CN109479907A

CN109479907A - 一种天然细菌群体感应抑制剂的制备方法

Info

Publication number: CN109479907A
Application number: CN201811448637.1A
Authority: CN
Inventors: 李永裕; 王文婷; 吴英详; 吴少华; 张燎原; 康开权; 杨超; 刘靖媛
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2019-03-19

Abstract

本发明提供了一种天然细菌群体感应抑制剂的制备方法，所述的方法包括活性精油的制备及细菌群体感应抑制剂的制备。本发明从千层金植物中获得细菌群体感应抑制剂，经实验首次证实，本发明制备的千层金精油具有抑制野生紫色杆菌群体感应系统的活性，显著降低紫色杆菌素的产量，抑制生物膜的形成和群集运动，导致紫色杆菌失去致病性，而且千层金精油对紫色杆菌没有生存压力，不会导致细菌耐药性的发生，是一种基于细菌群体感应抑制作用的新型抗菌物质；本发明具有原料易得、制备方法简单可靠、抑菌剂对细菌不产生耐药性和无毒害作用等优点和特点，在细菌感染性疾病生物防治方面具有广阔的应用前景。

Description

一种天然细菌群体感应抑制剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种天然的细菌群体感应抑制剂的制备方法。

背景技术

群体感应（Quorum Sensing, QS）的发现源于费氏弧菌（V.fescheri）的生物发光现象，是依赖细菌种群密度的一种细菌交流机制，指细菌产生并分泌特定信号分子，并通过信号分子的浓度变化来感知环境中细菌的数量变化，当信号分子浓度达到一定的阀值即可激活多种基因的表达来适应环境的变化，包括生物发光，毒力，色素，生物膜的产生，孢芽的形成。传统的抗菌药物都是以细菌的蛋白质合成、细胞壁合成、DNA 超螺旋、叶酸合成等为作用靶点，对这些重要的生命过程进行干扰破坏而致死微生物以达到治疗感染的目的，然而由于适应性和进化使得微生物极易产生耐药性和菌群失衡等。因此，群体感应（QuorumSensing, QS）的提出为抗菌提出更加有效的方法，实现针对性阻止致病因子的表达或使其失活，使病原菌在正常增殖的条件下不产生致病性，既清除了致病因子，还不会对细菌生长产生压力而产生耐药性。

目前，已有一些从植物中分离细菌群体感应抵制剂的报道。如：穿心莲内酯可通过抑制铜绿假单胞菌毒力因子的产生而实现抗感染，呋喃酮通过群体淬灭来减弱绿脓杆菌毒力因子影响并降低了菌株抗性，姜黄中的姜黄素对尿道病原菌生物膜的产生有抑制作用。

千层金又名黄金香柳，属于桃金娘科，白千层属常绿乔木，原产于新西兰，于1999年引入我国。生长快且为优良色叶树种，可用做行道树，亦可栽植于林缘、池边、庭院，分枝性强且耐修剪，可做园林造型树种。千金层有极高的观赏价值和经济效益，枝叶可提取香气浓郁的活性精油，是珍贵的香料植物。对其详细研究发现千层金精油能够强烈抑制紫色杆菌QS系统的活性，千层金精油有望开发成以植物病原细菌QS系统为靶标的新型生物农药，防治植物细菌性病害。

发明内容

本发明旨在提供一类来源于植物的新型、环保的具有抑制细菌QS系统的抑制剂，防治细菌性病害。本发明以细菌群体感应抑制活性为追踪手段，从千层金植物中提取和制备细菌群体感应抑制剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种天然细菌群体感应抑制剂的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）千层金叶片预处理：将采摘的千层金叶片洗净后晾干，置于-20℃冰箱中备用；

（2）将步骤（1）预处理过的千层金叶片置于圆底烧瓶中，按照料液质量比1：10加入蒸馏水，于精油提取器中蒸馏提取2h，提取完成后用离心管收集精油，离心后加入1g的无水硫酸钠去除多余的水分，获得具有细菌群体感应抑制活性的千层金精油；

（3）将制备出的千层金精油用甲醇-水稀释至亚致死浓度下，即获得千层金精油细菌群体感应抑制剂。

步骤（3）所述甲醇-水为甲醇和水按体积比1：100混合均匀。

步骤（3）所述亚致死浓度为5mg/mL。

进一步地，将上述制备得到的天然细菌群体感应抑制剂应用于制备抗菌先导药物中。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明中基于千层金精油制备的细菌群体感应抑制剂在不影响野生紫色杆菌ATCC31532生长的情况下，显著抑制其群体感应作用，包括紫色杆菌素的生成, 生物膜的形成及群集现象。

（2）本发明具有制备原料易获得，制备方法简单可靠，且基于植物精油所制备的细菌群体感应抑制剂对细菌不产生耐药性和无毒害作用等优点。

附图说明

图1是以细菌群体感应抑制活性为追踪手段，从千层金植物中提取精油的群体感应活性筛选结果图。

图2是千层金精油处理下紫色杆菌的生长曲线结果图。

图3是千层金精油抑制紫色杆菌色素产生的结果图。

图4是千层金精油抑制紫色杆菌生物膜的生物量及其形成的抑制结果图。

图5是千层金精油抑制紫色杆菌群集运动结果图。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明作进一步的说明，其目的是帮助本领域技术人员更好地理解本发明的内容，但所举的实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例一：细菌群体感应抑制剂的筛选

从千层金植物的叶片和枝条中分别提取多酚、多糖、精油、生物碱等物质，以细菌群体感应抑制活性为追踪手段，筛选具有细菌群体感应抑制活性的有效部位和有效成分，从千层金叶片中分离到具有明显细菌群体感应抑制活性的千层金精油。

实施例二：具有细菌群体感应抑制活性的千层金精油的制备

千层金叶片的处理方法：将采摘的千层金叶片洗净后晾干，置于-20℃冰箱中备用。

称取50g处理好的千层金叶片置于圆底烧瓶中，按照料液质量比1：10加入蒸馏水，于精油提取器中蒸馏提取2h，提取完成后用2mL离心管收集精油，离心后加入1g无水硫酸钠去除多余的水分，获得具有细菌群体感应抑制活性的千层金精油。

实施例三: 千层金精油的群体感应抑制活性测试

1. 实验样品及实验方法

选用预先制备的野生型紫色杆菌Chromobacterium violaceum ATCC31532，在30 °C、150 rpm条件下于液体LB培养基中培养12 h，得菌悬液(OD ₆₀₀, 0.9)待用。加热固体LB培养基（含2%琼脂），冷却至50 °C左右按1%（V/V）加入菌悬液，摇匀后迅速倒入培养皿，20mL/皿。采用滤纸片法初步研究细菌群体感应抑制活性，具体方法为：将直径为6mm的滤纸片放置在上述制备好的培养基中，往滤纸片注入15µL的千层金精油，用封口膜封好培养皿置于30 °C条件下培养24 h后观察。为了验证群体感应抑制圈中细菌是否存活，分别取抑制圈中的细菌在固体LB培养基上划线培养24 h后进行验证，有细菌存活即证明抑制圈中的细菌并未被杀死。

2. 实验结果

附图1是千层金精油抑制紫色杆菌群体感应活性的实验结果图。在千层金精油样品的周围具有透明度不同的两个圈，内圈颜色透明为抑菌圈，外圈较为浑浊为群体感应抑制圈。取浑浊圈中的细菌划线培养24h后，均有菌落生长，说明该圈中的细菌没有被杀死。这种结果表明，千层金精油具有群体感应抑制的效果，同时也具有抑菌的作用。

实施例四: 千层金精油对紫色杆菌的最小抑菌浓度（MIC）及生长曲线测试

1. 实验样品及实验方法

最低抑菌浓度试验采用两倍稀释法，略改动。取用灭菌后的1.5mL离心管，每管中加入液体LB培养基150 µL，并往第一孔中加入终浓度80 mg/mL的千层金精油混匀稀释，随后逐孔稀释两倍，配成一系列样品浓度（80-1.25mg/mL）的培养液，随后往每孔中加入供试野生紫色杆菌菌悬液(OD ₆₀₀ , 0.9)5 µL；并将离心管于30 °C、150 rpm条件下培养，24 h后取培养后的培养液，将其置于96孔板，采用iMark酶标仪测定600 nm处吸光度确定细菌活性，并观察溶液中无明显菌体生长的最低样品浓度即为最低抑菌浓度。

野生型紫色杆菌(Chromobacterium violaceum ATCC31532)预先在30 °C、150rpm条件下于液体LB培养基中活化培养12h。在含有1%（V/V）紫色杆菌菌悬液的20mL的液体培养基中，加入经甲醇-水稀释后不同浓度（MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC，其中MIC为5mg/mL）的千层金精油1.2mL，在30 °C、150r/min的摇床中活化，测定在3h-72h的OD ₆₀₀吸光值。

2. 实验结果

千层金精油抑制紫色杆菌的MIC为5mg/mL。

附图2为千层金精油处理下紫色杆菌的生长曲线结果图。在处理前期（0-3h），各处理组与对照组中紫色杆菌生长均处于生长迟缓期；3-12h时，千层金精油处理下（除MIC处理组）的紫色杆菌与对照组（control）皆处于生长指数期；在处理后期（≥24h），对照组（Control）和各精油处理组中，紫色杆菌的生长情况总体一致，无明显差别。结果表明，在该试验浓度下，千层金精油对紫色杆菌的生长无抑制作用。

实施例五: 千层金精油抑制紫色杆菌色素生成的测试

1. 实验样品及实验方法

采用两倍稀释法进行试验，将240mL经甲醇-水稀释后不同浓度（MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，其中MIC为5mg/mL）的千层金精油，置于含1%（v/v）的野生紫色杆菌菌液和4mL LB液体培养基的试管中，试验混合液在30 °C条件下培养24h后，对紫色杆菌素进行测定。测定方法如下：吸取1 mL上述培养好的菌液于1.5 mL 离心管中，12000 g、4℃离心 20 min，使菌体和紫色菌素沉淀至离心管底部；去上清，加入1 mL 二甲基亚砜于离心管中，涡旋震荡使紫色菌素充分溶解于二甲基亚砜中；12000 g 室温再次离心3 min，去除菌体及碎屑；吸取200 μL 上清, 在酶标仪上测定OD ₆₀₀光吸收值。实验重复3次。

紫色杆菌素抑制率=（空白对照吸光值-样品吸光值）/空白对照吸光值 ×100%

2. 实验结果

附图3是千层金精油抑制紫色杆菌色素产生的结果图。经精油处理的菌液中，紫色杆菌素的含量均低于对照组（CK）, 且随着处理浓度的增加而减少（图-3A）。定量结果（图-3B）显示：不同浓度精油（MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）处理下紫色杆菌素的抑制率分别为85.47%、82.84%、79.34%、64.70%。由此可得出：千层金精油能够明显抑制紫色杆菌中紫色杆菌素的合成，且随着精油浓度的增加，抑制作用逐渐增大。

实施例六：千层金精油抑制紫色杆菌生物膜生物量及其形成的测试

1. 实验样品及实验方法

采用灭菌后的96孔板，每个孔中含有液体培养基100mL，1%（v/v）紫色杆菌原液和不同浓度经甲醇-水稀释后（MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC，其中MIC为5mg/mL）的千层金精油20mL，于30℃条件下培养24h。具体为：将培养液倒出，用无菌PBS缓冲液清洗多次，每孔加入200μL甲醇固定15min，烘干后每孔加入200μL浓度为1%（w/v）的结晶紫溶液，室温染色5mim，倒出培养孔中的结晶紫染色液，用流水将多余的染料冲洗干净，待完全干燥后，每孔加入200μL 33%冰乙酸，在30℃恒温箱中作用30min，酶标仪测定OD ₆₀₀的吸光值。

显微镜观测生物膜：将规格为1×1cm的盖玻片置于灭菌后的6孔板底部，每个孔中含有液体培养基5mL，1%紫色杆菌原液和不同浓度（MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC，其中MIC为5mg/mL）的千层金精油，于30 °C条件下培养24h。处理方法同实施例五，经结晶紫染色后，将盖玻片覆盖于干净的盖玻片上，随后置于光学显微镜下观测。

2. 实验结果

附图4是千层金精油抑制紫色杆菌生物膜生物量及其形成的抑制结果图。定量结果显示（图-4A），紫色杆菌的生物膜量随着千层金叶片精油浓度的增加而降低。不同浓度（MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，其中MIC为5mg/mL）千层金精油处理下，生物膜的抑制率分别为：75.56%, 75.03%, 58.16%, 20.2%。如图-4B所示，千层金精油亦能抑制紫色杆菌生物膜的形成，对照组（Control）中，生物膜分布较为密集且聚集成块；香樟叶片精油处理组中紫色杆菌的生物膜分布松散且不能连成块。

实施例七：千层金精油抑制紫色杆菌群集运动测试

1. 实验样品及实验方法

Swarming培养基：包含1%（w/v）细菌学蛋白胨、0.5%（w/v）氯化钠、0.5%（w/v）葡萄糖和0.5%（w/v）琼脂。加热固体培养基使其融化，待培养基温度降至约为50℃时加入1.2mL经甲醇-水稀释后浓度为MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的千层金精油样品，并倒入培养皿，待培养基冷却后，取上述上述菌悬液5 µL点到培养基中央，随后取封口膜封口培养皿并于30℃条件下培养18h，其中MIC为5mg/mL。

2. 实验结果

附图5是千层金精油抑制紫色杆菌群集运动结果图。紫色杆菌以鞭毛的形式向外迁移。在加入不同浓度（MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）千层金精油的实验组中，紫色杆菌的迁移直径与对照相比明显变小，因此群集运动减弱，MIC浓度对紫色杆菌群集运动的抑制效应更明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种天然细菌群体感应抑制剂的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述一种天然细菌群体感应抑制剂的制备方法，其特征在于步骤（3）所述甲醇-水为甲醇和水按体积比1：100混合均匀。

3.根据权利要求1所述一种天然细菌群体感应抑制剂的制备方法，其特征在于步骤（3）所述亚致死浓度为5mg/mL。

4.如权利要求1-3任一所述一种天然细菌群体感应抑制剂的制备方法在制备抗菌先导药物中的应用。