CN102586355B - 利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的培养基及制备方法 - Google Patents
利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的培养基及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的培养基及制备方法。揭示了一种新型培养基，该培养基成分简单，制备操作方便，成本低廉，不需特殊设备，能显著提高海洋红树林内生真菌No.1403发酵生产1403C的产量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学领域；更具体地，涉及利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的培养基及制备方法。
背景技术
21世纪是一个海洋大开发的时代，越来越多的沿海国家把开发海洋资源的能力作为当前评估国家综合实力的砝码。独特的海洋环境造就了各种各样的生态系统，被誉为“海上森林”的红树林就是其中之一。红树林生长在热带、亚热带海岸的潮间带，其生活环境具有强还原性、强酸性、高含盐量和营养丰富等特点。红树林具有丰富的真菌资源，目前已分离鉴定的红树林真菌超过200种，海洋真菌可以产生众多种类的天然活性化合物。
海洋红树林内生真菌No.1403属于层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)，盐生坚座壳种(Halorosellinia sp.)，由香港城市大学L.L.P.Vrijmoed教授从红树林树叶内部分离得到。红树林内生真菌No.1403经液体或固体发酵可产生20多种代谢物，包括蒽醌类(Anthraquinone)、萘醌类(Naphthoquinone)和咕吨酮类(Xanthone)等天然物质。1403C是其产生的一种蒽醌类次级代谢物，1403C也叫做SZ-685C，1403C纯品为红色颗粒状结晶，1403C及其乙酰化产物具有显著的抗肿瘤活性，通过Akt/FOXO途径诱导癌细胞凋亡，是一种具有较好前景的抗癌候选药物。
然而，1403C在初始环境下的得率相当低，目前已经成为制约1403C用于临床前研究的瓶颈。因此通过优化其培养环境、改善其发酵工艺已成为当务之急。培养基是微生物生长的基质，本领域迫切需要借助各种优化手段，寻求利用海洋红树林内生真菌No.1403高效生产抗癌蒽醌类化合物1403C的培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的培养基。
本发明的另一目的在于提供利用海洋红树林内生真菌生产抗癌蒽醌类化合物的方法。
在本发明的第一方面，提供一种发酵培养基，所述培养基含有：
(1)葡萄糖 7-20g/L；
(2)蛋白胨 0.5-2g/L；
(3)牛肉浸膏 2-8g/L；
(4)一水硫酸锰 0.1-0.5g/L；
(1)-(4)的组分溶于10-60％(v/v)浓度的人工海水中。
在一个优选例中，所述培养基含有：
(1)葡萄糖 9-15g/L；
(2)蛋白胨 0.9-1.6g/L；
(3)牛肉浸膏 3-7g/L；
(4)一水硫酸锰 0.2-0.4g/L。
在另一优选例中，所述的培养基含有：
(1)葡萄糖 11-13g/L；
(2)蛋白胨 0.95-1.2g/L；
(3)牛肉浸膏 5.5-6.5g/L；
(4)一水硫酸锰 0.2-0.3g/L。
在另一优选例中，所述的培养基含有：
(1)葡萄糖 12.36g/L；
(2)蛋白胨 1.05g/L；
(3)牛肉浸膏 6.08g/L；
(4)一水硫酸锰 0.246g/L。
在另一优选例中，所述的培养基中，(1)-(4)的组分溶于30-50％(v/v)浓度的人工海水中；更佳地，(1)-(4)的组分溶于40％(v/v)浓度的人工海水中。
在另一优选例中，所述的人工海水含有：
(a)氯化钠 15-25g/L；
(b)无水硫酸钠 3-7g/L；
(c)无水氯化钙 1-2g/L；
(d)六水氯化镁 4-8g/L；
(e)硼酸 0.02-0.04g/L；
(f)溴化钾 0.06-0.1g/L；
(g)碳酸氢钠 0.1-0.2g/L；
(a)-(g)的组分溶于水(较佳地为去离子水)中。
在另一优选例中，所述的人工海水含有：
(a)氯化钠 18-22g/L；
(b)无水硫酸钠 4-6g/L；
(c)无水氯化钙 1.2-1.5g/L；
(d)六水氯化镁 5.5-6.8g/L；
(e)硼酸 0.025-0.035g/L；
(f)溴化钾 0.07-0.09g/L；
(g)碳酸氢钠 0.14-0.18g/L。
在另一优选例中，所述的人工海水含有：
(a)氯化钠 19.624g/L；
(b)无水硫酸钠 4.908g/L；
(c)无水氯化钙 1.392g/L；
(d)六水氯化镁 6.240g/L；
(e)硼酸 0.032g/L；
(f)溴化钾 0.081g/L；
(g)碳酸氢钠 0.161g/L。
在本发明的另一方面，提供一种制备所述的发酵培养基的方法，包括：分别称取葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、一水硫酸锰，溶于所述10-60％(v/v)浓度的人工海水中，使得它们在培养基中的终浓度分别为7-20g/L、0.5-2g/L、2-8g/L、0.1-0.5g/L。
在本发明的另一方面，提供所述的发酵培养基的用途，用于培养海洋红树林内生真菌No.1403，生产蒽醌类化合物1403C。
在本发明的另一方面，提供一种培养海洋红树林内生真菌No.1403、生产蒽醌类化合物1403C的方法，包括：利用前面任一所述的发酵培养基培养。
在另一优选例中，所述的方法包括：
按3-10％(v/v)的接种量将海洋红树林内生真菌No.1403的新鲜种子液接入前面任一所述的发酵培养基，28±2℃、170±20r/min摇床发酵培养4-7天(如5天，6天)，获得发酵液。
在另一优选例中，海洋红树林内生真菌No.1403的新鲜种子液通过如下方式获得：用接种铲从新鲜的海洋红树林内生真菌No.1403的固体平板中挖取4块3×3mm琼脂块，接种至装有100m1种子培养基的500ml挡板瓶中，28±2℃、170±20r/min摇床发酵培养2-3天，获得种子液。
在另一优选例中，还包括：从发酵液中分离获得蒽醌类化合物1403C。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了各实施例中，海洋红树林内生真菌No.1403在不同配方的培养基中进行发酵，得到的1403C产量。
具体实施方式
针对现有技术中难以利用海洋红树林内生真菌No.1403高效生产抗癌蒽醌类化合物1403C(亦称SZ-685C)的现状，本发明人经过深入的研究，揭示了一种新型培养基，该培养基成分简单，制备操作方便，成本低廉，不需特殊设备，能显著提高海洋红树林内生真菌No.1403发酵生产1403C的产量，从原来的600-800mg/L提高到2000mg/L以上。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”“基本上由……构成”、和“由……构成”。
培养基
本发明人优化了用于海洋红树林内生真菌No.1403发酵的培养基，所述的培养基中包含葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏和一水硫酸锰。
作为本发明的优选方式，用于配制本发明的培养基的各组分的用量如表1所示。
表1
| 含量 | 优选量 | 更优选量 | 最优选量 | |
| 葡萄糖 | 7-20g/L | 9-15g/L | 11-13g/L | 12.36g/L |
| 蛋白胨 | 0.5-2g/L | 0.9-1.6g/L | 0.95-1.2g/L | 1.05g/L |
| 牛肉浸膏 | 2-8g/L | 3-7g/L | 5.5-6.5g/L | 6.08g/L |
| 一水硫酸锰 | 0.1-0.5g/L | 0.2-0.4g/L | 0.2-0.3g/L | 0.246g/L |
上述配方的营养成分被溶于10-60％(v/v)、较佳地30-50％(v/v)、更佳地40％(v/v)浓度人工海水中，从而为海洋红树林内生真菌No.1403提供适宜的生长环境。
作为本发明的优选方式，用于配制本发明的人工海水的各组分的用量如表2所示。
| 含量 | 优选量 | 最优选量 | |
| 氯化钠 | 15-25g/L | 18-22g/L | 19.624g/L |
| 无水硫酸钠 | 3-7g/L | 4-6g/L | 4.908g/L |
| 无水氯化钙 | 1-2g/L | 1.2-1.5g/L | 1.392g/L |
| 六水氯化镁 | 4-8g/L | 5.5-6.8g/L | 6.240g/L |
| 硼酸 | 0.02-0.04g/L | 0.025-0.035g/L | 0.032g/L |
| 溴化钾 | 0.06-0.1g/L | 0.07-0.09g/L | 0.081g/L |
| 碳酸氢钠 | 0.1-0.2g/L | 0.14-0.18g/L | 0.161g/L |
经本发明人优化后的培养基配方，它含有足够且合理的营养成份，有利于海洋红树林内生真菌No.1403的生长及大量生产蒽醌类化合物1403C。
在本发明的优选实施例中，所述的发酵培养基的可采用如下方法配制：
a.准确称重所述葡萄糖、所述蛋白胨、所述牛肉浸膏、所述一水硫酸锰；
b.准确称重所述氯化钠、所述无水硫酸钠、所述六水氯化镁、所述硼酸、所述无水氯化钙、所述溴化钾、所述碳酸氢钠，去离子水溶解并定容至1000ml；
c.人工海水I和去离子水按照4∶6的体积比进行混合，得到40％浓度的人工海水I；
d.步骤a所述四种成分溶于步骤c所述40％浓度的人工海水I，并用所述40％浓度的人工海水I定容至1000ml；
e.将步骤d所获得的培养基在121℃，灭菌15-30min。
培养方法
本发明还提供了培养海洋红树林内生真菌No.1403、生产蒽醌类化合物1403C的方法，包括：利用本发明所述的发酵培养基培养。
作为本发明的优选实施例，一种使用所述新型培养基发酵培养海洋红树林内生真菌No.1403生产1403C的方法，其操作步骤包括：
a.用接种铲从新鲜的海洋红树林内生真菌No.1403的固体平板中挖取4块3×3mm琼脂块，接种至装有100ml种子培养基的500ml挡板瓶中，28℃、170r/min摇床环境发酵培养2-3天，获得新鲜种子液；
b.取所述新鲜种子液，按3-10％(v/v)的接种量接入所述新型培养基，28℃、170r/min摇床发酵培养4-7天，获得发酵液。
更适宜的是，将-80℃保存的菌种复苏后，用接种针在固体平板培养基中央进行点样，置于28℃恒温培养箱，湿度保持在50％以上，活化培养4-6天，获得新鲜固体平板，然后置于4℃冰箱待用，固体平板每隔30天重新活化一次。
更适宜的是，每升固体培养基包含有葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母干粉1g，琼脂粉15-20g，其余为100％浓度的人工海水II。
更适宜的是，接种时的新鲜种子液的单位体积菌体干重控制在1.5-3.5g/L，pH控制在5-6，一般按照5％(v/v)接种量进行接种。
更适宜的是，每升种子培养基包含有葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母干粉1g，其余为100％浓度的人工海水II。
更适宜的是，每升所述人工海水II包含有氯化钠24.5g，无水硫酸钠4.0g，无水氯化钙0.56g，六水氯化镁5.0g，硼酸0.026g，氯化钾0.664g，溴化钾0.1g，碳酸氢钠0.2g，其余为去离子水。
利用本发明的培养基和方法获得的抗癌蒽醌类化合物1403C的检测可采用本领域常规的技术。作为本发明的优选方式，待所述发酵液pH接近7.0或所述发酵液变为红黑色，一般在120h左右，停止发酵；取适量所述发酵液，加入乙酸乙酯和玻璃珠，密封后进行研磨、萃取，静置分层后取适量上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯；残留物用无水乙酸溶解；高速离心后取适量上清液，用无水乙酸稀释若干倍后，用HPLC测定1403C的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中1403C的实际含量。
更适宜的是，所述发酵液取10ml，所述乙酸乙酯20ml，所述玻璃珠30颗，其直径为3mm；所述萃取条件为28℃和170r/min摇床环境萃取24h；所述高速离心为13780×g，离心3min。
本发明的发酵培养基的主要优点如下：
(1)本发明的发酵培养基成分包括葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏和一水硫酸锰常见试剂，组成简单、添加量低、原料易得，有利于推广应用；
(2)配制本发明的发酵培养基只需将一些常见试剂以适合的比例溶于适当浓度的人工海水中，制备简单，难度低，无需专门技术培训及特殊仪器设备；
(3)采用本发明的新型培养基培养海洋红树林内生真菌No.1403，该菌株在该新型培养基中生长迅速，较大程度改变代谢通路，减少副产物，提高目标产物1403C产量，粗产品的纯度可达80％以上，为后期纯化工作降低难度，1403C的最高产量可达到2298mg/L，是原始水平的2-3倍。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如袁丽红编著，微生物学实验，化学工业出版社，2010中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1、制备人工海水I
准确称取氯化钠19.624g，无水硫酸钠4.908g，无水氯化钙1.392g，六水氯化镁6.240g，硼酸0.032g，溴化钾0.081g，碳酸氢钠0.161g，用去离子水溶解并定容至1000ml，称为人工海水I。
将前述获得的人工海水I和去离子水按照4∶6的体积比混合，得到40％(v/v)浓度的人工海水I。
2、配制发酵培养基
准确称取葡萄糖10g，蛋白胨1g，牛肉浸膏4g，一水硫酸锰0.246g，用40％(v/v)浓度的人工海水I溶解并定容至1000ml，获得发酵培养基。
3、发酵操作过程
海洋红树林内生真菌No.1403菌种由中山大学提供，菌种分别保藏在香港城市大学、中山大学和中国典型微生物保藏中心(武汉大学保藏中心)。从已经活化好的固体平板中挖取4块3×3mm琼脂块，接种至装有100ml种子培养基的500ml挡板瓶中，28℃、170r/min摇床环境发酵培养3天，获得新鲜种子液；新鲜种子液的单位体积菌体干重控制在2.5g/L左右，pH控制在5-6，按5％(v/v)的接种量将新鲜种子液接入发酵培养基，28℃、170r/min摇床环境发酵培养5天，获得发酵液。
4、1403C产量测定
取10ml所获发酵液于250ml锥形瓶，加入20ml乙酸乙酯和30颗玻璃珠，密封后，置于28℃和170r/min摇床环境进行研磨、萃取24h，静置分层后取2.5ml上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯；残留物用2ml无水乙酸溶解；13780×g、离心3min后取100μl上清液，用无水乙酸稀释10倍后，用HPLC测定1403C的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中1403C的实际含量。
最后测得目标产物1403C的产量为1528mg/L。
实施例2
1、制备人工海水I
同实施例1的步骤1。
2、配制发酵培养基
准确称取葡萄糖10g，蛋白胨1.25g，牛肉浸膏5g，一水硫酸锰0.307g，用40％浓度的人工海水I溶解并定容至1000ml。
3、发酵操作过程
同实施例1的步骤3。
4、1403C产量测定
同实施例1的步骤4，最后测得目标产物1403C的产量为1633mg/L。
实施例3
1、制备人工海水I
同实施例1的步骤1。
2、配制发酵培养基
准确称取葡萄糖9g，蛋白胨1.05g，牛肉浸膏4.4g，一水硫酸锰0.246g，用40％浓度的人工海水I溶解并定容至1000ml。
3、发酵操作过程
同实施例1的步骤3。
4、1403C产量测定
同实施例1的步骤4，最后测得目标产物1403C的产量为1503mg/L。
实施例4
1、制备人工海水I
同实施例1的步骤1。
2、配制发酵培养基
准确称取葡萄糖12.36g，蛋白胨1.05g，牛肉浸膏4.4g，一水硫酸锰0.246g，用40％浓度的人工海水I溶解并定容至1000ml。
3、发酵操作过程
同实施例1的步骤3。
4、1403C产量测定
同实施例1的步骤4，最后测得目标产物1403C的产量为2242mg/L。
实施例5
1、制备人工海水I
同实施例1的步骤1。
2、配制发酵培养基
准确称取葡萄糖12.36g，蛋白胨1.05g，牛肉浸膏6.08g，一水硫酸锰0.246g，用40％浓度的人工海水I溶解并定容至1000ml。
3、发酵操作过程
同实施例1的步骤3。
4、1403C产量测定
同实施例1的步骤4，最后测得目标产物1403C的产量为2298mg/L。
实施例6(对照实例)
1、制备人工海水II
准确称取氯化钠24.5g，无水硫酸钠4.0g，无水氯化钙0.56g，六水氯化镁5.0g，硼酸0.026g，氯化钾0.664g，溴化钾0.1g，碳酸氢钠0.2g，用去离子水溶解并定容至1000ml；
将人工海水II和去离子水按照2∶8的体积比混合，得到20％浓度的人工海水II。
2、配制发酵培养基
准确称取葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母干粉1g，用20％浓度的人工海水II溶解并定容至1000ml。
3、发酵操作过程
同实施例1的步骤3。
4、1403C产量测定
同实施例1的步骤4，最后测得目标产物1403C的产量为754mg/L。
从实施例1～5可以发现：利用本发明的新型培养基，抗癌蒽醌类化合物1403C的产量都在1500mg/L以上，最高产量为2298mg/L，与实施例6的对照组相比较，本发明的新型培养基能显著促进海洋红树林内生真菌No.1403发酵生产抗癌蒽醌类化合物1403C，1403C的产量得到显著提高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种发酵培养基，其特征在于，所述培养基含有：
(1)-(4)的组分溶于30-50%(v/v)浓度的人工海水中；
其中，所述的人工海水含有：
(a)-(g)的组分溶于水中。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述培养基含有：
3.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的人工海水含有：
4.一种制备权利要求1所述的发酵培养基的方法，其特征在于，包括：分别称取葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、一水硫酸锰，溶于所述30-50%(v/v)浓度的人工海水中，使得它们在培养基中的终浓度分别为7-20g/L、0.5-2g/L、2-8g/L、0.1-0.5g/L。
5.权利要求1-3任一所述的发酵培养基的用途，用于培养海洋红树林内生真菌No.1403，生产蒽醌类化合物1403C。
6.一种培养海洋红树林内生真菌No.1403、生产蒽醌类化合物1403C的方法，包括：
按3-10%(v/v)的接种量将海洋红树林内生真菌No.1403的新鲜种子液接入权利要求1-3任一所述的发酵培养基，28±2℃、170±20r/min摇床发酵培养4-7天，获得发酵液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，海洋红树林内生真菌No.1403的新鲜种子液通过如下方式获得：用接种铲从新鲜的海洋红树林内生真菌No.1403的固体平板中挖取4块3×3mm琼脂块，接种至装有100ml种子培养基的500ml挡板瓶中，28±2℃、170±20r/min摇床发酵培养2-3天，获得种子液。
8.如权利要求6-7任一所述的方法，其特征在于，还包括：从发酵液中分离获得蒽醌类化合物1403C。
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| Identification of mangrove endophytic fungus 1403 (Fusarium proliferatum) based on morphological and molecular evidence;zhong-shan cheng 等;《Journal of Forestry Research》;20080930;第19卷(第3期);219-224 * |
| zhong-shan cheng 等.Identification of mangrove endophytic fungus 1403 (Fusarium proliferatum) based on morphological and molecular evidence.《Journal of Forestry Research》.2008,第19卷(第3期),219-224. |
| 代谢途径抑制剂及前体对海洋红树林_省略_3产抗肿瘤化合物1403C的影响;余超 等;《生物技术通报》;20101231(第11期);199-205 * |
| 余超 等.代谢途径抑制剂及前体对海洋红树林_省略_3产抗肿瘤化合物1403C的影响.《生物技术通报》.2010,(第11期),199-205. |
| 康丽.海洋红树林内生真菌产抗肿瘤活性化合物1403C发酵条件的优化.《生物技术通报》.2011,(第12期),199-203. |
| 海洋红树林内生真菌产抗肿瘤活性化合物1403C发酵条件的优化;康丽;《生物技术通报》;20111231(第12期);199-203 * |
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| CN102586355A (zh) | 2012-07-18 |
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