CN103849663B

CN103849663B - 利用海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙的方法及其培养基

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Publication number: CN103849663B
Application number: CN201410012366.0A
Authority: CN
Inventors: 卢艳花; 朱一翔; 焦瑞华; 谭仁祥; 姚凌云; 胡伟伟
Original assignee: East China University of Science and Technology; Nanjing University
Current assignee: East China University of Science and Technology; Nanjing University
Priority date: 2014-01-10
Filing date: 2014-01-10
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2034-01-10
Also published as: CN103849663A

Abstract

本发明涉及一种用于发酵培养海蟹共生烟曲霉（CY018，Aspergillus？fumigatus）生产生物碱类选择性免疫抑制剂-烟曲霉文丙（Fumigaclavine？C，通称FC）的方法及其培养基。配制1000ml所述培养基所需的成分包含：糖蜜50-150g/L、蔗糖40-80g/L、硝酸钠（NaNO₃）2-5g/L、磷酸氢二钾（K₂HPO₄）0.5-1.5g/L、氯化钾（KCl）0.25-1g/L、七水硫酸镁（MgSO₄?7H₂O）0.25-1g/L、硫酸亚铁（FeSO₄）0.005-0.02g/L、硫酸锌（ZnSO₄）0.005-0.02g/L、硫酸铜（CuSO₄）0.001-0.01g/L、色氨酸0.5-1.5g/L，以自来水溶解，并定容至1000ml，再以盐酸调节pH值至4.0-4.5，将所获得的培养基以121℃灭菌15-30分钟。本发明的培养基成分简单，成本低廉，制备操作方便，不需特殊设备，用于发酵培养海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙，能显著提高烟曲霉文丙的产量。

Description

利用海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙的方法及其培养基

技术领域

本发明涉及培养基技术领域，更具体地，涉及用于培养海蟹共生曲霉的培养基技术领域，特别是指一种用于发酵培养海蟹共生曲霉（CY018，Aspergillusfumigatus）生产生物碱类选择性免疫抑制剂-烟曲霉文丙（FumigaclavineC，通称FC）的培养基之制备方法及使用该培养基制备烟曲霉文丙的方法。

背景技术

海洋是一个开放的复杂系统，在海洋特殊的生态环境下生活着40多万种动植物和上亿种微生物。近年来许多文献报导了海洋生物作为活性化合物和药物来源的巨大潜力，具有重要的研究意义与开发价值。为适应海洋特有环境，各种海洋生物必须与其共生菌长期共进化并建立稳定的互惠共生关系，有些共生菌似乎与宿主形成了类似于“整体”的统一体，缺一难活。研究表明该“互惠共生”的化学本质是共生菌可产生结构和功能都比较特殊的代谢物，来保护或调节海洋生物的生长发育、抵御天敌、寻取食物等行为。故海洋共生菌被认为是新药源分子的重要来源，对其产物深入研究可为人类急需新药的发现与研发提供广阔的空间。

海洋来源内生真菌菌株编号：CY018属半知菌类、丝孢目(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、曲霉属(Aspergillus)真菌，由南京大学谭仁祥教授分离得到。海洋来源内生真菌CY018经液体或固体发酵可产生多种代谢物，包括生物碱类、萜类化合物、多烯类化合物和鞘氨酸类化合物等天然物质。烟曲霉文丙是其产生的一种生物碱类次级代谢物，烟曲霉文丙纯品为白色针状结晶，其具有同环孢菌素A相媲美的免疫抑制活性，是一种潜在的免疫抑制剂候选药物。

然而，烟曲霉文丙在初始发酵工艺下的得率相当低，已经成为制约烟曲霉文丙用于临床前研究的瓶颈。因此通过改善其发酵工艺提高烟曲霉文丙产量已成为当务之急。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，解决限制对烟曲霉文丙深入研究的瓶颈问题，提供一种用于发酵海蟹共生曲霉生产选择性免疫抑制剂-烟曲霉文丙的培养基及其制备方法，及使用该培养基发酵生产烟曲霉文丙的方法；该培养基成分简单，制备方法操作方便，成本低廉，不需特殊设备，而使用该培养基发酵海蟹共生曲霉生产选择性免疫抑制剂烟曲霉文丙，能显著提高烟曲霉文丙的产量。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于发酵培养海蟹共生曲霉生产烟曲霉文丙的培养基，每升所述培养基包含：糖蜜50-150g/L、蔗糖40-80g/L、硝酸钠2-5g/L、磷酸氢二钾0.5-1.5g/L、氯化钾0.25-1g/L、七水硫酸镁0.25-1g/L、硫酸亚铁0.005-0.02g/L、硫酸锌0.005-0.02g/L、硫酸铜0.001-0.01g/L、色氨酸0.5-1.5g/L，以自来水溶解。

作为本发明的优选方案之一，每升所述培养基包含：所述糖蜜90-130g/L、蔗糖55-75g/L、硝酸钠3-4.5g/L、磷酸氢二钾0.9-1.3g/L、氯化钾0.4-0.7g/L、七水硫酸镁0.4-0.7g/L、硫酸亚铁0.009-0.013g/L、硫酸锌0.009-0.013g/L、硫酸铜0.004-0.007g/L、色氨酸0.8-1.3g/L、以自来水溶解。

一种用于制备上述本发明所述培养基的方法，包括如下步骤：

将所述糖蜜、蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、七水硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、色氨酸准确称量后，以自来水溶解，并定容至1000ml，使它们在培养基中的终浓度分别为50-150g/L、40-80g/L、2-5g/L、0.5-1.5g/L、0.25-1g/L、0.25-1g/L、0.005-0.02g/L、，0.005-0.02g/L、0.001-0.01g/L、0.5-1.5g/L，再以盐酸调节pH值至4.0-4.5，然后将所获得的培养基在121℃下灭菌15-30分钟。

一种使用前述本发明所述培养基发酵培养海蟹共生曲霉生产烟曲霉文丙的方法，其操作步骤包括：

a.将冷冻保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，在固体平板培养基中央进行点样并活化培养4-6天，获得新鲜固体平板培养基，固体平板培养基每隔30天重新活化一次；

b.从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块琼脂块，接种至种子培养基发酵培养3-4天，获得新鲜种子液；

c.取所述新鲜种子液，按5-20%(v/v)的接种量接入所述培养基，以28±2°C、130±20rpm摇床振荡培养3-5天后，将转速降为0rpm，静置培养7-10天，获得发酵液获得发酵液；以及

d.取所述发酵液进行研磨、萃取、纯化，获得烟曲霉文丙。

所述固体平板培养基每升包含有葡萄糖20g、土豆200g、琼脂粉15-20g，以自来水溶解。

所述种子培养基每升包含有葡萄糖20g、土豆200g，以自来水溶解。

本发明提供的一种利用海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙的方法及其培养基的主要优点如下：

本发明的培养基成分糖蜜、蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、七水硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜和色氨酸，原料易得，价格低廉，有利于推广应用；

制备本发明的培养基只需将上述原料以自来水溶解，方法简单，难度低，无需专门技术培训及特殊仪器设备；

采用本发明的培养基及方法发酵培养海蟹共生烟曲霉，该菌株在该培养基中生长迅速，较大程度改变代谢通路，减少副产物，使用该培养基发酵培养海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙，可提高目标产物烟曲霉文丙的产量，为后期纯化工作降低难度，烟曲霉文丙的最高产量可达到278.9mg/L，是原始水平的4.4倍。

附图说明

图1是本发明各实施例与对照组的烟曲霉文丙的产量的结果对照图。

具体实施方式

本发明将根据具体实例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不起到限制性作用。

在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：

采用不同厂家、不同批次的糖蜜会造成实验结果的差异，属于正常现象；

在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议将培养基过滤处理，以除掉来自于糖蜜的不溶性杂质的干扰。

实施例1

1.配制发酵培养基

准确称取糖蜜100g、蔗糖71.11g、硝酸钠4.375g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.0125g、硫酸锌0.01g、硫酸铜0.00625g、色氨酸1.25g，以自来水溶解，并定容至1000ml。

2.发酵操作过程

将-80℃保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，活化培养4-6天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5mm琼脂块，接种至装有400ml种子培养基的1000ml摇瓶中，以28°C、150rpm摇床发酵培养3-4天，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按5-20%(v/v)的接种量接入所述新颖培养基，以28°C、130rpm摇床振荡培养4.5天，后将转速降为0rpm，静置培养8天，获得发酵液。

3.烟曲霉文丙产量检测

取50ml所获发酵液于250ml锥形瓶中，加入50ml乙酸乙酯和30颗直径为3mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次，然后取3ml上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯；残留物用1ml无水甲醇溶解；在相对离心力为13780×g的条件下离心3分钟后，取500μl上清液，用高效液相色谱法测定烟曲霉文丙的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中烟曲霉文丙的实际含量。

最后测得目标产物烟曲霉文丙的产量为238.5mg/L。

实施例2

1.配制发酵培养基：

准确称取糖蜜100g、蔗糖71.11g、硝酸钠3.5g、磷酸氢二钾1.25g、氯化钾0.625g、七水硫酸镁0.625g、硫酸亚铁0.01g、硫酸锌0.01g、硫酸铜0.005g、色氨酸1.25g，以自来水溶解，并定容至1000ml。

2.发酵操作过程

同实施例1步骤2。

3.烟曲霉文丙产量检测

同实施例1步骤3，最后测得目标产物烟曲霉文丙的产量为240.6mg/L。

实施例3

1.配制发酵培养基：

准确称取糖蜜125g、蔗糖56.89g、硝酸钠3.5g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.625g、七水硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.0125g、硫酸锌0.0125g、硫酸铜0.005g、色氨酸1.25g，以自来水溶解，并定容至1000ml。

2.发酵操作过程

同实施例1步骤2。

3.烟曲霉文丙产量检测

同实施例1步骤3，最后测得目标产物烟曲霉文丙的产量为258.5mg/L。

实施例4

1.配制发酵培养基：

准确称取糖蜜100g、蔗糖56.89g、硝酸钠3.5g、磷酸氢二钾1g、氯化钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、硫酸锌0.01g、硫酸铜0.005g、色氨酸1g，用自来水溶解并定容至1000ml。

2.发酵操作过程

同实施例1步骤2。

3.烟曲霉文丙产量检测

同实施例1步骤3，最后测得目标产物烟曲霉文丙的产量为278.9mg/L。

对照组实例

1.配制发酵培养基：

准确称取葡萄糖36g、甘露醇24g、硝酸钠3.5g、磷酸氢二钾1.5g、七水硫酸镁0.7g、硫酸亚铁0.02g、谷氨酸钠3g、酒石酸钠1.5g，用自来水溶解并定容至1000ml。

2.发酵操作过程

同实施例1步骤2。

3.烟曲霉文丙产量检测

同实施例1步骤3，最后测得目标产物烟曲霉文丙的产量为62.7mg/L。

从实施例1~4可以发现：使用本发明的培养基发酵培养海蟹共生曲霉生产获得的烟曲霉文丙的产量都在200mg/L以上，最高产量为278.9mg/L，与对照组相比较，使用本发明的培养基酵培养海蟹共生曲霉生产烟曲霉文丙，如图1所示，烟曲霉文丙的产量得到显著提高。

需要说明的是，以上较佳实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，所作出各种变换或变型，均属于本发明的范畴。

Claims

1.一种利用海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙的方法，其特征在于，所述方法所用的每升培养基的成分包含有糖蜜50-150g/L、蔗糖40-80g/L、硝酸钠2-5g/L、磷酸氢二钾0.5-1.5g/L、氯化钾0.25-1g/L、七水硫酸镁0.25-1g/L、硫酸亚铁0.005-0.02g/L、，硫酸锌0.005-0.02g/L、硫酸铜0.001-0.01g/L、色氨酸0.5-1.5g/L，以自来水溶解；

该方法所用菌种为海蟹共生烟曲霉AspergillusfumigatusCY018，

所述方法包括以下操作步骤：

b.从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块琼脂块，接种至种子培养基中发酵培养3-4天，获得新鲜种子液；

c.取所述新鲜种子液，按5-20％(v/v)的接种量接入上述培养基，以28±2℃、130±20rpm摇床振荡培养3-5天后，将转速降为0rpm，静置培养7-10天，获得发酵液；以及

d.取所述发酵液进行抽提、萃取、纯化，获得烟曲霉文丙。

2.根据权利要求1所述的利用海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙的方法，其特征在于，每升所述培养基的成分包含：所述糖蜜90-130g/L、蔗糖55-75g/L、硝酸钠3-4.5g/L、磷酸氢二钾0.9-1.3g/L、氯化钾0.4-0.7g/L、七水硫酸镁0.4-0.7g/L、硫酸亚铁0.009-0.013g/L、硫酸锌0.009-0.013g/L、硫酸铜0.004-0.007g/L、色氨酸0.8-1.3g/L，以自来水溶解。

3.一种如权利要求1所述的利用海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙的方法中所用培养基之制备方法，其特征在于，该制备方法包括：

将所述糖蜜、蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、七水硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、色氨酸准确称量后，以自来水溶解，并定容至1000ml，使上述成分在培养基中的终浓度分别为50-150g/L、40-80g/L、2-5g/L、0.5-1.5g/L、0.25-1g/L、0.25-1g/L、0.005-0.02g/L、，0.005-0.02g/L、0.001-0.01g/L、0.5-1.5g/L，再以盐酸调节pH值至4.0-4.5，然后在121℃下灭菌15-30分钟。