CN105504002A - 一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，在自然光下，没有被噬菌体侵染的细菌不显蓝色，噬菌体侵染的细菌显蓝色；在加入致死条件诱导剂诱导下，具有抑制QS功能的特异多肽因抑制QS分子的活性而不启动自杀基因的表达，因此存活；而非特异多肽无法抑制QS分子，导致自杀基因启动致死；然后将存活的候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的QSI多肽。本发明步骤简单，只需要3天至一周左右的时间，就可以获得多个QSI候选多肽，因此具有非常明显的优势。

Description

一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法

技术领域

本发明涉及基因工程与适体技术，公开了针对筛选细菌群体感应抑制物的噬菌体展示技术。具体而言，特指一种筛选细菌群体感应抑制物的技术，该方法同样也适用于长、短链N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)的群体感应分子抑制物的筛选。本发明中涉及的噬菌体展示技术可适用于例如噬菌体抗体库、环肽、线性多肽等带有随机文库的任何噬菌体文库。涉及的宿主菌为可以被噬菌体文库侵染的雄性F’细菌，例如ER2738、DH5αF’、XL1-Blue，涉及的载体为加入QS分子可导致自身基因诱导细菌死亡的载体pSB537。属于病原微生物预防与控制领域。

背景技术

细菌耐药的形势严峻，如何提高新药研发速度，抑制或杀死病原菌的要求迫在眉睫。目前新药的开发主要有几种方法：一是传统的经典方法，即从自然环境例如土壤或者植物中筛选天然抗生素或者抗菌物质。但筛选天然抗菌物质的方法存在着过程繁琐，工作量大等问题，需要在筛选规模与通量上得到质的提高；二是人工合成或者半合成的抗生素，通过修改一些化学修饰改变化合物结构，提高药效。但由于同类合成的抗生素都具有类似化学结构和作用机理，因此容易对同类耐药细菌产生抗性；三、近十几年来在国际知名药物公司和科研机构中发展十分迅速的高通量药物筛选技术，使新药的大规模筛选、靶点确认、自动化以及效价评估成为可能。同时，该技术也面临着筛选模型与数据库有限的技术难题；除上述几种抑菌方法以外，还有一些利用细菌特殊生理功能以及重要靶点的新型抑菌药物正在研究开发。例如消除细菌生物膜生成、抑制细菌群体感应以及抗体靶向抑制耐药菌的策略。这些方法为新型药物开发提供了新的思路，有待于进一步研究。

细菌的群体感应（QS,quorumsensing）是指细菌根据自身细胞密度变化进行基因表达调控的群体行为，研究发现，自然界中大部分的细菌都存在QS现象，它不仅控制细菌的生物发光，还与生物被膜和孢子生成、毒素分泌、质粒转移以及包括抗生素在内的第二代谢产物合成紧密相关。目前已知的细菌QS系统，可以根据分泌的化学信号分子性质（又称为自诱导物，AI,autoinducer）分为以下4类：一类信号分子为AI-1，是N-酰基高丝氨酸内酯类（AHLs）及其衍生物,广泛分布在革兰氏阴性细菌中并具有种属特异性。该类分子作用机理的研究相对比较透彻：AHLs分子由一系列具有相同高丝氨酸内酯环和不同碳原子数目和饱和程度的酰胺侧链构成，N侧链中的碳原子数多为偶数（只有C7一个奇数），从C4至C18不等，而且在3碳位置上可以有不同的取代基团。如图1所示，以费氏弧菌为例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并扩散到细胞外，当细胞密度增加到一定阈值时，AHLs与LuxR家族蛋白结合，从而使LuxR族蛋白与DNA上的调控元件结合，起始转录LuxCDABEG，启动生物发光过程；第二类是由LuxS家族蛋白形成的自诱导物AI-2，其主要成分为呋喃酮酰硼酸酯。文献报道AI-2在多种革兰氏阳性和阴性细菌中存在，是不同物种细菌间相互联系的通用信号。另外两类是在革兰氏阳性细菌中独有的寡肽类分子AIP（Autoinducingpeptide）以及目前机制还尚未完全清楚的肾上腺素/去甲肾上腺素信息系统（AI-3）信号分子。

由于QS在细菌的生命活动中所起的重要作用，抑制细菌群体感应并不影响细菌的生长，但却可以减少生物膜的生成、影响细菌毒素的分泌并且很难产生耐药性，因此，开发针对QS相关基因或者其分泌的信号小分子物质的抑制物，称之为群体感应抑制剂（QSI，quorumsensinginhibitor）或者群体感应淬灭（QQ，quorumquenching），是一个具有广阔应用潜力的抑菌策略，也是今后新型抗生素替代品的理想化合物来源，成为当前药物开发研究的热点。

发明内容

关于QSI分子的筛选，目前主要集中在对AHLs和AI-2的抑制上。QSI的来源可以大致分为4种，一种是从环境中提取的天然QSI分子。例如从海洋红藻Deliseapulchra、海洋珊瑚Euniceaknighti、大蒜等天然物质中提取的AHLs和呋喃酮类物质；一种是根据信号分子的结构，人工设计和合成其相似结构分子，以达到与QS分子竞争底物但又不激活活性的目的；还有一种是利用表达QS分子降解酶的方法；此外，还有利用QS筛选特异抗体或者适体的方法。以上四种是当前获得QSI的主要来源，但是都存在一些问题：植物等来源的样品成份复杂，QSI前期的提取、鉴定和纯化过程繁琐而且还受到样品纯度与温度、地域等不确定因素的限制；人工设计合成与抗体筛选不仅需要专业的化学合成与结构分析背景，还要考虑到样品制备过程的繁琐程度，专业的设备、中间产物毒性与污染评估以及样品纯度等一系列问题。

这些问题制约着QSI分子筛选的进一步发展，急需一种能快速、高通量地筛选出高效QSI分子的新方法。因此，本发明所要解决的技术问题是：建立一种简单、快速地筛选抑制不同类型QS分子特异性多肽的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

将噬菌体展示随机肽库与QS自杀感应菌株相结合的方法来筛选QSI分子。噬菌体展示随机肽库（Phagedisplay），是将一段长度大约为15-36bp的随机核苷酸序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因内，外源短肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。理论上,7个随机氨基酸序列可产生约20⁷种多肽序列，可以作为“人工抗体”，筛选出能特异性结合靶物质的多肽。该技术一般采用生物淘选（Biopanning）的方法来筛选抗原表位，其基本技术流程大致为：将靶蛋白或物质包被固定在聚乙烯平板中，再加入噬菌体展示肽库与之特异性结合，经过多轮的清洗和筛选后，获得与靶物质结合较紧密的噬菌体克隆，最终确认特异的短肽序列。但由于本专利研究的靶物质是N-酰基高丝氨酸内酯类（AHLs）以及呋喃酮酰硼酸酯等小分子物质，很难直接包被在平板上进行富集，因此本专利中采用一个与传统生物淘选方法完全不同的特异多肽筛选策略。主要原理是如图2所示：感应到QS分子将致死的感应菌株与噬菌体随机肽库孵育侵染，在添加入相应抗生素、特异QS信号分子、致死条件诱导剂和IPTG/X-gal诱导孵育平板长菌。在自然光下，没有被噬菌体侵染的细菌不显蓝色，噬菌体侵染的细菌显蓝色；在加入致死条件诱导剂诱导下，具有抑制QS功能的特异多肽因抑制QS分子的活性而不启动自杀基因的表达，因此存活。而非特异多肽无法抑制QS分子，导致自杀基因启动致死。然后将存活的候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的QSI多肽。

本发明所要解决的问题是通过以下技术途径来实现的：如图2所示，本发明公开了一个利用M13噬菌体展示随机肽库筛选QSI多肽的方法。以QS分子C4-AHL感应致死载体pSB537为例，如图2所示，该质粒带有嗜水气单胞菌群体感应系统AhyRI’和条件致死基因SacB，AhyR蛋白感应C4-AHL分子，激活AhyI’启动子，诱导细菌表达SacB蛋白。在添加自杀诱导物20%蔗糖后，可导致细菌死亡，只有添加或者产生QSI分子才能使细胞存活。然后利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB537的F’大肠杆菌，在添加C4-AHL分子、四环素、氨苄青霉素、20%蔗糖和IPTG/X-gal的平皿中筛选出在可见光下显蓝色、12小时孵育后能正常生长的噬菌斑。然后将该噬菌体扩增，加入带有pSB536的QS感应菌株中，通过抑制生物发光的方法验证QSI功能，最后测序获得特异QSI多肽序列。需要指出的是，目前已经有利用自杀基因SacB或者PhlA来筛选QSI的载体，例如QSIS1和QSIS213，因此本专利重点描述的是利用噬菌体展示技术与QS感应自杀载体结合的技术。

所述方法具体包括如下：

（1）将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株，获得菌株，从划线平板中挑取该单菌落并接种到5ml添加有20μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37^oC、250rpm振荡过夜，以2%接种量转接到LB培养基中，然后在200rpm条件下振荡至对数生长中期并收集1mL菌体后重悬于200μLLB培养基中待用；

（2）将噬菌体肽库放置冰上化冻，取10μL稀释到90μL无菌水中，再分别将步骤（1）中待用重悬后的200μL菌液与10μL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5min；吸取上述所有预混液加入3mL、45^oC温浴已融化的含有10-30wt.%蔗糖、0.7wt.%琼脂粉的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素、10μMC4-AHL、10-30wt.%蔗糖、1.5wt.%琼脂粉的IPTG/X-galLB培养基平板上；待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37^oC培养箱中静置培养12-16h；

（3）翌日，将过夜平板分别在白光光源下拍照比对，分析比较在致死条件下能够生长且存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37^oC、250rpm振条件下，培养4-5h；

（4）然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含pSB536质粒菌株过夜活化后，按2%接种量转接至LB培养基中培养3h，再以体积比1：100稀释于LB培养基后添加终浓度为10μMC4-AHL信号分子待用，最后以每孔200μL体积量添加于96孔黑色微孔板中，并将待用上清，即外源添加所筛选出阳、阴性结果的上清10μL加入到96孔黑色微孔板，充分混匀后于37℃多孔道酶标仪中，在OD490nm波长下每小时监测一次，共监测12-16h；

（5）利用化学发光成像技术，将该监测后的96孔黑色微孔板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为10min；根据拍照结果，挑选出目标噬菌体，最终，将目的噬菌体灭活后送测序。

所述的IPTG/X-galLB培养基制备方法为：称取1.25gIPTG、1gX-gal溶于25mL二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1%添加到LB培养基中；所述的LB培养基为5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，pH7.4－7.6,1000mL。

所述的上层琼脂LB培养基为LB培养基中添加10-30wt.%蔗糖、0.7wt.%琼脂粉。

所述质粒为pSB537，其制备方法为，将含有pSB536质粒菌株利用碱裂解法提取该质粒，利用分子改造技术将该质粒中发光基因序列LuxCDABE替换成致死基因序列SacB，经测序及功能验证后保存于-20^oC备用，致死基因序列SacB序列如SEQIDNO.1所示。

本发明的优点在于：本发明中使用的方法在原理上与现有筛选QSI的策略几乎完全不同，首先它利用随机文库筛选获得特异性多肽序列，在实验室中就可以获得结果，不需要从自然界的众多生物中去筛选，这样就省去了选材盲目、样品处理步骤繁琐、结果无法预知、最终抑制物的结构和性质很难分离鉴定等问题；其次，和目前仅有的利用噬菌体抗体文库筛选群体感应抑制多肽的方法相比，也有很大的不同。目前的文库筛选方法，是先用QS分子化学修饰生成半抗原，然后免疫动物并构建特异性抗体噬菌体文库，最后进行传统的生物淘洗方法寻找特异性抗体。该方法需要复杂的化学结构背景，半抗原的构建还取决于QS分子自身的化学结构。而本发明适用于任何已知道基因调控背景的QS元件。同时，以往方法共有的问题是，步骤繁琐，耗时长，需找一个QSI至少需要花费1个月至半年以上的时间。本发明步骤简单，只需要3天至一周左右的时间，就可以获得多个QSI候选多肽，因此具有非常明显的优势。该发明专利不仅可以用于抑制细菌毒性、生物膜形成，降低细菌耐药性等医疗用途，还可以用于相对应QS分子检测试剂盒的开放。

附图说明

图1.费氏弧菌中LuxR/LuxI系统的QS感应原理简单示意图。

图2.本专利中构建的QSI诱导质粒pSB537_SacB图谱。

图3.本专利中筛选细菌群体感应抑制剂(QSI)多肽的原理示意图。

图4.本专利中筛选细菌群体感应抑制剂(QSI)多肽的试验流程图。

图5.筛选的噬菌体上清影响QS生物发光感应菌株pSB536情况。A）孵育24小时后，OD490nm下，带pSB536质粒的大肠杆菌生物发光OD值，C4-AHL+为阳性对照（未添加外源添加物）、C4-AHL为阴性对照（未添加信号分子以及外源添加物）、C4-AHL+peptide1为随机挑选的非特异菌斑上清、C4-AHL+peptid2-5为实验组（在致死条件下能够在平板生长且存在噬菌斑的个体菌落）；B)孵育24小时后，相应添加物在化学发光成像仪下图像。以上试验在96孔黑色微孔板中完成，各重复三次，三个星号代表与只加C4-AHL相比显著性差异P<0.001。

具体实施方式

所述方法具体包括如下：

（1）将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株，获得菌株，从划线平板中挑取该单菌落并接种到5ml添加有20μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37^oC、250rpm振荡过夜，以2%接种量转接到LB培养基中，然后在200rpm条件下振荡至对数生长中期并收集1mL菌体后重悬于200μLLB培养基中待用；

（2）将噬菌体肽库放置冰上化冻，取10μL稀释到90μL无菌水中，再分别将步骤（1）中待用重悬后的200μL菌液与10μL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5min；吸取上述所有预混液加入3mL、45^oC温浴已融化的含有10-30wt.%蔗糖、0.7wt.%琼脂粉的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素、10μMC4-AHL、10-30wt.%蔗糖、1.5wt.%琼脂粉的IPTG/X-galLB培养基平板上；待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37^oC培养箱中静置培养12-16h；

（3）翌日，将过夜平板分别在白光光源下拍照比对，分析比较在致死条件下能够生长且存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37^oC、250rpm振条件下，培养4-5h；

（4）然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含pSB536质粒菌株过夜活化后，按2%接种量转接至LB培养基中培养3h，再以体积比1：100稀释于LB培养基后添加终浓度为10μMC4-AHL信号分子待用，最后以每孔200μL体积量添加于96孔黑色微孔板中，并将待用上清，即外源添加所筛选出阳、阴性结果的上清10μL加入到96孔黑色微孔板，充分混匀后于37^oC多孔道酶标仪中，在OD490nm波长下每小时监测一次，共监测12-16h；

（5）利用化学发光成像技术，将该监测后的96孔黑色微孔板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为10min；根据拍照结果，挑选出目标噬菌体，最终，将目的噬菌体灭活后送测序。

所述的IPTG/X-galLB培养基制备方法为：称取1.25gIPTG、1gX-gal溶于25mL二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1%添加到LB培养基中；所述的LB培养基为5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，pH7.4－7.6,1000mL。

所述的上层琼脂LB培养基为LB培养基中添加10-30wt.%蔗糖、0.7wt.%琼脂粉。

实施例1

1.材料方法

实验材料BamHI、EcoRI购自Thermoscientific公司；QuorumSensing检测质粒pSB536和E.coliJM109（SIMONSWIFTet,1997）宿主菌为本实验室保存，ER2738宿主菌、噬菌体环7肽库Ph.D.-C7C^TMPhageDisplayPeptideLibraryKit购自美国NewEnglandBiolabs纽英伦生物技术有限公司；抗生素四环素、氨苄青霉素购于Sigma公司，其他蔗糖等相关药品试剂及培养基分别购于中国国药集团化学有限公司与英国OXOID公司。引物合成和序列测定由上海立菲生物技术有限公司完成；信号分子N-butyryl-L-Homoserinelactone（C4-AHL）购自Cayman公司,货号10007898，50mg。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实验步骤

(1)首先，将实验室所保存的含有pSB536质粒菌株利用碱裂解法提取该质粒，利用分子改造技术将该质粒中发光基因序列LuxCDABE通过酶切位点BamHI、EcoRI替换成致死基因序列SacB，经测序及功能验证后保存于-20^oC备用，命名为pSB537；同时将噬菌体环7肽库试剂盒中的侵染所用宿主菌ER2738利用氯化钙法制备感受态（参考分子克隆实验指南第四版）；然后取出核酸含量为100ng的pSB537质粒运用热激转化法将该质粒转导入所制备的ER2738感受态中。以上该步骤的实施，有效的提高了本实验筛选的过程中噬菌体对宿主菌侵染能力，故将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒pSB537转导入大肠杆菌ER2738菌株尤为必要。从划线平板中挑取单菌落ER2738接种至5ml含有终浓度为20μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中37^oC，250rpm振荡过夜；翌日，取过夜菌以1:200转接到LB培养基中，然后在200rpm条件下振荡至对数生长中期并收集1mL菌体后重悬于200μLLB培养基中待用；

(2)然后，将噬菌体C7C环肽文库（NEB公司）放置冰上化冻，取出10μL稀释至90μL无菌水中，再分别将步骤（1）稀释后待用的200μL菌液与该稀释后10μL的噬菌体肽库轻轻混匀，置于室温条件下孵育2-5min；接着吸取上述预混液加入45^oC温浴已融化的含有10-30wt.%蔗糖、0.7wt.%琼脂粉的上层琼脂LB培养基，迅速充分混匀并倾倒至含有终浓度为20μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素、20wt.%蔗糖和10μMC4-AHL、1.5wt.%琼脂粉的IPTG/X-gal下层固体LB培琼脂培养基平板上；除以上实验组之外，还设置了一组不添加信号分子的对照组，等待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37^oC培养箱中静置培养14h；

(3)翌日,将过夜平板分别在白光光源下拍照比对，分析比较在致死条件下能够生长且存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落以及对照未显蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37^oC、250rpm振条件下，培养5h；

(4)此后，将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含QS信号分子C4-AHL感应质粒pSB536菌株过夜活化后以体积比1:100转接到LB培养基中200rpm3h，再将其以1：100稀释于LB培养基中并添加终浓度为10μM的C4-AHL混匀后，以每孔200μL体积量添加于96孔黑色微孔板中，再外源添加筛选出阳性结果的上清10μL为实验组，并以不含信号分子为阴性对照以及含有信号分子为阳性对照，每组设三个重复；将上清液加入96孔黑色微孔板充分混匀后于37^oC培养箱，静置过夜培养。

(5)最后，利用化学发光成像技术，将该过夜的96孔黑色微孔板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为10min。结果如图5所示，不含外源添加物和添加随机序列的噬菌体上清的阳性对照发光强度和490nm吸收光值最强，其他挑选的peptide2-5上清与不添加信号分子的阴性对照一样不发光。最终，将这些验证后目的噬菌斑扩增后失活，送至北京金唯智测序公司测序，以进行进一步生物验证分析。

综上所述，利用QS感应自杀菌株可以被QSI抑制拯救的特性，结合噬菌体随机文库展示技术进行QSI的筛选，解决传统噬菌体文库展示方法中，小分子物质化学结构复杂，难以固定的难题，可以迅速、大规模地筛选针对各种不同类型QS分子的QSI；同时，根据QSI多肽的空间结构，可以为研究与QS分子相互作用的天然蛋白三维构象预测提供参考依据。因此，本专利具有理论与实际运用的多重优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建农林大学

<120>一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法

<130>2

<160>2

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>5796

<212>DNA

<213>发光基因序列LuxCDABE

<400>1

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<212>DNA

<213>致死基因序列SacB序列

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Claims (4)

1.一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于：所述方法为：感应到QS分子将致死的感应菌株与噬菌体随机肽库孵育侵染，再添加入相应抗生素、特异QS分子、致死条件诱导剂和IPTG/X-gal诱导孵育平板长菌，在自然光下，没有被噬菌体侵染的细菌不显蓝色，噬菌体侵染的细菌显蓝色；在加入致死条件诱导剂诱导下，具有抑制QS功能的特异多肽因抑制QS分子的活性而不启动自杀基因的表达，因此存活；而非特异多肽无法抑制QS分子，导致自杀基因启动致死；然后将存活的候选克隆挑出来，进一步功能验证，最后通过DNA测序的方法获得特异多肽序列对应的DNA序列，从而获得高效、特异的QSI多肽。

2.根据权利要求1所述的一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于：所述方法具体包括如下：

（1）将QS信号分子C4-AHL感应自杀质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株，获得菌株，从划线平板中挑取该单菌落并接种到5ml添加有20μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37^oC、250rpm振荡过夜，以2%接种量转接到LB培养基中，然后在200rpm条件下振荡至对数生长中期并收集1mL菌体后重悬于200μLLB培养基中待用；

（2）将噬菌体肽库放置冰上化冻，取10μL稀释到90μL无菌水中，再分别将步骤（1）中待用重悬后的200μL菌液与10μL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2-5min；吸取上述所有预混液加入3mL、45^oC温浴已融化的含有10-30wt.%蔗糖、0.7wt.%琼脂粉的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20μg/mL四环素、100μg/mL氨苄青霉素、10μMC4-AHL、10-30wt.%蔗糖、1.5wt.%琼脂粉的IPTG/X-galLB培养基平板上；待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37^oC培养箱中静置培养12-16h；

（3）翌日，将过夜平板分别在白光光源下拍照比对，分析比较在致死条件下能够生长且存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37^oC、250rpm振条件下，培养4-5h；

（4）然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将原始含pSB536质粒菌株过夜活化后，按2%接种量转接至LB培养基中培养3h，再以体积比1：100稀释于LB培养基后添加终浓度为10μMC4-AHL信号分子待用，最后以每孔200μL体积量添加于96孔黑色微孔板中，并将待用上清，即外源添加所筛选出阳、阴性结果的上清10μL加入到96孔黑色微孔板，充分混匀后于37^oC多孔道酶标仪中，在OD490nm波长下每小时监测一次，共监测12-16h；

（5）利用化学发光成像技术，将该监测后的96孔黑色微孔板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为10min；根据拍照结果，挑选出目标噬菌体，最终，将目的噬菌体灭活后送测序。

3.根据权利要求2所述的一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于：所述的IPTG/X-galLB培养基制备方法为：称取1.25gIPTG、1gX-gal溶于25mL二甲基甲酰胺为母液，然后用时按体积分数为0.1%添加到LB培养基中；所述的LB培养基为5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，pH=7.4－7.6，1000mL。

4.根据权利要求2所述的一种利用自杀基因快速筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于：所述质粒为pSB537，其制备方法为，将含有pSB536质粒菌株利用碱裂解法提取该质粒，利用分子改造技术将该质粒中发光基因序列LuxCDABE替换成致死基因序列SacB，经测序及功能验证后保存于-20^oC备用，发光基因序列LuxCDABE序列如SEQIDNO.1所示致死基因序列SacB序列如SEQIDNO.2所示。