CN113528596A - 一种提高海蟹共生烟曲霉发酵生产cha产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提高海蟹共生烟曲霉发酵生产CHA产量的方法，通过在发酵过程中外援添加金属离子，尤其是钙离子。本发明的方法操作简单，培养基成分简单，成本低廉，不需特殊设备，使用该金属离子添加工艺优化发酵海蟹共生曲霉的发酵过程来审查抗癌活性生物碱CHA，产量显著提高。

Description

一种提高海蟹共生烟曲霉发酵生产CHA产量的方法

技术领域

本发明发明涉及微生物培养和外源金属离子添加技术领域，具体涉及培养海蟹共生曲霉的发酵优化技术领域，特别是指一种用于发酵培养海蟹共生曲霉生产生物碱类抗癌活性化合物Chaetominine(通称CHA)的实验室规模发酵优化方法。

背景技术

海洋占据着地球表面近71％的面积，由于高盐、高压、低温、低氧的环境，各种海洋生物必须与其共生菌长期共进化并建立稳定的互惠共生关系，其丰富了海洋生物的多样性，并且能够合成许多结构独特且具有显著生物活性的海洋天然产物，吸引许多专家学者从海洋中获取天然产物。历年来科学研究者发现的新天然产物呈逐年递增的趋势，其中具有抗癌活性的天然产物占据了63％的比例，而且FDA/EMA批准的海洋药物中多数应用于癌症的治疗，可见，癌症依旧是威胁人类健康的巨大隐患。故海洋共生菌被认为是新药源分子的重要来源，对其产物深入研究可为人类抵抗癌症等疾病有着较为深远的影响。

海洋来源内生真菌菌株编号：CY018属半知菌类、丝孢目(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、曲霉属(Aspergillus)真菌。海洋来源内生真菌CY018经液体或固体发酵可产生多种代谢物，包括生物碱类、萜类化合物、多烯类化合物和鞘氨酸类化合物等天然物质。CHA是其产生的一种生物碱类次级代谢物，CHA纯品为无色颗粒状结晶，对人白血病K562细胞系和人结肠癌SW1116细胞系具有同5氟尿嘧啶相媲美的抗癌活性，是一种潜在的抗癌制剂候选药物。

然而，CHA在初始发酵条件下的得率较低，CHA的产量低下已经成为制约CHA用于临床前研究的瓶颈。因此，通过改善其发酵优化工艺提高CHA产量已成为当务之急。

发明内容

发明目的：本发明的主要目的就是针对以上现状，解决限制对烟曲霉CY018次级代谢产物CHA产量提高研究的瓶颈问题，提供一种用于发酵海蟹共生曲霉生产抗癌活性生物碱CHA的方法。

为实现上述目的，本发明提出一种提高海蟹共生烟曲霉发酵生产CHA产量的方法，通过在发酵过程中外援添加金属离子。

优选地，所述金属离子为Ca²⁺、Al³⁺或Cu²⁺中的任意一种或几种的组合。

优选地，所述金属离子为Ca²⁺和Al³⁺的混合物。更优选地，Ca²⁺和Al³⁺的摩尔比为1:1。

所述金属离子的添加浓度为0.2～1mM。

具体地，在发酵100-130h时添加金属离子。

优选地，在发酵115-120h时添加金属离子.

在一个优选的实施方式中，在发酵120h时添加0.45M Ca²⁺。

其中，蔗糖100-120g/L，乙酸铵4.5-5g/L，七水合硫酸镁0.78-0.84g/L，七水合硫酸亚铁0.012-0.016g/L，磷酸二氢钾0.8-1.2g/L，酒石酸钠1.6-2g/L，谷氨酸钠2.0-2.4g/L。

发酵条件为：将种子液按照14-20％(v/v)的接种量接入所述发酵培养基，以25-28℃、150-180rpm摇床振荡培养10-14天，并于发酵100-130h时添加金属离子获得发酵液。有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明的培养基成分蔗糖、乙酸铵、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、七水合硫酸亚铁、谷氨酸钠和酒石酸钠，原料易得，价格低廉，有利于推广应用；

(2)在摇瓶水平，于发酵120h外源添加0.45M钙离子可显著提高烟曲霉发酵产物CHA的产量；

(3)制备本发明的培养基只需将上述原料以自来水溶解，方法简单，难度低，无需专门技术培训及特殊仪器设备；

(4)采用本发明的金属离子添加工艺培养海蟹共生烟曲霉，该菌株在工艺下生长迅速，较大程度改变代谢通路，减少副产物，可提高目标产物CHA的产量，为后期纯化工作降低难度，在发酵120h外源添加0.5M钙离子和0.5M铝离子，使得CHA的产量可达到65.87mg/L，是原始水平的1.91倍。

附图说明

图1为金属离子的添加对于菌体生长以及CHA产量的影响；

图2为不同浓度的CaCl₂对CHA的产量的影响；

图3为不同的添加时间对CHA产量和生物量的影响；

图4为添加钙离子后，目标化合物的HPLC检测结果；

图5为不同浓度的AlCl₃对CHA产量的影响；

图6为AlCl₃不同的添加时间对CHA产量和生物量的影响；

图7为钙离子和铝离子共添加对CHA产量和生物量的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议将培养基中玉米浆、淀粉先加热溶解，以防形成颗粒状营养物质的干扰。

实施例1不同金属离子对CHA发酵量的影响。

(1)配制发酵培养基：

准确称取蔗糖120g/L，乙酸铵5g/L，七水合硫酸镁0.84g/L，七水合硫酸亚铁0.016g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，酒石酸钠2g/L，谷氨酸钠2.4g/L。将50mL发酵液分装于250mL三角瓶中，于灭菌锅中121℃下灭菌30min后，冷却后使用。

(2)种子液发酵操作过程：

将-80℃保存的海蟹共生烟曲霉解冻后，用接种针在固体平板培养基中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，活化培养7天，获得新鲜固体平板培养基，然后置于4℃冰箱保存。用接种铲从新鲜的海蟹共生烟曲霉的固体平板培养基中挖取1块5×5mm琼脂块，接种至装有400mL种子培养基的1000mL摇瓶中，以28℃、150rpm摇床发酵培养3-4天，获得新鲜种子液。

(3)摇瓶发酵操作过程：

取新鲜种子液，按14％(v/v)的接种量接入所述新颖培养基，以28℃、180rpm摇床振荡培养14天，获得发酵液。在发酵初始0h，添加0.5和1mM浓度Al³⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺和Zn²⁺金属离子对生物量和CHA合成的影响。

(4)菌体生物量测定：

将全部发酵液用已称重的定性滤纸真空抽滤，滤去上清液，将菌体用去离子水冲洗3遍并滤干、收集。随后放入55℃鼓风干燥箱中干燥24h，于干燥器中冷却，细胞干重(Drycell weight(DCW)，g/L)采用减重法测定获得。

(5)CHA产量检测：

取50mL所获发酵液于250mL锥形瓶中，加入50mL乙酸乙酯和30颗直径为3mm的玻璃珠，密封后，置于28℃和200rpm摇床环境进行研磨、萃取1小时，并重复三次，然后取3mL上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯；残留物用1mL无水甲醇溶解；在相对离心力为13000rpm的条件下离心3分钟后，取500μL上清液，用高效液相色谱法测定CHA的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中CHA的实际含量。

结果如图1所示，发酵培养基中加入不同浓度的AlCl₃、CaCl₂、MnSO₄、CuSO₄和ZnSO₄溶液，考察金属离子的添加对于菌体生长以及CHA产量的影响。如图1所示，Al³⁺和Ca²⁺对CHA的合成具有促进作用，Cu²⁺对CHA的合成无明显的影响，Mn²⁺和Zn²⁺对CHA的合成有抑制作用。最后测得对照组中CHA的产量为34.45mg/L，发酵初时，添加0.5mM钙离子，CHA的产量为55.31mg/L，添加0.5mM铝离子，CHA的产量为52.30mg/L。因此，下面的实验我们以添加CaCl₂、AlCl₃进行进一步的优化。

实施例2不同浓度钙离子对CHA产量的影响。

配制发酵培养基和种子液发酵操作过程同实施例1，在摇瓶发酵操作过程中，针对金属钙离子的添加量，设置了9个梯度，分别为0、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65和0.7mM，在接种后添加钙离子，考察不同的金属钙离子添加量对于菌体生物量和CHA的生物合成的影响。

通过添加不同浓度的CaCl₂，实验结果如图2所示，CHA的产量随着钙离子添加浓度的增加，呈现先升高后降低的趋势，且生物量也呈现相同的趋势，当添加浓度为0.5mM时，CHA产量最高达到58.80mg/L。究其原因可能是低浓度的钙离子可以促使细胞生长，从而有更多的活性细胞进行CHA的合成，促使CHA的高产。而高浓度的钙离子可能抑制菌体生长导致生物量较低，从而CHA合成的活性细胞降数量低，CHA产量降低。因此，确定钙离子的最佳添加浓度为0.5mM。最后测得在发酵初始0h，添加0.5mM钙离子，目标产物CHA的产量为58.80mg/L。

实施例3钙离子添加时间对CHA产量的影响。

其他步骤同实施例1，仅改变钙离子添加时间，分别设置发酵0、72、120、168、216、264和312h添加钙离子，考察金属钙离子添加时间对于菌体生物量和CHA的生物合成的影响。

在确定CaCl₂，添加浓度为0.5mM的基础上，我们考察不同的添加时间对CHA产量和生物量的影响。实验结果如图3所示，CHA的产量随着钙离子添加时间的变化而变化，在120h时CHA产量达到最大值。并且通过HPLC检测，如图4所示，发现添加钙离子后，目标化合物的峰值确实增加。因此，最终确定钙离子添加时间为第120h，添加浓度为0.5mM，CHA的产量达到62.74mg/L。

实施例4不同浓度铝离子对CHA产量的影响。

配制发酵培养基和种子液发酵操作过程同实施例1，在摇瓶发酵操作过程中，针对金属铝离子的添加量，设置了9个梯度，分别为0、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65和0.7mM，在接种后添加铝离子，考察不同的金属铝离子添加量对于菌体生物量和CHA的生物合成的影响。

通过添加不同浓度的AlCl₃，实验结果如图5所示，CHA的产量随着铝离子添加浓度的增加，呈现先升高后降低的趋势，且生物量保持平稳的趋势，当添加浓度为0.5mM时，CHA产量最高达到49.45mg/L。究其原因可能是与钙离子的不同浓度作用相似，低浓度促进细胞生长，积累大量细胞合成CHA，而高浓度离子会影响细胞代谢和生长，减少菌体数量，CHA的生物合成降低。因此，确定铝离子的最佳添加浓度为0.5mM。最后测得在发酵初始0h，添加0.5mM钙离子，目标产物CHA的产量为49.45mg/L。

实施例5铝离子添加时间对CHA产量的影响。

其他步骤同实施例1，仅改变铝离子添加时间，分别设置发酵0、72、120、168、216、264和312h添加钙离子，考察金属铝离子添加时间对于菌体生物量和CHA的生物合成的影响。

在确定AlCl₃，添加浓度为0.5mM的基础上，我们考察不同的添加时间对CHA产量和生物量的影响。实验结果如图6所示，CHA的产量随着铝离子添加时间的变化呈现先增加后降低的趋势，在120h时CHA产量达到最大值，50.43mg/L。因此，最终确定钙离子添加时间为第120h，添加浓度为0.5mM，CHA的产量达到50.43mg/L。

实施例6钙离子和铝离子共添加对CHA产量的影响。

其他步骤同实施例1，在发酵120h共同添加0.5mM钙离子和0.5mM铝离子，考察钙离子和铝离子共添加对于菌体生物量和CHA的生物合成的影响。

在确定CaCl₂添加浓度为0.5mM，AlCl₃添加浓度为0.5mM，两个离子添加时间为120h的基础上，我们考察钙离子和铝离子共添加对CHA产量和生物量的影响。实验结果如图7所示，CHA的产量随着发酵时间的变化呈现先增加后降低的趋势，在发酵时间288h时CHA产量达到最大值，50.12mg/L。生物量随发酵时间逐步积累，pH在发酵0-48h会出现一个短时的增加，此时菌体消耗氮源促进细胞生长，释放大量碱性物质，从而提高pH，在后续的发酵过程由于消耗碳源和胞内产生有机酸，发酵液中pH则保持较低的数值。残糖消耗随时间增加缓慢消耗，在240-336h出现急速消耗，此时细胞生物量达到较高的水平，且CHA生物合成产量也在急速积累。可见，在120h共同添加钙离子和铝离子能够有效促进CHA的生物合成，在发酵288h，CHA的产量可达到65.87mg/L。

需要说明的是，以上较佳实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (9)

1.一种提高海蟹共生烟曲霉发酵生产CHA产量的方法，其特征在于，在发酵过程中外援添加金属离子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属离子为Ca²⁺、Al³⁺ 或Cu²⁺中的任意一种或几种的组合。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金属离子为Ca²⁺和Al³⁺的混合物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属离子的浓度为0.2~1mM。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵100-130h时添加金属离子。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵115-120h时添加金属离子。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵120h时添加0.45M Ca²⁺。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基为：蔗糖100-120 g/L，乙酸铵4.5-5 g/L，七水合硫酸镁0.78-0.84 g/L，七水合硫酸亚铁0.012-0.016 g/L，磷酸二氢钾0.8-1.2 g/L，酒石酸钠1.6-2 g/L，谷氨酸钠2.0-2.4 g/L。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵条件为：将种子液按照14-20% (v/v)的接种量接入所述发酵培养基，以25-28℃、150-180 rpm摇床振荡培养10-14天，并于发酵100-130h时添加金属离子获得发酵液。

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