CN109207374B - 一种花蚬共生真菌烟曲霉及其制备方法以及提取物和应用 - Google Patents

一种花蚬共生真菌烟曲霉及其制备方法以及提取物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种花蚬共生真菌烟曲霉及其制备方法以及提取物和应用，花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX‑1菌株于2018年06月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M 2018377，其发酵提取物对鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）具有抑制效果，因此，本发明的实现为研究与开发新的抗菌药物提供了候选药物。

Description

一种花蚬共生真菌烟曲霉及其制备方法以及提取物和应用
技术领域
本发明涉及一种微生物学、发酵工程、医药学等领域，具体涉及一种花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1及制备方法，以及从该菌株的液体培养发酵产物中制备的发酵提取物，和该提取物在制备抗细菌药物中的应用。
背景技术
海洋真菌由于其遗传背景复杂、代谢产物种类多、产量高，成为海洋微生物天然产物的主要来源。自20世纪90年代开始一直到现在，已从海藻、海绵、红树林生态系统、海洋沉积物、海洋软体动物、海鞘、珊瑚、鱼类、其他海洋动植物等来源海洋真菌的发酵产物中发现了二千多个新的次生代谢产物，化合物类型包括生物碱、多肽、聚酮、萜类、甾类等多种结构类型及其卤代衍生物，这些代谢产物表现出良好的抗菌、抗肿瘤、抗病毒等生物活性。据估计，海洋真菌有6000种以上，但到2015年为止，已鉴定的海洋真菌仅有472属1112种，仅占陆地真菌总数（约5万种）的2%左右。因此，海洋真菌仍处于一个探索和研究的阶段。
目前关于海洋真菌活性物质的研究，在医药的开发上比较深入，有关海洋真菌对水产病原菌和水产品腐败菌拮抗物质的研究鲜有报道。随着社会经济水平的提高及人们对健康和环境保护的重视，安全、高效、低残留的新型水用抑菌药物和水产品防腐保鲜剂亟待开发。海洋真菌成为寻找新型抗水产病原菌或水产品腐败菌活性物质的重要资源。
发明内容
本发明目的在于：提供一种花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1及其提取物，以及提取物在抗菌药物中的应用，具体技术方案如下：
一种花蚬共生真菌烟曲霉，该真菌为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1，于2018年06月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 2018377。
进一步的，所述烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1菌落直径可达50-65 mm，中心稍凸起，有不规则状的条纹，边缘薄，中心表面呈绒毛状，菌丝灰白色或乳白色，背面淡青色，在光学显微镜和扫描电镜下观察，分生孢子梗光滑不分支，顶囊为半球状，孢子梗中长出许多分生孢子，近球形，粗糙。
一种花蚬共生真菌烟曲霉的制备方法，具体步骤如下：将花蚬用无菌剪子剪碎，加入无菌水制成悬液，取0.1 mL均匀涂布沙氏固态培养基中，28℃恒温箱培养7天，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化。
一种花蚬共生真菌烟曲霉提取物，以烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，利用乙酸乙酯萃取发酵液，并将萃取液浓缩获得烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵提取物。
进一步的，所述液体发酵是将花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1菌种接种到海水液体培养基中，在160 r/min，28℃条件下培养7d，获得花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵提取物。
一种花蚬共生真菌烟曲霉提取物的应用，所述烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵提取物作为活性成分，在制备抗细菌药物中的应用。
进一步的，所述抗细菌药物为抗鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）或腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）药物。
进一步的，所述海水液体培养基是在每升培养基中加入葡萄糖10 g、麦芽糖20 g、味精10 g、酵母膏3 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g，陈海水 1 L构成。
进一步的，所述沙氏固态培养基是将4% (W/V) 葡萄糖、1% (W/V) 蛋白胨和2%(W/V) 琼脂加热溶解后，加陈海水定容，在121℃灭菌20 min后获得
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
本发明提供的烟曲霉HX-1的发酵提取物，对鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）或腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）均具有显著的拮抗活性，可用于作为抗菌药物，提供了新型的抗菌药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1菌株的菌落形态。
图2为花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1菌株的产孢结构。
图3为花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1菌株的分生孢子。
图4为花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1菌株的系统发育树。
图5为花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1菌株的发酵液提取物对主要水产品病原菌和腐败菌的抑制活性。
生物材料样品保藏：
烟曲霉HX-1，拉丁文名为Aspergillus fumigatusHX-1，已于2018年06月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，（China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M 2018377，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌珞珈山。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创作性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护的范围。
本发明的第一目的是提供一种花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1，该菌株于2018年06月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2018377。
本发明的花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1是从海水养殖动物花蚬共生微生物中分离得到，其分离纯化的制备方法为：将花蚬用无菌剪子剪碎，加入无菌水制成悬液，取0.1 mL均匀涂布沙氏固态培养基中，28℃恒温箱培养，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化。
优选地，所述沙氏固态培养基是将4% (W/V) 葡萄糖、1% (W/V) 蛋白胨和2% (W/V) 琼脂加热溶解后，加陈海水定容，在121℃灭菌20 min后获得。
优选地，所述经由分离纯化制备的花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1的生物学形态描述为：在海水沙氏培养基上生长迅速，28℃培养7天，菌落直径可达50-65 mm，中心稍凸起，有不规则状的条纹，边缘薄，中心表面成绒毛状，菌丝灰白色或乳白色，背面淡青色，如图1所示；在光学显微镜和扫描电镜下观察，分生孢子梗光滑不分支，顶囊为半球状，孢子梗中长出许多分生孢子，近球形，粗糙，如图2、图3所示。
所述花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1的遗传性特征，该海洋真菌的ITS序列如图4所示，Genbank登录号为MH824433，该序列与NCBI核酸数据库(Genbankhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/) BLAST比对结果显示，该序列与曲霉属真菌(Aspergillus sp.)的ITS序列具有很高的同源性，其中与菌株AspergillusfumigatusF35-02、AspergillusfumigatusRES1（序列号分别为KX664380.1和KY026061.1）的ITS序列同源性为99%，在以N-J法构建的系统发育树上聚为同一簇群，如图5所示。
本发明的第二个目的是提供一种具有抗菌作用的花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵提取物，其特征在于，以花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1作为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，除去菌丝体后获得发酵液，取发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经浓缩后即得花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵提取物。
优选地，所述的液体发酵是将花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1菌种接种到海水液体培养基中，160r/min，28℃培养7d，获得花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵培养物。
优选地，所述海水液体培养基是在每升培养基中加入葡萄糖10 g、麦芽糖20 g、味精10 g、酵母膏3 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g，陈海水 1 L构成。
本发明的第三个目的是提供花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1的发酵提取物在制备抗细菌药物中的应用。
优选地，本发明的花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1的发酵提取物对鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）或腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）均具有显著的拮抗活性，因此，本发明以烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵提取物作为活性成分，优选为抗鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）或抗腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）药物。
实施例1：花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1的分离和鉴定
其分离纯化制备方法为：将4% (W/V) 葡萄糖、1% (W/V) 蛋白胨和2% (W/V) 琼脂加热溶解后，加陈海水定容，在121℃灭菌20 min，获得沙氏固态培养基；将花蚬用无菌剪子剪碎，加入无菌水制成悬液，取0.1 mL均匀涂布沙氏固态培养基中，28℃恒温箱培养，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化。
上述的花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1的生物学形态描述为：在海水沙氏培养基上生长迅速，28℃培养7天，菌落直径可达50-65 mm，中心稍凸起，有不规则状的条纹，边缘薄，中心表面成绒毛状，菌丝灰白色或乳白色，背面淡青色，如图1所示；在光学显微镜和扫描电镜下观察，分生孢子梗光滑不分支，顶囊为半球状，孢子梗中长出许多分生孢子，近球形，粗糙，如图2、3所示。
上述的花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1的遗传性特征，该海洋真菌的ITS序列如图4所示，Genbank登录号为MH824433。该序列与NCBI核酸数据库(Genbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) BLAST比对结果显示，该序列与曲霉属真菌(Aspergillus sp.)的ITS序列具有很高的同源性，其中与菌株AspergillusfumigatusF35-02、A.fumigatusRES1（序列号分别为KX664380.1和KY026061.1）的ITS序列同源性为99%，在以N-J法构建的系统发育树上聚为同一簇群，如图5所示。
实施例2：花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵提取物
将花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1菌种接种到海水液体培养基中，160 r/min，28℃培养7 d，获得花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1的液体培养物。将花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1液体培养物过滤，使菌丝体和发酵液分离，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到发酵提取物。
所述海水液体培养基是在每升培养基中加入葡萄糖10 g、麦芽糖20 g、味精10 g、酵母膏3 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g，陈海水 1 L。
实施例3：花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵液提取物的抗菌活性
指示菌液制备：将鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）或腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）分别以牛肉膏蛋白胨液体培养基制成孢子悬液（107个/mL），将孢子悬液按5%接种量接种到已灭菌的内含200mL牛肉膏蛋白胨培养基的500mL三角瓶中，于温度37℃、转速160r/min的恒温振荡培养箱中，振荡培养1天，获得指示菌液。
抑菌活性测试：将熔化后冷却至45-50℃的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒入90.00mm平板中，每板倒20mL左右，放置冷却至凝固。分别于每个平板上涂抹100μＬ指示菌液，放置20min，然后在平板上放置好牛津杯，将200μL发酵液提取物（5mg/mL）加入牛津杯内，平行3孔，37℃培养箱中培养24h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径，活性大小以抑菌圈直径的平均值（mm）表示，参见图5。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种花蚬共生真菌烟曲霉，其特征在于：该真菌为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1，于2018年06月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M2018377。
2.如权利要求1所述的一种花蚬共生真菌烟曲霉，其特征在于：所述烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1菌落直径可达50-65 mm，中心稍凸起，有不规则状的条纹，边缘薄，中心表面呈绒毛状，菌丝灰白色或乳白色，背面淡青色，在光学显微镜和扫描电镜下观察，分生孢子梗光滑不分支，顶囊为半球状，孢子梗中长出许多分生孢子，近球形，粗糙。
3.如权利要求1或2所述的一种花蚬共生真菌烟曲霉的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：将花蚬用无菌剪子剪碎，加入无菌水制成悬液，取0.1 mL均匀涂布沙氏固态培养基中，28℃恒温箱培养7天，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化。
4.如权利要求1所述的一种花蚬共生真菌烟曲霉提取物，其特征在于：以保藏编号CCTCC NO: M 2018377的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1为发酵菌株，将该菌株接种到海水液体培养基中，在160 r/min，28℃条件下培养7d进行液体发酵，并对发酵获得花蚬共生真菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1进行分离菌丝体和发酵液，利用乙酸乙酯萃取发酵液，并将萃取液浓缩获得烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵提取物。
5.如权利要求4所述的一种花蚬共生真菌烟曲霉提取物的应用，其特征在于：所述烟曲霉（Aspergillus fumigatus）HX-1发酵提取物作为活性成分，在制备抗细菌药物中的应用。
6.如权利要求5所述的一种花蚬共生真菌烟曲霉及其提取物的应用，其特征在于：所述抗细菌药物为抗鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）或腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）药物。
7.如权利要求4所述的一种花蚬共生真菌烟曲霉提取物，其特征在于：所述海水液体培养基是在每升培养基中加入葡萄糖10 g、麦芽糖20 g、味精10 g、酵母膏3 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g，陈海水 1 L构成。
8.如权利要求3所述的一种花蚬共生真菌烟曲霉的制备方法，其特征在于：所述沙氏固态培养基是将4% (W/V) 葡萄糖、1% (W/V) 蛋白胨和2% (W/V) 琼脂加热溶解后，加陈海水定容，在121℃灭菌20 min后获得。
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陈培钦等.海洋烟曲霉菌代谢活性物质的萃取.《华侨大学学报(自然科学版)》.2010,第31卷(第2期), *

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