CN103966289A - 一种制备malforminC的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物发酵法制备malforminC的一个菌株和从其代谢产物中分离纯化malforminC的方法。该菌株是从2007年6月采自泰国普吉岛的土壤中分离获得，在PDA培养基上菌落呈黑色，被鉴定塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)，实验室保藏编号SYP2612，CGMCC编号为XXX。该发明生产工艺先进，原料成本低，适于大规模工业化生产，而且生产过程中无有害物质的排放，对周围环境无污染、无公害、符合环保要求。
Description
技术领域：
发明涉及药品技术领域，即利用生物发酵生产malformin C的方法，即提供了微生物发酵制备malformin C的一个菌株和用其发酵液生产malformin C的方法。
技术背景：
环肽类化合物malformin C是1968年由Steenbergen S等人从发霉的大米上找到的一株黑曲霉产生，其发酵产率极低，只有200ug/ml(Steenbergen，S.，and E.D.Weinberg.Trace metal requirements for malformin biosynthesis.Growth.1968，32：125-134)。此外，Yasuhiro Kojimal等采固相合成的方法合成malformin C，收率只有15％(Yasuhiro Kojimal，Toshiaki Sunazukal，Kenichiro Nagail，et al.Solid-phase synthesis and biological activity of malformin C and its derivatives.The Journal of Antibiotics2009，62：681-686)。Keiichi HAGIMORI等人在2007年阐述了malformin C的抗癌机制。即malformin C作为一个G2期检验点(checkpoint)的抑制剂来达到抗癌的效果(Keiichi HAGIMORI，Takashi FUKUDA，Yoko HASEGAWA，et al.Fungal Malformins Inhibit Bleomycin-Induced G2 Checkpoint in Jurkat Cells.Biol.Pharm.Bull.2007，30(8)：1379-1383)。因此，找到一个收率高、成本低的新方法来积累malformin C对于开发这类抗肿瘤药物具有非常重要的作用。
发明内容：
本发明提供了一套完整的从生产到分离纯化malformin C的方法。选择菌株SYP2612，采用需氧微生物发酵法，从其发酵液中分离纯化获得malformin C。
该方法包括原始菌种的活化、摇瓶种子培养、微生物发酵、以及后提取的各种步骤。其生产工艺包括：
脱脂牛奶冻干管菌种→斜面活化→摇瓶种子→微生物发酵→终止发酵，提取纯化获得malformin C。
本发明所述的摇瓶种子培养是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，挖取适量菌体斜面，转移到种子摇瓶中，在自动旋转摇瓶机上震荡培养，50-300rpm，25～30℃，培养24-48小时获得摇瓶种子。本发明涉及的菌株SYP2612已提交相关单位保藏， 其分类命名及保藏信息如下：
分类命名：塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2012年12月14日
保藏编号：CGMCC NO.6992
本发明所述的微生物发酵是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，按照一定比例(1-15％)转入种子液。既可以采用在自动旋转摇瓶机上震荡，100-300rpm，25～30℃培养96～144小时后，停止发酵；也可以使用发酵罐进行微生物有氧发酵，100-400rpm，25～30℃培养96～144小时后，停止发酵。均可获得发酵产物malformin C。
本发明所述的微生物发酵的提取、分离、纯化过程如下：将所述的微生物发酵液用高速离心机或者布氏漏斗减压抽滤，除去菌丝体，将发酵上清液用乙酸乙酯或水饱和正丁醇等体积分别连续萃取三次，合并乙酸乙酯或水饱和正丁醇萃取液上层部分，用旋转蒸发仪减压浓缩至干燥，用甲醇完全溶解后取出，经过硅胶柱层析、经TLC获得目标馏分后，进一步采用HPLC法制备malformin C。
附图说明
附图1：菌株SYP2612菌落形态
附图2：菌株SYP2612孢子囊和孢子形态
附图3：菌株SYP2612依据ITS-5.8S rDNA序列的系统进化树
附图4：菌株SYP2612代谢产物的分离纯化流程
附图5：malfominC的ESI-MS图谱
附图6：C5的HPLC检测图谱
附图7：malfominC的13C-NMR图谱
附图8：malformin C的1H-NMR图谱
附图9：malformin C的HSQC-NMR图谱
附图10：malformin C的HMBC-NMR图谱
具体实施方式
下面结合优选实施例对本发明做进一步叙述，但保护范围不受所述实施例的限制。
实施例1：本发明所述真菌SYP2612在不同培养基上的特征。
上述菌株的生长状态参见附图1：菌株SYP2612菌落形态。
菌株SYP2612菌株在光学显微镜下的特征：
分生孢子头球形至辐射形；分生孢子梗壁光滑，顶囊球形，产孢结构双层，分生孢子球形，壁粗糙或具疣状突起。参见附图2：菌株SYP2612孢子囊和孢子形态。
以分子生物学手段，提取上述真菌基因组DNA，以ITS1、ITS4(ITS1：5’-TCC GTC GGT GAA CCT GCG G-3’；ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)为引物进行PCR扩增，测序，并将所测序列与Genbank中的rRNA同源序列比对，选取11株较高同源性的菌株，并以Sphingobacterium siyangensis为参照，利用软件Clustal X与Mega3.1构建菌种进化树。菌株SYP2612与Aspergillus tubingensis strain CBS103.12同源性最高(100％)。再结合形态学鉴定结果，该菌株被鉴定为塔宾曲霉Aspetgillus tubingensis。参见附图3：菌株SYP2612依据ITS-5.8SrDNA序列的系统进化树。
实施例2：需氧微生物摇瓶发酵法制备malformin C的方法
一、培养基
1.斜面培养基(g/L)
PDA培养基：马铃薯200、葡萄糖10、琼脂20、蒸馏水配制pH7.2-7.4121℃30min
马铃薯浸汁的制备：取200g去皮马铃薯，切成小块，置于1000ml水中煮一个小时后过滤，用蒸馏水将滤液补足1000ml。
2.摇瓶种子培养基(g/L)
3.摇瓶与发酵罐发酵培养基(g/L)摇瓶和发酵罐的培养基一样？
二、需氧微生物发酵过程
1.菌种的斜面活化：打开菌种脱脂牛奶冻干管，挑取少量粉匀涂布在上述灭菌后的斜面上，在28℃温度下培养5～7天，菌苔生长致密、布满斜面、无杂菌，冰箱4℃保存。
2.摇瓶种子培养：将活化好的斜面菌种挖块1*1cm2接种到种子培养瓶中，在28℃温度下恒温震荡培养，200rpm，培养40～48h，镜检菌丝生长舒展、染色深、无杂菌即可。
3.摇瓶发酵培养：发酵培养基如上，按1％的转种量将种子液接入发酵培养基中，28℃，200r/min培养144h，发酵120h时发酵液中C5含量达到最大值(758ug/ml)，随后有所下降。
4.发酵罐发酵培养：发酵培养基如上，接种量1％～5％，通气量为0.66vvm(air volume/culture volume/min)，28℃，200～400r/min发酵培养；C5产量达到最高峰的时间为96h， 经HPLC检测发酵液中C5浓度达到930ug/ml，随后有所下降；菌丝体前期生长状态良好，菌丝伸展，粗细均匀，在培养120h时菌丝体断裂成片段；在培养120h左右时残糖量下降为0g/100ml，氨基氮在24h左右下降到最低点，结束发酵。
三、菌株2612微生物发酵液中分离纯化C5的方法
1.发酵液预处理：将发酵液用布氏漏斗减压抽滤除去菌丝体，滤液乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液上层部分，用旋转蒸发仪减压浓缩至干燥，备用。
2.代谢产物C-5的纯化
将上述干燥的样品用甲醇溶解，用10g硅胶拌样进行硅胶(200-300目，150g)柱层析，采用氯仿-甲醇梯度洗脱(15∶1→10∶1→5∶1)，每100mL为一馏分，根据TLC分析，合并极性相近部分，得到极性较小的Section E部分，流程图见附图4。再将Section E部分进行制备液相作进一步纯化(菲纳米Kromasil C18，10*250mm5μm，流动相：甲醇∶水＝90∶10；检测波长205nm)，得到单体化合物，分析纯度达到95％以上，经过二次制备后，纯度可以达到99％。将所得纯净样品溶于氘代吡啶中，委托沈阳药科大学测试中心代测MS、13C、1H、HMQC、HMBC核磁数据，进行结构解析，鉴定为malformin C，malfominC的ESI-MS图谱见附图5。
3、HPLC法检测malformin C
色谱柱：Diamonsil C18(200*4.6mm5μm) 流速：1ml/min
流动相：甲醇∶水＝90∶10 检测条件：205nm
保留时间：tR＝15.565min
C5的HPLC检测图谱见附图6。
Claims (4)
1.一种制备malforminC的方法，其特征在于：选取代谢产物中含有malforminC的活性菌株，采用需氧微生物发酵方法，分离提取并纯化malforminC的过程。
2.根据权力要求1所述的一种制备malformin C的方法，其特征在于：选取的具有产生malformin C的活性菌株为塔宾曲霉。
3.根据权力要求1所述的一种制备malformin C的方法，其特征在于：采用需氧微生物发酵制备malformin C的步骤为：原始菌种的活化、摇瓶种子的制备、微生物发酵、发酵液的后处理；步骤如下：
(1)培养基种子培养基和微生物发酵培养基中的营养采用常用的碳源和氮源，其中碳源可为葡萄糖、糊精、蔗糖、淀粉、麦芽糖、糖蜜等，氮源可为玉米浆、蛋白胨、热/冷轧花生饼粉、酵母粉、黄豆饼粉，棉籽饼粉，硫酸铵，尿素，等，此外还需要添加一定比例的无机盐，如NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4、(NH4)2SO4，等。
(2)微生物发酵工艺：通过摇瓶或发酵罐二级发酵可获得malformin C，培养方法包括：摇瓶种子的制备：灭菌前培养基保持自然pH，灭菌后挖块接种生产菌株斜面菌苔后，于自动旋转摇瓶机上，转数100～400rpm，温度为25～30℃，培养时间为24～48小时。摇瓶微生物发酵：培养基pH自然，灭菌后按照1～10％的接种量转种，于自动旋转摇瓶机上，转数100～300转/分钟，温度为25～30℃，培养时间96～144小时。发酵罐微生物发酵：培养基pH自然，灭菌后按照1-15％的接种量转种，于发酵罐中发酵，转数100-400rpm，通气比0.3～1.5vvm，温度为25～30℃，培养时间96～144小时。
4.根据权力要求1所述的一种制备malformin C的方法，其特征在于：将所述的微生物发酵液用布氏漏斗减压抽滤除去菌丝体，将上清用乙酸乙酯或水饱和正丁醇等体积萃取三次，合并乙酸乙酯或水饱和正丁醇萃取液上层部分，用旋转蒸发仪减压浓缩，用色谱甲醇完全溶解后取出，采用硅胶拌样进行硅胶(200-300目)柱层析，采用氯仿-甲醇梯度洗脱，根据TLC检测分析，合并极性相近部分，得到极性较小的Section E部分。再将Section E部分进行制备液相作进一步纯化，制备液相的流动相为：甲醇∶水＝90∶10；检测波长为203nm，获得单体化合物，经过结构解析，鉴定为malformin C，其化学结构式如下：
malformin C的化学结构式
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Cited By (2)
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| CN105112298A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-12-02 | 中国科学院微生物研究所 | 沃格玛木霉产菌丝培养基及其制备方法与应用 |
| CN109626598A (zh) * | 2019-01-23 | 2019-04-16 | 南华大学 | 一种利用塔宾曲霉和植酸盐原位修复六价铀污染地表水的方法 |
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