CN101503730A

CN101503730A - 一种检测革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的方法

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Publication number: CN101503730A
Application number: CNA2009100258686A
Authority: CN
Inventors: 綦国红; 董明盛; 陈贵堂; 王岁楼; 李博; 杨志萍
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2009-03-12
Filing date: 2009-03-12
Publication date: 2009-08-12

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的检测方法。其特征是：使用细菌生物感应器紫色杆菌CVO26和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，采用肉眼观察即可检测出待检微生物是否产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂。本发明的检测方法简单、快速。

Description

一种检测革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的检测方法。

背景技术

许多海洋细菌聚集在一个很小的微环境中，并达到很高的密度从而展现出特定的生理性状，即群体感应现象(Quorum sensing，QS)(Fuqua W C，et al.Journal of Bacteriology，176(2)：269-275，1994)。研究发现革兰氏阴性菌通过产生N-酰基-高丝氨酸内酯类(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)化合物来调控与食品腐败、动植物致病性等有关的许多特定的生理性状的表达，如蛋白酶活性、致病因子的表达、生物膜的形成等(Whitehead N A，et al.FEMS Microbiology Reviews，25：364-404，2001)。

近几年群体感应抑制成了人们研究的另一个热点。通过群体感应抑制剂(Quorum sensinginhibitor，QSI)使致病细菌、腐败细菌中由QS系统所调控的生理特性不表达或者表达水平下降，开创新的食品防腐保鲜技术及新药开发途径。其中利用AHL类似物是研究群体感应抑制的一个非常重要的方式。发现最早同时也是研究最广泛的是由海洋红藻(Delisseapulchra)产生的卤化呋喃酮，该化合物能够抑制V.fischeri和V.harveyi的生物发光、S.liquefaciens的浮游、E.carotovora胞外酶的产生以及减弱铜绿假单胞菌的致病力等(Manefield M，et al.Microbiology，145：283-291，1999；Manefield M，et al.FEMSMicrobiology Letters，205(1)：131-138，2001；Hentzer M，et al.The EMBO Journal，22(15)：3803-3815，2003)。因此，QSI化合物在医疗、食品防腐等领域都具有非常广泛的应用价值。建立筛选群体感应抑制剂的方法对研究群体感应抑制是非常重要的。

紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)通过产生C6-HSL以群体感应方式来调控紫色色素的产生，而细菌生物感应器紫色杆菌CVO26是AHL功能基因的突变体，不产生AHL，也不能产生紫色，但是有外源的AHL存在的条件下，恢复产生紫色的能力。发明人前期研究发现，当有QSI化合物存在的条件下，该化合物会阻断CVO26群体感应系统，即便是有外源AHL存在时，也不能恢复产生紫色(綦国红，等.中国农业科学，40(7)：1486-1491，2007)。

发明内容

本发明公开了一种检测微生物是否产生群体感应抑制剂的方法。本发明使用细菌生物感应器紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)CVO26和其敏感的信号分子己酰基高丝氨酸内酯(C6-HSL)对微生物进行检测，以筛选能产生革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的微生物。

本发明具体方法如下：

使用细菌生物感应器紫色杆菌CVO26和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，将被检测微生物进行以下任一项方法的检测：

1)将被检测微生物在含有1.5×10^-6mol/L～2.5×10^-6mol/L(优选2×10^-6mol/L)的己酰基高丝氨酸内酯的LB固体平板上划条接种后，培养24h～48h，再将紫色杆菌CVO26平行于被检测微生物划条后继续培养24h～48h，观察现象即可判断，如果紫色杆菌CVO26呈现紫色变浅或褪去的现象，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂；

2)将被检测微生物在LB固体平板的中央划条，培养24h～48h，紫色杆菌CVO26培养16h～24h，与LB琼脂培养基混合，并添加己酰基高丝氨酸内酯至1.5×10^-6mol/L～2.5×10^-6mol/L(优选2×10^-6mol/L)，混匀后迅速覆盖在LB固体平板的上面，继续培养24h～48h，观察现象即可判断，如果在被检测微生物周围的紫色杆菌CVO26呈现紫色变浅或褪去的现象，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂；

3)被检测微生物培养后，对培养上清液进行提取后获得提取物，将提取物点样于C18反相薄层板上，充分展开后，把含有紫色杆菌CVO26和1.5×10^-6mol/L～2.5×10^-6mol/L(优选2×10^-6mol/L)己酰基高丝氨酸内酯的琼脂LB培养基铺于C18反相薄层板上，培养24h～48h，观察现象即可判断，如果在C18反相在薄层板上有紫色变浅或褪去的区域，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂。

其中3)中被检测微生物培养所用的LB培养基含有：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％，余量为水。

其中3)中对培养上清液进行提取的方法包括将培养液6000～8000rpm，4～5℃条件离心，取上清，用等量的乙酸乙酯提取三次，取有机相，合并提取液，旋转蒸发仪蒸干溶剂后，溶于甲醇中，-20℃保存。

上述三种试验任选一种即可进行检测，筛选出待测微生物是否产生群体感应抑制剂。

为了确保实验的准确性，可以采用产生紫色杆菌CVO26 QSI化合物的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PAO-1为阳性对照菌株，以不产生AHL分子及QSI化合物的大肠杆菌Escherichia coli JM109为阴性对照菌株。

检测的培养温度优选为25～28℃。

本发明的有益效果如下：

1、本方法简单、易得，不需要昂贵的硬件设备，检测目标明确，检测样品不需要纯化。克服了HPLC/MS检测QSI需要特定的硬件设备、检测目标不明确以及需对样品纯化等缺点。

2、本方法成本低廉，获得结果迅速，可用于大规模的QSI化合物的筛选。

3、本方法可用于微生物产生QSI化合物的的大量筛选，对筛选到的目标样品，通过薄层层析的方法进一步确证。由于目标样品中的化合物经薄层层析分离后，避免了由于检测对象产生抗菌物质抑制细菌生物感应器的生长所至的假阳性结果，还可以根据所产生的斑点的Rf值等获取该化合物的一些定性信息。

具体实施方式

实施例1

对荧光假单胞菌所产生的QSI化合物进行检测，具体操作如下：

首先，阳性对照菌株铜绿假单胞菌PAO-1、紫色杆菌CVO26、被检测菌荧光假单胞菌，用LB培养基(蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％)在25℃条件下，150rpm振荡活化两次后备用。活化紫色杆菌CVO26所使用的LB培养基中添加卡那霉素至20μg/ml。阴性对照菌株大肠杆菌JM109在LB培养基中37℃条件下，150rpm振荡活化两次后备用。进行如下试验：

1、在含有0.8％琼脂的LB培养基(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％)中加入信号分子C6-HSL至2×10^-6mol/L，倾注平板，凝固后，将活化好的被检测菌荧光假单胞菌在LB平板上划条，无菌风吹干，培养24h后，再将紫色杆菌CVO26与LB平板上的荧光假单胞菌平行划条，紫色杆菌CVO26与被检测微生物平行划条的距离在1cm以下。无菌风吹干后，继续培养24h。铜绿假单胞菌PAO-1为阳性对照菌株，大肠杆菌JM109为阴性对照菌株，以与被检测菌同样的方法划条、培养。与被检测菌平行划条后共同培养的紫色杆菌CVO26所产生的紫色变淡甚至褪去，判断荧光假单胞菌产生QSI类化合物。

2、将荧光假单胞菌的培养物在LB平板(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂0.8％)的中央划条，无菌风吹干后，培养24h。将紫色杆菌CVO26的LB培养物与温度在46℃～50℃且含有0.8％～1.0％琼脂的LB培养基混合，并添加信号分子C6-HSL至2×10^-6mol/L，充分混合后迅速覆盖在LB平板的上面，继续培养24h。铜绿假单胞菌PAO-1为阳性对照菌株，大肠杆菌JM109为阴性对照菌株。用与被检测菌同样的方法进行处理。根据平板中央荧光假单胞菌所在位置的紫色杆菌CVO26所产生的紫色变淡甚至褪去判断该荧光假单胞菌产生QSI类化合物。

3、被检测菌荧光假单胞菌在LB培养基中25℃，150rpm振荡培养24h，4～5℃离心，取上清用等量的乙酸乙酯提取三次，取有机相，合并提取液，旋转蒸发仪蒸干溶剂后，溶于甲醇中，-20℃保存备用。2-5μL提取液点样于C18反相薄层板上，甲醇/水(60:40，V/V)充分展开后，无菌风吹干，将紫色杆菌CVO26的LB培养物与46℃～50℃含有0.8％～1.0％琼脂的LB培养基混合，并添加信号分子C6-HSL至2×10^-6mol/L，充分混合后立即铺于C18反相薄层板上，凝固后，置于消毒的密闭容器中25～28℃培养48h。铜绿假单胞菌PAO-1的乙酸乙酯的提取液作阳性对照，C6-HSL为阴性对照。根据在C18反相在薄层板上有紫色变浅或褪去的区域，判断被检测菌产生QSI。根据所产生斑点的Rf值可初步判断该QSI化合物为C12-HSL或3-oxo-C14-HSL。

本实施例利用三个试验来检测荧光假单胞菌，试验结果表明，三种试验方法均检测出荧光假单胞菌可产生QSI。

Claims

1、一种革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂的检测方法，其特征是使用细菌生物感应器紫色杆菌CVO26和己酰基高丝氨酸内酯进行检测，将被检测微生物进行以下任一项方法的检测：

1)将被检测微生物在含有1.5×10^-6mol/L～2.5×10^-6mol/L的己酰基高丝氨酸内酯的LB固体平板上划条接种后，培养24h～48h，再将紫色杆菌CVO26平行于被检测微生物划条后继续培养24h～48h，观察现象即可判断，如果紫色杆菌CVO26呈现紫色变浅或褪去的现象，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂；

2)将被检测微生物在LB固体平板的中央划条，培养24h～48h，紫色杆菌CVO26培养16h～24h，与LB琼脂培养基混合，并添加己酰基高丝氨酸内酯至1.5×10^-6mol/L～2.5×10^-6mol/L，混匀后迅速覆盖在LB固体平板的上面，继续培养24h～48h，观察现象即可判断，如果在被检测微生物周围的紫色杆菌CVO26呈现紫色变浅或褪去的现象，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂；

3)被检测微生物培养后，对培养上清液进行提取后获得提取物，将提取物点样于C18反相薄层板上，充分展开后，把含有紫色杆菌CVO26和1.5×10^-6mol/L～2.5×10^-6mol/L己酰基高丝氨酸内酯的琼脂LB培养基铺于C18反相薄层板上，培养24h～48h，观察现象即可判断，如果在C18反相在薄层板上有紫色变浅或褪去的区域，则被检测微生物产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂，如果没这些现象，则被检测微生物不产生革兰氏阴性细菌群体感应抑制剂。

2、权利要求1的检测方法，其中3)中被检测微生物培养所用LB培养基含有：胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、氯化钠1％，余量为水。

3、权利要求1的检测方法，其中3)中对培养上清液进行提取的方法包括将培养液6000～8000rpm，4～5℃条件离心，取上清，用等量的乙酸乙酯提取三次，取有机相，合并提取液，旋转蒸发仪蒸干溶剂后，溶于甲醇中，-20℃保存。

4、权利要求1的检测方法，其中己酰基高丝氨酸内酯的浓度是2×10^-6mol/L。