CN111961692A - 一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物cha的方法 - Google Patents
一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物cha的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111961692A CN111961692A CN202010765903.4A CN202010765903A CN111961692A CN 111961692 A CN111961692 A CN 111961692A CN 202010765903 A CN202010765903 A CN 202010765903A CN 111961692 A CN111961692 A CN 111961692A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- parts
- cha
- aspergillus fumigatus
- fermentation
- sea crab
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 title claims abstract description 56
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 title claims abstract description 56
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 26
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 56
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 88
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 88
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 28
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 27
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 24
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 18
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 15
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 claims description 15
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 14
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 14
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 claims description 14
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 14
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 14
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 claims description 14
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 14
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 claims description 14
- HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L 0.000 claims description 13
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 claims description 13
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 claims description 13
- 229960002167 sodium tartrate Drugs 0.000 claims description 13
- 235000011004 sodium tartrates Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 239000008399 tap water Substances 0.000 claims description 10
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 9
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 9
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 9
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 9
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 3
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- OQTQHQORDRKHFW-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);sulfate;heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O OQTQHQORDRKHFW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 3
- RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 abstract description 4
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 abstract description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 abstract description 2
- GEURDGODABUDHB-TYTLQBBQSA-N chaetominine Chemical compound C1=NC2=CC=CC=C2C(=O)N1[C@@H](C1=O)C[C@]2(O)C3=CC=CC=C3N3[C@@H]2N1[C@@H](C)C3=O GEURDGODABUDHB-TYTLQBBQSA-N 0.000 abstract 3
- GEURDGODABUDHB-UHFFFAOYSA-N chaetominine 1 Natural products CC1N2C3N(C1=O)c4ccccc4C3(O)CC(N5C=Nc6ccccc6C5=O)C2=O GEURDGODABUDHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 235000001727 glucose Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000003592 new natural product Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- -1 polyene compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011172 small scale experimental method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 150000003410 sphingosines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本申请公开了一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，涉及微生物培养基领域，特别是指一种用于发酵培养海蟹共生烟曲霉CY018，Aspergillus fumigatus生产生物碱类抗癌活性化合物Chaetominine即CHA的方法。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养基技术领域，特别涉及一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法。
背景技术
海洋占据着地球表面近71%的面积，由于高盐、高压、低温、低氧的环境，各种海洋生物必须与其共生菌长期共进化并建立稳定的互惠共生关系，其丰富了海洋生物的多样性，并且能够合成许多结构独特且具有显著生物活性的海洋天然产物，吸引许多专家学者从海洋中获取天然产物。历年来科学研究者发现的新天然产物呈逐年递增的趋势，其中具有抗癌活性的天然产物占据了63%的比例，而且FDA/EMA批准的海洋药物中多数应用于癌症的治疗，可见，癌症依旧是威胁人类健康的巨大隐患。故海洋共生菌被认为是新药源分子的重要来源，对其产物深入研究可为人类抵抗癌症等疾病有着较为深远的影响。
海洋来源内生真菌菌株编号：CY018属半知菌类、丝孢目(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、曲霉属(Aspergillus)真菌。海洋来源内生真菌CY018经液体或固体发酵可产生多种代谢物，包括生物碱类、萜类化合物、多烯类化合物和鞘氨酸类化合物等天然物质。CHA是其产生的一种生物碱类次级代谢物，CHA纯品为无色颗粒状结晶，对人白血病K562细胞系和人结肠癌SW1116细胞系具有同5氟尿嘧啶相媲美的抗癌活性，是一种潜在的抗癌制剂候选药物。
然而，CHA在初始发酵工艺下的得率相当低，CHA的产量低下已经成为制约CHA用于临床前研究的瓶颈。因此，通过改善其发酵工艺提高CHA产量已成为当务之急。
发明内容
解决的技术问题：本申请主要是提出一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，解决现有技术中存在的得率相当低，CHA的产量低下等技术问题。解决限制对烟曲霉CY018次级代谢产物CHA产量提高研究的瓶颈问题，发酵海蟹共生烟曲霉的抗癌活性生物碱CHA产量能显著提高。
技术方案：
一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，包括如下步骤：
第一步，配制发酵培养基：按质量份数配比称取葡萄糖10-36份、甘露醇20-24 份、硝酸钠3.5 份、磷酸二氢钾 0.5-1.5份、七水硫酸亚铁 0.02-0.3份、七水硫酸镁 0.7-2份、谷氨酸钠 3-10份、酒石酸钠 1.5 份中的一种或几种混合物，以自来水溶解，并定容至1000 mL；
第二步，发酵操作过程：将-80℃保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基PDA中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，活化培养7天，获得新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基，然后置于4℃冰箱保存；
第三步：用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5 mm琼脂块，接种至装有400 mL种子培养基PDB的1000 mL摇瓶中，以28℃、150 rpm摇床发酵培养24-96h，获得新鲜种子液；
第四步：取新鲜种子液，按5-22% (v/v)的接种量接入第一步所述发酵培养基，以26-32℃、180 rpm摇床振荡培养13天，获得发酵液；
第五步，CHA产量检测：取50 mL所获发酵液于250 mL锥形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30颗直径为3 mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200 rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次，然后取3 mL上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯；残留物用1 mL无水甲醇溶解；在相对离心力为13000 rpm的条件下离心3分钟后，取500 μL上清液，用高效液相色谱法测定CHA的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中CHA的实际含量。
作为本发明的一种优选技术方案，所述第一步发酵培养基的原料按质量份数配比除了葡萄糖10-36份、甘露醇20-24 份、硝酸钠3.5 份、磷酸二氢钾 0.5-1.5份、七水硫酸亚铁 0.02-0.3份、七水硫酸镁 0.7-2份、谷氨酸钠 3-10份、酒石酸钠 1.5 份中的一种或几种混合物，还含有麦芽糖20份、酵母提取物3份、玉米浆1份。
作为本发明的一种优选技术方案，所述第一步发酵培养基的原料按质量份数配比除了葡萄糖10-36份、甘露醇20-24 份、硝酸钠3.5 份、磷酸二氢钾 0.5-1.5份、七水硫酸亚铁 0.02-0.3份、七水硫酸镁 0.7-2份、谷氨酸钠 3-10份、酒石酸钠 1.5 份中的一种或几种混合物，还含有麦精20份、蛋白胨1份。
作为本发明的一种优选技术方案，所述第一步发酵培养基的原料按质量份数配比除了葡萄糖10-36份、甘露醇20-24 份、硝酸钠3.5 份、磷酸二氢钾 0.5-1.5份、七水硫酸亚铁 0.02-0.3份、七水硫酸镁 0.7-2份、谷氨酸钠 3-10份、酒石酸钠 1.5 份中的一种或几种混合物，还含有淀粉60份、柠檬酸铵12份、七水硫酸锌0.005份、五水硫酸铜0.005份、七水硫酸锰0.01份。
作为本发明的一种优选技术方案，所述第三步中28℃、150 rpm摇床发酵培养24、30 h、36 h、42 h，获得新鲜种子液。
作为本发明的一种优选技术方案，所述第四步中取新鲜种子液，按10%、14%、18%、22% (v/v)的接种量接入。
作为本发明的一种优选技术方案，所述第四步中以26、28、30、32 ℃，180 rpm摇床振荡培养13天。
有益效果：本申请所述一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：
1、培养基成分葡萄糖、甘露醇、硝酸钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、谷氨酸钠和酒石酸钠，原料易得，价格低廉，有利于推广应用；
2、只需将上述原料以自来水溶解，方法简单，难度低，无需专门技术培训及特殊仪器设备；
3、发酵培养条件优化，只需恒温培养箱，无需特殊仪器设备，操作简便。
8、发酵培养海蟹共生烟曲霉，该菌株在该培养基中生长迅速，较大程度改变代谢通路，减少副产物，使用该培养基发酵培养海蟹共生烟曲霉生产CHA，可提高目标产物CHA的产量，为后期纯化工作降低难度，CHA的最高产量可达到23.45 mg/L，是原始水平的9.98倍；
4、通过4种发酵培养基筛选，确定实例1中培养基为CHA发酵培养基，通过检测CHA的产量为14.71 mg/L；
5、通过种子液的种龄的优化，确定种子液的种龄为30 h，检测CHA的产量为16.32 mg/L；
6、通过种子液的接种量的优化，确定种子液的接种量为14%（v/v），检测CHA的产量为17.56mg/L；
7、通过发酵液的温度的优化，确定发酵液的温度为28℃，检测CHA的产量为23.45 mg/L。
附图说明：
图1为实施例1利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA与对照组的CHA的产量和生物量的结果对照图。
图2为实施例4利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA与对照组的CHA的产量和生物量的结果对照图。
图3为实施例5利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA与对照组的CHA的产量和生物量的结果对照图。
图4为实施例6利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA与对照组的CHA的产量和生物量的结果对照图。
具体实施方式
在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议将培养基中玉米浆、淀粉先加热溶解，以防形成颗粒状营养物质的干扰。
Aspergillus fumigatus海蟹共生烟曲霉为CY018。
实施例1：
一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，包括如下步骤：
第一步，配制发酵培养基：准确称取葡萄糖36g，甘露醇24 g，硝酸钠3.5 g，磷酸二氢钾1.5 g，七水硫酸亚铁 0.02 g，七水硫酸镁 0.7 g，谷氨酸钠 3 g，酒石酸钠 1.5 g，以自来水溶解，并定容至1000 mL；
第二步，发酵操作过程：将-80℃ 保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基PDA中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，活化培养7天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5 mm琼脂块，接种至装有400 mL种子培养基PDB的1000 mL摇瓶中，以28℃、150 rpm摇床发酵培养3-4天，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按5-20% (v/v)的接种量接入第一步所述发酵培养基，以28℃、180 rpm摇床振荡培养13天，获得发酵液；
第三步，CHA产量检测：取50 mL所获发酵液于250 mL锥形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30颗直径为3 mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200 rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次， 然后取3 mL上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯； 残留物用1 mL无水甲醇溶解； 在相对离心力为13000 rpm的条件下离心3分钟后，取500 μL上清液，用高效液相色谱法测定CHA的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中CHA的实际含量；
第四步：最后测得目标产物CHA的产量为14.71 mg/L。
实施例2：
一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，包括如下步骤：
第一步，配制发酵培养基：准确称取麦芽糖20 g，葡萄糖10 g，甘露醇20 g，谷氨酸钠10g，酵母提取物3 g，玉米浆1 g，磷酸二氢钾 0.5 g，七水硫酸镁 0.3 g，以自来水溶解，并定容至1000 mL；
第二步，发酵操作过程：将-80℃ 保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基PDA中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，活化培养7天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5 mm琼脂块，接种至装有400 mL种子培养基PDB的1000 mL摇瓶中，以28℃、150 rpm摇床发酵培养3-4天，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按5-20% (v/v)的接种量接入第一步所述发酵培养基，以28℃、180 rpm摇床振荡培养13天，获得发酵液；
第三步，CHA产量检测：取50 mL所获发酵液于250 mL锥形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30颗直径为3 mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200 rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次， 然后取3 mL上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯； 残留物用1 mL无水甲醇溶解； 在相对离心力为13000 rpm的条件下离心3分钟后，取500 μL上清液，用高效液相色谱法测定CHA的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中CHA的实际含量；
第四步：最后测得目标产物CHA的产量为9.34 mg/L。
实施例3：
一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，包括如下步骤：
第一步，配制发酵培养基：准确称取麦精20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，以自来水溶解，并定容至1000 mL；
第二步，发酵操作过程：将-80℃ 保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基PDA中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，活化培养7天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5 mm琼脂块，接种至装有400 mL种子培养基PDB的1000 mL摇瓶中，以28℃、150 rpm摇床发酵培养3-4天，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按5-20% (v/v)的接种量接入第一步所述发酵培养基，以28℃、180 rpm摇床振荡培养13天，获得发酵液；
第三步，CHA产量检测：取50 mL所获发酵液于250 mL锥形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30颗直径为3 mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200 rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次， 然后取3 mL上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯； 残留物用1 mL无水甲醇溶解； 在相对离心力为13000 rpm的条件下离心3分钟后，取500 μL上清液，用高效液相色谱法测定CHA的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中CHA的实际含量；
第四步：最后测得目标产物CHA的产量为7.01 mg/L。
对照组：
一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，包括如下步骤：
第一步，配制发酵培养基：准确称取淀粉60 g，柠檬酸铵12 g，七水硫酸镁 2 g，七水硫酸锌 0.005 g，七水亚硫酸铁 0.05 g，五水硫酸铜 0.005 g，七水硫酸锰 0.01 g，磷酸二氢钾 1.0 g，以自来水溶解，并定容至1000 mL；
第二步，发酵操作过程：将-80℃ 保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基PDA中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，活化培养7天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5 mm琼脂块，接种至装有400 mL种子培养基PDB的1000 mL摇瓶中，以28℃、150 rpm摇床发酵培养3-4天，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按5-20% (v/v)的接种量接入第一步所述发酵培养基，以28℃、180 rpm摇床振荡培养13天，获得发酵液；
第三步，CHA产量检测：取50 mL所获发酵液于250 mL锥形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30颗直径为3 mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200 rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次， 然后取3 mL上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯； 残留物用1 mL无水甲醇溶解； 在相对离心力为13000 rpm的条件下离心3分钟后，取500 μL上清液，用高效液相色谱法测定CHA的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中CHA的实际含量；
第四步：最后测得目标产物CHA的产量为2.35 mg/L。
实施例4：
一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，包括如下步骤：
第一步，配制发酵培养基：准确称取葡萄糖36g，甘露醇24 g，硝酸钠3.5 g，磷酸二氢钾1.5 g，七水硫酸亚铁 0.02 g，七水硫酸镁 0.7 g，谷氨酸钠 3 g，酒石酸钠 1.5 g，以自来水溶解，并定容至1000 mL；
第二步，发酵操作过程：将-80℃ 保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基PDA中央进行点样，置于28 ℃恒温培养箱，活化培养7天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4 ℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5 mm琼脂块，接种至装有400 mL种子培养基PDB的1000 mL摇瓶中，以28 ℃、150 rpm摇床发酵培养24 h、30 h、36 h、42 h，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按5-20% (v/v)的接种量接入第一步所述发酵培养基，以28 ℃、180 rpm摇床振荡培养13天，获得发酵液。每组三个平行实验；
第三步，CHA产量检测：取50 mL所获发酵液于250 mL锥形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30颗直径为3 mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200 rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次， 然后取3 mL上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯； 残留物用1 mL无水甲醇溶解； 在相对离心力为13000 rpm的条件下离心3分钟后，取500 μL上清液，用高效液相色谱法测定CHA的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中CHA的实际含量；
第四步：最后测得种龄为24h时，目标产物CHA的产量为13.41 mg/L；种龄为30h时，目标产物CHA的产量为16.32 mg/L；种龄为36h时，目标产物CHA的产量为14.15 mg/L；种龄为42h时，目标产物CHA的产量为12.68 mg/L。
实施例5：
一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，包括如下步骤：
第一步，配制发酵培养基：准确称取葡萄糖36g，甘露醇24 g，硝酸钠3.5 g，磷酸二氢钾1.5 g，七水硫酸亚铁 0.02 g，七水硫酸镁 0.7 g，谷氨酸钠 3 g，酒石酸钠 1.5 g，以自来水溶解，并定容至1000 mL；
第二步，发酵操作过程：将-80℃ 保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基PDA中央进行点样，置于28 ℃恒温培养箱，活化培养7天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4 ℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5 mm琼脂块，接种至装有400 mL种子培养基PDB的1000 mL摇瓶中，以28 ℃、150 rpm摇床发酵培养30 h，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按10%、14%、18%、22% (v/v)的接种量接入第一步所述发酵培养基，以28 ℃、180 rpm摇床振荡培养13天，获得发酵液。每组三个平行实验；
第三步，CHA产量检测：取50 mL所获发酵液于250 mL锥形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30颗直径为3 mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200 rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次， 然后取3 mL上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯； 残留物用1 mL无水甲醇溶解； 在相对离心力为13000 rpm的条件下离心3分钟后，取500 μL上清液，用高效液相色谱法测定CHA的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中CHA的实际含量；
第四步：最后测得接种量为10%时，目标产物CHA的产量为12.84 mg/L；接种量为14%时，目标产物CHA的产量为17.56 mg/L；接种量为18%时，目标产物CHA的产量为11.39 mg/L；接种量为22%时，目标产物CHA的产量为9.24 mg/L。
实施例6：
一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，包括如下步骤：
第一步，配制发酵培养基：准确称取葡萄糖36g，甘露醇24 g，硝酸钠3.5 g，磷酸二氢钾1.5 g，七水硫酸亚铁 0.02 g，七水硫酸镁 0.7 g，谷氨酸钠 3 g，酒石酸钠 1.5 g，以自来水溶解，并定容至1000 mL；
第二步，发酵操作过程：将-80℃ 保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基PDA中央进行点样，置于28 ℃恒温培养箱，活化培养7天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4 ℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5 mm琼脂块，接种至装有400 mL种子培养基PDB的1000 mL摇瓶中，以28 ℃、150 rpm摇床发酵培养30 h，获得新鲜种子液。取新鲜种子液，按14% (v/v)的接种量接入第一步所述发酵培养基，培养基pH为6，以26、28、30、32 ℃，180 rpm摇床振荡培养13天，获得发酵液。每组三个平行实验；
第三步，CHA产量检测：取50 mL所获发酵液于250 mL锥形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30颗直径为3 mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200 rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次， 然后取3 mL上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯； 残留物用1 mL无水甲醇溶解； 在相对离心力为13000 rpm的条件下离心3分钟后，取500 μL上清液，用高效液相色谱法测定CHA的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中CHA的实际含量；
第四步：最后测得发酵温度为26 ℃时，目标产物CHA的产量为7.56 mg/L；发酵温度为28 ℃时，目标产物CHA的产量为23.45 mg/L；发酵温度为30 ℃时，目标产物CHA的产量为16.34 mg/L；发酵温度为32 ℃时，目标产物CHA的产量为15.16 mg/L。
从实施例1-3可以发现：使用本发明的培养基1发酵培养海蟹共生烟曲霉生产获得的CHA的最高产量为14.71 mg/L，如图1所示，与对照组相比较，使用本发明的培养基1发酵培养海蟹共生烟曲霉生产CHA的产量得到明显提高。从实施例4可以发现：在不同种龄考察时，在种龄为30 h时CHA的最高产量为16.32 mg/L，如图2所示，种龄为30 h时CHA的产量得到明显提高。从实施例5可以发现：在不同接种量考察时，在接种量为14%（v/v）时CHA的最高产量为17.56 mg/L，如图3所示，接种量为14%（v/v）时CHA的产量得到明显提高。从实施例6可以发现：在不同发酵温度考察时，在发酵温度为28 ℃时CHA的最高产量为23.45 mg/L，如图4所示，发酵温度为28 ℃时CHA的产量得到明显提高。综上所述，与对照组相比较，使用本发明的培养基和发酵条件发酵培养海蟹共生烟曲霉生产CHA， CHA的产量得到显著提高。
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于包括如下步骤：
第一步，配制发酵培养基：按质量份数配比称取葡萄糖10-36份、甘露醇20-24 份、硝酸钠3.5 份、磷酸二氢钾 0.5-1.5份、七水硫酸亚铁 0.02-0.3份、七水硫酸镁 0.7-2份、谷氨酸钠 3-10份、酒石酸钠 1.5 份中的一种或几种混合物，以自来水溶解，并定容至1000 mL；
第二步，发酵操作过程：将-80℃保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基PDA中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，活化培养7天，获得新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基，然后置于4℃冰箱保存；
第三步：用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5 mm琼脂块，接种至装有400 mL种子培养基PDB的1000 mL摇瓶中，以28℃、150 rpm摇床发酵培养24-96h，获得新鲜种子液；
第四步：取新鲜种子液，按5-22% (v/v)的接种量接入第一步所述发酵培养基，以26-32℃、180 rpm摇床振荡培养13天，获得发酵液；
第五步，CHA产量检测：取50 mL所获发酵液于250 mL锥形瓶中，加入50 mL乙酸乙酯和30颗直径为3 mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200 rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次，然后取3 mL上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯；残留物用1 mL无水甲醇溶解；在相对离心力为13000 rpm的条件下离心3分钟后，取500 μL上清液，用高效液相色谱法测定CHA的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中CHA的实际含量。
2. 根据权利要求1所述一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第一步发酵培养基的原料按质量份数配比除了葡萄糖10-36份、甘露醇20-24 份、硝酸钠3.5 份、磷酸二氢钾 0.5-1.5份、七水硫酸亚铁 0.02-0.3份、七水硫酸镁0.7-2份、谷氨酸钠 3-10份、酒石酸钠 1.5 份中的一种或几种混合物，还含有麦芽糖20份、酵母提取物3份、玉米浆1份。
3.根据权利要求1所述一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第一步发酵培养基的原料按质量份数配比除了葡萄糖10-36份、甘露醇20-24份、硝酸钠3.5 份、磷酸二氢钾 0.5-1.5份、七水硫酸亚铁 0.02-0.3份、七水硫酸镁 0.7-2份、谷氨酸钠 3-10份、酒石酸钠 1.5 份中的一种或几种混合物，还含有麦精20份、蛋白胨1份。
4.根据权利要求1所述一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第一步发酵培养基的原料按质量份数配比除了葡萄糖10-36份、甘露醇20-24份、硝酸钠3.5 份、磷酸二氢钾 0.5-1.5份、七水硫酸亚铁 0.02-0.3份、七水硫酸镁 0.7-2份、谷氨酸钠 3-10份、酒石酸钠 1.5 份中的一种或几种混合物，还含有淀粉60份、柠檬酸铵12份、七水硫酸锌0.005份、五水硫酸铜0.005份、七水硫酸锰0.01份。
5.根据权利要求1所述一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第三步中28℃、150 rpm摇床发酵培养24、30 h、36 h、42 h，获得新鲜种子液。
6.根据权利要求1所述一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第四步中取新鲜种子液，按10%、14%、18%、22% (v/v)的接种量接入。
7.根据权利要求1所述一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物CHA的方法，其特征在于：所述第四步中以26、28、30、32 ℃，180 rpm摇床振荡培养13天。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010765903.4A CN111961692A (zh) | 2020-08-03 | 2020-08-03 | 一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物cha的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010765903.4A CN111961692A (zh) | 2020-08-03 | 2020-08-03 | 一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物cha的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111961692A true CN111961692A (zh) | 2020-11-20 |
Family
ID=73363799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010765903.4A Pending CN111961692A (zh) | 2020-08-03 | 2020-08-03 | 一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物cha的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111961692A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113528596A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-10-22 | 盐城工学院 | 一种提高海蟹共生烟曲霉发酵生产cha产量的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103849663A (zh) * | 2014-01-10 | 2014-06-11 | 华东理工大学 | 利用海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙的方法及其培养基 |
| CN104630303A (zh) * | 2014-07-03 | 2015-05-20 | 中国海洋大学 | 一种用于真菌Oidiodendron truncatum生产新型抗肿瘤活性化合物chetracin B的新型培养基及其制备方法 |
-
2020
- 2020-08-03 CN CN202010765903.4A patent/CN111961692A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103849663A (zh) * | 2014-01-10 | 2014-06-11 | 华东理工大学 | 利用海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙的方法及其培养基 |
| CN104630303A (zh) * | 2014-07-03 | 2015-05-20 | 中国海洋大学 | 一种用于真菌Oidiodendron truncatum生产新型抗肿瘤活性化合物chetracin B的新型培养基及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHANGQING LIU等: "Adsorption characteristics and preparative separation of chaetominine from Aspergillus fumigatus mycelia by macroporous resin", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B》 * |
| 张玉鹏: "海洋来源真菌烟曲霉CY018发酵生产抗癌代谢产物Chaetominine的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)工程科技I辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113528596A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-10-22 | 盐城工学院 | 一种提高海蟹共生烟曲霉发酵生产cha产量的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jeya et al. | Isolation of a novel high erythritol-producing Pseudozyma tsukubaensis and scale-up of erythritol fermentation to industrial level | |
| CN1082546C (zh) | 植物细胞培养期间改变培养基温度来大量生产紫杉醇的方法 | |
| CN105112305B (zh) | 一种富含Monacolin K的红曲米及其制备方法 | |
| CN106191173A (zh) | 一种提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素产量的方法 | |
| CN109022293B (zh) | 一种紫红曲霉菌株及其发酵产品和发酵方法 | |
| CN111961692A (zh) | 一种利用海蟹共生烟曲霉生产抗癌活性化合物cha的方法 | |
| CN108315265B (zh) | 一种杂色曲霉Av-2菌株及其应用 | |
| CN103849663B (zh) | 利用海蟹共生烟曲霉生产烟曲霉文丙的方法及其培养基 | |
| CN108660093B (zh) | 一种海洋链霉菌、衣霉素类化合物及其制备方法 | |
| CN113293106B (zh) | 一种子囊菌纲Filobasidium属的真菌及其应用 | |
| CN109456899B (zh) | 一种青霉菌及其发酵生产青霉酸的方法 | |
| CN114213428B (zh) | 一种吲哚生物碱化合物及其制备方法和应用 | |
| CN104804020B (zh) | 硫代二酮哌嗪类化合物及其制备方法和用途 | |
| CN111944854A (zh) | 一种利用海蟹共生烟曲霉制备抗癌活性化合物cha的方法 | |
| CN105505798A (zh) | 一种产麦角甾醇内生真菌及其应用 | |
| CN113151061B (zh) | 一种葡萄糖抑制型耐氧己酸菌 | |
| Zhong | Biomanufacturing | |
| CN102399848B (zh) | 利用竞争性微生物提高埃博霉素发酵产量的方法及应用 | |
| CN108841798B (zh) | 一种拟青霉发酵产生超氧化物歧化酶的培养基及方法 | |
| CN102586355B (zh) | 利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的培养基及制备方法 | |
| CN108794502B (zh) | 一种单端孢霉烯类化合物及其制备方法和用途 | |
| CN110195083B (zh) | 一种提高桦褐孔菌液态发酵桦褐孔菌醇产量的方法 | |
| CN113528596A (zh) | 一种提高海蟹共生烟曲霉发酵生产cha产量的方法 | |
| CN103966289A (zh) | 一种制备malforminC的方法 | |
| CN114874915B (zh) | 一株产布雷菲德菌素a的毛黄堇内生真菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201120 |