应抑制化合物的高通量筛选

待筛选化合物4000个，分别用二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为5000ppm的溶液，记为待测溶液。

1、将报告质粒pBA7P导入菌株N5，得到重组菌，命名为报告菌。将报告菌接种至含30μg/mL硫酸庆大霉素和50μg/mL硫酸卡那霉素的液体ABM培养基中，28℃、160rpm振荡培养至OD_600nm≈0.4。

2、取96孔板，每孔加入196μL步骤1得到的菌液，然后每孔加入4μL待测溶液，混匀，28℃静置培养2h。以4-硝基吡啶-N-氧化物(4-NPO，百灵威科技有限公司，货号：274301)作为阳性对照。以DMSO作为阴性对照。

3、取完成步骤2的96孔板，每孔加入10μl 10μM 3OXO-C6-HSL溶液，混匀，28℃静置培养2h。

3OXO-C6-HSL溶液：用液体ABM培养基配制10μM 3OXO-C6-HSL溶液。

4、取完成步骤3的96孔板，每孔加入10μL 250μg/mL头孢硝噻酚溶液，混匀，28℃静置培养10min，观察孔中颜色变化。若孔中显示淡黄色，说明该化合物可能具有抑制群体感应系统活性，可做进一步验证；若孔中显示红色，这说明该化合物无群体感应抑制活性。反应产物在490nm处具有吸收峰，使用酶标仪对显色后的结果进行定量分析。

通过该筛选系统筛选得到多个阳性转化子(见图5中黑色箭头标注)。经后续实验验证已得到16个群体感应抑制化合物。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 用于高通量筛选细菌群体感应淬灭剂的试剂盒及其应用

<130> GNCYX181464

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7323

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ctcgggccgt ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60

cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120

ccggcgtctc aacgcgcttt gagattccca gcttttcggc caatccctgc ggtgcatagg 180

cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg 240

cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgttgca 300

gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc gcgggtcatc tgcgctttgt 360

tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt cagcggcacc acgaacgcgg 420

tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga tgctggccgt cacgatgcga tccgccccgt 480

acttgtccgc cagccacttg tgcgccttct cgaagaacgc cgcctgctgt tcttggctgg 540

ccgacttcca ccattccggg ctggccgtca tgacgtactc gaccgccaac acagcgtcct 600

tgcgccgctt ctctggcagc aactcgcgca gtcggcccat cgcttcatcg gtgctgctgg 660

ccgcccagtg ctcgttctct ggcgtcctgc tggcgtcagc gttgggcgtc tcgcgctcgc 720

ggtaggcgtg cttgagactg gccgccacgt tgcccatttt cgccagcttc ttgcatcgca 780

tgatcgcgta tgccgccatg cctgcccctc ccttttggtg tccaaccggc tcgacggggg 840

cagcgcaagg cggtgcctcc ggcgggccac tcaatgcttg agtatactca ctagactttg 900

cttcgcaaag tcgtgaccgc ctacggcggc tgcggcgccc tacgggcttg ctctccgggc 960

ttcgccctgc gcggtcgctg cgctcccttg ccagcccgtg gatatgtgga cgatggccgc 1020

gagcggccac cggctggctc gcttcgctcg gcccgtggac aaccctgctg gacaagctga 1080

tggacaggct gcgcctgccc acgagcttga ccacagggat tgcccaccgg ctacccagcc 1140

ttcgaccaca tacccaccgg ctccaactgc gcggcctgcg gccttgcccc atcaattttt 1200

ttaattttct ctggggaaaa gcctccggcc tgcggcctgc gcgcttcgct tgccggttgg 1260

acaccaagtg gaaggcgggt caaggctcgc gcagcgaccg cgcagcggct tggccttgac 1320

gcgcctggaa cgacccaagc ctatgcgagt gggggcagtc gaaggcgaag cccgcccgcc 1380

tgccccccga gcctcacggc ggcgagtgcg ggggttccaa gggggcagcg ccaccttggg 1440

caaggccgaa ggccgcgcag tcgatcaaca agccccggag gggccacttt ttgccggagg 1500

gggagccgcg ccgaaggcgt gggggaaccc cgcaggggtg cccttctttg ggcaccaaag 1560

aactagatat agggcgaaat gcgaaagact taaaaatcaa caacttaaaa aaggggggta 1620

cgcaacagct cattgcggca ccccccgcaa tagctcattg cgtaggttaa agaaaatctg 1680

taattgactg ccacttttac gcaacgcata attgttgtcg cgctgccgaa aagttgcagc 1740

tgattgcgca tggtgccgca accgtgcggc accctaccgc atggagataa gcatggccac 1800

gcagtccaga gaaatcggca ttcaagccaa gaacaagccc ggtcactggg tgcaaacgga 1860

acgcaaagcg catgaggcgt gggccgggct tattgcgagg aaacccacgg cggcaatgct 1920

gctgcatcac ctcgtggcgc agatgggcca ccagaacgcc gtggtggtca gccagaagac 1980

actttccaag ctcatcggac gttctttgcg gacggtccaa tacgcagtca aggacttggt 2040

ggccgagcgc tggatctccg tcgtgaagct caacggcccc ggcaccgtgt cggcctacgt 2100

ggtcaatgac cgcgtggcgt ggggccagcc ccgcgaccag ttgcgcctgt cggtgttcag 2160

tgccgccgtg gtggttgatc acgacgacca ggacgaatcg ctgttggggc atggcgacct 2220

gcgccgcatc ccgaccctgt atccgggcga gcagcaacta ccgaccggcc ccggcgagga 2280

gccgcccagc cagcccggca ttccgggcat ggaaccagac ctgccagcct tgaccgaaac 2340

ggaggaatgg gaacggcgcg ggcagcagcg cctgccgatg cccgatgagc cgtgttttct 2400

ggacgatggc gagccgttgg agccgccgac acgggtcacg ctgccgcgcc ggtagcactt 2460

gggttgcgca gcaacccgta agtgcgctgt tccagactat cggctgtagc cgcctcgccg 2520

ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc atggagccgg gccacctcga 2580

cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa cggattcacc gtttttatca ggctctggga 2640

ggcagaataa atgatcatat cgtcaattat tacctccacg gggagagcct gagcaaactg 2700

gcctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg gtagtcaata aaccggtaaa 2760

ccagcaatag acataagcgg ctatttaacg accctgccct gaaccgacga ccgggtcgaa 2820

tttgctttcg aatttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag 2880

gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc 2940

agtcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 3000

aaatattaac gcttacaatt tccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 3060

atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 3120

attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 3180

gcgcgcgtaa tacgactcac tatagggcga attggagctc caccgcggtg gcggccgctc 3240

tagaactagt ggatcccccg ggctgcagga attccgcaag tctattatgt cggtttattg 3300

ggcggcgtaa acgatatgga cctgctcgcc aaaacgggcg tggggcgtga cattaaccgg 3360

cactattacg gcaacgacga aatcggtacg gcccttgaga cgccgctctt ccatcgcctt 3420

tcaaatctga tccgtttcag gaacacccat cccgccttcg gtggagcgct caaggccacc 3480

attgctgatg ccggagcgtt ggtgctttca tggcaacacg gcgatgcttt tgctgaattg 3540

aagatctcat ttgccgaccg caaggcgagc attgccgcat ctggtcagag cgagatgcag 3600

atcgtcgagt gaactgcacg caagtgccgc ttccccggct cgatagcatg tacaggggga 3660

tagtacggat attcgtgaag cgttggagca tgtatgcctc gtggaaaaat gcttcggctc 3720

agcctgagtt gtctgggtaa aagaggatga aagcagattc agcccggcgg tcggctgctg 3780

ggagcaaacg ttagagtagg catcgcacac cagcatatgg gggtatggaa tgcagcactg 3840

gctggacaag ttgaccgatc ttgccgcaat tcagggcgac gagtgcatcc tgaaggatgg 3900

ccttgccgac cttgccgaac atttcggctt caccggctat gcctatctcc atatccagca 3960

caaacacacc atcgcggtca ccaattatca tcgtgactgg cgatcggctt acttcgagaa 4020

caacttcgac aagctcgatc cggtcgtcaa gcgcgcgaaa tccaggaagc acgtctttgc 4080

ctggtccggc gaacaggaac gatcgcggct atcgaaggaa gagcgtgcct tctacgcgca 4140

tgcggccgat ttcggcatcc gctccggcat caccattccg atcaagaccg ccaacggatc 4200

aatgtcgatg ttcacgctgg cgtcggaaag gccggcgatc gacctcgacc gtgagatcga 4260

cgcggccgca gccgcgggcg ccgtcgggca gctccatgcc cgcatctctt tccttcagac 4320

cactccgaca gtggaagatg ccgcctggct cgatccgaaa gaggcgacct atctcagatg 4380

gatcgccgtc ggcatgacaa tggaggaagt cgcagacgtg gagggcgtca agtacaacag 4440

cgtccgtgtc aagctccgcg aggccatgaa gcgcttcgac gttcgcagca aggcccatct 4500

caccgccctc gcaatcagaa gaaagctgat ctgaaaacgt gacagacaaa ccaggggaga 4560

ggaatgatgt cagtaacttc ctatacgttc tacacctatt ctcaggcgac tgccgatgat 4620

caggcgcact ggctgcacgg gcacaccacc gttcagtttt tcgatagcct ggaagcggcc 4680

cggcaggagt tagtcaagtt gcacgaagac ctaagccagg atctcgacct cacgtggcgt 4740

ccgctctatc tcgaaaaaat cgagacccgg gccgtcacaa aagagctgct gctgtctttg 4800

ctcaatcgca acatggaagc ccttatcgag cggcacatga ttgttgatac aatctcctcc 4860

ttctcttcga gcgctttaag cgggcataat tgatggatgc cagttccatg tttaaatgaa 4920

gattaaacat cgtatgcaac tattcgcgct ctgccgcgac cttcggtccg gtaagtatcc 4980

ttgggaggtc gcctggtgaa tattctcaat cgtggtgcca atgcatgcgc ggtacttgct 5040

gccctctcta agtctcaggc catgatcgaa ttcgatatca agcttttacc aatgcttaat 5100

cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 5160

cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 5220

accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 5280

ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 5340

ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 5400

tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 5460

acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 5520

tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 5580

actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 5640

ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 5700

aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 5760

ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 5820

cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 5880

aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 5940

actcatatgg gtcgcatctc cctggaaatc ctgcggcgtc tgttccgctg caagatttcc 6000

tcaaaagcac ttcggaagga atgtgcagat ctgcacgtcg gcaaagaagc ttatcgatac 6060

cgtcgacctc gagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 6120

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcat gcataaaaac tgttgtaatt cattaagcat 6180

tctgccgaca tggaagccat cacaaacggc atgatgaacc tgaatcgcca gcggcatcag 6240

caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggacgca caccgtggaa acggatgaag 6300

gcacgaaccc agttgacata agcctgttcg gttcgtaaac tgtaatgcaa gtagcgtatg 6360

cgctcacgca actggtccag aaccttgacc gaacgcagcg gtggtaacgg cgcagtggcg 6420

gttttcatgg cttgttatga ctgttttttt gtacagtcta tgcctcgggc atccaagcag 6480

caagcgcgtt acgccgtggg tcgatgtttg atgttatgga gcagcaacga tgttacgcag 6540

cagcaacgat gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca aagttaggtg gctcaagtat 6600

gggcatcatt cgcacatgta ggctcggccc tgaccaagtc aaatccatgc gggctgctct 6660

tgatcttttc ggtcgtgagt tcggagacgt agccacctac tcccaacatc agccggactc 6720

cgattacctc gggaacttgc tccgtagtaa gacattcatc gcgcttgctg ccttcgacca 6780

agaagcggtt gttggcgctc tcgcggctta cgttctgccc aggtttgagc agccgcgtag 6840

tgagatctat atctatgatc tcgcagtctc cggcgagcac cggaggcagg gcattgccac 6900

cgcgctcatc aatctcctca agcatgaggc caacgcgctt ggtgcttatg tgatctacgt 6960

gcaagcagat tacggtgacg atcccgcagt ggctctctat acaaagttgg gcatacggga 7020

agaagtgatg cactttgata tcgacccaag taccgccacc taacaattcg ttcaagccga 7080

gatcggcttc ccggccgcgg agttgttcgg taaattgtca caacgccgcc aggtggcact 7140

tttcggggaa atgtgcgcgc ccgcgttcct gctggcgctg ggcctgtttc tggcgctgga 7200

cttcccgctg ttccgtcagc agcttttcgc ccacggcctt gatgatcgcg gcggccttgg 7260

cctgcatatc ccgattcaac ggccccaggg cgtccagaac gggcttcagg cgctcccgaa 7320

ggt 7323

<210> 2

<211> 953

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

acgtgcagat ctgcacattc cttccgaagt gcttttgagg aaatcttgca gcggaacaga 60

cgccgcagga tttccaggga gatgcgaccc atatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 120

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 180

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 240

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 300

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 360

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 420

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 480

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 540

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 600

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 660

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 720

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 780

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 840

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 900

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taa 953

<210> 3

<211> 234

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Gln His Trp Leu Asp Lys Leu Thr Asp Leu Ala Ala Ile Gln Gly

1 5 10 15

Asp Glu Cys Ile Leu Lys Asp Gly Leu Ala Asp Leu Ala Glu His Phe

20 25 30

Gly Phe Thr Gly Tyr Ala Tyr Leu His Ile Gln His Lys His Thr Ile

35 40 45

Ala Val Thr Asn Tyr His Arg Asp Trp Arg Ser Ala Tyr Phe Glu Asn

50 55 60

Asn Phe Asp Lys Leu Asp Pro Val Val Lys Arg Ala Lys Ser Arg Lys

65 70 75 80

His Val Phe Ala Trp Ser Gly Glu Gln Glu Arg Ser Arg Leu Ser Lys

85 90 95

Glu Glu Arg Ala Phe Tyr Ala His Ala Ala Asp Phe Gly Ile Arg Ser

100 105 110

Gly Ile Thr Ile Pro Ile Lys Thr Ala Asn Gly Ser Met Ser Met Phe

115 120 125

Thr Leu Ala Ser Glu Arg Pro Ala Ile Asp Leu Asp Arg Glu Ile Asp

130 135 140

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Gly Gln Leu His Ala Arg Ile Ser

145 150 155 160

Phe Leu Gln Thr Thr Pro Thr Val Glu Asp Ala Ala Trp Leu Asp Pro

165 170 175

Lys Glu Ala Thr Tyr Leu Arg Trp Ile Ala Val Gly Met Thr Met Glu

180 185 190

Glu Val Ala Asp Val Glu Gly Val Lys Tyr Asn Ser Val Arg Val Lys

195 200 205

Leu Arg Glu Ala Met Lys Arg Phe Asp Val Arg Ser Lys Ala His Leu

210 215 220

Thr Ala Leu Ala Ile Arg Arg Lys Leu Ile

225 230

<210> 4

<211> 286

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala

1 5 10 15

Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys

20 25 30

Asp Ala Glu Asp Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp

35 40 45

Leu Asn Ser Gly Lys Ile Leu Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe

50 55 60

Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser

65 70 75 80

Arg Ile Asp Ala Gly Gln Glu Gln Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser

85 90 95

Gln Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr

100 105 110

Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala Ile Thr Met Ser

115 120 125

Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr Ile Gly Gly Pro Lys

130 135 140

Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu

145 150 155 160

Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala Ile Pro Asn Asp Glu Arg

165 170 175

Asp Thr Thr Met Pro Val Ala Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu

180 185 190

Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gln Gln Leu Ile Asp Trp

195 200 205

Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro

210 215 220

Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp Lys Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser

225 230 235 240

Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile

245 250 255

Val Val Ile Tyr Thr Thr Gly Ser Gln Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn

260 265 270

Arg Gln Ile Ala Glu Ile Gly Ala Ser Leu Ile Lys His Trp

275 280 285

<210> 5

<211> 256

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Met Leu Gln Ser Gly Thr Leu Lys Cys Lys Val His Asn Ile Lys Met

1 5 10 15

Asn Gln Gly Asp Gly Ala Asp Tyr Glu Ile Pro Val Pro Phe Phe Leu

20 25 30

Ile Thr His Pro Asp Gly His Thr Val Ile Asp Gly Gly Asn Ala Ile

35 40 45

Glu Val Ala Thr Asp Pro Arg Gly His Trp Gly Gly Val Cys Asp Val

50 55 60

Tyr Trp Pro Val Leu Asp Lys Asp Gln Gly Cys Val Asp Gln Ile Lys

65 70 75 80

Ala Leu Gly Phe Asp Pro Ala Asp Val Lys Tyr Val Val Gln Ser His

85 90 95

Leu His Leu Asp His Thr Gly Ala Ile Gly Arg Phe Pro Asn Ala Thr

100 105 110

His Ile Val Gln Arg Arg Glu Tyr Glu Tyr Ala Phe Thr Pro Asp Trp

115 120 125

Phe Ala Ala Gly Gly Tyr Ile Arg Lys Asp Phe Asp Lys Pro Gly Leu

130 135 140

Lys Trp Gln Phe Leu Asn Gly Ala Asp Asp Asp Leu Tyr Asp Ile Tyr

145 150 155 160

Gly Asp Gly Thr Leu Thr Thr Ile Phe Thr Pro Gly His Ala Pro Gly

165 170 175

His Gln Ser Phe Leu Val Arg Val Pro Glu Ser Lys Pro Leu Leu Leu

180 185 190

Thr Ile Asp Ala Ala Tyr Thr Leu Asp His Trp Glu Glu Lys Ala Leu

195 200 205

Pro Gly Phe Leu Ala Ser Thr Val Asp Thr Val Arg Ser Val Gln Lys

210 215 220

Leu Arg Thr Ile Ala Asp Lys Thr Asp Ala Ile Val Val Thr Gly His

225 230 235 240

Asp Pro Asp Ala Trp Ser Thr Phe Lys Lys Ala Pro Glu Tyr Tyr Gly

245 250 255

<210> 6

<211> 771

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atgcttcaat ccggaacctt gaagtgcaag gtacacaaca tcaagatgaa ccagggagac 60

ggcgcggatt acgaaatccc cgtccctttc ttcctgatca cccacccgga cgggcatacc 120

gtcatcgatg gcggcaatgc gatcgaagtg gcaaccgacc cgcgcggcca ttggggcggc 180

gtgtgcgatg tctattggcc ggttctggac aaggatcagg gctgcgtcga tcagataaag 240

gcgctcggct tcgaccctgc ggatgtcaaa tacgtcgtcc agtcccacct gcatctcgat 300

cacaccggcg ccatcggtcg ctttcccaat gccacccata tcgtccaacg ccgagaatat 360

gaatacgcct tcacgccgga ctggtttgcg gcaggcggct atatccgaaa ggatttcgat 420

aaaccgggtc tgaaatggca gttcctcaac ggcgcggatg acgatctcta cgacatttac 480

ggcgatggta cccttacgac catattcact cccggccacg ctccgggcca ccagtccttc 540

ctggtgcgag tgccggagag caagccgttg ctgctcacca tcgacgctgc ctacacgctc 600

gatcactggg aagaaaaggc attgccaggc ttcctcgcct ccactgtaga caccgtgcgt 660

tccgtacaga aactgagaac aattgccgat aaaacagatg cgatcgtggt gacggggcat 720

gaccccgacg cttggtcgac cttcaaaaaa gctcccgaat attacggctg a 771

Claims

1.一种特异质粒，为序列表的序列1所示的环形质粒。

2.一种重组菌，是将权利要求1所述特异质粒导入宿主菌得到的；所述宿主菌为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)N5，其保藏登记号为CGMCC No.16312。

3.一种用于筛选群体感应淬灭剂的试剂盒，包括质粒和宿主菌；所述质粒为权利要求1所述特异质粒；所述宿主菌为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)N5，其保藏登记号为CGMCC No.16312。

4.权利要求1所述特异质粒、权利要求2所述重组菌或权利要求3所述试剂盒的应用，为筛选群体感应淬灭剂。