TW202106700A - Aav 工程化 - Google Patents

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Abstract

本發明提供產生相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼的方法及組合物。此等衣殼適用於例如遞送基因組工程化分子及基因療法分子以治療有需要之個體。

Description

AAV工程化
本發明之領域為與基因組工程化及基因療法相關之分子的遞送。
人工核酸酶，諸如工程化鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、具有工程化crRNA/tracrRNA (『單鏈導引RNA』)之CRISPR/Cas系統(亦稱為RNA引導核酸酶)及/或基於阿爾古(Argonaute)系統之核酸酶正在徹底變革藥物、生物技術及農業領域。此等分子工具允許以先前絕不可能的水準對生物體中之基因組進行基因操控(例如編輯)。另外，正在臨床上研究基因療法(將轉殖基因遞送至體內細胞，該細胞維持於染色體外且表現由轉殖基因編碼之產物)，以遞送必需蛋白質，諸如凝血因子及治療眼病之蛋白質。此等革命性技術之前景取決於將核酸酶系統及/或轉殖基因有效遞送至適當的體內組織。
腺相關病毒(AAV)為用於遞送上文所述之核酸酶系統之有前景的活體外及活體內基因遞送載體以及與基因療法相關之載體。存在若干天然存在之(「野生型」)血清型及超過100種已知AAV變異體，其在胺基酸序列中，尤其在衣殼蛋白之高變區內，且因此在其基因遞送特性中各自不同。AAV尚未與任何人類疾病相關，使得重組AAV對於臨床應用有吸引力。AAV亦顯示若干額外有利特徵，包括不存在病原性、低免疫原性及穩定游離型轉殖基因表現。然而，使用AAV亦具有一些問題，包括病毒向性雜亂、避開生物障壁之能力有限及人類個體中針對AAV衣殼蛋白之預先存在的中和抗體發生率高，潛在地限制了AAV衣殼蛋白之功效。因此，需要改良AAV設計以充分利用此等新系統。
本發明提供產生相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼的方法及組合物。此等衣殼適用於例如遞送基因組工程化分子及基因療法分子以治療有需要之個體。在一些實施例中，衣殼用於將有效負載遞送至所需組織、細胞或細胞器。
在第一態樣中，本發明提供鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法，其包含：(i)使細胞、細胞株或組織與AAV變異體之文庫接觸，其中該文庫之各成員包含：a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸；(ii)使該文庫中之AAV變異體轉導細胞、細胞株或組織；(iii)自細胞、細胞株或組織回收AAV變異體；及(iv)鑑別具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在第二態樣中，本發明提供鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法，其包含：(i)使細胞、細胞株或組織與AAV變異體之文庫接觸，其中該文庫之各成員包含：a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸；(ii)使該文庫中之AAV變異體轉導細胞、細胞株或組織；(iii)自細胞、細胞株或組織回收AAV變異體；及(iv)鑑別具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之文庫的各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於獨立核酸分子中。在其他實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於一個核酸分子中。在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。在一些實施例中，文庫之各成員包含：5'ITR序列、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸、編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之AAV變異體之文庫包含衍生自兩種或更多種AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。在一些實施例中，AAV血清型選自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
在一些實施例中，編碼報導蛋白之核酸及編碼AAV變異衣殼之核酸處於獨立啟動子的控制下。在一些實施例中，編碼報導蛋白之核酸及編碼AAV變異衣殼之核酸各自獨立地以可操作方式連接於啟動子。
在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法鑑別之AAV衣殼變異體之所需特徵為增強之細胞或組織向性。
在第三態樣中，本發明提供鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法，其包含：(i)將複數個編碼肽之核酸插入至編碼AAV衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環之核酸群體中，以產生編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸之文庫；(ii)將該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至以下中之一或多者：(a)包含條形碼之核酸，(b)編碼報導蛋白之核酸，及(c)編碼定位信號之核酸；(iii)藉由以反式提供腺病毒輔助及AAV rep功能而在生產細胞中製造AAV變異體之文庫；(iv)純化AAV變異體之文庫；(v)使細胞、細胞株或組織與AAV變異體之文庫接觸；(vi)自目標細胞、細胞株或組織回收AAV變異體；及(vii)鑑別具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(a)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(a)包含條形碼之核酸，及(b)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(a)包含條形碼之核酸，及(c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(a)包含條形碼之核酸，(b)編碼報導蛋白之核酸，及(c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(a)包含條形碼之核酸，及(d)側接肽插入位點之核酸序列中之一或多個沉默突變。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(a)包含條形碼之核酸，(b)編碼報導蛋白之核酸，及(d)側接肽插入位點之核酸序列中之一或多個沉默突變。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(a)包含條形碼之核酸，(b)編碼報導蛋白之核酸，(c)編碼定位信號之核酸，及(d)側接肽插入位點之核酸序列中之一或多個沉默突變。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(b)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(b)編碼報導蛋白之核酸，及(c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸進一步包含側接肽插入位點之核酸序列中之一或多個沉默突變。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(b)編碼報導蛋白之核酸，及(d)側接肽插入位點之核酸序列中之一或多個沉默突變。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(c)編碼定位信號之核酸，及(d)側接肽插入位點之核酸序列中之一或多個沉默突變。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(d)側接肽插入位點之核酸序列中之一或多個沉默突變。
在一些實施例中，步驟(iv)進一步包含組合基於兩種或更多種AAV血清型之變異AAV之文庫以產生單一集合體。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之編碼AAV衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環之核酸序列群體包含衍生自兩種或更多種AAV血清型之序列。在一些實施例中，AAV血清型選自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之腺病毒輔助功能包含以下中之一或多者：E2A、E4、VA、E1A及E1B。在一些實施例中，AAV rep功能包含rep78、rep 68、rep 52及rep40基因。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之rep78及/或rep68基因之起始密碼子自ACG修飾為ATG。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之生產細胞為HEK293細胞。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸及/或編碼定位信號之核酸以任何次序彼此連接。在一些實施例中，文庫之各成員包含：5'ITR序列、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸、編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之編碼報導蛋白之核酸及編碼AAV變異衣殼之核酸處於獨立啟動子的控制下。在一些實施例中，本文所揭示之方法中所用之編碼報導蛋白之核酸及編碼AAV變異衣殼之核酸各自獨立地以可操作方式連接於啟動子。
在一些實施例中，AAV衣殼變異體之所需特徵為增強之細胞或組織向性。
在本文所揭示之方法之一些實施例中，具有所需特徵之AAV衣殼變異體係經由相關條形碼之定序來鑑別。在本文所揭示之方法之一些實施例中，具有所需特徵之AAV衣殼變異體係經由相關的一或多個條形碼之定序來鑑別。在一些實施例中，以可操作方式連接於啟動子之第一條形碼鑑別靶細胞群體，例如神經元或肝細胞中帶條形碼的轉錄物，因為啟動子僅表現於特定細胞群體中。在一些實施例中，第二條形碼鑑別所有細胞類型中之表現，因為其以可操作方式連接於驅動遍存表現之啟動子。
在本文所揭示之方法之一些實施例中，具有所需特徵之AAV衣殼變異體係藉由AAV基因組之純化及定序來鑑別。
在本文所揭示之方法之一些實施例中，細胞或組織包括但不限於來自以下各者之細胞或組織：CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴或口腔黏膜。
在本文所揭示之方法之一些實施例中，細胞包括但不限於神經元、膠細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞、室管膜細胞、肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞(Kupffer cell)、肝內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。
在本文所揭示之方法之一些實施例中，相對於編碼包含插入肽之AAV變異衣殼蛋白之核酸以反式提供以下中之一或多者：(i)編碼定位信號之核酸；(ii)包含條形碼之核酸；及(iii)編碼報導蛋白之核酸。在本文所揭示之方法之一些實施例中，相對於編碼包含插入肽之AAV變異衣殼蛋白之核酸全部以反式提供(i)編碼定位信號之核酸；(ii)包含條形碼之核酸；及(iii)編碼報導蛋白之核酸。在本文所揭示之方法之一些實施例中，相對於編碼包含插入肽之AAV變異衣殼蛋白之核酸以順式提供以下中之一或多者：(i)編碼定位信號之核酸；(ii)包含條形碼之核酸；及(iii)編碼報導蛋白之核酸。在本文所揭示之方法之一些實施例中，相對於編碼包含插入肽之AAV變異衣殼蛋白之核酸全部以順式提供(i)編碼定位信號之核酸；(ii)包含條形碼之核酸；及(iii)編碼報導蛋白之核酸。.
在第四態樣中，本發明提供AAV變異體之文庫，其中該文庫之各成員包含：a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在第五態樣中，本發明提供AAV變異體之文庫，其中該文庫之各成員包含：a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a）AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及c）編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於獨立核酸分子中。在其他實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於一個核酸分子中。在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。在一些實施例中，本文所揭示之文庫之各成員包含：5'ITR序列、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸、編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體之文庫包含衍生自兩種或更多種AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。在一些實施例中，AAV血清型選自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
在一些實施例中，編碼報導蛋白之核酸及編碼AAV變異衣殼之核酸處於獨立啟動子的控制下。在一些實施例中，編碼報導蛋白之核酸及編碼AAV變異衣殼之核酸各自獨立地以可操作方式連接於啟動子。
在第六態樣中，本發明提供一種AAV變異體，其包含：a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在第七態樣中，本發明提供一種AAV變異體，其包含：a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變，其中一或多個沉默突變在側接肽插入位點之核酸序列中，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之AAV變異體包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於獨立核酸分子中。在其他實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於一個核酸分子中。在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。在一些實施例中，AAV變異體包含：5'ITR序列、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸、編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
在一些實施例中，本文揭示之AAV變異體衍生自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
在一些實施例中，編碼報導蛋白之核酸及編碼AAV變異衣殼之核酸處於獨立啟動子的控制下。在一些實施例中，編碼報導蛋白之核酸及編碼AAV變異衣殼之核酸各自獨立地以可操作方式連接於啟動子。
在第八態樣中，本發明提供一種核酸分子，其包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)編碼變異衣殼蛋白之核酸序列，該變異衣殼蛋白在其高變環及/或外露表面環中側接肽插入位點之核苷酸序列中包含一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸序列；d)包含條形碼之核酸序列；及e)編碼報導蛋白之核酸序列。
在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變。在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，b)側接AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及c)編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，c)編碼定位信號之核酸，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及d)包含條形碼之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，d)包含條形碼之核酸，及e)編碼報導蛋白之核酸。在一些實施例中，本文所揭示之核酸包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽，及e)編碼報導蛋白之核酸。
在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，插入至變異衣殼蛋白中之肽的長度為4-15個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度為6-15個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度為7、10或15個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度為7個胺基酸。在一些實施例中，插入肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，插入肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
在一些實施例中，肽插入至衣殼蛋白之VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII或VR-IX區中。在一些實施例中，肽插入至衣殼蛋白之VR-I中。在一些實施例中，肽插入至衣殼蛋白之VR-IV中。在一些實施例中，肽插入至衣殼蛋白之VR-VIII中。在一些實施例中，肽插入至衣殼蛋白VP1、VP2或VP3中。
在一些實施例中，肽插入衣殼蛋白之胺基酸殘基450與600之間的位置處。在一些實施例中，(i) AAV血清型為AAV1且肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置590處，(ii) AAV血清型為AAV6且肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置454或590處，(iii) AAV血清型為AAV2且肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置588處，(iv) AAV血清型為AAV3B且肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置589處，(v) AAV血清型為AAV5且肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置578處，(vi) AAV血清型為AAV8且肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置591處，或(vii) AAV血清型為AAV9且肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置266、455或589處，其中位置對應於AAV血清型中VP1之編號。
在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸處於p40啟動子的控制下。在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸以可操作方式連接於p40啟動子。
在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，編碼報導蛋白之核酸編碼螢光蛋白。在一些實施例中，報導蛋白係選自由以下組成之群：EGFP、mCherry、mClover3、mRuby3、mApple、iRFP、tdTomato、mVenus、YFP、RFP、螢火蟲螢光素酶及奈米螢光素酶。
在一些實施例中，編碼報導蛋白之核酸處於細胞類型及/或組織特異性啟動子的控制下。在一些實施例中，編碼報導蛋白之核酸以可操作方式連接於細胞類型及/或組織特異性啟動子。在一些實施例中，編碼報導蛋白之核酸以可操作方式連接於細胞類型特異性RNA聚合酶II啟動子(例如甲狀腺素轉運蛋白或hSynapsin1)。在一些實施例中，細胞類型及/或組織特異性啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。在一些實施例中，細胞類型及/或組織特異性啟動子為hSyn1啟動子。在一些實施例中，細胞類型及/或組織特異性啟動子為TTR啟動子。
在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，報導蛋白與定位信號融合。在一些實施例中，定位信號在N端、在C端或在N端及C端與報導蛋白融合。在一些實施例中，定位信號為核定位信號(NLS)、核膜結合域或組蛋白結合域。在一些實施例中，NLS為SV40 NLS。在一些實施例中，核膜結合域為KASH域。在一些實施例中，組蛋白結合域為H2B。
在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，條形碼之長度為5-18個核苷酸。
在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154或155-198中之任一者的序列。在一些實施例中，包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。在一些實施例中，包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154或155-198中之任一者。在一些實施例中，包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。在一些實施例中，包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
在本文所揭示之方法、AAV變異體之文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，文庫之各成員含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸不同。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列，或選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。在本文所揭示之方法、AAV變異體之文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，包含第二條形碼之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列，或選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列，或選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者，且包含第二條形碼之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列，或選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。在一些實施例中，該啟動子對於第一條形碼及第二條形碼中之每一者不同。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸及第二核酸中之每一者獨立地處於不同啟動子的控制下。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子(例如人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子或甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子)。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子(例如U6啟動子、H1啟動子或7SK啟動子)。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子為RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子為RNA Pol III啟動子。在一些實施例中，包含條形碼之核酸進一步包含報導基因、核定位信號及聚腺苷酸化信號。
在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，各插入肽編碼序列由全部編碼相同肽之多個不同核酸序列合成。各核酸序列連接至獨特條形碼，以使得可在兩種或更多種變異體經鑑別具有相同插入肽序列，但其中不同核酸序列編碼該插入肽時驗證插入肽之效能(例如富集)。
在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，相對於編碼包含插入肽之AAV變異衣殼蛋白之核酸以反式提供以下中之一或多者：(i)編碼定位信號之核酸；(ii)包含條形碼之核酸；及(iii)編碼報導蛋白之核酸。在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，相對於編碼包含插入肽之AAV變異衣殼蛋白之核酸全部以反式提供(i)編碼定位信號之核酸；(ii)包含條形碼之核酸；及(iii)編碼報導蛋白之核酸。在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，相對於編碼包含插入肽之AAV變異衣殼蛋白之核酸以順式提供以下中之一或多者：(i)編碼定位信號之核酸；(ii)包含條形碼之核酸；及(iii)編碼報導蛋白之核酸。在本文所揭示之方法、文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，相對於編碼包含插入肽之AAV變異衣殼蛋白之核酸全部以順式提供(i)編碼定位信號之核酸；(ii)包含條形碼之核酸；及(iii)編碼報導蛋白之核酸。
在第九態樣中，本文揭示之AAV變異體用於將轉殖基因遞送至目標細胞或組織。在一些實施例中，轉殖基因適用於基因療法。在一些實施例中，轉殖基因適用於基因組編輯。
在第十態樣中，本發明提供包含編碼肽之核酸的AAV載體，該肽包含SEQ ID No. 1-32或68-110中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，AAV載體包含編碼肽之核酸，該肽包含SEQ ID No. 1-32中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在其他實施例中，AAV載體包含編碼肽之核酸，該肽包含SEQ ID No. 68-110中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，核酸編碼SEQ ID No. 1-32或SEQ ID No. 68-110中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，核酸編碼SEQ ID No. 1-32中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，核酸編碼SEQ ID No. 68-110中之任一者的胺基酸序列。在一些實施例中，插入胺基酸序列為衣殼蛋白的一部分。在一些實施例中，衣殼蛋白為VP1、VP2或VP3。在一些實施例中，胺基酸序列插入衣殼蛋白之胺基酸殘基450與600之間的位置處。在一些實施例中，胺基酸序列插入(i) AAV1衣殼蛋白之胺基酸位置590，(ii) AAV6衣殼蛋白之胺基酸位置454或590，(iii) AAV2衣殼蛋白之胺基酸位置588，(iv) AAV3B衣殼蛋白之胺基酸位置589，(v) AAV5衣殼蛋白之胺基酸位置578，(vi) AAV8衣殼蛋白之胺基酸位置591，或(vi) AAV9衣殼蛋白之胺基酸位置266、455或589，其中位置對應於AAV血清型中VP1之編號。
在第十一態樣中，本發明提供包含本文所揭示之AAV載體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在第十二態樣中，本發明提供包含SEQ ID No. 1-32或68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的肽。在一些實施例中，肽包含SEQ ID No. 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含SEQ ID No. 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，肽為SEQ ID No. 1-32中所闡述之序列中之任一者。在一些實施例中，肽為SEQ ID No. 68-110中所闡述之序列中之任一者。在一些實施例中，肽為AAV載體的一部分。在一些實施例中，肽為AAV載體之衣殼蛋白的一部分。
在第十三態樣中，本發明提供包含肽之衣殼蛋白，該肽包含SEQ ID No. 1-32或68-110中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，衣殼蛋白包含插入肽，該插入肽包含SEQ ID No. 1-32中所闡述之胺基酸序列之至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID No. 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白包含插入肽，該插入肽包含SEQ ID No. 68-110中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID No. 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
在第十四態樣中，本發明提供編碼本文所揭示之肽或衣殼蛋白的核酸序列。
在第十五態樣中，本發明提供將核酸遞送至個體之目標細胞或組織的方法，其包含：投與含有包含核酸之AAV載體的組合物，且其中AAV載體進一步含有包含插入肽之衣殼蛋白，該插入肽包含SEQ ID No. 1-32或68-110中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，衣殼蛋白包含插入肽，該插入肽包含SEQ ID No. 1-32中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在其他實施例中，衣殼蛋白包含插入肽，該插入肽包含SEQ ID No. 68-110中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID No. 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。在其他實施例中，衣殼蛋白包含SEQ ID No. 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
在一些實施例中，目標細胞或組織包括但不限於來自以下各者之細胞或組織：CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴或口腔黏膜。在一些實施例中，目標細胞或組織包括但不限於CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴或口腔黏膜。在一些實施例中，目標細胞或組織為CNS細胞或組織。在其他實施例中，目標細胞或組織為肝細胞或組織。
在一些實施例中，目標細胞包括但不限於神經元、膠細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞、室管膜細胞、肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞、肝內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。
在一些實施例中，目標細胞或組織來自肝臟。
在一些實施例中，目標細胞或組織來自CNS。
熟習此項技術者根據本發明整體，此等及其他態樣將顯而易見。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年4月26日申請之美國臨時申請案62/839,421；2019年10月15日申請之62/915,386及2019年11月22日申請之62/939,094之權益及優先權。前述申請案中之每一者以全文引用的方式併入本文中。序列表
本申請案含有序列表，其已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。2020年4月17日創建之該ASCII複本命名為000222-0002-TW1_SL.txt且大小為70,798個位元組。
本發明提供產生相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼的方法及組合物。此等衣殼適用於例如將基因組工程化分子及基因療法分子遞送至目標細胞、細胞株或組織(例如活體外或活體內)，以治療有需要之個體。
許多組織為高度異質的，且含有限制腺相關病毒(AAV)轉導之生物障壁。功能選擇策略使得能夠自文庫選擇能夠轉導組織內之特定細胞類型的AAV變異體。此外，選擇壓力經設計以鑑別在介導進入後步驟及驅動轉殖基因表現中出眾的變異體。為了確立適用於所有物種及組織之功能選擇策略，在AAV病毒基因組中引入若干修飾。本文中吾人描述產生AAV變異體文庫之方法，及能夠轉導所需組織、細胞及/或細胞器之變異體的功能選擇方法。此等方法適用於產生適合於所有物種、細胞類型及目標細胞器之AAV變異體。綜述
除非另外規定，否則本文所揭示之方法的實踐，以及組合物的製備及使用採用分子生物學、生物化學、染色體結構及分析、計算化學、細胞培養、重組DNA及在此項技術之技藝內之相關領域中的習知技術。此等技術在文獻中已充分解釋。參見例如Sambrook等人 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989及第三版, 2001；Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987及定期更新；系列METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 第三版, Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY, 第304卷, 「Chromatin」 (P.M. Wassarman及A. P. Wolffe編), Academic Press, San Diego, 1999；及METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第119卷, 「Chromatin Protocols」 (P.B. Becker編) Humana Press, Totowa, 1999。定義
術語「本文中」意謂整個申請案。
除非本文中另外定義，否則本申請案中所用之科學及技術術語應具有本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常理解之含義。一般而言，與本文所述之化合物、組合物及方法結合使用之命名法為此項技術中熟知且常用之彼等。
應理解，除非明確否認或不當，否則本文所述之任一實施例，包括在本發明之不同態樣及本說明書之不同部分中所述之實施例(包括僅在實例中描述之實施例)可與本發明之一或多個其他實施例組合。實施例之組合不限於由多個附屬技術方案所主張之彼等特定組合。
本申請案中所提及之所有上述及任何其他公開案、專利及公開專利申請案特定地以引用之方式併入本文中。在衝突之情況下，以本說明書(包括其特定定義)為主。
在本說明書通篇中，字語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變化應理解為暗示包括所陳述之整體(或組分)或整體(或組分)之群，但不排除任何其他整體(或組分)或整體(或組分)之群。
在整個本說明書中，當組合物描述為具有、包括或包含(或其變化形式)特定組分時，預期組合物亦可基本上由所述組分組成或由其組成。類似地，當將方法或製程描述為具有、包括或包含特定製程步驟時，製程亦可基本上由所述處理步驟組成或由其組成。另外，應理解，步驟之次序或進行某些動作之次序不重要，只要本文所述之組合物及方法保持可操作。此外，可同時進行兩個或更多個步驟或動作。
術語「包括」用以意謂「包括但不限於」。「包括」及「包括但不限於」可互換使用。
如本文所用，「約」或「大約」意謂在如由一般熟習此項技術者所測定的特定值之可接受誤差範圍內，該誤差範圍將部分取決於如何量測或測定該值，亦即量測系統之限度。
除非本文另外指明或明顯與內容相矛盾，否則在描述要素之上下文中(尤其在以下申請專利範圍之上下文中)使用術語「一」及「所述」及類似指示物應理解為涵蓋單數及複數。
除非上下文另外明確指示，否則如本文所用之術語「或」應理解為意謂「及/或」。
除非另外指示，否則本文中值範圍之列舉僅意欲充當單獨提及屬於該範圍內之各獨立值的簡寫方法，且各獨立值併入至本說明書中，如同在本文中單獨列舉一般。除非本文另外指示或另外明顯地與上下文相矛盾，否則本文所述之所有方法均可以任何適合次序進行。除非另外說明，否則本文提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)之使用僅旨在更好地闡明實施例，且不對申請專利範圍之範疇構成限制。說明書中之任何語言均不應解釋為指示任何未主張之要素為必不可少的。
術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」可互換使用，且係指去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，其呈線性或圓形構形，且呈單股或雙股形式。出於本發明之目的，就聚合物之長度而言，此等術語不應理解為限制性的。術語可涵蓋天然核苷酸之已知類似物，以及在鹼基、糖及/或磷酸酯部分(例如硫代磷酸酯主鏈)中經修飾之核苷酸。一般而言，特定核苷酸之類似物具有相同鹼基配對特異性；亦即A之類似物將與T鹼基配對。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換使用，係指胺基酸殘基之聚合物。術語亦適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸為對應天然存在之胺基酸的化學類似物或經修飾衍生物。
「結合」係指大分子之間(例如蛋白質與核酸)之間的序列特異性、非共價相互作用。並非結合相互作用之全部組分均需要為序列特異性的(例如與DNA主鏈中之磷酸酯殘基接觸)，只要整體相互作用為序列特異性的即可。此類相互作用一般藉由10-6 M-1 或更低之解離常數(Kd )表徵。「親和力」係指結合強度：增加之結合親和力與較低Kd 相關。「非特異性結合」係指在任何所關注分子(例如工程化核酸酶)與不為依賴性目標序列之大分子(例如DNA)之間發生的非共價相互作用。
「結合蛋白」為能夠非共價結合至另一分子的蛋白質。結合蛋白可結合至例如DNA分子(DNA結合蛋白)、RNA分子(RNA結合蛋白)及/或蛋白質分子(蛋白質結合蛋白)。在蛋白質結合蛋白之情況下，其可結合至其自身(以形成均二聚體、均三聚體等)，及/或其可結合至一或多種不同蛋白質之一或多個分子。結合蛋白可具有超過一種類型的結合活性。舉例而言，鋅指蛋白具有DNA結合、RNA結合及蛋白質結合活性。在RNA導引之核酸酶系統的情況下，RNA引導物與核酸酶組分(Cas9或Cfp1)異源且兩者均可經工程化。
「DNA結合分子」為可結合至DNA之分子。此類DNA結合分子可為多肽、蛋白質域、較大蛋白質內之域或聚核苷酸。在一些實施例中，聚核苷酸為DNA，而在其他實施例中，聚核苷酸為RNA。在一些實施例中，DNA結合分子為核酸酶之蛋白質域(例如Fok I域)，而在其他實施例中，DNA結合分子為RNA導引之核酸酶的導引RNA組分(例如Cas9或Cpf1)。
「DNA結合蛋白」(或結合域)為蛋白質或較大蛋白質內之域，其以序列特異性方式，例如經由一或多個鋅指或經由分別與鋅指蛋白或TALE中之一或多個RVD相互作用而結合DNA。術語鋅指DNA結合蛋白常常縮寫為鋅指蛋白或ZFP。
「鋅指DNA結合蛋白」(或結合域)為經由一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之蛋白質或較大蛋白質內之域，該等鋅指為結合域內經由鋅離子配位穩定結構之胺基酸序列區。術語鋅指DNA結合蛋白常常縮寫為鋅指蛋白或ZFP。
「TALE DNA結合域」或「TALE」為包含一或多個TALE重複域/單元之多肽。重複域涉及TALE與其同源目標DNA序列之結合。單一「重複單元」(亦稱為「重複序列」)之長度通常為33-35個胺基酸，且與天然存在之TALE蛋白內之其他TALE重複序列展現至少一些序列同源性。參見例如美國專利第8,586,526號，其以全文引用的方式併入本文中。
「TtAgo」為被認為涉及基因沉默之原核阿爾古蛋白。TtAgo衍生自細菌嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus )。參見例如Swarts等人, 同上；G. Sheng等人 (2013)Proc. Natl. Acad. Sci . U.S.A. 111, 652)。「TtAgo系統」為所有所需組分，包括例如藉由TtAgo酶裂解之導引DNA。
「裂解」係指DNA分子之共價主鏈的斷裂。裂解可藉由多種方法，包括但不限於磷酸二酯鍵之酶或化學水解引發。單股裂解及雙股裂解均為可能的，且雙股裂解可由於兩個獨特單股裂解事件而出現。DNA裂解可致使產生鈍端或交錯末端。在某些實施例中，融合多肽用於靶向雙股DNA裂解。
如本文所用之術語「編輯」係指其中核苷酸鹼基經修飾以使得將點突變引入至DNA股中之過程。在DNA中引入點突變將必定再現自經編輯DNA轉錄之任何mRNA中的變化。腺嘌呤及胞苷去胺酶自其各別核苷酸標靶移除胺基，分別將該等標靶轉化為肌苷及尿苷。在DNA修復或複製期間，聚合酶將肌苷識別為鳥嘌呤且將尿苷識別為胸腺嘧啶，使得在已編輯之雙股DNA中將A:T鹼基對轉化為G:C鹼基對，或將C:G鹼基對轉化為T:A鹼基對。
術語「序列」係指任何長度之核苷酸序列，其可為DNA或RNA；可為線性、圓形或分支的，且可為單股或雙股的。術語「轉殖基因」係指插入至基因組中之核苷酸序列。轉殖基因可具有任何長度，例如長度為2至100,000,000個核苷酸(或其間或其上之任何整數值)，長度為約100至100,000個核苷酸(或其間之任何整數)，長度為約2000至20,000個核苷酸(或其間之任何值)，或約5至15 kb (或其間之任何值)。
「染色體」為包含細胞之全部或一部分基因組的染色體複合物。細胞之基因組通常由其核型表徵，核型為包含細胞之基因組之所有染色體的集合。細胞之基因組可包含一或多種染色體。
「游離基因體」為包含並非細胞之染色體核型之一部分之核酸的複製核酸、核蛋白複合物或其他結構。游離基因體之實例包括質體、微環及某些病毒基因組。本文所述之肝臟特異性構築體可游離地維持，或替代地可穩定地整合至細胞中。
「外源」分子為通常不存在於細胞中，但可藉由一或多種遺傳、生物化學或其他方法引入至細胞中之分子。「通常存在於細胞中」係相對於細胞之特定發育階段及環境條件而測定。因此，舉例而言，僅在肌肉之胚胎發育期間存在之分子為相對於成體肌肉細胞之外源分子。類似地，由熱休克誘導之分子為相對於非熱休克細胞之外源分子。外源分子可包含例如發生故障之內源分子的起作用型式，或正常起作用內源分子之發生故障的型式。
外源分子可尤其為小分子，諸如藉由組合化學方法產生，或大分子，諸如蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、醣蛋白、脂蛋白、多醣、以上分子之任何經修飾衍生物或包含以上分子中之一或多者的任何複合物。核酸包括DNA及RNA，可為單股或雙股的；可為線性、分支或圓形的；且可具有任何長度。核酸包括能夠形成雙螺旋體之核酸，以及形成三螺旋體之核酸。參見例如美國專利第5,176,996號及第5,422,251號。蛋白質包括但不限於DNA結合蛋白、轉錄因子、染色體重塑因子、甲基化DNA結合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基酶、乙醯基酶、脫乙醯基酶、激酶、磷酸酶、連接酶、去泛素化酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓樸異構酶、旋轉酶及解螺旋酶。
外源分子可與內源分子為相同分子類型，例如外源蛋白質或核酸。舉例而言，外源核酸可包含引入至細胞或通常不存在於細胞中之染色體中的感染病毒基因組、質體或游離基因體。將外源分子引入至細胞中之方法為熟習此項技術者所知，且包括但不限於脂質介導之轉移(亦即脂質體，包括中性及陽離子型脂質)、電穿孔、直接注射、細胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沈澱、DEAE-聚葡萄糖介導之轉移及病毒載體介導中轉移。外源分子亦可與內源分子為相同分子類型，但衍生自與衍生細胞之物種不同的物種。舉例而言，人類核酸序列可引入至初始衍生自小鼠或倉鼠之細胞株中。
相比之下，「內源」分子為在特定發育階段在特定環境條件下通常存在於特定細胞中之分子。舉例而言，內源性核酸可包含染色體；粒線體、葉綠體或其他細胞器之基因組；或天然存在之游離型核酸。額外內源分子可包括蛋白質，例如轉錄因子及酶。
如本文所用，術語「外源核酸之產物」包括聚核苷酸及多肽產物，例如轉錄產物(聚核苷酸，諸如RNA)及轉譯產物(多肽)。
術語「異源」意謂衍生自與比較之實體以外的其他實體相比基因型獨特之實體。舉例而言，藉由基因工程化技術引入至衍生自不同物種之質體或載體中的聚核苷酸為異源聚核苷酸。自其天然編碼序列移除且以可操作方式連接於天然地發現不與其連接之編碼序列的啟動子為異源啟動子。因此，舉例而言，包括編碼異源基因產物之異源核酸序列的rAAV為包括通常不包括於天然存在之野生型AAV中之聚核苷酸的rAAV，且經編碼之異源基因產物為通常不由天然存在之野生型AAV編碼之基因產物。
術語「融合(fusion/fused)」分子或其變化形式係指其中兩個或更多個次單位分子較佳共價連接之分子。次單位分子可為相同化學類型之分子，或可為不同化學類型之分子。融合分子之實例包括但不限於融合蛋白(例如蛋白質DNA結合域與裂解域之間的融合)、與裂解域可操作地締合之聚核苷酸DNA結合域(例如sgRNA)之間的融合及融合核酸(例如編碼融合蛋白之核酸)。
融合蛋白於細胞中之表現可由將融合蛋白遞送至細胞或藉由將編碼融合蛋白之聚核苷酸遞送至細胞而產生，其中聚核苷酸經轉錄，且轉錄物經轉譯以產生融合蛋白。反式剪接、多肽裂解及多肽連接亦可涉及蛋白質於細胞中之表現。將聚核苷酸及多肽遞送至細胞之方法呈現於本發明中之其他地方。
出於本發明之目的，「基因」包括編碼基因產物(參見下文)之DNA區，以及調節基因產物產生之所有DNA區，無論此類調節序列是否鄰近於編碼序列及/或轉錄序列。因此，基因包括(但不一定限於)啟動子序列、終止子、轉譯調節序列(諸如核糖體結合位點及內部核糖體入口位點)、強化子、靜止子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附接位點及基因座控制區。
「基因表現」係指基因中所含之資訊轉換為基因產物。基因產物可為基因之直接轉錄產物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核糖核酸酶、結構RNA或任何其他類型之RNA)，或由mRNA轉譯產生之蛋白質。基因產物亦包括藉由諸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化及編輯之方法修飾之RNA，及藉由例如甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、豆蔻醯化及糖基化修飾之蛋白質。
基因表現「調節」係指基因活性之變化。表現調節可包括但不限於基因活化及基因抑制。基因組編輯(例如裂解、改變、不活化、隨機突變)可用於調節表現。基因不活化係指相比於不包括如本文所述之ZFP、TALE或CRISPR/Cas系統之細胞，基因表現之任何降低。因此，基因不活化可為部分或完全的。
「所關注區域」為細胞染色體之任何區域，諸如基因或在基因內或附近之非編碼序列，其中期望結合外源分子。結合可出於靶向DNA裂解及/或靶向重組之目的。所關注區域可存在於例如染色體、游離基因體、細胞器基因組(例如粒線體、葉綠體)或感染病毒基因組中。所關注區域可在基因之編碼區內；在經轉錄之非編碼區域，諸如前導序列、尾隨序列或內含子內；或在未經轉錄之區域內，在編碼區上游或下游。所關注區域之長度可小至單個核苷酸對或至多2,000個核苷酸對，或核苷酸對之任何整數值。
「報導基因」或「報導序列」係指產生在分析中易於量測之蛋白質產物(「報導蛋白」)的任何序列。分析可為(但未必)常規的。適合之報導基因包括但不限於編碼介導抗生素抗性(例如安比西林抗性、新黴素抗性、G418抗性、嘌呤黴素抗性)之蛋白質的序列、編碼著色或螢光或發光蛋白質(例如綠色螢光蛋白、增強型綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、螢光素酶)及介導增強之細胞生長及/或基因擴增之蛋白質(例如二氫葉酸還原酶)的序列。抗原決定基標籤包括例如FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可偵測胺基酸序列之一或多個複本。「表現標籤」包括編碼報導子之序列，該等報導子可操作地連接於所需基因序列以監測所關注基因之表現。
「真核」細胞包括但不限於真菌細胞(諸如酵母)、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞(例如T細胞)，包括幹細胞(多能及多潛能)。
如本文所用，術語「條形碼」係指獨特寡核苷酸序列(例如5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、50、75、100個核苷酸)，其具有用作鑑別其所併入之核酸序列之手段的特定序列。條形碼係用作區分或鑑別文庫中之個別成員(例如變異體)之手段。
術語「可操作連接」及「可操作地連接」(operatively linked/operably linked)可與提及的兩種或更多種組分(諸如序列元件)並列互換使用，其中組分經配置以使得兩種組分均正常起作用，且使得組分中之至少一者可介導施加於其他組分中之至少一者之功能成為可能。以說明方式，若轉錄調節序列回應於一或多種轉錄調節因子之存在或不存在而控制編碼序列之轉錄水準，則諸如啟動子之轉錄調節序列以可操作方式連接於編碼序列。轉錄調節序列一般以順式與編碼序列可操作地連接，但不必與其直接相鄰。舉例而言，強化子為以可操作方式連接於編碼序列之轉錄調節序列，儘管其不為鄰接的。
蛋白質、多肽或核酸之「功能片段」為序列與全長蛋白質、多肽或核酸不同，但保留與全長蛋白質、多肽或核酸相同的功能之蛋白質、多肽或核酸。功能片段可具有比對應天然分子更多、更少或與其相同數目的殘基，及/或可含有一或多個胺基酸或核苷酸取代。測定核酸或蛋白質功能(例如編碼功能、與另一核酸雜交之能力、酶活性分析)之方法為此項技術中熟知的。
聚核苷酸「載體」或「構築體」能夠將基因序列轉移至目標細胞。通常，「載體構築體」、「表現載體」、「表現構築體」、「表現卡匣」及「基因轉移載體」意謂能夠導引所關注基因之表現且可將基因序列轉移至目標細胞的任何核酸構築體。因此，術語包括選殖及表現媒介以及整合載體。
術語「個體」及「患者」可互換使用，且係指哺乳動物，包括但不限於人類患者及非人類靈長類動物，以及實驗動物，諸如兔、狗、貓、大鼠、小鼠及其他動物。因此，如本文所用之術語「個體」或「患者」意謂可投與本發明之表現卡匣的任何哺乳動物患者或個體。本發明之個體包括患有病症之彼等。
如本文所用之術語「治療(treating/treatment)」係指降低症狀之嚴重度及/或頻率、消除症狀及/或根本病因、預防出現症狀及/或其根本病因及改善或補救損害。癌症、單基因病及移植物抗宿主疾病為可使用本文所述之組合物及方法治療之病況的非限制性實例。
如本文所用之術語「有效量」為足以實現有利或所需臨床結果之量。有效量可以一或多次投藥投與。出於本發明之目的，化合物(例如感染性rAAV病毒粒子)之有效量為足以減輕、改善、穩定、逆轉、預防特定疾病狀態(例如肌肉疾病)(及/或與其相關之症狀)、減緩或延遲其進展的量。因此，感染性rAAV病毒粒子之有效量為能夠將異源核酸有效遞送至個體之一個目標細胞(或多個目標細胞)的感染性rAAV病毒粒子之量。可藉由例如使用此項技術中充分理解之技術，例如RT-PCR、西方墨點法、ELISA、螢光或其他報導子讀出及類似技術偵測細胞或組織中由異源核酸序列編碼之基因產物(RNA、蛋白質)而在臨床前確定有效量。可藉由例如使用此項技術中已知之方法，例如本文所述且此項技術中已知之6分鐘行走測試、左心室射血分數、手持式肌力測定法、Vignos量表及類似方法偵測疾病發作或進展之變化而在臨床上確定有效量。
「染色體」為包含細胞基因組之核蛋白結構。細胞染色體包含核酸，主要為DNA，及蛋白質，包括組蛋白及非組蛋白染色體蛋白質。大部分真核細胞染色體以核小體形式存在，其中核小體核心包含與八聚體相關之DNA的大約150個鹼基對，該八聚體各包含兩個組蛋白H2A、H2B、H3及H4；且連接子DNA (取決於生物體，長度可變)在核小體核心之間延伸。組蛋白H1之分子一般與連接子DNA相關。出於本發明之目的，術語「染色體」意欲涵蓋所有類型之細胞核蛋白(原核及真核)。細胞染色體包括染色體及游離型染色體。
術語「病毒基因組」係指側接有順式作用核酸序列之核酸序列，該等順式作用核酸序列介導將核酸封裝至病毒衣殼中。對於例如AAV及細小病毒，眾所周知的是位於病毒基因組之5'及3'端的「反向末端重複序列」(ITR)具有此功能，且ITR可介導將異源，例如非野生型病毒基因組封裝至病毒衣殼中。
術語「元件」係指某物之單獨或獨特部分，例如較長核酸序列內具有單獨功能之核酸序列。術語「調節元件」及「表現控制元件」在本文中可互換使用，且係指可影響可操作地連接之編碼序列於特定宿主生物體中之表現的核酸分子。此等術語被廣泛使用且涵蓋促進或調節轉錄之所有元件，包括啟動子、RNA聚合酶及轉錄因子之基本相互作用所需的核心元件、上游元件、強化子及反應元件(參見例如Lewin, 「Genes V」 (Oxford University Press, Oxford) 第847-873頁)。原核生物中之例示性調節元件包括啟動子、操縱子序列及核糖體結合位點。用於真核細胞中之調節元件可包括但不限於轉錄及轉譯控制序列，諸如啟動子、強化子、剪接信號、聚腺苷酸化信號、終止子、蛋白質降解信號、內部核糖體進入元件(IRES)、2A序列及其類似物，其提供及/或調控宿主細胞中編碼序列之表現及/或編碼多肽之產生。
如本文所用，術語「變異體」係指具有與參考聚核苷酸或多肽基本上類似的序列之聚核苷酸或多肽。在聚核苷酸之情況下，與參考聚核苷酸相比，變異體可在5'端、3'端及/或一或多個內部位點處具有一或多個核苷酸之缺失、取代、添加。變異體與參考聚核苷酸之間之序列類似性及/或差異可使用此項技術中已知之習知技術(例如聚合酶鏈反應(PCR)及雜交技術)偵測。變異體聚核苷酸亦包括合成衍生之聚核苷酸，諸如例如藉由使用定點突變誘發產生之聚核苷酸。一般而言，如藉由熟練的技術人員已知之序列比對程式所測定，包括但不限於DNA之聚核苷酸之變異體可與參考聚核苷酸具有至少約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列一致性。在多肽之情況下，與參考多肽相比，變異體可具有一或多個胺基酸之缺失、取代、添加。變異體與參考多肽之間之序列類似性及/或差異可使用此項技術中已知之習知技術(例如西方墨點(Western blot))偵測。一般而言，如藉由熟練的技術人員已知之序列比對程式所測定，多肽之變異體可與參考多肽具有至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列一致性。在一些情況下，術語「變異體」亦可用於描述包含變異衣殼序列之AAV。
術語「AAV」或「腺相關病毒」係指病毒之細小病毒科(Parvoviridae)屬內的依賴細小病毒(Dependoparvovirus)。舉例而言，AAV可為衍生自天然存在之「野生型」病毒之AAV、衍生自rAAV基因組之AAV，該rAAV基因組封裝至衍生自由天然存在之cap基因編碼之衣殼蛋白的衣殼中及/或封裝至衍生自由非天然衣殼cap基因編碼之衣殼蛋白的衣殼中。出於本文中之本發明的目的，術語「AAV」為腺相關病毒之縮寫，包括但不限於病毒自身及其衍生物。除非另有指示，否則術語係指所有亞型或血清型，以及複製勝任型及重組形式兩者。術語「AAV」包括但不限於AAV1型(AAV-1或AAVl)、AAV2型(AAV-2或AAV2)、AAV 3A型(AAV-3A或AAV3A)、AAV 3B型(AAV-3B或AAV3B)、AAV 4型、(AAV-4或AAV4)、AAV 5型(AAV-5或AAV5)、AAV 6型(AAV-6或AAV6)、AAV 7型(AAV-7或AAV7)、AAV 8型(AAV-8或AAV8)、AAV 9型(AAV-9或AAV9)、AAV 10型(AAV-10或AAV10或AAVrhlO)、禽類AAV、牛類AAV、犬類AAV、山羊類AAV、馬類AAV、靈長類AAV、非靈長類AAV及綿羊類AAV。「靈長類AAV」係指感染靈長類動物之AAV，「非靈長類AAV」係指感染非靈長類哺乳動物之AAV，「牛類AAV」係指感染牛類哺乳動物之AAV，等等。
各種血清型之AAV的基因組序列，以及自然末端重複序列(TR)、Rep蛋白及衣殼次單位之序列為此項技術中已知的。此類序列可發現於文獻中或諸如GenBank之公共資料庫中。參見例如GenBank寄存編號NC_002077.1 (AAVl)、AF063497.1 (AAVl)、NC 001401.2 (AAV2)、AF043303.1 (AAV2)、J01901.1 (AAV2)、U48704.1 (AAV3A)、NC_001729.1 (AAV3A)、AF028705.1 (AAV3B)、NC_001829.1 (AAV4)、U89790.1 (AAV4)、NC_006152.1 (AA5)、AF085716.1 (AAV-5)、AF028704.1 (AAV6)、NC_006260.1 (AAV7)、AF513851.1 (AAV7)、AF513852.1 (AAV8) NC 006261.1 (AAV-8)、AY530579.1 (AAV9)、AAT46337 (AAV10)及AAO88208 (AAVrhlO)；其關於教示AAV核酸及胺基酸序列之揭示內容以引用之方式併入本文中。亦參見例如Srivistava等人 (1983)J. Virology 45 :555；Morini等人 (1998)J. Virology 71 :6823；Chiorini等人 (1999) J. Virology 73 : 1309；Bantel-Schaal等人 (1999)J. Virology 73:939；Xiao等人 (1999)J. Virology 73 :3994；Muramatsu等人 (1996)Virology 221 :208；Shade等人 (1986)J. Virol . 58:921；Gao等人 (2002)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854；Moris等人 (2004)Virology 33 :375-383；國際專利公開案WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；及美國專利第6,156,303號。
術語「rAAV」係指「重組AAV」。在一些實施例中，重組AAV具有AAV基因組，其中部分或所有rep及cap基因已經異源序列置換。若AAV病毒粒子包含異源聚核苷酸(亦即，除野生型AAV基因組以外的聚核苷酸，例如待遞送至目標細胞之轉殖基因、核酸酶系統、待遞送至目標細胞之RNAi藥劑或CRISPR藥劑等)，則通常將其稱為「重組AAV (rAAV)病毒粒子」或「rAAV病毒粒子」。一般而言，異源多核苷酸係藉由至少一個，且一般藉由兩個AAV反向末端重複序列(ITR)側接。
術語「cap基因」或「衣殼基因」係指編碼形成，或促進形成病毒之衣殼或蛋白質外殼之衣殼蛋白的核酸序列。在AAV之情況下，衣殼蛋白可為VP1、VP2或VP3。對於其他細小病毒，衣殼蛋白之名稱及數目可不同。
術語「rep基因」係指編碼病毒複製及生產所需之非結構蛋白(rep78、rep68、rep52及rep40)的核酸序列。
術語「封裝」係指引起AAV粒子之組裝及衣殼化的一系列細胞內事件。AAV「rep」及「cap」基因係指編碼腺相關病毒之複製及衣殼化蛋白質的聚核苷酸序列。AAV rep及cap在本文中被稱作AAV「封裝基因」。
術語AAV之「輔助病毒」係指允許AAV (例如，野生型AAV)由哺乳動物細胞複製及封裝之病毒。AAV之各種此類輔助病毒為此項技術中已知的，包括腺病毒、疱疹病毒及痘病毒(諸如牛痘)。腺病毒涵蓋多個不同子組，但子組C之腺病毒5型最常用。已知人類、非人類哺乳動物及禽類來源之多種腺病毒且獲自貯藏所(諸如ATCC)。疱疹家族之病毒包括例如單純疱疹病毒(HSV)及埃-巴二氏病毒(EBV)以及巨細胞病毒(CMV)及假性狂犬病病毒(PRV)；其亦獲自諸如ATCC之貯藏所。
術語「輔助病毒功能」係指在輔助病毒基因組中編碼的功能，其允許AAV複製及封裝(結合本文所述之其他複製及封裝需求)。如本文所述，「輔助病毒功能」可以多種方式提供，包括藉由以反式向生產細胞提供輔助病毒或提供例如編碼必需功能之聚核苷酸序列。舉例而言，質體或其他包含編碼一或多種腺病毒蛋白質之核苷酸序列的表現載體與rAAV載體一起轉染至生產細胞中。
術語「感染性」病毒或病毒粒子為如下病毒或病毒粒子：包含勝任組裝之病毒衣殼且能夠將聚核苷酸組分遞送至病毒物種對其具向性之細胞中。該術語未必暗示病毒之任何複製能力。用於計數感染性病毒粒子之分析描述於在本發明中之其他地方及此項技術中。病毒感染性可表示為感染性病毒粒子與總病毒粒子之比。確定感染性病毒粒子與總病毒粒子之比的方法為此項技術中已知的。參見例如Grainger等人 (2005)Mol. Ther . 11: S337 (描述TCID50感染效價分析)；及Zolotukhin等人 (1999)Gene Ther . 6:973。
如本文所用之術語「向性」係指經特定宿主物種之細胞或宿主物種內之特定細胞類型之病毒(例如AAV)優先靶向。舉例而言，相對於僅可感染肺及肌肉細胞之病毒，可感染心臟、肺、肝及肌肉細胞之病毒具有更廣(亦即，增加之)向性。向性亦可包括病毒對宿主之特定細胞表面分子類型的依賴性。舉例而言，一些病毒可僅感染具有表面葡糖胺聚糖之細胞，而其他病毒可僅感染具有唾液酸之細胞(此類相關性可使用缺乏作為病毒感染之潛在宿主細胞之特定類別分子的各種細胞株來測試)。在一些情況下，病毒向性描述病毒之相對偏好。舉例而言，第一病毒可能夠感染所有細胞類型，但成功得多地感染具有表面葡糖胺聚糖之彼等細胞。若第二病毒亦偏好相同特徵(例如第二病毒亦更成功地感染具有表面葡糖胺聚糖之彼等細胞)，則可將第二病毒視為與第一病毒具有相似(或相同)向性，即使絕對轉導效率不相似亦如此。舉例而言，第二病毒可比第一病毒更高效地感染測試之每一給定細胞類型，但若相對偏好相似(或相同)，則仍可將第二病毒視為與第一病毒具有相似(或相同)向性。在一些實施例中，相對於天然存在之病毒粒子，包含個別變異AAV衣殼蛋白之病毒粒子的向性不改變。在一些實施例中，相對於天然存在之病毒粒子，包含個別變異AAV衣殼蛋白之病毒粒子的向性擴大(亦即，加寬)。在一些實施例中，相對於天然存在之病毒粒子，包含個別變異AAV衣殼蛋白之病毒粒子的向性減小。
術語「複製勝任型」病毒(例如複製勝任型AAV)係指在表型上為野生型之病毒，其為感染性的，且亦能夠在感染細胞中(亦即，在輔助病毒或輔助病毒功能存在下)複製。在AAV之情況下，複製能力一般需要存在功能性AAV封裝基因。一般而言，藉助於不具有一或多種AAV封裝基因，如本文所述之rAAV載體在哺乳動物細胞中(尤其在人類細胞中)為複製缺陷型的。通常，此類rAAV載體不具有任何AAV封裝基因序列，以使得藉由AAV封裝基因與進入的rAAV載體之間的重組產生複製勝任型AAV之可能性降至最低。在許多實施例中，如本文所述之rAAV載體製劑為含有少量(若存在)複製勝任型AAV (rcAAV，亦稱為RCA)(例如小於約1個rcAAV/102 個rAAV粒子、小於約1個rcAAV/104 個rAAV粒子、小於約1個rcAAV/10個rAAV粒子、小於約1個rcAAV/1012 個rAAV粒子或無rcAAV)之彼等。
「文庫」可呈大量線性核酸、質體、病毒粒子或病毒載體等的形式。文庫將包括至少兩種核酸、質體、病毒粒子、病毒載體等。 AAV變異體之文庫
在一個態樣中，本文所揭示之主題係關於產生編碼相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼蛋白的文庫。因此，本文描述用於產生相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼的AAV變異體之文庫。在一些實施例中，所需特徵為相比於天然AAV血清型增強之細胞或組織向性。在一些實施例中，所需特徵為避免預先存在的宿主抗體反應。在一些實施例中，所需特徵為降低的免疫原性以免引起宿主反應。
在一些實施例中，本發明之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之兩者或更多者：b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之三者或更多者：b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之文庫之各成員包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)側接肽插入位點之核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之兩者或更多者：b)側接肽插入位點之核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之三者或更多者：b)側接肽插入位點之核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之文庫之各成員包含a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；b)側接肽插入位點之核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，文庫之各成員包含編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，文庫之各成員包含編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，文庫之各成員含有包含條形碼之核酸。在一些實施例中，文庫之各成員含有包含兩個或更多個條形碼之核酸。在一些實施例中，文庫之各成員包含編碼報導蛋白之核酸。
在以上實施例中之任一者中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸存在於獨立核酸分子上。在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸存在於單一核酸分子上。在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。在一些實施例中，文庫之各成員包含5'ITR序列、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸、編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
在一些實施例中，AAV變異衣殼蛋白衍生自AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8及AAV9。在一些實施例中，AAV變異衣殼蛋白衍生自表徵不太充分的AAV血清型，包括但不限於AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。在一些實施例中，AAV變異體之文庫包含衍生自單一AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。在一些實施例中，AAV變異體之文庫包含衍生自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。在一些實施例中，一旦產生個別血清型文庫，便組合衍生自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。在一些實施例中，藉由修飾編碼來自相同集合體中之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種血清型之AAV衣殼蛋白的核酸來產生組合文庫。
在一些實施例中，將突變(例如插入、缺失及/或取代)引入至編碼衣殼蛋白中之外露環的DNA序列中。在一些實施例中，將肽插入至AAV衣殼中之外露環(例如高變區)中。在一些實施例中，肽包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個胺基酸。在一些實施例中，HI環經靶向(突變)，而在其他實施例中，DE環經靶向(突變)。在一些實施例中，在兩個環中進行突變(例如插入、缺失及/或取代)。在其他實施例中，將突變(例如插入、缺失及/或取代)引入至表面環之VR區中，包括VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII及或VR-IX。在其他實施例中，在VR-I、VR-VIII及或VR-IV中進行突變(例如插入、缺失及/或取代)。在一些實施例中，將突變(例如插入、缺失及/或取代)引入至AAV衣殼蛋白VP1、VP2或VP3中，或呈任何組合之兩種衣殼蛋白中，或所有三種衣殼蛋白中。在一些實施例中，將突變引入至VP1中。在一些實施例中，將突變引入至VP2中。在一些實施例中，將突變引入至VP3中。在一些實施例中，將突變引入至VP1及VP2中。在一些實施例中，將突變引入至VP1及VP3中。在一些實施例中，將突變引入至VP2及VP3中。在一些實施例中，將突變引入至VP1、VP2及VP3中。在一些實施例中，在編碼衣殼蛋白之基因中之單一位點處引入單一突變(例如插入、缺失及/或取代)，而在其他實施例中，在編碼衣殼蛋白之基因中引入超過1、2、3、4、5、6、7、10、20、30、40、50、100個或更多個(包括1與100之間的任何數目或更多個)突變(例如插入、缺失及/或取代)。
在一些例示性實施例中，將肽引入至衣殼蛋白之可變區VR-I、VR-IV或VR-VIII中。在一些實施例中，將肽引入衣殼蛋白之位置450與600之間的位置處。在一些實施例中，若衣殼蛋白對應於AAV1，則將肽引入位置590處。在一些實施例中，若AAV6衣殼經修飾，則將肽引入至位置454或590中。在一些實施例中，若AAV2衣殼經修飾，則將肽引入位置588處。在一些實施例中，若使用AAV3B衣殼，則將肽引入至位置589中。在一些實施例中，若使用AAV5衣殼，則將肽引入至位置578中。在一些實施例中，若使用AAV8衣殼，則將肽引入至位置591中。在一些實施例中，若使用AAV9衣殼，則將肽引入至位置266、455及/或589中。應理解，可選擇衣殼蛋白中之其他位點用於插入。
在一些實施例中，插入肽之長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度為7個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度為10個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度為15個胺基酸。在一些實施例中，在藉由PCR擴增作為插入位點之3'的衣殼基因片段期間引入肽。因此，在一些實施例中，衣殼基因使用PCR多樣化。在一些實施例中，引入的序列係在擴增作為插入位點之3'的衣殼基因片段期間引入。
在一些實施例中，將沉默突變引入至側接引入肽之區域的衣殼基因區域中，以使得所有衣殼血清型基因在此等側接區域中具有相同核苷酸序列。側接區域可在肽插入位點之任一側上包括10個或更多個、20個或更多個、30個或更多個、40個或更多個、50個或更多個、100個或更多個、150個或更多個或200個或更多個核苷酸。以此方式，相同引子序列可用於所有血清型文庫之PCR擴增及下一代定序(NGS)。此允許更快地篩選基於2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種血清型之文庫。在一些實施例中，引入2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個沉默突變，以使側接序列與兩個共同序列(一個在多樣化區域之5' 端且一個在多樣化區域之3'端)進行比對。在一些實施例中，若衣殼蛋白對應於AAV1，則在位置571、612及617中之一或多者處引入沉默突變。在一些實施例中，若衣殼蛋白對應於AAV2，則在位置568、569、572、573、574、610、611、613、615、616及617中之一或多者處引入沉默突變。在一些實施例中，若衣殼蛋白對應於AAV3B，則在位置569、570、571、573、574、575、612、614、615及616中之一或多者處引入沉默突變。在一些實施例中，若衣殼蛋白對應於AAV8，則在位置573、575、576、577、614及619中之一或多者處引入沉默突變。在一些實施例中，若衣殼蛋白對應於AAV9，則在位置571、572、573、574、575、611、612、615、616及617中之一或多者處引入沉默突變。應理解，可選擇衣殼蛋白中之其他位點用於插入。
在一些實施例中，文庫中之各AAV變異體之有效負載或基因組進一步包含報導基因。在一些實施例中，由報導子編碼之蛋白質為螢光的。例示性的非限制性報導基因包括EGFP、mCherry、mClover3及mRuby3。其他例示性的非限制性報導基因包括mApple、iRFP、tdTomato、mVenus、YFP、RFP、螢火蟲螢光素酶及奈米螢光素酶。
在一些實施例中，衣殼基因及報導基因處於獨立啟動子的控制下。在一些實施例中，衣殼基因及報導基因各自獨立地為以可操作方式連接於啟動子。
在一些實施例中，報導基因受細胞類型及/或組織特異性啟動子控制。在一些實施例中，報導基因以可操作方式連接於細胞類型及/或組織特異性啟動子。在一些實施例中，報導基因以可操作方式連接於細胞類型特異性RNA聚合酶II啟動子。例示性細胞類型及/或組織特異性啟動子包括僅表現於神經元中之人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)，或表現於肝細胞中之甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)。用於本發明方法及組合物中之其他非限制性細胞類型及/或組織特異性啟動子包括細胞角蛋白18及19 (上皮細胞特異性，Zheng及Baum (2008)Methods Mol Biol 434:205-219)、unc45b或unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (肌肉特異性，Rudeck等人 (2016)Genesis 54(8):431-8)、心肌肌鈣蛋白T (cTnT) (心肌細胞特異性，Ma等人 (2004)Am J Physiol Cell Physiol 286(3):556-64)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP) (星形膠質細胞特異性，Lee等人 (2008)Glia 56(5):481-93)、髓鞘鹼性蛋白 (MBP) (寡樹突神經膠質細胞特異性，Wei等人 (2003)Gene 313:161-7)、甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2) (神經元特異性，Adachi等人 (2005)Hum Mol Genetics 14(23):3709-22)，及其他大腦或眼部特異性rAAV相容性微型啟動子(MiniPromoters) (Leeuw等人 (2016)Molecular Brain 9(1):52)。
在一些實施例中，文庫中各AAV變異體之有效負載或基因組進一步包含編碼定位信號之核酸。在一些實施例中，報導基因與編碼定位信號之核酸融合。在一些實施例中，報導基因與域融合以增加報導子向細胞器中之移動。在一些實施例中，報導基因與域融合以增加報導子向細胞核中之移動。在一些實施例中，報導基因與編碼核定位信號(NLS) (例如SV40大T-抗原核定位信號)之核酸融合。NLS之非限制性實例包括衍生自以下之NLS序列：SV40病毒大T-抗原之NLS；來自核質蛋白之NLS；c-myc NLS；hRNPA1 M9；來自輸入蛋白-α之IBB域；肌瘤T蛋白NLS；人類p53 NLS；小鼠c-ab1 IV NLS；流感病毒NS1 NLS；肝炎病毒δ抗原NLS；小鼠Mx1蛋白NLS；人類聚(ADP-核糖)聚合酶NLS；及類固醇激素受體(人類)糖皮質激素NLS。其他NLS為此項技術中已知的。在一些實施例中，報導蛋白與定位至核膜(例如KASH域)之蛋白質融合。在一些實施例中，報導蛋白與組蛋白結合域(例如組蛋白2B結合域，H2B)融合。其他非限制性組蛋白包括H1、H2A、H3及H4家族中之彼等。應理解，N端及C端融合至報導基因均支持核定位。在一些實施例中，報導蛋白與超過一個定位信號融合。在一些實施例中，多個定位信號為串聯的。在一些實施例中，報導蛋白在其N端處與一或多個定位信號融合且在其C端處與一或多個定位信號融合。
在一些實施例中，將包含條形碼之核酸添加至文庫中各AAV變異體之有效負載或基因組。在一些實施例中，條形碼以生物資訊學方式連接至引入變異衣殼蛋白中之肽。在一些實施例中，合成包含編碼插入肽之變異DNA序列的DNA序列，以進一步包含隨機或指定條形碼。條形碼可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個或更多個核苷酸。在一些實施例中，核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154或155-198中之任一者的條形碼。在一些實施例中，核酸包含選自SEQ ID NO: 111-154之條形碼。在一些實施例中，核酸包含選自SEQ ID NO: 155-198之條形碼。在一些實施例中，包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。在一些實施例中，包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。合成DNA亦可包含用於藉由Gibson組裝進行分子選殖之限制位點及或核酸序列。在一些實施例中，內含子包括於表現卡匣中，以確認定序轉錄物衍生自mRNA且不衍生自載體基因組DNA。在其他實施例中，AAV有效負載或基因組係經由Gibson組裝進行組裝，其中衣殼基因之3'端連接至插入位點處之隨機或指定插入序列，且條形碼連接至polyA序列及5'ITR。在一些實施例中，跨越條形碼及衣殼基因中之插入可變區進行ILLUMINA®定序(或任何其他定序技術)，以通過生物資訊學方式連接兩個隨機序列。在其他實施例中，報導構築體、報導子特異性啟動子、衣殼特異性啟動子及衣殼基因之5'端經組裝以產生最終有效負載構築體。在一些實施例中，相對於cap 基因，表現卡匣呈有義定向。
在一些實施例中，文庫之各成員含有包含超過一個條形碼序列之核酸。在一些實施例中，文庫之各成員包含兩個或更多個各自包含條形碼序列之核酸。在一些實施例中，文庫之各成員含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸不同。在一些實施例中，包含第一條形碼序列之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。在一些實施例中，第一條形碼序列選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。在一些實施例中，包含第二條形碼序列之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。在一些實施例中，包含第二條形碼序列之第二核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子(例如選自U6啟動子、H1啟動子及7SK啟動子之群的啟動子)。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子以可操作方式連接於RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子為RNA Pol III啟動子(例如選自以下之群的啟動子：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
在一些實施例中，合成一小段DNA，其包含隨機產生或指定之條形碼及隨機產生或指定之衣殼變異區域，以及用於Gibson組裝之兩個區域。隨後，多樣化區域之衣殼序列3'經擴增。在其他實施例中，進行Gibson組裝反應，其中5'ITR及聚腺苷酸化序列與條形碼在5'端上融合，且第二Gibson組裝區域與衣殼基因之3'端及用於衣殼基因之polyA信號及3'ITR融合。在其他實施例中，跨越條形碼及變異衣殼序列進行ILLUMINA®定序。在其他實施例中，進行限制酶消化。在其他實施例中，PCR擴增步驟，其中製備報導子、定位信號、啟動子及衣殼基因之5'端。或者，包含報導子、定位信號、啟動子及衣殼基因之5'端的片段可在供體質體中預組裝，用BsaI消化，且經凝膠純化。在其他實施例中，進行golden gate選殖步驟以產生最終構築體。
在一些實施例中，合成兩個DNA片段。片段A包含Gibson組裝區域#1、限制酶位點、可變衣殼區域及與用作PCR引子之衣殼基因同源之區域。片段B包含Gibson組裝區域#2、隨機條形碼、限制酶位點及Gibson組裝區域#1。隨後，進行PCR程序，其中使用步驟1中合成之片段A作為PCR引子來擴增衣殼基因之3'序列。在其他實施例中，藉由Gibson組裝產生中間AAV構築體，其中構築體以5'-3'次序包含5' ITR、SV40 poly A信號、條形碼、兩個限制性核酸內切酶位點、變異衣殼序列、衣殼蛋白之3'區域、用於衣殼表現構築體之polyA序列及3' ITR。在其他實施例中，跨越條形碼及變異衣殼序列進行ILLUMINA®定序。在其他實施例中，進行限制酶消化。在其他實施例中，進行PCR擴增步驟，其中製備報導子、定位信號、啟動子及衣殼基因之5'端。或者，包含報導子、定位信號、啟動子及衣殼基因之5'端的片段可在供體質體中預組裝，用BsaI消化，且經凝膠純化。在其他實施例中，進行golden gate選殖步驟以產生最終構築體。
在一些實施例中，各插入肽可由各自具有不同序列(由於密碼簡併)之多個核酸分子編碼。各核酸序列連接至獨特條形碼，以使得可在兩種或更多種變異體經鑑別具有相同插入肽序列，但其中插入肽由不同核酸序列編碼時驗證插入肽之效能(例如富集)。
在一些實施例中，條形碼經由標準選殖技術連接至報導基因、polyA序列及5'ITR。在其他實施例中，編碼肽之變異序列經由標準技術插入至衣殼基因中，且接著添加特異性啟動子，且添加衣殼基因之5'端。接著在兩個獨立反應中進行ILLUMINA®定序(或任何其他高度可靠的定序技術)，其中條形碼及插入核苷酸序列經定序。最後，進行OXFORD NANOPORE® 定序(或任何其他長讀段定序技術，例如PACBIO® SMRT定序)，以使得長讀段長度序列包含條形碼及插入核苷酸序列兩者。
在一些實施例中，產生『查找』表，其將各條形碼連接至已插入衣殼基因中之各核苷酸序列。
本發明之文庫可包含102 、103 、104 、105 、106 、107 或108 個或更多個獨特AAV變異體。在一些實施例中，文庫可包含102 -103 、103 -104 、104 -105 、105 -106 、106 -107 或107 -108 個獨特AAV變異體。
AAV變異體之前述文庫中之任一者可用於本文所揭示之方法。 鑑別AAV衣殼變異體之方法
本發明提供產生相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼的方法及組合物。此等衣殼適用於例如將基因組工程化分子及基因療法分子遞送至目標細胞、細胞株或組織(例如活體外或活體內)，以治療有需要之個體。在一些實施例中，衣殼用於將有效負載遞送至所需組織、細胞或細胞器。
在另一態樣中，本文揭示AAV衣殼蛋白之定向進化及鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法。
在一些實施例中，鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法包含：(i)在活體外或活體內使細胞、細胞株或組織與本文所揭示之AAV變異體之文庫中之任一者接觸，(ii)使該文庫中之AAV變異體轉導細胞、細胞株或組織；(iii)自細胞、細胞株或組織回收AAV變異體；及(iv)鑑別具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
在一些實施例中，鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法包含：(i)將複數個編碼肽之核酸插入至編碼AAV衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環之核酸群體中，以產生編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸之文庫；(ii)將該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至以下中之一或多者：(a)包含條形碼之核酸，(b)編碼報導蛋白之核酸，及(c)編碼定位信號之核酸，以形成有效負載構築體；(iii)藉由以反式提供腺病毒輔助及AAV rep功能而在生產細胞中製造AAV變異體之文庫；(iv)純化AAV變異體之文庫；(v)在活體外或活體內使細胞、細胞株或組織與AAV變異體之文庫接觸；(vi)自目標細胞、細胞株或組織回收AAV變異體；及(vii)鑑別具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
在一些實施例中，鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法包含：(i)將複數個編碼肽之核酸插入至編碼AAV衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環之核酸群體中，以產生編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸之文庫；(ii)將該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至以下中之兩者或更多者：(a)包含條形碼之核酸，(b)編碼報導蛋白之核酸，及(c)編碼定位信號之核酸，以形成有效負載構築體；(iii)藉由以反式提供腺病毒輔助及AAV rep功能而在生產細胞中製造AAV變異體之文庫；(iv)純化AAV變異體之文庫；(v)在活體外或活體內使細胞、細胞株或組織與AAV變異體之文庫接觸；(vi)自目標細胞、細胞株或組織回收AAV變異體；及(vii)鑑別具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
在一些實施例中，鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法包含：(i)將複數個編碼肽之核酸插入至編碼AAV衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環之核酸群體中，以產生編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸之文庫；(ii)將該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至(a)包含條形碼之核酸，(b)編碼報導蛋白之核酸，及(c)編碼定位信號之核酸，以形成有效負載構築體；(iii)藉由以反式提供腺病毒輔助及AAV rep功能而在生產細胞中製造AAV變異體之文庫；(iv)純化AAV變異體之文庫；(v)在活體外或活體內使細胞、細胞株或組織與AAV變異體之文庫接觸；(vi)自目標細胞、細胞株或組織回收AAV變異體；及(vii)鑑別具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白定向進化以鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的步驟包含(i)將肽插入至來自一或多種AAV血清型之衣殼蛋白中之高變環及/或外露表面環中，從而對於各AAV血清型產生經修飾變異衣殼之文庫；(ii)在生產細胞中封裝變異AAV，其中腺病毒輔助及AAVrep 功能係以反式提供；(iii)純化病毒衣殼文庫集合體；(iv)活體外或活體內投與集合體；(v)自目標組織或細胞株回收AAV變異體；(vi)下一代定序以測定工程化變異衣殼序列之一致性；(vii)重複輪次之活體外或活體內選擇，其中變異體自目標組織或細胞株分離；及(viii)全面評估富集變異體。
在一些實施例中，所需特徵為相比於天然AAV血清型增強之細胞或組織向性。此等方法亦可適於選擇逃避預先存在之宿主抗體反應的AAV衣殼變異體及/或產生將不引起宿主反應之AAV變異體。
在一些實施例中，選擇例如來自AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8及AAV9之衣殼蛋白用於起始點。在一些實施例中，選擇來自表徵不太充分的AAV血清型之衣殼蛋白，包括但不限於AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。在一些實施例中，AAV變異體之文庫包含衍生自單一AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。在一些實施例中，AAV變異體之文庫包含衍生自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。在一些實施例中，一旦產生個別血清型文庫，便組合衍生自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。在一些實施例中，藉由修飾編碼來自相同集合體中之2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種血清型之AAV衣殼蛋白的核酸來產生組合文庫。
在一些實施例中，定向進化包含對AAV衣殼進行突變(例如插入、缺失及/或取代)。在一些實施例中，將突變(例如插入、缺失及/或取代)引入至編碼衣殼蛋白中之外露環的DNA序列中。在一些實施例中，定向進化包含將肽插入至AAV衣殼中之外露環(例如高變區)中。
在一些實施例中，文庫封裝於HEK293細胞中，其中輔助功能(例如E2A、E4、VA、E1A及E1B)係以反式提供。在一些實施例中，AAV rep功能包含rep78、rep 68、rep 52及rep40基因。在一些實施例中，rep基因係以反式提供。在一些實施例中，rep78及/或rep68基因之起始密碼子自ACG變為ATG，以增加含有反向末端重複序列(ITR)之衣殼文庫構築體的複製，由此提高AAV文庫製造產率。在一些實施例中，Cap 基因作為有效負載提供至製造之AAV。在一些實施例中，衣殼基因受p40啟動子控制，以使其僅在輔助病毒功能存在下在HEK293細胞中製造期間表現。
在一些實施例中，在細胞中選擇文庫。在一些實施例中，個別血清型文庫經組合以產生包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種血清型之單一文庫，其中各AAV變異體亦包含插入至AAV變異衣殼中之肽。在一些實施例中，使用單一血清型文庫，其中該血清型文庫中之各AAV包含插入至AAV變異衣殼中之肽。在一些實施例中，細胞用文庫處理且接著監測報導基因於細胞之細胞質中或所關注細胞器中之表現。在一些實施例中，所關注細胞器為細胞核。在一些實施例中，包含AAV有效負載或基因組(如由報導基因之表現所證明)之細胞器自細胞分離。在一些實施例中，細胞器為細胞核。在一些實施例中，自細胞器(例如細胞核)提取核酸。在一些實施例中，提取之核酸為RNA，而在一些實施例中，提取之核酸為DNA。在一些實施例中，對提取之RNA進行反轉錄以產生cDNA，其接著使用對帶條形碼的區域具有特異性之引子進行擴增及定序。在一些實施例中，使用對引入之可變序列具有特異性之引子對提取之DNA進行擴增及定序。在一些實施例中，在細胞中選擇後觀測到特異性AAV變異體之富集。
在一些實施例中，使用之細胞包括但不限於來自以下各者之細胞：CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴或口腔黏膜。
在一些實施例中，細胞包括但不限於神經元、膠細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞、室管膜細胞、肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞、肝內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。
在一些實施例中，在動物中選擇文庫。在一些實施例中，個別血清型文庫經組合以產生包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15種或更多種血清型之單一文庫，其中各AAV亦包含插入至AAV變異衣殼中之肽。在一些實施例中，使用單一血清型文庫，其中該血清型文庫中之各AAV包含插入至AAV變異衣殼中之肽。在一些實施例中，經由靜脈內、顱內或鞘內注射，或藉由一些其他途徑(例如經鼻、肝、腦室內、腦池內、玻璃體內、耳蝸內等)注射來用文庫處理動物。在足以使AAV通行至所需組織或器官之時間(例如7、10、14、18、21、24、28、30天或更久)後，處死動物，且收集所關注組織/器官。在一些實施例中，關於報導基因於細胞之細胞質中或所關注細胞器中之表現對組織中之細胞進行監測。在一些實施例中，所關注細胞器為細胞核。在一些實施例中，包含AAV有效負載(如由報導基因之表現所證明)之細胞器自組織分離。在一些實施例中，細胞器為細胞核。在一些實施例中，自細胞器(例如細胞核)提取核酸。在一些實施例中，提取之核酸為RNA，而在一些實施例中，提取之核酸為DNA。在一些實施例中，對提取之RNA進行反轉錄以產生cDNA，其接著使用對帶條形碼的區域具有特異性之引子進行擴增及定序。在一些實施例中，使用對引入之可變序列具有特異性之引子對提取之DNA進行擴增及定序。在一些實施例中，在活體內選擇後觀測到特異性AAV變異體之富集。
在此等實施例中之任一者中，在細胞中或活體內選擇AAV變異體可進行1、2、3、4、5輪或更多輪，在各情況下彙集獲自前一輪之AAV變異體或合成經富集之變異體子組且在細胞中或活體內重新選擇。
在一些實施例中，在所需數目之選擇輪次後，分析變異體。在一些實施例中，個別變異體用於將轉殖基因活體內遞送至所需細胞或器官。在分析變異體之遞送能力之後，選擇最佳候選物以供將來使用。
在一些實施例中，文庫之各成員含有包含兩個條形碼序列之核酸。在一些實施例中，文庫之各成員含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸不同。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列，或選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。在本文所揭示之方法、AAV變異體之文庫、AAV變異體或核酸之一些實施例中，包含第二條形碼之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列，或選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列，或選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者，且包含第二條形碼之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列，或選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。在一些實施例中，該啟動子對於第一條形碼及第二條形碼中之每一者不同。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸及第二核酸中之每一者獨立地處於不同啟動子的控制下。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子(例如人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子或甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子)。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子(例如U6啟動子、H1啟動子或7SK啟動子)。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子為RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子為RNA Pol III啟動子。在一些實施例中，包含條形碼之核酸進一步包含報導基因、核定位信號及聚腺苷酸化信號。 AAV變異體
本文描述用於產生相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼的AAV變異體。在一些實施例中，所需特徵為相比於天然AAV血清型增強之細胞或組織向性。在一些實施例中，所需特徵為避免預先存在的宿主抗體反應。在一些實施例中，所需特徵為降低的免疫原性以免引起宿主反應。
在一些實施例中，本發明之AAV變異體包含：a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之AAV變異體包含：a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之兩者或更多者：b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之AAV變異體包含：a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之三者或更多者：b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之AAV變異體包含：a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之AAV變異體包含：a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)側接肽插入位點之核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之AAV變異體包含：a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之兩者或更多者：b)側接肽插入位點之核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之AAV變異體包含：a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之三者或更多者：b)側接肽插入位點之核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在一些實施例中，本發明之AAV變異體包含：a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；b)側接肽插入位點之核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸；d)包含條形碼之核酸；及e)編碼報導蛋白之核酸。
在以上實施例中之任一者中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸存在於獨立核酸分子上。在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸存在於單一核酸分子上。在一些實施例中，編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。在一些實施例中，文庫之各成員包含5'ITR序列、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸、編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
AAV變異體之各種組分(例如AAV變異衣殼蛋白、插入肽、側接肽插入位點之沉默突變、定位信號、條形碼、報導蛋白、啟動子或相關核酸序列等)揭示於本文中之其他地方。
在另一態樣中，本發明提供編碼本文所揭示之AAV變異體的核酸分子。在一些實施例中，核酸分子包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者：b)編碼變異衣殼蛋白之核酸序列，該變異衣殼蛋白在其高變環及/或外露表面環中側接肽插入位點之核苷酸序列中包含一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸序列；d)包含條形碼之核酸序列；及e)編碼報導蛋白之核酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種核酸分子，其包含以下中之兩者或更多者：a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之兩者或更多者：b)編碼變異衣殼蛋白之核酸序列，該變異衣殼蛋白在其高變環及/或外露表面環中側接肽插入位點之核苷酸序列中包含一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸序列；d)包含條形碼之核酸序列；及e)編碼報導蛋白之核酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種核酸分子，其包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之三者或更多者：b)編碼變異衣殼蛋白之核酸序列，該變異衣殼蛋白在其高變環及/或外露表面環中側接肽插入位點之核苷酸序列中包含一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸序列；d)包含條形碼之核酸序列；及e)編碼報導蛋白之核酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種核酸分子，其包含a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；b)編碼變異衣殼蛋白之核酸序列，該變異衣殼蛋白在其高變環及/或外露表面環中側接肽插入位點之核苷酸序列中包含一或多個沉默突變；c)編碼定位信號之核酸序列；d)包含條形碼之核酸序列；及e)編碼報導蛋白之核酸序列。
在一些實施例中，條形碼核酸序列包含超過一個條形碼序列。在一些實施例中，條形碼核酸序列包含兩個或更多個條形碼序列。在一些實施例中，條形碼核酸序列含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸不同。在一些實施例中，包含第一條形碼序列之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。在一些實施例中，第一條形碼序列選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。在一些實施例中，包含第二條形碼序列之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。在一些實施例中，包含第二條形碼序列之第二核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。在一些實施例中，包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子(例如選自U6啟動子、H1啟動子及7SK啟動子之群的啟動子)。在一些實施例中，以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子以可操作方式連接於RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子為RNA Pol III啟動子(例如選自以下之群的啟動子：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
在一些實施例中，AAV3B變異體含有包含選自由以下組成之群的任何序列之肽：EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、TDFRSPQ (SEQ ID NO: 80)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、PYASITG (SEQ ID NO: 76)及YGSRSVD (SEQ ID NO: 83)。在一些實施例中，AAV3B變異體包含選自由以下組成之群的肽序列：序列EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、TDFRSPQ (SEQ ID NO: 80)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、PYASITG (SEQ ID NO: 76)及YGSRSVD (SEQ ID NO: 83)。
在一些實施例中，AAV1變異體含有包含序列SVVVSSDSSKRPNL (SEQ ID NO: 71)之肽。在一些實施例中，AAV1變異體包含肽序列SVVVSSDSSKRPNL (SEQ ID NO: 71)。
在一些實施例中，AAV2變異體含有包含選自由以下組成之群的任何序列之肽：RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)、PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)、ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)及RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)。在一些實施例中，AAV2變異體包含選自由以下組成之群的肽序列：RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)、PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)、ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)及RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)。在一些實施例中，AAV2變異體含有包含選自由以下組成之群的任何序列之肽：RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)及PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)。在一些實施例中，AAV2變異體含有包含選自由以下組成之群的任何序列之肽：ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)及RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)。在一些實施例中，AAV2變異體包含選自由以下組成之群的肽序列：RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)及PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)。在一些實施例中，AAV2變異體包含選自由以下組成之群的肽序列：ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)及RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)。
在一些實施例中，AAV9變異體含有包含序列NIPKAYG (SEQ ID NO: 89)之肽。在一些實施例中，AAV9變異體包含肽序列NIPKAYG (SEQ ID NO: 89)。
在一些實施例中，AAV3B變異體含有包含胺基酸序列EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)之肽。在一些實施例中，AAV3B變異體含義包含胺基酸序列TDFRSPQ (SEQ ID NO: 80)之肽。在一些實施例中，AAV3B變異體含有包含胺基酸序列TGAFSST (SEQ ID NO: 77)之肽。在一些實施例中，AAV3B變異體含義包含胺基酸序列FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)之肽。在一些實施例中，AAV3B變異體含義包含胺基酸序列PYASITG (SEQ ID NO: 76)之肽。在一些實施例中，AAV3B變異體含有包含胺基酸序列YGSRSVD (SEQ ID NO: 83)之肽。
在一些實施例中，AAV2變異體含有包含胺基酸序列RPLTAND (SEQ ID NO: 95)之肽。在一些實施例中，AAV2變異體含有包含胺基酸序列PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)之肽。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)。在一些實施例中，AAV2變異體含有包含胺基酸序列ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)之肽。在一些實施例中，AAV2變異體含有包含胺基酸序列LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)之肽。在一些實施例中，AAV2變異體含有包含胺基酸序列GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)之肽。在一些實施例中，AAV2變異體含有包含胺基酸序列TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)之肽。在一些實施例中，AAV2變異體含有包含胺基酸序列RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)之肽。
在一些實施例中，AAV1變異體含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：KSPQSKV (SEQ ID NO:1)、SDLRSKV (SEQ ID NO:2)及TTTVRKV (SEQ ID NO:3)。在一些實施例中，AAV1變異體包含選自由以下組成之群的肽：KSPQSKV (SEQ ID NO:1)、SDLRSKV (SEQ ID NO:2)及TTTVRKV (SEQ ID NO:3)。
在一些實施例中，AAV1變異體含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：AALRDIR (SEQ ID NO:68)、PAIKTYS (SEQ ID NO: 69)、TGDRISSRTL (SEQ ID NO: 70)、SVVVSSDSSKRPRNL (SEQ ID NO: 71)、VGARLSA (SEQ ID NO: 72)、IEKPNTSTKK (SEQ ID NO: 73)、DTVRSKN (SEQ ID NO: 74)及KELNKAR (SEQ ID NO: 75)。在一些實施例中，AAV1變異體包含選自由以下組成之群的肽：AALRDIR (SEQ ID NO:68)、PAIKTYS (SEQ ID NO: 69)、TGDRISSRTL (SEQ ID NO: 70)、SVVVSSDSSKRPRNL (SEQ ID NO: 71)、VGARLSA (SEQ ID NO: 72)、IEKPNTSTKK (SEQ ID NO: 73)、DTVRSKN (SEQ ID NO: 74)及KELNKAR (SEQ ID NO: 75)。
在一些實施例中，AAV2變異體含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：GRSDMAG (SEQ ID NO: 4)、LLSSERS (SEQ ID NO: 5)、EQRPNVS (SEQ ID NO: 6)及TRQISSD (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，AAV2變異體包含選自由以下組成之群的肽：GRSDMAG (SEQ ID NO: 4)、LLSSERS (SEQ ID NO: 5)、EQRPNVS (SEQ ID NO: 6)及TRQISSD (SEQ ID NO: 7)。
在一些實施例中，AAV2變異體含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：MTLTRQE (SEQ ID NO: 90)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)、EVRGGPS (SEQ ID NO: 92)、VISDRSS (SEQ ID NO: 93)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)、RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)、DVGIRPS (SEQ ID NO: 97)、KDSTAFG (SEQ ID NO: 98)、YPGRNPD (SEQ ID NO: 99)、ISDTRIS (SEQ ID NO: 100)、ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)、LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)、VSNPLNQ (SEQ ID NO: 104)、LNERGLG (SEQ ID NO: 105)、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)、VGHAGNP (SEQ ID NO: 107)、SRAGTVP (SEQ ID NO: 108)、GLVAKLP (SEQ ID NO: 109)及AESLRTP (SEQ ID NO: 110)。在一些實施例中，AAV2變異體包含選自由以下組成之群的肽：MTLTRQE (SEQ ID NO: 90)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)、EVRGGPS (SEQ ID NO: 92)、VISDRSS (SEQ ID NO: 93)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)、RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)、DVGIRPS (SEQ ID NO: 97)、KDSTAFG (SEQ ID NO: 98)、YPGRNPD (SEQ ID NO: 99)、ISDTRIS (SEQ ID NO: 100)、ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)、LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)、VSNPLNQ (SEQ ID NO: 104)、LNERGLG (SEQ ID NO: 105)、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)、VGHAGNP (SEQ ID NO: 107)、SRAGTVP (SEQ ID NO: 108)、GLVAKLP (SEQ ID NO: 109)及AESLRTP (SEQ ID NO: 110)。
在一些實施例中，AAV3B變異體含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：QGALAQV (SEQ ID NO: 8)、YPSSNTP (SEQ ID NO: 9)、MLNPRTE (SEQ ID NO: 10)及QMRTRDE (SEQ ID NO: 11)。在一些實施例中，AAV3B變異體包含選自由以下組成之群的肽：QGALAQV (SEQ ID NO: 8)、YPSSNTP (SEQ ID NO: 9)、MLNPRTE (SEQ ID NO: 10)及QMRTRDE (SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，AAV3B變異體含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：PYASITG (SEQ ID NO: 76)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、TDFRSPQ (SEQ ID NO:80)、MYSLMKD (SEQ ID NO:81)、LYLSSAS (SEQ ID NO: 82)、YGSRSVD (SEQ ID NO:83)、LYSHQVS (SEQ ID NO: 84)及ISTHSPP (SEQ ID NO: 85)。在一些實施例中，AAV3B變異體包含選自由以下組成之群的肽：PYASITG (SEQ ID NO: 76)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、TDFRSPQ (SEQ ID NO:80)、MYSLMKD (SEQ ID NO:81)、LYLSSAS (SEQ ID NO: 82)、YGSRSVD (SEQ ID NO:83)、LYSHQVS (SEQ ID NO: 84)及ISTHSPP (SEQ ID NO: 85)。
在一些實施例中，AAV9變異體含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：MPGRAPI (SEQ ID NO: 12)、LGRLTAN (SEQ ID NO: 13)、SYSTSRS (SEQ ID NO: 14)、TRPSSTN (SEQ ID NO: 15)、VPQSSSR (SEQ ID NO: 16)、VSRSYPA (SEQ ID NO: 17)及QRARPDT (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，AAV9變異體包含選自由以下組成之群的肽：MPGRAPI (SEQ ID NO: 12)、LGRLTAN (SEQ ID NO: 13)、SYSTSRS (SEQ ID NO: 14)、TRPSSTN (SEQ ID NO: 15)、VPQSSSR (SEQ ID NO: 16)、VSRSYPA (SEQ ID NO: 17)及QRARPDT (SEQ ID NO: 18)。
在一些實施例中，AAV9變異體含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：RQPTTIP (SEQ ID NO: 86)、RSTSSLL (SEQ ID NO: 87)、FRLSSPQ (SEQ ID NO: 88)及NIPKAYG (SEQ ID NO: 89)。在一些實施例中，AAV9變異體包含選自由以下組成之群的肽：RQPTTIP (SEQ ID NO: 86)、RSTSSLL (SEQ ID NO: 87)、FRLSSPQ (SEQ ID NO: 88)及NIPKAYG (SEQ ID NO: 89)。
在一些實施例中，AAV6變異體含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：SQLTPHS (SEQ ID NO: 19)、LGSHLPS (SEQ ID NO: 20)、YTLSSGQ (SEQ ID NO: 21)、SSRIPPD (SEQ ID NO: 22)、WTETIPR (SEQ ID NO: 23)、HGLQGVA (SEQ ID NO: 24)、TMRVSDQ (SEQ ID NO: 25)、GSSKVVM (SEQ ID NO: 26)及SALDRGV (SEQ ID NO: 27)。在一些實施例中，AAV6變異體包含選自由以下組成之群的肽：SQLTPHS (SEQ ID NO: 19)、LGSHLPS (SEQ ID NO: 20)、YTLSSGQ (SEQ ID NO: 21)、SSRIPPD (SEQ ID NO: 22)、WTETIPR (SEQ ID NO: 23)、HGLQGVA (SEQ ID NO: 24)、TMRVSDQ (SEQ ID NO: 25)、GSSKVVM (SEQ ID NO: 26)及SALDRGV (SEQ ID NO: 27)。
在一些實施例中，AAV5變異體含有包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之肽：KELGTQR (SEQ ID NO: 28)、RSSDVQR (SEQ ID NO: 29)、PSAPKTF (SEQ ID NO: 30)、HTKRSEY (SEQ ID NO: 31)及IKGSNLP (SEQ ID NO: 32)。在一些實施例中，AAV5變異體包含選自由以下組成之群的肽：KELGTQR (SEQ ID NO: 28)、RSSDVQR (SEQ ID NO: 29)、PSAPKTF (SEQ ID NO: 30)、HTKRSEY (SEQ ID NO: 31)及IKGSNLP (SEQ ID NO: 32)。 肽
本文描述使用本發明之方法鑑別之插入肽，其相比於天然AAV血清型賦予AAV變異體所需特徵。在一些實施例中，所需特徵為相比於天然AAV血清型增強之細胞或組織向性。在一些實施例中，本發明之插入肽允許AAV變異體逃避預先存在之宿主抗體反應。在一些實施例中，本發明之插入肽使得AAV變異體之免疫原性較低，以使其將不引起宿主反應。在一些實施例中，插入肽能夠將AAV載體導引至特定目標細胞或組織。
插入肽之長度可為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30個或更多個胺基酸，或任何兩個此等值之間的範圍。在一些實施例中，肽之長度為7個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度為10個胺基酸。在一些實施例中，肽之長度為15個胺基酸。
在一些實施例中，插入肽包含SEQ ID No. 1-32中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，肽包含SEQ ID No. 1-32中所闡述之胺基酸序列的至少5個連續胺基酸。在一些實施例中，肽包含SEQ ID No. 1-32中所闡述之胺基酸序列的至少6個連續胺基酸。在一些實施例中，肽包含SEQ ID No. 1-32中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含與SEQ ID No. 1-32中所闡述之胺基酸序列具有至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，插入肽包含SEQ ID No. 68-110中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。在一些實施例中，肽包含SEQ ID No. 68-110中所闡述之胺基酸序列的至少5個連續胺基酸。在一些實施例中，肽包含SEQ ID No. 68-110中所闡述之胺基酸序列的至少6個連續胺基酸。在一些實施例中，肽包含SEQ ID No. 68-110中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，肽包含與SEQ ID No. 68-110中所闡述之胺基酸序列具有至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更大序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的任何序列：EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、TDFRSPQ (SEQ ID NO: 80)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、PYASITG (SEQ ID NO: 76)及YGSRSVD (SEQ ID NO: 83)。在一些實施例中，肽序列選自由以下組成之群：序列EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、TDFRSPQ (SEQ ID NO: 80)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、PYASITG (SEQ ID NO: 76)及YGSRSVD (SEQ ID NO: 83)。在一些實施例中，肽包含序列SVVVSSDSSKRPNL (SEQ ID NO: 71)。在一些實施例中，肽序列為SVVVSSDSSKRPNL (SEQ ID NO: 71)。在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的任何序列：RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)、PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)、ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)及RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)。在一些實施例中，肽序列選自由以下組成之群：序列RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)、PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)、ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)及RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)。在一些實施例中，肽包含序列NIPKAYG (SEQ ID NO: 89)。在一些實施例中，肽序列為NIPKAYG (SEQ ID NO: 89)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、TDFRSPQ (SEQ ID NO: 80)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、PYASITG (SEQ ID NO: 76)、YGSRSVD (SEQ ID NO: 83)、SVVVSSDSSKRPNL (SEQ ID NO: 71)、RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)及PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)。在一些實施例中，肽序列選自由以下組成之群：EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、TDFRSPQ (SEQ ID NO: 80)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、PYASITG (SEQ ID NO: 76)、YGSRSVD (SEQ ID NO: 83)、SVVVSSDSSKRPNL (SEQ ID NO: 71)、RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)及PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、LGNGKMTVQP、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 103)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)、RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)及NIPKAYG (SEQ ID NO: 89)。在一些實施例中，肽序列選自由以下組成之群：EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、TDFRSPQ (SEQ ID NO: 80)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、PYASITG (SEQ ID NO: 76)、YGSRSVD (SEQ ID NO: 83)、SVVVSSDSSKRPNL (SEQ ID NO: 71)、RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)及PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)。
在一些實施例中，肽包含胺基酸序列EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列TDFRSPQ (SEQ ID NO: 80)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列TGAFSST (SEQ ID NO: 77)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列PYASITG (SEQ ID NO: 76)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列YGSRSVD (SEQ ID NO: 83)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列RPLTAND (SEQ ID NO: 95)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)。在一些實施例中，肽包含胺基酸序列RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：KSPQSKV (SEQ ID NO:1)、SDLRSKV (SEQ ID NO:2)及TTTVRKV (SEQ ID NO:3)。在一些實施例中，肽選自由以下組成之群：KSPQSKV (SEQ ID NO:1)、SDLRSKV (SEQ ID NO:2)及TTTVRKV (SEQ ID NO:3)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：AALRDIR (SEQ ID NO:68)、PAIKTYS (SEQ ID NO: 69)、TGDRISSRTL (SEQ ID NO: 70)、SVVVSSDSSKRPRNL (SEQ ID NO: 71)、VGARLSA (SEQ ID NO: 72)、IEKPNTSTKK (SEQ ID NO: 73)、DTVRSKN (SEQ ID NO: 74)及KELNKAR (SEQ ID NO: 75)。在一些實施例中，肽選自由以下組成之群：AALRDIR (SEQ ID NO:68)、PAIKTYS (SEQ ID NO: 69)、TGDRISSRTL (SEQ ID NO: 70)、SVVVSSDSSKRPRNL (SEQ ID NO: 71)、VGARLSA (SEQ ID NO: 72)、IEKPNTSTKK (SEQ ID NO: 73)、DTVRSKN (SEQ ID NO: 74)及KELNKAR (SEQ ID NO: 75)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GRSDMAG (SEQ ID NO: 4)、LLSSERS (SEQ ID NO: 5)、EQRPNVS (SEQ ID NO: 6)及TRQISSD (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，肽選自由以下組成之群：GRSDMAG (SEQ ID NO: 4)、LLSSERS (SEQ ID NO: 5)、EQRPNVS (SEQ ID NO: 6)及TRQISSD (SEQ ID NO: 7)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：MTLTRQE (SEQ ID NO: 90)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)、EVRGGPS (SEQ ID NO: 92)、VISDRSS (SEQ ID NO: 93)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)、RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)、DVGIRPS (SEQ ID NO: 97)、KDSTAFG (SEQ ID NO: 98)、YPGRNPD (SEQ ID NO: 99)、ISDTRIS (SEQ ID NO: 100)、ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)、LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)、VSNPLNQ (SEQ ID NO: 104)、LNERGLG (SEQ ID NO: 105)、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)、VGHAGNP (SEQ ID NO: 107)、SRAGTVP (SEQ ID NO: 108)、GLVAKLP (SEQ ID NO: 109)及AESLRTP (SEQ ID NO: 110)。在一些實施例中，肽選自由以下組成之群：MTLTRQE (SEQ ID NO: 90)、TSNSRTE (SEQ ID NO: 91)、EVRGGPS (SEQ ID NO: 92)、VISDRSS (SEQ ID NO: 93)、PRDTFNG (SEQ ID NO: 94)、RPLTAND (SEQ ID NO: 95)、PLRMVNE (SEQ ID NO: 96)、DVGIRPS (SEQ ID NO: 97)、KDSTAFG (SEQ ID NO: 98)、YPGRNPD (SEQ ID NO: 99)、ISDTRIS (SEQ ID NO: 100)、ENFSKVA (SEQ ID NO: 101)、RDALSGLRPE (SEQ ID NO: 102)、LGNGKMTVQP (SEQ ID NO: 103)、VSNPLNQ (SEQ ID NO: 104)、LNERGLG (SEQ ID NO: 105)、GRNTVGLSSA (SEQ ID NO: 106)、VGHAGNP (SEQ ID NO: 107)、SRAGTVP (SEQ ID NO: 108)、GLVAKLP (SEQ ID NO: 109)及AESLRTP (SEQ ID NO: 110)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：QGALAQV (SEQ ID NO: 8)、YPSSNTP (SEQ ID NO: 9)、MLNPRTE (SEQ ID NO: 10)及QMRTRDE (SEQ ID NO: 11)。在一些實施例中，肽選自由以下組成之群：QGALAQV (SEQ ID NO: 8)、YPSSNTP (SEQ ID NO: 9)、MLNPRTE (SEQ ID NO: 10)及QMRTRDE (SEQ ID NO: 11)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：PYASITG (SEQ ID NO: 76)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、TDFRSPQ (SEQ ID NO:80)、MYSLMKD (SEQ ID NO:81)、LYLSSAS (SEQ ID NO: 82)、YGSRSVD (SEQ ID NO:83)、LYSHQVS (SEQ ID NO: 84)及ISTHSPP (SEQ ID NO: 85)。在一些實施例中，肽選自由以下組成之群：PYASITG (SEQ ID NO: 76)、TGAFSST (SEQ ID NO: 77)、EQFRNLA (SEQ ID NO: 78)、FNSPVIQ (SEQ ID NO: 79)、TDFRSPQ (SEQ ID NO:80)、MYSLMKD (SEQ ID NO:81)、LYLSSAS (SEQ ID NO: 82)、YGSRSVD (SEQ ID NO:83)、LYSHQVS (SEQ ID NO: 84)及ISTHSPP (SEQ ID NO: 85)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：MPGRAPI (SEQ ID NO: 12)、LGRLTAN (SEQ ID NO: 13)、SYSTSRS (SEQ ID NO: 14)、TRPSSTN (SEQ ID NO: 15)、VPQSSSR (SEQ ID NO: 16)、VSRSYPA (SEQ ID NO: 17)及QRARPDT (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，肽選自由以下組成之群：MPGRAPI (SEQ ID NO: 12)、LGRLTAN (SEQ ID NO: 13)、SYSTSRS (SEQ ID NO: 14)、TRPSSTN (SEQ ID NO: 15)、VPQSSSR (SEQ ID NO: 16)、VSRSYPA (SEQ ID NO: 17)及QRARPDT (SEQ ID NO: 18)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：RQPTTIP (SEQ ID NO: 86)、RSTSSLL (SEQ ID NO: 87)、FRLSSPQ (SEQ ID NO: 88)及NIPKAYG (SEQ ID NO: 89)。在一些實施例中，肽選自由以下組成之群：RQPTTIP (SEQ ID NO: 86)、RSTSSLL (SEQ ID NO: 87)、FRLSSPQ (SEQ ID NO: 88)及NIPKAYG (SEQ ID NO: 89)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SQLTPHS (SEQ ID NO: 19)、LGSHLPS (SEQ ID NO: 20)、YTLSSGQ (SEQ ID NO: 21)、SSRIPPD (SEQ ID NO: 22)、WTETIPR (SEQ ID NO: 23)、HGLQGVA (SEQ ID NO: 24)、TMRVSDQ (SEQ ID NO: 25)、GSSKVVM (SEQ ID NO: 26)及SALDRGV (SEQ ID NO: 27)。在一些實施例中，肽選自由以下組成之群：SQLTPHS (SEQ ID NO: 19)、LGSHLPS (SEQ ID NO: 20)、YTLSSGQ (SEQ ID NO: 21)、SSRIPPD (SEQ ID NO: 22)、WTETIPR (SEQ ID NO: 23)、HGLQGVA (SEQ ID NO: 24)、TMRVSDQ (SEQ ID NO: 25)、GSSKVVM (SEQ ID NO: 26)及SALDRGV (SEQ ID NO: 27)。
在一些實施例中，肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：KELGTQR (SEQ ID NO: 28)、RSSDVQR (SEQ ID NO: 29)、PSAPKTF (SEQ ID NO: 30)、HTKRSEY (SEQ ID NO: 31)及IKGSNLP (SEQ ID NO: 32)。在一些實施例中，肽選自由以下組成之群：KELGTQR (SEQ ID NO: 28)、RSSDVQR (SEQ ID NO: 29)、PSAPKTF (SEQ ID NO: 30)、HTKRSEY (SEQ ID NO: 31)及IKGSNLP (SEQ ID NO: 32)。
本文亦揭示包含如本文所揭示之插入肽的AAV衣殼蛋白。在一些實施例中，衣殼蛋白為VP1、VP2或VP3。在一些實施例中，肽插入衣殼蛋白之殘基450與600之間的位置處。在一些實施例中，肽插入(i) AAV1衣殼蛋白之位置590，(ii) AAV6衣殼蛋白之位置454或590，(iii) AAV2衣殼蛋白之位置588，(iv) AAV3B衣殼蛋白之位置589，(v) AAV5衣殼蛋白之位置578，(vi) AAV8衣殼蛋白之位置591，或(vii) AAV9衣殼蛋白之位置266、455或589，其中位置對應於AAV血清型中VP1之編號。在一些實施例中，肽插入AAV1衣殼蛋白之位置590處。在一些實施例中，肽插入AAV6衣殼蛋白之位置454或590處。在一些實施例中，肽插入AAV2衣殼蛋白之位置588處。在一些實施例中，肽插入AAV3B衣殼蛋白之位置589處。在一些實施例中，肽插入AAV5衣殼蛋白之位置578處。在一些實施例中，肽插入AAV8衣殼蛋白之位置591處。在一些實施例中，肽插入AAV9衣殼蛋白之位置266、455或589處。應理解，可選擇衣殼蛋白中之其他位點用於插入。亦應理解，胺基酸序列可插入VP2或VP3之對應位置處。
本文亦揭示編碼本文所揭示之肽的核酸序列。
另外，本文揭示包含本文所揭示之插入肽的AAV載體。在一些實施例中，肽為AAV載體之衣殼蛋白的一部分。
在一些實施例中，本發明之插入肽具有針對目標細胞或組織之細胞或組織向性。在一些實施例中，目標細胞或組織包括但不限於來自以下各者之細胞：CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴或口腔黏膜。在一些實施例中，目標細胞或組織來自肝臟。在一些實施例中，目標細胞或組織來自CNS。在一些實施例中，目標細胞包括但不限於神經元、膠細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞、室管膜細胞、肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞、肝內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。
包含本發明之插入肽的載體可用於將核酸遞送至目標細胞或組織。在一個態樣中，本發明提供將核酸遞送至目標細胞或組織的方法，其包含投與包含核酸之AAV載體，其中AAV載體包含本發明之靶向蛋白。在一些實施例中，目標細胞或組織包括但不限於來自以下各者之細胞：CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴或口腔黏膜。在一些實施例中，目標細胞或組織來自肝臟。在一些實施例中，目標細胞或組織來自CNS。在一些實施例中，目標細胞包括但不限於神經元、膠細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞、室管膜細胞、肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞、肝內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。 DNA結合分子/域
本文描述包含特異性結合於任何所關注基因或基因座中之目標位點之DNA結合分子/域的組合物。任何DNA結合分子/域可用於本文揭示之組合物及方法，包括但不限於鋅指DNA結合域、TALE DNA結合域、CRISPR/Cas核酸酶之DNA結合部分(導引或sgRNA)或來自大範圍核酸酶之DNA結合域。在本文所述之方法及組合物中，應理解，術語「Cas」包括Cas9及Cfp1蛋白兩者。因此，如本文所用，「CRISPR/Cas系統」係指CRISPR/Cas及/或CRISPR/Cfp1系統，包括核酸酶、切口酶及/或轉錄因子系統。
在一些實施例中，可使用其他Cas蛋白。一些例示性Cas蛋白包括Cas9、Cpf1 (亦稱為Cas12a)、C2c1、C2c2 (亦稱為Cas13a)、C2c3、Cas1、Cas2、Cas4、CasX及CasY；且包括其工程化及天然變異體(Burstein等人 (2017)Nature 542:237-241)，例如HF1/spCas9 (Kleinstiver等人 (2016)Nature 529: 490-495；Cebrian-Serrano及Davies (2017)Mamm Genome (2017) 28(7):247-261)；分裂Cas9系統(Zetsche等人 (2015)Nat Biotechnol 33(2):139-142)、基於內含肽-外顯肽系統之反式剪接Cas9 (Troung等人 (2015)Nucl Acid Res 43(13):6450-8)；mini-SaCas9 (Ma等人 (2018)ACS Synth Biol 7(4):978-985)。因此，在本文所述之方法及組合物中，應理解，術語「Cas」包括所有Cas變異蛋白質(天然及工程化)。因此，如本文所用，「CRISPR/Cas系統」係指任何CRISPR/Cas系統，包括核酸酶、切口酶及/或轉錄因子系統。 系統
本文所述之DNA編輯複合物(或其組分分子)可藉由如本文所述之方法及組合物遞送至目標細胞。遞送可為遞送至經分離細胞(其轉而可向活的個體投與，以用於離體細胞療法)或活的個體。將基因編輯分子遞送至細胞及個體為此項技術中已知的。
適合之細胞包括但不限於真核及原核細胞及/或細胞株。此類細胞或由此類細胞產生之細胞株之非限制性實例包括T細胞、COS、CHO (例如CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293 (例如HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)及perC6細胞，以及昆蟲細胞，諸如草地貪夜蛾(Spodoptera fugiperda ，Sf)，或真菌細胞，諸如酵母屬(Saccharomyces )、畢赤酵母屬(Pichia )及裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces )。在某些實施例中，細胞株為CHO-K1、MDCK或HEK293細胞株。適合之細胞亦包括幹細胞，諸如胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞(iPS細胞)、造血幹細胞、神經元幹細胞及間葉幹細胞。
如本文所述之DNA編輯複合物亦可使用含有編碼組分(例如融合分子)中之一或多者之序列的本發明載體來遞送。另外，亦可經由此等載體遞送額外核酸(例如供體)。此外，將顯而易見的是此等載體中之任一者可按需要包含一或多個DNA結合蛋白編碼序列及/或額外核酸。因此，當一或多種如本文所述之DNA結合蛋白及額外DNA按需要引入至細胞中時，其可在相同載體或不同載體上進行。當使用多個載體時，各載體可視需要包含編碼一或多種DNA結合蛋白及額外核酸之序列。習知基於病毒及非病毒之基因轉移方法可用於在細胞(例如哺乳動物細胞)及目標組織中引入編碼工程化DNA結合蛋白之核酸及視需要共引入額外核苷酸序列。此類方法亦可用於將核酸活體外投與(例如編碼DNA結合蛋白及/或供體)至細胞。在某些實施例中，投與核酸以用於活體內或離體基因療法用途。
封裝細胞用於形成能夠感染宿主細胞之病毒粒子。此類細胞包括HEK293細胞，其封裝腺病毒或AAV。基因療法中所用之病毒載體通常由將核酸載體封裝於病毒顆粒中之生產細胞株產生。載體通常含有封裝及後續整合至宿主(若可行)中所需之最少病毒序列，其他病毒序列經編碼待表現之蛋白質之表現卡匣置換。遺漏病毒功能係由封裝細胞株以反式供應。例如基因療法中所用之AAV載體通常僅具有來自AAV基因組之反向末端重複(ITR)序列，其為封裝及整合至宿主基因組中所需。將病毒DNA封裝於含有編碼其他AAV基因(亦即rep及cap)但缺乏ITR序列之輔助質體之細胞株中。細胞株亦感染有腺病毒作為輔助體。輔助病毒促進AAV載體複製及由輔助質體進行之AAV基因表現。由於缺乏ITR序列，故不大量封裝輔助質體。腺病毒污染可藉由例如相比於AAV而言腺病毒更對其具有敏感性之熱治療來減少。在一些實施例中，桿狀病毒系統用於產生AAV (參見例如Smith等人 (2009)Mol Ther 434:37-54)。
在許多基因療法應用中，需要在針對特定組織類型之高程度特異性的情況下遞送基因療法載體。因此，病毒載體可藉由將配位體表現為在病毒之外表面上具有病毒外殼蛋白之融合蛋白而經修飾，以對於給定細胞類型具有特異性。配位體經選擇以對於已知存在於所關注細胞類型上之受體具有親和力。例如，Han等人 (1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751報導莫洛尼鼠類白血病病毒可經修飾以表現與gp70融合之人類調蛋白，且重組病毒感染表現人類表皮生長因子受體之某些人類乳癌細胞。此原理可擴展至其他病毒-目標細胞對，其中目標細胞表現受體且病毒表現包含用於細胞表面受體之配位體的融合蛋白。例如，絲狀噬菌體可經工程化以呈現對於幾乎任何所選細胞受體具有特異性結合親和力之抗體片段(例如FAB或Fv)。儘管以上描述主要適用於病毒載體，但相同原理可適用於非病毒載體。此類載體可經工程化以含有有利於經特定目標細胞吸收之特定吸收序列。
用於CRISPR/Cas系統之遞送方法可包含上文所述之彼等方法。例如，在動物模型中，活體外轉錄之Cas編碼mRNA或重組Cas蛋白可使用玻璃針直接注入至基因組編輯動物之單細胞期胚胎中。為了活體外表現細胞中之Cas及導引RNA，通常經由脂質體轉染或電穿孔將編碼其之質體轉染至細胞中。另外，重組Cas蛋白可與活體外轉錄之導引RNA複合，其中Cas-導引RNA核糖核蛋白經所關注細胞吸收(Kim等人 (2014)Genome Res 24(6):1012)。出於治療目的，可藉由病毒及非病毒技術之組合來遞送Cas及導引RNA。例如，編碼Cas之mRNA可經由奈米粒子遞送來遞送，而導引RNA及任何所需轉殖基因或修復模板係經由AAV遞送(Yin等人 (2016)Nat Biotechnol 34(3):328)。
基因療法載體可藉由向個別患者(個體)投與，通常藉由全身投與(例如靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下或顱內輸注)或局部施用而活體內遞送，如下文所述。或者，載體可離體遞送至細胞，諸如自個別患者外植之細胞(例如淋巴細胞、骨髓抽出物、組織切片)或通用供體造血幹細胞，之後通常在針對已併入載體之細胞選擇之後將細胞再植入患者中。
用於診斷、研究、移植或用於基因療法(例如經由將經轉染細胞再輸注至宿主生物體中)之離體細胞轉染為熟習此項技術者所熟知。在一些實施例中，細胞自主體生物體分離，經DNA結合蛋白核酸(基因或cDNA)轉染，且再輸注返回至主體生物體(例如患者)中。適合於離體轉染之各種細胞類型已為熟習此項技術者所熟知(參見例如Freshney等人, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (第3版 1994))及其中所引用的關於如何自患者分離及培養細胞之論述的參考文獻)。
在一個實施例中，幹細胞在離體程序中用於細胞轉染及基因療法。使用幹細胞之優勢為其可活體外分化為其他細胞類型，或可引入至其將在骨髓中移植之哺乳動物(諸如細胞供體)中。使用諸如GM-CSF、IFN-γ及TNF-α之細胞介素將CD34+細胞活體外分化為臨床上重要的免疫細胞類型之方法為已知的(參見Inaba等人 (1992)J. Exp. Med. 176:1693-1702)。
含有治療DNA結合蛋白(或編碼此等蛋白質之核酸)的如本文所述之載體亦可直接投與至生物體，用於活體內轉導細胞。投與係藉由通常用於使分子與血液或組織細胞最終接觸之途徑中之任一者，包括但不限於注射、輸注、局部施用及電穿孔。投與此類核酸之適合方法為熟習此項技術者可用及熟知的，且儘管超過一種途徑可用於投與特定組合物，但特定途徑可通常提供比另一途徑更直接且更有效的反應。
醫藥學上可接受之載劑部分藉由所投與之特定組合物以及藉由投與組合物使用之特定方法決定。因此，存在多種可用的醫藥組合物之適合調配物，如下文所述(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, 1989)。
如上所指出，所揭示方法及組合物可用於任何類型之細胞，包括但不限於任何類型之原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞，包括T細胞及幹細胞。適用於蛋白質表現之細胞株為熟習此項技術者所知且包括但不限於COS、CHO (例如CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293 (例如HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)、perC6、昆蟲細胞(諸如草地貪夜蛾(Sf))，及真菌細胞(諸如酵母屬、畢赤酵母屬及裂殖酵母屬)。亦可使用此等細胞株之後代、變異體及衍生物。 應用
工程化AAV衣殼可用於活體內及離體基因療法及基因組編輯之許多不同應用。本文所揭示之AAV變異體係經由使用定向進化產生，定向進化涉及在投與後使用細胞及活體內選擇。在一些實施例中，相比於藉由包含對應親本AAV衣殼蛋白或野生型AAV之AAV病毒粒子的細胞、組織或細胞器轉導，本文所揭示之變異衣殼蛋白當存在於AAV病毒粒子中時賦予增加的細胞、組織或細胞器轉導。舉例而言，在一些實施例中，相比於包含對應親本AAV衣殼蛋白或野生型AAV衣殼蛋白之AAV病毒粒子，本文所揭示之變異衣殼蛋白當存在於AAV病毒粒子中時賦予更高效的細胞、組織或細胞器轉導，例如相比於包含親本AAV衣殼蛋白或野生型AAV之AAV病毒粒子，細胞、組織或細胞器吸收更多包含變異AAV衣殼蛋白之AAV病毒粒子。在一些此類實施例中，相比於藉由野生型AAV病毒粒子或包含對應親本AAV衣殼蛋白之rAAV的細胞、組織或細胞器轉導，AAV變異病毒粒子或變異rAAV展現細胞、組織或細胞器轉導之至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或大於50倍增加。在一些實施例中，細胞或組織包括但不限於來自以下各者之細胞或組織：CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴或口腔黏膜。在一些實施例中，細胞或組織來自肝臟。在一些實施例中，細胞或組織來自CNS。在一些實施例中，目標細胞包括但不限於神經元、膠細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞、室管膜細胞、肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞、肝內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。在一些實施例中，相比於藉由野生型AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8或AAV9病毒粒子之細胞、組織或細胞器轉導，AAV變異病毒粒子或變異rAAV展現細胞、組織或細胞器轉導之至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或大於1000倍增加。在某些此類實施例中，相比於包含對應親本AAV衣殼蛋白或野生型AAV衣殼蛋白之AAV病毒粒子，本文所揭示之變異衣殼蛋白當存在於AAV病毒粒子中時賦予更廣泛的靈長類動物CNS細胞轉導。在一些實施例中，變異AAV病毒粒子轉導未經包含對應親本AAV衣殼蛋白之病毒粒子轉導的細胞類型，且因此相比於對應親本AAV病毒粒子轉導CNS中更多的細胞類型。在一些實施例中，AAV變異病毒粒子優先轉導CNS細胞，例如rAAV病毒粒子以相比於另一細胞的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或大於50倍特異性感染CNS細胞。在一些實施例中，經轉導之CNS細胞為神經元或膠細胞，包括但不限於星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞或室管膜細胞。
在某些此類實施例中，相比於包含對應親本AAV衣殼蛋白或野生型AAV衣殼蛋白之AAV病毒粒子，本文所揭示之變異衣殼蛋白當存在於AAV病毒粒子中時賦予更廣泛的靈長類動物肝細胞轉導。在一些實施例中，變異AAV病毒粒子轉導未經包含對應親本AAV衣殼蛋白之病毒粒子轉導的細胞類型，且因此相比於對應親本AAV病毒粒子轉導肝臟中更多的細胞類型。在一些實施例中，AAV變異病毒粒子優先轉導肝細胞，例如rAAV病毒粒子以相比於另一細胞的2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或大於50倍特異性感染肝細胞。在一些實施例中，經轉導之肝細胞為(但不限於)肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞或肝內皮細胞。
可藉由此項技術中任何數目的用於量測基因表現之方法在活體外或活體內容易地評估CNS或肝細胞轉導的增加，例如轉導效率增加、更廣泛轉導、更優先轉導等。舉例而言，AAV可封裝有含有包含報導基因(例如螢光蛋白)之表現卡匣的基因組，處於普遍存在的或細胞類型及/或組織特異性啟動子的控制下或以可操作方式連接於該啟動子，且藉由以例如螢光顯微法偵測螢光蛋白來評估轉導程度。作為另一實例，AAV可封裝有包含帶條形碼的核酸序列之基因組，且藉由以例如PCR偵測核酸序列來評估轉導程度。作為另一實例，AAV可封裝有含有包含用於治療疾病之治療性基因之表現卡匣的基因組，且藉由偵測投與該AAV之需要治療之個體的疾病治療來評估轉導程度。
可藉由本文所述之組合物及方法治療及/或預防之例示性遺傳疾病包括但不限於軟骨發育不全、色盲、酸性麥芽糖酶缺乏症、腺苷脫胺酶缺乏症(OMIM編號102700)、腎上腺腦白質營養不良、艾卡迪症候群(aicardi syndrome)、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、α-地中海貧血症、雄激素不敏感症候群、阿帕特症候群(apert syndrome)、致心律失常性右室發育不良、毛細血管擴張性共濟失調、巴特症候群(barth syndrome)、β-地中海貧血症、藍色橡皮皰痣症候群、卡納萬氏病(canavan disease)、慢性肉芽腫病(CGD)、貓叫症候群(cri du chat syndrome)、囊腫性纖維化、德爾肯氏病(dercum's disease)、外胚層發育不良、范康尼氏貧血(fanconi anemia)、進行性骨化性纖維發育不良、X脆折症候群、半乳糖血症、高歇氏病(Gaucher's disease)、全身型神經節苷脂貯積病(例如GM1)、血色沉著病、β-血球蛋白之第6密碼子中之血紅蛋白C突變(HbC)、血友病、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、賀勒侯症群(Hurler Syndrome)、低磷酸酶症、克氏症候群(Klinefelter syndrome)、克拉貝氏病(Krabbes Disease)、蘭-吉二氏症候群(Langer-Giedion Syndrome)、白血球黏著缺乏症(LAD，OMIM編號116920)、腦白質營養不良、長QT症候群、馬凡氏症候群(Marfan syndrome)、牟比士症候群(Moebius syndrome)、黏多糖病(MPS)、甲髕症候群、腎原性尿崩症、神經纖維瘤、尼曼-匹克病(Neimann-Pick disease)、成骨不全、苯酮尿症(PKU)、卟啉症、普拉德-威利症候群(Prader-Willi syndrome)、早老症、普洛提斯症候群(Proteus syndrome)、視網膜母細胞瘤、雷特氏症候群(Rett syndrome)、魯-泰二氏症候群(Rubinstein-Taybi syndrome)、聖菲利波症候群(Sanfilippo syndrome)、嚴重複合免疫缺乏症(SCID)、舒瓦克曼症候群(Shwachman syndrome)、鐮狀細胞疾病(鐮狀細胞貧血)、史-馬二氏症候群(Smith-Magenis syndrome)、斯蒂克勒症候群(Stickler syndrome)、泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease)、血小板減少橈骨缺失(TAR)症候群、崔契爾柯林斯症候群(Treacher Collins syndrome)、三染色體症、結節性硬化症、特納氏症候群(Turner's syndrome)、尿素循環障礙、逢希伯-蘭道病(von Hippel-Landau disease)、瓦登伯革氏症候群(Waardenburg syndrome)、威廉姆斯症候群(Williams syndrome)、威爾森氏病(Wilson's disease)、韋-奧氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、X性聯淋巴增生症候群(XLP，OMIM編號308240)。
可藉由靶向DNA鹼基編輯治療之額外例示性疾病包括獲得性免疫缺乏症、溶酶體貯積病(例如高歇氏病(Gaucher's disease)、GM1、法布立病(Fabry disease)及泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease))、黏多糖病(例如亨特氏病(Hunter's disease)、赫爾勒氏病(Hurler's disease))、血紅素病(例如鐮狀細胞疾病、HbC、α-地中海貧血症、β-地中海貧血)及血友病。
此類方法亦允許治療宿主感染(病毒性或細菌性)(例如藉由阻斷病毒或細菌受體之表現，由此預防宿主生物體中之感染及/或擴散)。可靶向之病毒或病毒受體之非限制性實例包括單純疱疹病毒(HSV)(諸如HSV-1及HSV-2)、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)及細胞巨大病毒(CMV)、HHV6及HHV7。肝炎病毒家族包括A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、D型肝炎病毒(HDV)、E型肝炎病毒(HEV)及G型肝炎病毒(HGV)。可靶向之其他病毒或其受體包括但不限於小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰白質炎病毒等)；杯狀病毒科(Caliciviridae)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如風疹病毒、登革病毒等)；黃病毒科(Flaviviridae)；冠狀病毒科(Coronaviridae)；呼腸孤病毒科(Reoviridae)；雙股核醣酸病毒科(Birnaviridae)；彈狀病毒科(Rhabodoviridae)(例如狂犬病病毒等)；絲狀病毒科(Filoviridae)；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(例如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等)；正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如A、B及C型流感病毒等)；布尼亞病毒科(Bunyaviridae)；沙粒病毒科(Arenaviridae)；逆轉錄病毒科(Retroviradae)；慢病毒(例如HTLV-I、HTLV-II；HIV-1 (亦稱為HTLV-III、LAV、ARV、hTLR等)、HIV-II)；猿猴免疫缺乏病毒(SIV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、流感病毒及蜱傳腦炎病毒。關於此等及其他病毒之描述，參見例如Virology, 第3版 (W. K. Joklik編 1988)；Fundamental Virology, 第2版 (B. N. Fields及D. M. Knipe編 1991)。HIV受體例如包括CCR-5及CXCR-4。
由主體AAV變異體遞送之基因產物可用於改變與肌肉疾病及創傷直接或間接關聯之基因產物水準或基因產物活性。經主體AAV變異體轉導之骨骼肌、心肌或平滑肌亦可用作生物工廠，以產生及分泌治療蛋白，用於在遠端器官中以反式治療疾病。基因產物與遺傳疾病直接或間接關聯之基因包括例如編碼以下基因產物中之任一者之基因：肌縮蛋白，包括小型及微型肌縮蛋白(DMD；例如GenBank寄存編號NP 003997.1)；肌聯蛋白(TTN)；肌聯蛋白帽(TCAP) cc-肌聚糖(SGCA)、β-肌聚糖(SGCB)、γ-肌聚糖(SGCG)或δ-肌聚糖(SGCD)；α-1-抗胰蛋白酶(Al-AT)；肌凝蛋白重鏈6 (MYH6)；肌凝蛋白重鏈7 (MYH7)；肌凝蛋白重鏈11 (MYH11)；肌凝蛋白輕鏈2 (ML2)；肌凝蛋白輕鏈3 (ML3)；肌凝蛋白輕鏈激酶2 (MYLK2)；肌凝蛋白結合蛋白C (MYBPC3)；肌間線蛋白(DES)；發動蛋白2 (DNM2)；層黏連蛋白cc2 (LAMA2)；核纖層蛋白A/C (LMNA)；核纖層蛋白B (LMNB)；核纖層蛋白B受體(LBR)；質膜修復蛋白(dysferlin，DYSF)；伊默菌素(emerin，EMD)；胰島素；凝血因子，包括但不限於因子VIII及因子IX；紅血球生成素(EPO)；脂蛋白脂肪酶(LPL)；肌質網狀Ca2++-ATP酶(SERCA2A)、S100鈣結合蛋白Al (S100A1)；肌微管素(MTM)；DM1蛋白激酶(DMPK；例如GenBank寄存編號NG_009784.1)；肝糖磷酸化酶L (PYGL)；肌肉相關性肝糖磷酸化酶(PYGM；例如GenBank寄存編號NP 005600.1)；肝糖合酶1 (GYS1)；肝糖合酶2 (GYS2)；cc-半乳糖苷酶A (GLA；例如GenBank寄存編號NP_000160.1；SEQ ID NO: 67)；a-N-乙醯半乳糖胺酶(NAGA)；酸性cc-葡糖苷酶(GAA；例如Genbank寄存編號NP_000143.2；SEQ ID NO: 68)、神經磷脂酶磷酸二酯酶1 (SMPD1)；溶酶體酸脂肪酶(LIP A)；膠原蛋白I型al鏈(COL1 Al)；膠原蛋白I型o2鏈(COL1A2)；膠原蛋白III型al鏈(COL3A1)；膠原蛋白V類型al鏈(COL5A1)；膠原蛋白V類型a2鏈(COL5A2)；膠原蛋白VI型al鏈(COL6A1)；膠原蛋白VI型o2鏈(COL6A2)；膠原蛋白VI型a3鏈(COL6A3)；原膠原-離胺酸2-側氧基戊二酸酯5-雙加氧酶(PLOD1)；溶酶體酸脂肪酶(LIP A)；共濟蛋白(FXN；例如Genbank寄存編號NP_000135.2)；肌肉抑制素(MSTN)；β-Ν-乙醯基己糖苷酶A (HEXA)；β-Ν-乙醯基己醣胺酶B (HEXB)；β-葡糖腦苷脂酶(GBA)；單磷酸腺苷脫胺酶1 (AMPD1)；β-血球蛋白(HBB)；艾杜糖苷(IDUA)；2-硫酸艾杜糖醛(IDS)；肌鈣蛋白1 (TNNI3)；肌鈣蛋白T2(TNNT2)；肌鈣蛋白C (TNNC1)；肌旋蛋白1 (TPM1)；肌旋蛋白3 (TPM3)；N-乙醯基-a-胺基葡糖苷酶(NAGLU)；N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)；乙醯肝素-a-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶(HGSNAT)；整合素a7 (IGTA7)；整合素a9 (IGTA9)；葡糖胺(N-乙醯基)-6-硫酸酯酶(GNS)；半乳胺糖(N-乙醯基)-6-硫酸酯酶(GALNS)；β-半乳糖苷酶(GLB1)；β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)；玻尿酸胺基葡糖苷酶1 (HYALl)；酸性神經醯胺酶(ASAHl)；半乳糖神經醯胺酶(GALC)；組織蛋白酶A (CTSA)；組織蛋白酶D (CTSA)；組織蛋白酶K (CTSK)；GM2神經節苷脂活化劑(GM2A)；芳基硫酸酯酶A (ARSA)；芳基硫酸酯酶B (ARSB)；甲醯基甘胺酸生成酶(SUMF1)；神經胺糖酸酶1 (NEU1)；N-乙醯葡糖胺-1-磷酸酯轉移酶a (GNPTA)；N-乙醯葡糖胺-1-磷酸酯轉移酶β (GNPTB)；N-乙醯葡糖胺-1-磷酸酯轉移酶γ (GNPTG)；黏脂蛋白-1 (MCOLN1)；NPC細胞內轉運體1 (NPC1)；NPC細胞內轉運體2 (NPC2)；蠟樣質脂褐質沈積症5 (CLN5)；蠟樣質脂褐質沈積症6 (CLN6)；蠟樣質脂褐質沈積症8 (CLN8)；棕櫚醯基蛋白質硫酯酶1 (PPT1)；三肽基肽酶1 (TPP1)；battenin (CLN3)；DNAJ熱休克蛋白家族40成員C5 (DNAJC5)；主要易化子超家族域包含8 (MFSD8)；甘露糖苷酶a 2B類成員1 (MAN2B1)；甘露糖苷酶β (MANBA)；天冬胺醯葡糖胺苷酶(AGA)；cc-L-岩藻糖苷酶(FUCA1)；胱氨酸素，溶酶體半胱氨酸轉運體(cystinosin，CTNS)；唾液酸轉運蛋白；溶質載體家族2成員10 (SLC2A10)；溶質載體家族17成員5 (SLC17A5)；溶質載體家族6成員19 (SLC6A19)；溶質載體家族22成員5 (SLC22A5)；溶質載體家族37成員4 (SLC37A4)；溶酶體相關膜蛋白2 (LAMP2)；鈉電壓閘控通道a次單位4 (SCN4A)；鈉電壓閘控通道β次單位4 (SCN4B)；鈉電壓閘控通道a次單位5 (SCN5A)；鈉電壓閘控通道a次單位4 (SCN4A)；鈣電壓閘控通道次單位ale (CACNA1C)；鈣電壓閘控通道次單位eels (CACNA1S)；磷酸甘油酸激酶1 (PGK1)；磷酸甘油酸變位酶2 (PGAM2)；澱粉-a-l,6-葡糖苷酶,4-cc-葡聚糖轉移酶(AGL)；鉀電壓閘控通道ISK相關子族成員1 (KCNE1)；鉀電壓閘控通道ISK相關子族成員2 (KCNE2)；鉀電壓閘控通道子族J成員2 (KCNJ2)；鉀電壓閘控通道子族J成員5 (KCNJ5)；鉀電壓閘控通道子族H成員2 (KCNH2)；鉀電壓閘控通道KQT樣子族成員1 (KCNQ1)；超極化活化環狀核苷酸閘控鉀通道4 (HCN4)；氯離子電壓閘控通道1 (CLCN1)；肉鹼棕櫚醯基轉移酶1 A (CPT1 A)；利阿諾定(ryanodine)受體1 (RYR1)；利阿諾定受體2 (RYR2)；橋接積分器1 (BIN1)；LARGE木糖基及葡萄糖醛酸基轉移酶1 (LARGE1)；對接蛋白7 (DOK7)；fukutin (FKTN)；fukutin相關蛋白(FKRP)；硒蛋白N (SELENON)；蛋白質O-甘露糖基轉移酶1 (POMT1)；蛋白質O-甘露糖基轉移酶2 (POMT2)；蛋白質O-鍵聯甘露糖N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶1 (POMGNT1)；蛋白質O-鍵聯甘露糖N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶2 (POMGNT2)；蛋白質-O-甘露糖激酶(POMK)；類異戊二烯合酶域含有(ISPD)；網蛋白(PLEC)；膽鹼能受體菸鹼ε次單位(CHRNE)；膽鹼O-乙醯轉移酶(CHAT)；膽鹼激酶β (CHKB)；不對稱乙醯膽鹼酯酶之膠原蛋白樣尾次單位(COLQ)；突觸之受體相關蛋白(RAPSN)；四個半LIM域1 (FHLl)；β-1,4-葡萄糖醛酸基轉移酶1 (B4GAT1)；β-1-N-乙醯基半乳糖胺基轉移酶2 (B3GALNT2)；營養不良聚糖蛋白1 (DAG1)；跨膜蛋白5 (TMEM5)；跨膜蛋白43 (TMEM43)；SECIS結合蛋白2 (SECISBP2)；葡糖胺(UDP-N-乙醯基)-2-表異構酶/N-乙醯甘露糖胺激酶(GNE)；anoctamin 5 (AN05)；結構維持染色體可撓性鉸鏈域含有1 (SMCHD1)；乳酸脫氫酶A (LDHA)；乳酸脫氫酶B (LHDB)；鈣蛋白酶3 (CAPN3)；窖蛋白3 (CAV3)；三聯基元含有32 (TRIM32)；CCHC型鋅指核酸結合蛋白(CNBP)；伴肌動蛋白(NEB)；肌動蛋白，ccl，骨胳肌(ACTA1)；肌動蛋白，ccl，心肌(ACTC1)，輔肌動蛋白cc2 (ACTN2)；poly(A)結合蛋白核1 (PABPNl)；含LEM域蛋白3 (LEMD3)；鋅金屬蛋白酶STE24 (ZMPSTE24)；微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTTP)；膽鹼能受體菸鹼ccl次單位；生育酚轉移酶蛋白(TTPA)；驅動蛋白家族成員21 A (KIF21 A)；配對樣同源盒2a (PHOX2A)；硫酸乙醯肝素蛋白聚糖2 (HSPG2)；基質相互作用分子1 (STIM1)；notch 1 (NOTCH1)；notch 3 (NOTCH3)；小肌營養蛋白a (DTNA)；蛋白激酶AMP活化，非催化j2 (PRKAG2)；富半胱胺酸及甘胺酸蛋白3 (CSRP3)；黏著斑蛋白(VCL)；雷帕黴素靶蛋白2 (MyoZ2)；肌鈀蛋白(MYPN)；連接蛋白2 (JPH2)；受磷蛋白(PLN)；鈣網蛋白3 (CALR3)；連接蛋白F-肌動蛋白-結合蛋白(NEXN)；LIM域結合3 (LDB3)；無眼4 (EYA4)；亨廷頓蛋白(HTT)；雄激素受體(AR)；蛋白質酪胺酸磷酸酯非受體11型(PTPNl l)；連接斑珠蛋白(JUP)；橋粒斑蛋白(DSP)；橋粒斑菲素蛋白2 (PKP2)；橋粒芯蛋白2 (DSG2)；橋粒膠蛋白2 (DSC2)；連環蛋白cc3 (CTNNA3)；NK2同源盒5 (NKX2-5)；A-激酶錨定蛋白9 (AKAP9)；A-激酶錨定蛋白10 (AKAP10)；鳥嘌呤核苷酸-結合蛋白a-抑制活性多肽2 (GNAI2)；錨蛋白2 (ANK2)；syntropbin cc-1 (SNTA1)；調鈣蛋白1 (CALM1)；調鈣蛋白2 (CALM2)；HTRA絲胺酸肽酶1 (HTRA1)；原纖維蛋白1 (FBN1)；原纖維蛋白2 (FBN2)；木糖基轉移酶1 (XYLT1)；木糖基轉移酶2 (XYLT2)；tafazzin (TAZ)；尿黑酸1,2-雙加氧酶(HGD)；葡萄糖-6-磷酸酶催化次單位(G6PC)；1,4-α-葡聚糖酶1 (GBEl)；磷酸果糖激酶，肌肉(PFKM)；磷酸化酶激酶調節次單位α1 (PHKA1)；磷酸化酶激酶調節次單位α2 (PHKA2)；磷酸化酶激酶調節次單位β (PHKB)；磷酸化酶激酶催化次單位γ2 (PHKG2)；磷酸甘油酸變位酶2 (PGAM2)；胱硫醚-β-合酶(CBS)；亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)；5-甲基四氫葉酸-高半胱胺酸甲基轉移酶(MTR)；5-甲基四氫葉酸-高半胱胺酸甲基轉移酶還原酶(MTRR)；甲基丙二酸尿症及高胱胺酸尿症，cblD型(MMADHC)；粒線體DNA，包括但不限於粒線體編碼之NADH:泛醌氧化還原酶核次單位1 (MT-ND1)；粒線體編碼之NADH:泛醌氧化還原酶核次單位5 (MT-ND5)；粒線體編碼之tRNA麩胺酸(MT-TE)；粒線體編碼之tRNA組胺酸(MT-TH)；粒線體編碼之tRNA白胺酸1 (MT-TLl)；線粒體編碼之tRNA離胺酸(MT-TK)；線粒體編碼之tRNA絲胺酸1 (MT-TS1)；線粒體編碼之tRNA纈胺酸(MT-TV)；促分裂原活化蛋白激酶1 (MAP2K1)；B-Raf原癌基因，絲胺酸/蘇胺酸激酶(BRAF)；raf-1原癌基因，絲胺酸/蘇胺酸激酶(RAF1)；生長因子，包括但不限於胰島素生長因子1 (IGF-1)；轉型生長因子β3 (TGF 3)；轉型生長因子β受體，I型(TGF Rl)；轉型生長因子β受體，II型(TGF R2)、纖維母細胞生長因子2 (FGF2)、纖維母細胞生長因子4 (FGF4)、血管內皮生長因子A (VEGF-A)、血管內皮生長因子B (VEGF-B)；血管內皮生長因子C (VEGF-C)、血管內皮生長因子D (VEGF-D)、血管內皮生長因子受體1 (VEGFR1)及血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)；介白素；免疫黏附素；細胞介素；及抗體。在一些實施例中，遞送編碼產物(作為免疫調節劑)之基因。例示性免疫調節基因包括細胞介素、趨化因子及對其及/或其受體具有特異性之融合蛋白或抗體，例如抗IL-6融合蛋白利納西普(Rilonacept)1、補體因子H特異性抗體蘭帕米珠單抗(lampamizumab)等。
在一些實施例中，遞送編碼位點特異性核酸內切酶之基因。例示性核酸內切酶包括天然存在之限制酶及其類似物。在一些實施例中，遞送之核酸內切酶包括鋅指核酸酶、TALENs、megaTALs、大範圍核酸酶、CRISPR/Cas系統，包括Cas9、CasX、CasY及其類似物。此類位點特異性核酸酶可經工程化以切割基因組內之特定位置，且非同源末端連接可隨後修復斷裂，同時插入或缺失若干核苷酸(亦稱為「插入或缺失(INDELs)」)。此類位點特異性核酸內切酶接著將蛋白質拋出框架且有效地敲除基因。
在本文所揭示之變異rAAV載體之一些實施例中，編碼所關注基因產物之核苷酸序列可操作地連接於組成型啟動子。適合之組成型啟動子包括例如細胞巨大病毒啟動子(CMV)(Stinski等人 (1985)Journal of Virology 55(2): 431 -441)、CMV早期強化子/雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子/兔β-血球蛋白內含子(CAG) (Miyazaki等人 (1989)Gene 79(2): 269-277、CBSB (Jacobson等人 (2006)Molecular Therapy 13(6): 1074-1084)、人類延長因子la啟動子(EFI a) (Kim等人 (1990)Gene 91 (2): 217-223)、人類磷酸甘油酸激酶啟動子(PGK) (Singer-Sam等人 (1984)Gene 32(3): 409-417、粒線體重鏈啟動子(Loderio等人 (2012)Proc Natl Acad Sci USA 109(17): 6513-6518)、泛素啟動子(Wulff等人 (1990)FEBS Letters 261 : 101 -105)。在其他實施例中，編碼所關注基因產物之核苷酸序列可操作地連接於誘導型啟動子。在一些情況下，編碼所關注基因產物之核苷酸序列可操作地連接於組織特異性或細胞類型特異性調節元件。舉例而言，在一些情況下，編碼所關注基因產物之核苷酸序列可操作地連接於肝臟特異性調節元件(例如肝臟特異性啟動子)，例如賦予可操作地連接之基因於肝細胞中之選擇性表現的調節元件。適合之肝臟特異性調節元件包括例如白蛋白啟動子、α1-抗胰蛋白酶及甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)。在一些情況下，所關注基因可操作地連接於CNS特異性啟動子或調節元件。適合之CNS特異性啟動子包括但不限於GFAP啟動子(星形膠質細胞)、SYN1啟動子(神經元)及NSE/RU5'啟動子(成熟神經元)。在一些情況下，所關注基因可操作地連接於配位體反應性啟動子或分子開關(例如TetR系統(Berens及Hillen (2003)Eur J Biochem 270: 3109-3121)。
如上所指出，本文所述之組合物及方法可用於基因修飾、基因校正及基因破壞。
本文所述之組合物及方法亦可應用於基於幹細胞之療法，包括但不限於引起以下各者之編輯：校正體細胞突變；破壞顯性陰性對偶基因；破壞病原體進入細胞或產毒性感染細胞所需的基因；增強組織工程化，例如藉由編輯促進功能組織分化或形成之基因活性；及/或破壞促進功能組織分化或形成之基因活性；阻斷或誘導分化，例如藉由編輯阻斷分化之基因，該分化促進幹細胞沿特定譜系路徑向下分化。用於此程序之細胞類型包括但不限於T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。另外，可使用誘導多能幹細胞(iPSC)，其亦將由患者自身之體細胞產生。因此，此等幹細胞或其衍生物(分化之細胞類型或組織)可不管其起源或組織相容性而潛在地移植至任何個體中。
組合物及方法亦可用於體細胞療法，從而允許產生已經修飾以增強生物特性的細胞儲備。此類細胞可獨立於細胞之供體來源及其與受體之組織相容性而輸注至多個患者中。
除了治療應用以外，本文所述之DNA編輯複合物亦可用於細胞株工程化及構築疾病模型。 實例實例 1 ：文庫構築
概述 ：本文所揭示之方法及組合物適用於設計及鑑別AAV衣殼，該等衣殼可用於多種應用，包括特異性遞送至組織、細胞或細胞器，及發現能夠避開可存在於使用AAV給藥之患者中之抗AAV中和抗體的AAV衣殼。方法描述將隨機序列(文庫)插入至AAV衣殼蛋白之外露表面環及/或高變區中之一者中，以賦予AAV新穎及/或改良之屬性。方法亦包括將隨機序列插入至許多天然存在之AAV血清型之衣殼蛋白中，產生若干用於篩選之AAV文庫。接著將此等AAV變異體之文庫注射至動物體內或用於感染細胞株。為了幫助鑑別能夠增強所需組織、細胞或細胞器之轉導的AAV變異體，AAV變異體之基因組可包含用於追蹤AAV之遞送及轉殖基因表現的螢光報導蛋白。在一些實施例中，報導蛋白連接至條形碼，該條形碼與插入至衣殼基因中之隨機序列在生物資訊學上相關。在一些實施例中，AAV文庫經受活體內選擇，其中所需組織及/或細胞中之細胞核在暴露於AAV變異文庫之後經分離。可接著經由相關條形碼之定序，或藉由來自表現報導基因之細胞之AAV有效負載核酸的純化及定序來鑑別插入序列。所選AAV核酸序列可隨後經分析以確定包含插入序列之親本AAV血清型以及確定插入胺基酸本身。方法可重複2輪、3輪或更多輪，其中自第一輪分離之AAV變異體經彙集或合成且用於注射第二組動物或另一組細胞，以進一步增強經分離AAV變異體之特異性及效能的可信度。
構築 ：藉由將肽插入至衣殼蛋白之外露環中來構築衣殼文庫。在AAV 1、2、3B、5、6、8及9之衣殼蛋白中製得包含編碼7、10或15個胺基酸肽之插入的文庫。AAV衣殼序列各自以合成方式(ATUM)製備。在插入編碼肽之序列之前，將沉默突變引入至編碼鄰近於插入位點之衣殼蛋白的區域中。以此方式，相同引子組(例如DO112_MiCap1_VRVIII_Fwd及DO113_MiCap1_VRVIII_Rev)可用於所有文庫(參見圖1)。另外，分子選殖必需之限制酶位點，包括HindIII、AgeI及BsaI係藉由沉默突變誘發來消融。下表1展示引入突變之區域中之各衣殼基因的野生型序列。突變核苷酸以黑體指示。所得序列可經保守NGS引子對擴增。
類似方法用於設計側接衣殼基因中之其他可變區或外露表面環的保守引子結合位點。合成之完整衣殼基因核苷酸序列包括以下：表 1 ： 側接 VR-VIII 插入區域之引子結合位點的沉默突變位置
衣殼 野生型正向序列 (突變核苷酸呈黑體) aa位置 野生型反向序列 (突變核苷酸呈黑體) aa位置
AAV1 TAACCCT GTGGCCACCGAA (SEQ ID NO:33) 571 GACGTG TACCTGCAGGGTCCC (SEQ ID NO:34) 612、617
AAV2 C AAT CCCGTGGCT ACG GAG (SEQ ID NO:35) 568、569、572、573、574 GAT GTG TACCTT CAGGGG CCC (SEQ ID NO:36)_ 610、611、613、615、616、617
AAV3B C AAT CCT GTGGCA ACA GAG (SEQ ID NO:37) 569、570、571、573、574、575 GACGTG TACCTT CAA GGA CCT (SEQ ID NO:38) 612、614、615、616
AAV6 TAACCCCGTGGCCACCGAA (SEQ ID NO:39) N/A GACGTATACCTGCAGGGTCCT (SEQ ID NO:40) N/A
AAV8 TAACCCT GTGGCT ACA GAG (SEQ ID NO:41) 573、575、576、577 GACGTG TACCTGCAGGGTCCC (SEQ ID NO:42) 614、619
AAV9 TAACCCG GTA GCA ACG GAG (SEQ ID NO:43) 571、572、573、574、575 GAT GTG TACCTGCAA GGA CCC (SEQ ID NO:44) 611、612、615、616、617
AAV1合成之衣殼基因(SEQ ID No: 45)
Figure 02_image001
Figure 02_image003
AAV2合成之衣殼基因(SEQ ID No: 46)
Figure 02_image005
Figure 02_image007
AAV3B合成之衣殼基因(SEQ ID No: 47)
Figure 02_image009
Figure 02_image011
AAV5合成之衣殼基因(SEQ ID No: 48)
Figure 02_image013
Figure 02_image015
AAV6合成之衣殼基因(SEQ ID No: 49)
Figure 02_image017
Figure 02_image019
AAV8合成之衣殼基因(SEQ ID No: 50)
Figure 02_image021
Figure 02_image023
AAV9合成之衣殼基因(SEQ ID No: 51)
Figure 02_image025
Figure 02_image027
例示性NGS引子選擇描繪於下表中，其中可變區以引子名稱指示。表 2 ： 用於下一代定序分析之引子
引子名稱 引子核苷酸序列(5'-3') SEQ ID NO:
DO106_MiCap1_VRI_Fwd ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNAGAGTCATCACCACCAGCACC 52
DO107_MiCap1_VRI_Rev GACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNGAAATCAAAATACCCCCAGGG 53
DO108_MiCap1_VRIV_Fwd ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNATCGACCAGTACCTGTATTACCTG 54
DO109_MiCap1_VRIV_Rev GACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNTGCCGGTAACAGGGTCCAG 55
DO112_MiCap1_VRVIII_Fwd ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNTAACCCCGTGGCCACCGAA 56
DO113_MiCap1_VRVIII_Rev GACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNAGGACCCTGCAGGTATACGTCT 57
DO319_AAV5_MiCap1_VRVIII_Fwd ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGTGAACCGCGTGGCGTACAAC 58
DO320_AAV5_MiCap1_VRVIII_Rev GACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNGGGTCCTTGGAGGTACACGTCC 59
Gibson組裝用於產生衣殼文庫，其中引入之肽係藉由用於擴增右側片段之引子編碼(參見圖2)。來自衣殼基因序列(「Cap」)之兩個PCR產物經擴增(左側及右側片段)，該等片段具有重疊區域以促進使用Gibson組裝程序組裝為質體主鏈(參見例如Gibson等人 (2009)Nat Meth 6(5):343-345)。特定言之，用於右側片段之引子(「RF Fwd」)包含隨機核苷酸序列，其編碼成為引子之一部分的插入肽。此引子亦包含編碼重疊區域之序列，因此，此右側片段擴增產物將與經擴增左側片段重疊。最後，RF Fwd引子包含與編碼衣殼之序列的右側片段具有同源性之同源性區域。
各AAV血清型之肽插入位置不同(編號開始於VP1起始密碼子)。下表2展示發生肽插入之衣殼蛋白內之胺基酸位置。應注意，在AAV6衣殼中構築兩個文庫，其中將片段插入至位置454或590中。亦應注意，基於AAV9衣殼構築三個文庫，其中將片段插入至位置266、455或589中。表 3 ：肽插入位點
血清型 插入位點 ( aa 位置 )
AAV1 590
AAV2 588
AAV3B 589
AAV5 578
AAV6 454
AAV6 590
AAV8 591
AAV9 266
AAV9 455
AAV9 589
將Gibson組裝反應轉化為電感受態大腸桿菌且純化所得質體文庫。在低轉染倍率下將質體DNA文庫轉染至HEK293細胞中，以保留衣殼基因型與表型之間的連接。
接著製造文庫以產生用於測試之病毒衣殼文庫。野生型AAV包含編碼「Rep」蛋白Rep78、Rep68、Rep52及Rep40之基因序列，該等Rep蛋白對於病毒核酸複製及在腺病毒輔助功能存在下將病毒核酸填充至病毒粒子中是必需的。本文所述之AAV文庫不含與病毒ITR及「Cap」呈順式之「Rep」，因此，為了達成將文庫有效封裝至病毒衣殼中，在病毒製造期間以反式提供複製基因(「rep」)及腺病毒輔助功能(例如E2A、E4、VA、E1A及E1B)。舉例而言，構築在病毒製造期間以反式提供Rep之輔助質體。使用以下引子自標準AAV輔助質體擴增Rep基因(NC_001401，核苷酸191-2252)：表 4 ：用於擴增 Rep 基因之引子
引子名稱 引子核苷酸序列(5'-3') SEQ ID NO:
DO7_Rep_Fwd GTACTCTAGAGTCCTGTATTAGAGGTCACGTGA 60
DO8_Rep_Rev TGCTGCATGCTGTACCGAATTAACATGTTTATTGGTACGATCAGAGAGAGTGTCCTCGAGC 61
此等引子分別添加XbaI及SphI位點且擴增整個Rep基因。擴增之Rep片段接著藉由限制消化及在pUC19之多個選殖位點與XbaI及SphI位點連接進行選殖，以產生pRepInTrans。使用以下引子藉由定點突變誘發引入額外修飾，以將VP1 ACG起始密碼子轉化為ATG，從而產生pRepInTrans-ATG。表 5 ：用於 Rep 基因修飾之引子
引子名稱 引子核苷酸序列(5'-3') SEQ ID NO:
DO444_QCRep78_Fwd ACCCCGCCATGGTGGCTGCGCGTT 62
DO445_QCRep78_Rev AACGCGCAGCCACCATGGCGGGGT 63
引入ACG至ATG之修飾以經由較大Rep78/68表現來增加衣殼構築體複製，且因此提高AAV文庫製造產率。移除Rep使得AAV為複製缺陷型，其為頻繁帶有包括單純疱疹病毒之AAV輔助病毒的非人類靈長類動物中之重要選擇特徵(參見Morton等人 (2008)ILAR J 49(2):137-44)。另外，移除Rep優於簡單的基因敲除，該基因敲除使得仍有可能與以反式提供的Rep質體重組，其可能重組複製勝任型AAV。
AAV文庫接著藉由瞬時轉染封裝於HEK293生產系統中，且使用氯化銫密度梯度超速離心純化(關於例示性製程，參見Xiao及Samulski (1998)J Virol 40:241-247)。
此技術之目標為開發可用於所有物種、組織、細胞類型及組織處理條件之方法。因此，AAV經設計以攜有上文所述之衣殼文庫，且AAV亦攜有一些類型的鑑別標記，其將單一AAV中之變異衣殼基因之序列連接至獨特條形碼標識符，以使得條形碼之後續獨立定序將鑑別連接之衣殼突變。另外，單一AAV亦將攜有一些類型之報導基因，使得可監測及選擇將AAV粒子成功遞送至其預期目標(例如器官(例如肝臟或CNS)，及器官內之特定細胞類型(例如肝細胞或神經元))。
另外，在此實例中，報導基因包括定位信號，以使得一旦細胞經變異AAV衣殼轉導，報導子便侷限於細胞核。首先，在EGFP或mCherry之N端處引入SV40大T-抗原(PKKKRKV，SEQ ID NO: 64)。第二種方法使用與EGFP或mCherry之C端融合的KASH域。KASH域將蛋白質侷限於核膜，實際上將報導子繫栓至細胞核且防止擴散出核孔複合物。第三種方法將組蛋白H2B基因融合至EGFP、mClover3或mRuby3報導子之C端(參見圖3A及B)。用於驅動螢光報導子表現之hSyn1 (突觸蛋白)啟動子選擇為對神經元中之表現具有特異性。其他啟動子可用於其他靶向組織或細胞，包括肝臟特異性甲狀腺素轉運蛋白啟動子。基本概念為使包含變異AAV衣殼之序列物理連接至目標組織、細胞或細胞器中之報導子。以此方式，目標組織、細胞或細胞器一旦經AAV粒子成功轉導便可使用螢光蛋白分離，使得使用者可接著確定何種衣殼變異體允許將AAV粒子轉導至目標組織、細胞或細胞器中。
在一些實例中，將條形碼插入至包含變異衣殼蛋白之各AAV基因組中，以使得一旦文庫通過活體內選擇，便允許使用者藉由條形碼之獨立定序分析來鑑別衣殼蛋白中之突變(參見下文)。基本概念為使包含變異AAV衣殼之序列物理連接至目標組織、細胞或細胞器中之報導子。以此方式，目標組織、細胞或細胞器一旦經AAV粒子成功轉導便可使用螢光蛋白分離，使得使用者可接著確定何種衣殼變異體允許將AAV粒子轉導至目標組織、細胞或細胞器中。在一些實例中，各肽編碼序列由全部編碼相同肽之多個不同核酸序列合成。各核酸序列連接至獨特條形碼，以使得可在兩種或更多種變異體經鑑別具有相同肽序列，但變異體包含不同的編碼該肽之核酸序列時驗證肽變異體之效能(例如富集)。
對於藉由DNA合成及後續分子選殖步驟產生之文庫，以計算方式設計所有條形碼及肽編碼序列。重要的是，省去包含將用於後續選殖之限制酶識別位點的序列。序列經設計以具有40-60% GC含量，均聚物之長度均不大於3，且序列之間的類似性(編輯距離)極小。
為了以生物資訊學方式將各條形碼與各突變衣殼序列連接，進行兩種方法。
方法1採用ILLUMINA®定序。首先，將條形碼插入至表現構築體中，如圖4A及B中所概述。為了插入條形碼序列，將5' Gibson組裝區域#1合成為與衣殼基因中之可變區連接，轉而與3' Gibson組裝區域#2連接之DNA片段(參見圖4A，步驟1)。因此，合成序列包含可變條形碼區域及可變衣殼序列。其亦包含條形碼序列與可變序列之間的兩個限制核酸酶位點。II型限制位點BsaI用於促進最終構築體之無痕組裝。進行獨立PCR程序，其中衣殼基因之3'序列經擴增(步驟2)。隨後，藉由Gibson組裝產生中間AAV構築體，其中構築體以5'至3'次序包含5' ITR、SV40 poly A信號、條形碼、兩個限制性核酸內切酶位點、變異衣殼序列、衣殼蛋白之3'區域、用於衣殼表現構築體之polyA序列及3' ITR (步驟3)。在替代方法(圖4C)中，修改步驟1-3。在步驟1中，合成兩個DNA片段。片段A包含Gibson組裝區域#1、BsaI位點、可變衣殼區域及與用作PCR引子之衣殼基因同源之區域。片段B包含Gibson組裝區域#2、隨機條形碼、BsaI位點及Gibson組裝區域#1。隨後，進行PCR程序，其中使用步驟1中合成之片段A作為PCR引子來擴增衣殼基因之3'序列。隨後，藉由Gibson組裝產生中間AAV構築體，其中構築體以5'至3'次序包含5' ITR、SV40 poly A信號、條形碼、兩個限制性核酸內切酶位點、變異衣殼序列、衣殼蛋白之3'區域、用於衣殼表現構築體之polyA序列及3' ITR (步驟3)。對於圖4A/B及4C/D中所述之方法，步驟4-7均為等同的。進行成對末端ILLUMINA®定序以沿兩個方向跨越條形碼及變異衣殼序列(步驟4)。產生之序列因此將特定條形碼序列與衣殼基因中之特定變異序列連接。步驟4之ILLUMINA®定序指示在合成期間指定之條形碼與變異序列之間99.6%正確匹配。步驟5包含用BsaI限制酶進行消化。步驟6為PCR擴增步驟，其中製備了H2B、EGFP、細胞類型特異性啟動子(例如hSyn1)、p40啟動子及衣殼基因之5'端。或者，H2B、EGFP、細胞類型特異性啟動子(例如hSyn1)、p40啟動子及衣殼基因之5'端可在獨立供體質體中製備，用BsaI消化，且經凝膠純化。步驟7為組裝最終構築體之無痕golden gate選殖步驟。最終文庫樣品之桑格定序(Sanger sequencing)表明88個個別純系全部顯示條形碼與變異衣殼序列之間的適當指定連接。
方法2採用ILLUMINA®及OXFORD NANOPORE® 定序兩者。首先，經由圖2中所示之方法組裝AAV衣殼文庫，其中使用引子將可變序列添加至衣殼基因中。隨後，將衣殼基因文庫選殖至包含報導基因及隨機條形碼序列之載體中(參見圖5)。為了將各隨機條形碼序列與各變異衣殼序列連接，進行兩種類型之定序分析。標準ILLUMINA®定序對於短核酸伸長段(大約300 bp)高度精確，而OXFORD NANOPORE® 定序可得到長得多的序列讀段。然而，OXFORD NANOPORE® 定序具有大約12%的誤差率且可在讀取序列中產生插入或缺失，因此其獨自不適合於此目的。因此，首先進行兩組ILLUMINA®定序反應：一組定序條形碼區域且一組定序可變衣殼序列。之後，完成OXFORD NANOPORE® 定序反應以提供跨越整個AAV病毒基因組之長讀取長度。儘管精確性比不上ILLUMINA®定序，但奈米孔定序提供長讀取長度資料，其准許匹配已知條形碼序列與已知變異衣殼序列。
此兩種方法之結果均為使各條形碼與各變異衣殼序列產生匹配之『查找』表。一旦自目標細胞、組織或細胞器分離AAV，便僅需核酸條形碼定序，因為經由使用查找表，吾人便可知曉變異衣殼之序列。
在原代小鼠皮質神經元(Gibco)中活體外測試文庫。文庫為各血清型之所有AAV變異體之混合物。細胞用AAV變異體在每個細胞3×103 、1×104 、3×104 、1×105 及3×105 個載體基因組之劑量範圍內處理，且如下所述地分離EGFP陽性細胞核。分開地，自感染神經元分離總RNA且用於遵循標準方案及對AAV mRNA轉錄物具有特異性之引子DO441_AAVSpecific_RT：5' GGTTACAAATAAAGCAATAGCATCAC (SEQ ID NO:65)反轉錄為cDNA。所得cDNA條形碼接著藉由ILLUMINA®定序，用NGS引子DO439_RNABarcode_Fwd：5' ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGCATCACAAATTTCACAAATAAAGC (SEQ ID NO:66)及DO440_RNABarcode_Rev：5' GACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNGCCGTGTCCGAGGGTACTAAG (SEQ ID NO: 67)進行定序，以定量變異體效能。回收之AAV變異體樣品之結果展示於圖6中，其中log2倍數變化表示自轉導細胞分離之變異體相比於其於投與文庫中之頻率的富集。圖6之X軸表示變異體效能跨越樣品複本之相對變化性。如可見，變異體效能通常基於親本血清型而叢集，其中包含插入至AAV1中之肽的變異體為最富集及變化最小的。圖7A展示單獨繪製的AAV1血清型變異體，且亦指示野生型AAV1血清型(衣殼序列中無插入胺基酸)之效能。如可見，存在大量相比於野生型AAV1血清型顯示增加之富集的變異體。類似地，圖7B展示單獨繪製的基於肽插入至AAV2中之變異體，且指示野生型AAV2之相對效能。方法產生相比於野生型序列展示轉殖基因表現富集之AAV2變異體。亦進行比較以查看鑑別經富集AAV變異體之不同方法是否產生類似結果。圖8展示基於RNA分離、cDNA合成及條形碼定量評估之變異體效能與藉由分離EGFP陽性細胞核及可變衣殼區域定序評估之效能類似。另外，在Neuro2A細胞(ATCC CCL-131)及衍生自人類誘導多能幹細胞(NCR-100-010-001，Cellular Dynamics International)之iCell神經元中評估文庫效能。個別變異體效能跨越呈現不同選擇壓力之細胞株不同。本文所述之評估變異體效能之方法為始終適用及成功的。變異體為如下：
AAV 變異體 SEQ ID NO
KSPHPSV (AAV1) SEQ ID NO: 199
IKSNLTY (AAV1) SEQ ID NO: 200
STSPHAPSKE (AAV2) SEQ ID NO: 201
HATPQFDPSQ (AAV6) SEQ ID NO: 202
SALGLQAKAY (AAV9) SEQ ID NO: 203
實例 2 ：在小鼠中活體內選擇變異 AAV 文庫
構築此等AAV文庫之目標為鑑別將允許遞送AAV至任何物種之任何組織、細胞或細胞器的AAV衣殼變異體。
CNS 遞送 。此技術之一種潛在用途為將基因組編輯、轉殖基因及基因表現調節劑遞送至特定細胞類型。因此，對於此特定應用而言重要的是鑑別不僅將靶向特定組織內之特定細胞，且亦將行進至細胞內之細胞核且介導轉殖基因表現的AAV變異體。另外，相比於自組織分離特定全細胞體，自組織分離細胞核為直截了當的。細胞核跨越組織具有均勻形態且易於針對DNA含量進行染色，以促進FACS分析(例如DAPI或Hoescht染料)。舉例而言，神經元具有極伸長的細胞體且難以自腦組織中完整分離。另外，大腦內之一些組分，諸如脂褐質及髓鞘鹼性蛋白可為自體螢光的，與依賴於報導基因之螢光信號的分析混淆(參見例如Hainsworth等人 (2017)Neuropathol Appl Neurobio l 44(4): 417-426)。因此，如圖3A及圖3B中所示，採用不同方法將AAV基因組中之報導基因定位至細胞核，包括將其融合至核定位序列(SV40 NLS)、核膜結合蛋白域(KASH)及併入至核染色體中之組蛋白結合域(H2B)。
製備構築體以測試向HEK293細胞中之遞送。將僅包含單獨報導子而無核定位序列(EGFP及mCherry)之構築體相比於其中報導子已與SV40 NLS或KASH域融合之構築體(參見圖9)。所有構築體均在細胞中展示螢光，同時NLS標記之構築體展示細胞核內之定位且KASH連接之構築體展示報導子結合至核膜。然而，在自HEK293轉導之細胞分離細胞核後，僅KASH連接之構築體展示信號保留。細胞核分離之後的信號損失可能係因為相對於非繫栓構築體中之核孔截止(60 kDa)，報導蛋白之尺寸較小(27 kDa)。在不存在活細胞的情況下，用於報導子之核輸入的主動轉運機制喪失且報導子可擴散出細胞核。藉由將報導子融合至H2B域進行進一步測試且亦觀測到在經分離細胞核中穩定保留信號。所有H2B構築體高效驅動將報導子併入至核染色體中，該核染色體在細胞核分離及細胞及組織之冷凍/解凍處理之後均保持穩定。
基本上如Krishnaswami等人之方案(描述於Kelder等人 (2016)Nat Protoc 11(3):499中)中所述地自經培養細胞及組織分離細胞核。簡言之，用無菌剃刀片切下2-3 mm3 之組織切片。若使用經培養細胞，則收集細胞且以每毫升大約1×106 個細胞再懸浮於冷PBS中。使用杜恩斯均質機(dounce homogenizer)在包含蔗糖、MgCl2 、KCL及NuPAGE樣品還原劑(Thermo)之Tris緩衝液中對組織或細胞進行均質化。亦包括0.1% Triton及Hoescht 33352 (Molecular Probes)。接著使用40或70微米Flowmi細胞過濾器(Flowmi)過濾勻漿，以移除細胞核之其餘組織片段或高階聚集體。
在C57BL/6J小鼠中評估包含處於神經元特異性hSynapsin1啟動子控制下之EGFP-H2B、mClover3-H2B、mRuby3-H2B及EGFP-KASH的AAV衣殼文庫構築體。AAV衣殼文庫係藉由標準技術製造且藉由尾靜脈靜脈內注射以2×1011 個載體基因組/隻小鼠(n=3隻/組)之劑量投與。在投與測試物品之後兩週將小鼠處死，且將大腦左半球保存於4%多聚甲醛中，用於以所表現報導子為目標之免疫組織化學研究，以藉由此項技術中已知之技術來確認核定位。將右半球速凍，用於經轉導神經元細胞核之FACS分選。來自免疫組織化學研究之影像對於組織中之各構築體驗證核定位(參見圖10A及10B)，而對於mRuby3構築體，使用核定位mRuby3天然螢光之直接可視化。
如上文所述地自冷凍中樞神經系統小鼠組織分離細胞核，在細胞核分離期間用Hoescht染料染色，且藉由使用Sony SH800細胞分選儀根據製造商之說明針對EGFP、mClover3、mRuby3或EGFP-KASH信號進行分選。對於FACS分選，在樣品壓力5下以半純度模式使用70微米晶片。FACS圖閘控於單峰，以防止分選附著細胞核之二重峰、三重峰或更高階分組。將樣品分選至包含蔗糖及MgCl2 之Tris緩衝液，pH 7.5中。
使用Roche High Pure Viral核酸套組，根據製造商之方案自經分選細胞分離DNA。
FACS圖(圖11)表明EGFP陽性細胞核可自注射包含EGFP-H2B構築體之文庫之小鼠的中樞神經組織分離。另外，可在用mClover3構築體治療之小鼠的丘腦中及用EGFP-KASH文庫治療之小鼠的皮質中偵測到信號(圖12及13)。重要的是，當向小鼠注射EGFP-H2B文庫(其中EGFP-H2B係由神經元特異性hSynapsin啟動子驅動)時，不可在肝臟或心臟組織中偵測到背景上方之報導子信號，參見圖14。實例 3 ：非人類靈長類動物中之活體內選擇
肝遞送 ：本文所述之方法及組合物亦用於自文庫鑑別肝靶向AAV變異體。在此等實驗中，肝特異性啟動子甲狀腺素轉運蛋白(TTR)用於表現報導基因。文庫構築體因此經修飾以包含替代hSynapsin啟動子之TTR啟動子。首先在細胞中活體外測試文庫，該等細胞中可見劑量反應。跨越一定感染倍率(MOI)範圍經AAV文庫轉導HepG2細胞(ATCC HB-8065)，且接著如上地分選細胞核以量測來自報導基因之螢光。結果(參見圖15A-C)展現劑量反應，其概述於下表6中：表 6 ： HepG2 細胞中之劑量反應
MOI EGFP陽性%
模擬 0.2
3e3 0.5
1e4 2.5
3e4 8.6
1e5 36.9
3e5 53.3
1e6 64.3
亦在非人類靈長類動物肝細胞(BioIVT)中進行劑量反應實驗，其中亦觀測到劑量反應(參見下表7)。表 7 ： NHP 肝細胞中之劑量反應
MOI EGFP陽性%
模擬 0.6
3e3 1.3
3e4 3.8
3e5 12.4
以類似方式，在原代人類肝細胞(Corning)中量測劑量反應，且資料展示於下表8中。表 8 ：原代人類肝細胞中之劑量反應
MOI EGFP陽性%
模擬 0.4
5e4 6.7
1e5 20.0
2e5 35.4
4e5 47.3
8e5 50.2
亦使用文庫在C57BL/6J小鼠中評估文庫變異體效能，其中報導基因由TTR啟動子驅動。AAV衣殼文庫係藉由標準技術製造且藉由尾靜脈靜脈內注射以2E11個載體基因組/隻小鼠(n=3隻雄性及n=3隻雌性)之劑量投與。在投與測試物品之後兩週，處死小鼠且移除肝臟以評估經表現EGFP轉殖基因之靶向。
亦在非人類靈長類動物(食蟹獼猴)中進行選擇，以分離將對於人類肝臟轉導具有最大相關性之AAV變異體。
在第1輪選擇中，以5E12個載體基因組/公斤之劑量注射包含來自所有不同血清型之AAV變異體的文庫集合體。在此第一輪中，將數百萬個獨特變異體注射至一隻雄性及一隻雌性NHP中。15天後，處死該等NHP且分析肝臟。產生自NHP肝臟回收之一組成功AAV變異體且定序。AAV變異體接著用於製造包含大約500,000個獨特變異體之單一文庫。接著將此等以1.6E13個載體基因組/公斤之劑量靜脈內注射至新NHP對中。28天後，將NHP處死且分析其肝臟。分析之終點為與所投與文庫調配物相比，個別AAV變異體於肝組織中之富集；表現由AAV變異體編碼之EGFP之肝細胞核中之富集；及mRNA條形碼定序以確定相比於所投與文庫調配物，AAV衣殼變異體之富集。
如上文所述地自肝臟分離細胞核且藉由FACS分選EGFP陽性肝細胞核。結果(圖16，圖A)展示在背景上方易於偵測到EGFP信號。自各NHP之各個別肝葉之三個樣品分離之EGFP陽性細胞核的數目展示於下表9中。另外，進行EGFP之免疫組織化學偵測(圖16，圖B)以展現報導基因之核定位。表 9 ： 自雄性及雌性 NHP 肝組織分離之 AAV 變異體的數目。
   NHP 1001 ( 雄性) NHP 1501 ( 雌性)
組織區域 GFP+ 細胞核(%) 分選計數 GFP+ 細胞核(%) 分選計數
左外側葉1 6.0 133,043 1.5 28,746
左外側葉2 4.4 44,044 1.2 24,641
左外側葉3 4.1 71,123 1.2 18,762
右外側葉1 2.4 31,872 1.9 31,814
右外側葉2 4.5 76,013 1.6 34,736
右外側葉3 4.6 54,185 1.5 24,675
左內側葉1 3.2 66,751 1.7 18,433
左內側葉2 3.6 45,289 1.6 17,613
左內側葉3 2.9 40,757 1.7 17,961
右內測葉1 3.8 51,326 1.2 21,438
右內測葉2 3.7 58,040 0.9 12,986
右內測葉3 3.2 52,832 1.5 16,695
方葉1 4.0 57,774 0.8 10,325
方葉2 2.7 44,248 1.1 13,333
方葉3 3.5 58,053 1.3 15,150
有趣的是，在施加獨特選擇壓力之後分離的前2500個AAV變異體之比較表明以最大程度富集之AAV變異體之親本血清型中之顯著差異(圖17A及B)。HepG2及原代人類肝細胞經活體外評估，而小鼠及NHP經活體內評估。此等顯著物種特異性差異支持更接近人類之動物模型，例如NHP中之AAV選擇。
基於大約100個AAV變異體在NHP mRNA、NHP EGFP陽性肝細胞核及NHP肝總基因組DNA中之一致倍數富集，選擇其用於深入分析。排除之變異體包括在HEK293 AAV製造中具有低產率及在藉由奈米孔定序定位條形碼中具有低置信度的變異體。亦進行聚類分析，以選擇回應於選擇壓力包含獨特物理化學特性(例如重複性胺基酸基元或強疏水性)之AAV變異體。
來自此初始分析之前32個序列展示於圖18及表10中。該分析展示親本血清型以及在非人類靈長類動物中選擇之後觀測到的肝臟中之倍數富集。亦展示插入至衣殼環中之肽的序列。重要的是，在HEK293 AAV生產系統中產生各AAV變異體之能力經追蹤，以保證可有效地產生藉由本文所述之方法鑑別之任何AAV。因此，在一些實施例中，插入肽序列及AAV親本血清型可為表10中所闡述之彼等中之任一者。表 10
插入肽序列 AAV 親本血清型 SEQ ID NO 插入肽序列 AAV 親本血清型 SEQ ID NO
KSPQSKV AAV1 1 VSRSYPA AAV9 17
SDLRSKV AAV1 2 QRARPDT AAV9 18
TTTVRKV AAV1 3 SQLTPHS AAV6 19
GRSDMAG AAV2 4 LGSHLPS AAV6 20
LLSSERS AAV2 5 YTLSSGQ AAV6 21
EQRPNVS AAV2 6 SSRIPPD AAV6 22
TRQISSD AAV2 7 WTETIPR AAV6 23
QGALAQV AAV3B 8 HGLQGVA AAV6 24
YPSSNTP AAV3B 9 TMRVSDQ AAV6 25
MLNPRTE AAV3B 10 GSSKVVM AAV6 26
QMRTRDE AAV3B 11 SALDRGV AAV6 27
MPGRAPI AAV9 12 KELGTQR AAV5 28
LGRLTAN AAV9 13 RSSDVQR AAV5 29
SYSTSRS AAV9 14 PSAPKTF AAV5 30
TRPSSTN AAV9 15 HTKRSEY AAV5 31
VPQSSSR AAV9 16 IKGSNLP AAV5 32
CNS 遞送 ：進行額外實驗以鑑別使用本文所述之方法改良CNS轉導之AAV變異體。對於此等實驗，hSynapsin啟動子(hSyn1)用於表現報導基因及mRNA條形碼。在非人類靈長類動物(食蟹獼猴)中進行選擇，以分離將對於人類CNS轉導具有最大相關性之AAV變異體。
在非人類靈長類動物選擇第1輪中，包含基於血清型AAV1、AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8及AAV9之AAV變異體的文庫集合體係藉由腰椎鞘內穿刺以1E13個載體基因組之總劑量注射。在此第一輪中，將數百萬個獨特變異體注射至一隻雄性及一隻雌性NHP中。15天後，處死該等NHP且分析CNS組織以評估AAV變異體效能。
使用上文所述之方法1合成在第1輪CNS非人類靈長類動物選擇中具有高倍數富集之AAV變異體子組，以產生用於第2輪選擇之文庫。第2輪文庫之總大小為10,818個變異體。各AAV變異體使用編碼相同肽之三種不同核苷酸序列合成。各核苷酸序列連接至藉由hSyn1啟動子驅動之獨特mRNA條形碼，以對神經元中之轉殖基因表現排序。包括三個複製序列使得能夠提高評估變異體效能之置信度，因為三個序列中之每一者可在生物資訊學分析期間獨立處理。
首先如實例1中所述地在Neuro2A細胞(ATCC CCL-131)(圖19)、原代小鼠皮質神經元(Gibco)(圖20)及衍生自人類誘導多能幹細胞之iCell人類神經元(NCR-100-010-001，Cellular Dynamics International)(圖21)中活體外評估針對第2輪選擇製備以靶向CNS之文庫。
隨後藉由以每隻小鼠1.59E11個載體基因組之劑量單側腦室內注射10微升體積而在C57BL/6J小鼠中評估第2輪文庫(n=3隻雄性及n=3隻雌性)。在投與測試物品之後28天處死小鼠，且移除CNS組織以評估文庫效能(圖22)。對於在經注射半球對側之腦區完成分析，以避免同與注射道相關之轉導混淆。
最後，將第2輪文庫以每隻動物4.37E13 vg之劑量鞘內投與至兩隻雄性及一隻雌性食蟹獼猴。28天後，處死該等NHP且分析CNS組織。大腦以3 mm冠狀切片厚度進行切片。各切片沿中矢面切成對半。自大腦左半球切片獲得衝壓樣品(3 mm)，用於分析載體基因組DNA。將右半球置於RNAlater中且冷凍大約24小時以保持RNA完整性。在儲存之後，對各個腦區取樣，收集3 mm衝出物。將脊髓分成頸段、胸段及腰段以用於分析。
藉由分析載體基因組DNA頻率(圖23-25)以及藉由定量自特異性表現於神經元中之文庫mRNA轉錄物反轉錄之cDNA(圖26-28)來評估文庫AAV變異體效能。此兩個資料集分別被稱為DNA分析及RNA分析。非人類靈長類動物CNS組織之下一代定序分析鑑別了展現優於親本野生型血清型之轉導的高效能AAV變異體。基於跨越不同量度之效能，包括在DNA及RNA分析兩者中之富集而選擇此等高效能變異體之子組用於進一步評估。此子組之變異體效能的概述展示於圖29A-29D中。分析展示親本血清型以及在非人類靈長類動物中選擇之後觀測到的組織中之倍數富集。亦展示插入至衣殼環中之肽的肽序列。將變異體編號為1-43 (SEQ ID NO.: 68-110，參見表11)，且此編號用於在圖19至28之氣泡圖中註釋其相對於文庫之其餘部分的效能。在一些實施例中，插入肽及AAV親本血清型可為表11中所闡述之彼等中之任一者。表 11
編號 插入肽序列 AAV 親本血清型 SEQ ID NO 編號 插入肽序列 AAV 親本血清型 SEQ ID NO
1 AALRDIR AAV1 68 23 MTLTRQE AAV2 90
2 PAIKTYS AAV1 69 24 TSNSRTE AAV2 91
3 TGDRISSRTL AAV1 70 25 EVRGGPS AAV2 92
4 SVVVSSDSSKRPRNL AAV1 71 26 VISDRSS AAV2 93
5 VGARLSA AAV1 72 27 PRDTFNG AAV2 94
6 IEKPNTSTKK AAV1 73 28 RPLTAND AAV2 95
7 DTVRSKN AAV1 74 29 PLRMVNE AAV2 96
8 KELNKAR AAV1 75 30 DVGIRPS AAV2 97
9 PYASITG AAV3B 76 31 KDSTAFG AAV2 98
10 TGAFSST AAV3B 77 32 YPGRNPD AAV2 99
11 EQFRNLA AAV3B 78 33 ISDTRIS AAV2 100
12 FNSPVIQ AAV3B 79 34 ENFSKVA AAV2 101
13 TDFRSPQ AAV3B 80 35 RDALSGLRPE AAV2 102
14 MYSLMKD AAV3B 81 36 LGNGKMTVQP AAV2 103
15 LYLSSAS AAV3B 82 37 VSNPLNQ AAV2 104
16 YGSRSVD AAV3B 83 38 LNERGLG AAV2 105
17 LYSHQVS AAV3B 84 39 GRNTVGLSSA AAV2 106
18 ISTHSPP AAV3B 85 40 VGHAGNP AAV2 107
19 RQPTTIP AAV9 86 41 SRAGTVP AAV2 108
20 RSTSSLL AAV9 87 42 GLVAKLP AAV2 109
21 FRLSSPQ AAV9 88 43 AESLRTP AAV2 110
22 f AAV9 89            
實例 4 ：評估文庫篩選中鑑別之表現最佳的 AAV 變異體
在非人類靈長類動物中之兩輪選擇之後，在肝臟及CNS組織中鑑別高度富集變異體之子組(分別地，圖18及29)。不直接繼續進行僅一或兩個變異體之個別評估，吾人替代地產生帶條形碼的表現卡匣，以使得能夠進行肝臟及CNS中之許多表現最佳的變異體之面對面直接比較。在此方法中，確定地知曉連接至各AAV之條形碼，因為在彙集之前分開製造及滴定各AAV變異體。藉由含有驅動EGFP-H2B轉殖基因表現之細胞類型特異性RNA聚合酶II啟動子(例如甲狀腺素轉運蛋白或hSynapsin1)及獨特條形碼核苷酸序列之載體基因組(圖30)製造各AAV。亦包括第二RNA聚合酶III啟動子(例如hU6)，以獨立評估載體效能。hU6啟動子廣泛表現於所有細胞類型中，且因此使得能夠評估所有細胞及組織類型中之表現。此外，hU6轉錄物受限於細胞核，其為單細胞核定序方法之優勢。以計算方式設計表12中所列之所有條形碼，以將轉錄偏差的可能降至最低。表 12 ：用於經彙集 AAV 變異體評估之獨特條形碼
卡匣編號 RNA聚合酶II條形碼 SEQ ID NO: RNA聚合酶III條形碼 SEQ ID NO:
1 AAATCACCTGAC 111 CTTGTCGATAAG 155
2 TGATTCTTCTAC 112 GTGGTAAGCACG 156
3 GGCCACTGGTTG 113 AACTGGCTCCCA 157
4 AATCTATCGCCT 114 TGCGATCGTACA 158
5 AGACGATCAAGG 115 CAGAGGATAGCT 159
6 GTGTAGTGATCG 116 GAGGAGTCTCAT 160
7 TGGTAGTTTCCA 117 AGTTCCCACGGA 161
8 GATCAGTTGCGG 118 CCCTTCAGCAGT 162
9 CTTGGGACACAC 119 CGTACTCCGCGA 163
10 GATGCGGCCTCG 120 TCACCGACGTGG 164
11 CGCATCCTCGTT 121 CAACGGTCTTCC 165
12 ACGATGTCTACG 122 GTAACAGTCCGG 166
13 GTGTTCCACCTG 123 GTCGAGGATACC 167
14 GGAGGGAGCTGG 124 TGCGATGTGATG 168
15 CATAACTCTTGC 125 TAACCCGCCGAA 169
16 TGACAGTCTCGC 126 CGACCAACGACA 170
17 CTACCAGGATTC 127 CTGCTGCCATCA 171
18 ACACATGATGGC 128 CTAGTACACGCG 172
19 GGTGCTCGCAAT 129 TAGGTGCTAGTG 173
20 GATTGCACCGCA 130 TCCTCCCAGGAT 174
21 AACGGAGGCTGC 131 TAGGCGGCATTA 175
22 GGGAGAGTTCCG 132 CTTAGGCTAGCT 176
23 CGGGTAGCCGAA 133 CGACGTGCGATA 177
24 TGACCTAATTGG 134 ACCATTCCATCG 178
25 GGGTGAAGGATT 135 TGGAAAGGCCTA 179
26 CTGTGAGAGAAG 136 GGGAACATTGGA 180
27 ACTTGGTTCCGC 137 AAGTGAACGCGC 181
28 GTTGGCTGTACC 138 AGCAACGTTGTA 182
29 TGTAAGCTGTAG 139 AAGTGACGGACC 183
30 AGCTACCCTGGA 140 AGTAACGCCCGT 184
31 CCAAACAAGCGT 141 TGGGCTATGACA 185
32 GCTTGCCCATCC 142 CTGCAGTGAAGT 186
33 CATTCCGGGTTA 143 ATTCTGTTCGCA 187
34 CTTTGCCGGTAC 144 CTTCCTCACCTC 188
35 CATCAACTGTGC 145 GAGAGTCGAAAC 189
36 GCACAGCCGAAT 146 AGTCGTGAATCG 190
37 ATGCATCGGTCA 147 GGTGACAACAAT 191
38 GAACCAGAATGC 148 GCCTAGTAGCAT 192
39 CGGACGGTATGG 149 ACAGAAGCGCCT 193
40 TCCTATGAACAA 150 CTAGTTGAGTTC 194
41 TGGGAGTAGAGG 151 AAGTTCAGGATA 195
42 GCTCAACGATCG 152 TTGCCTCTATTC 196
43 GGACTAGGATAT 153 TGAACGTCTAAG 197
44 CCATTGTGGGAA 154 CGCTATCACGCA 198
應用此表現卡匣以評估自文庫篩選鑑別之一子組高效能CNS向性AAV變異體(列於圖29A-D中)的實例展示於圖31中。除了此研究中開發之工程化血清型以外，亦包括若干對照血清型：AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO。AAV9已關於其CNS轉導特性在領域中廣泛評估，包括在人類臨床試驗中(Lowes等人 Pediatr Neurol. 2019; 98:39-45)，因此其為效能之主要基準。PHP.B為先前顯示在C57BL/6J小鼠中展現高效力之工程化AAV9血清型(Deverman等人 Nat Biotechnol. 2016; 34(2):204-9)，此等特性不擴展至非人類靈長類動物(Hordeaux等人 Mol Ther. 2018年3月; 26(3):664-668)。AAV2_HSPGKO為AAV2之變異體，其具有兩個消除與硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)之結合的突變(R585A及R588A)(Opie等人 Virol. 2003年6月;77(12):6995-7006)。先前亦在非人類靈長類動物中評估此血清型(Naidoo等人 Mol Ther. 2018年10月3日;26(10):2418-2430)。在此實驗中，在Neuro2A細胞、原代小鼠皮質神經元及衍生自人類誘導多能幹細胞之iCell人類神經元中活體外評估帶條形碼的AAV變異體。在HEK293T細胞中產生病毒，使用CsCl密度-梯度純化，且藉由即時qPCR根據此項技術中已知之方法滴定。各個別製造及帶條形碼的病毒接著混合在一起以形成用於下游評估之單一集合體，且此集合體中各變異體之頻率係藉由下一代定序(NGS)來評估。圖30中所述之載體基因組卡匣用於彙集評估，以使得能夠自hSyn1 Pol II啟動子及hU6 Pol III啟動子定量獨特帶條形碼的轉錄物。帶條形碼的病毒集合體用於以每個細胞3×105 、1×105 、3×104 、1×104 、3×103 及1×103 個載體基因組複本感染細胞。在72小時(Neuro2A)、48小時(原代小鼠皮質神經元)或96小時(hiPSC源性人類神經元)之後，提取總RNA且使用分別靶向hSyn1及hU6轉錄物之基因特異性引子逆轉錄AAV轉錄物。下一代定序接著應用於定量衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比。此等百分比係藉由用於感染之集合體中各AAV變異體之頻率標準化。結果展示效能分佈，其中基於AAV1及AAV2之若干AAV變異體跨越所有三種細胞類型展現高效能。一般而言，基於AAV3B之AAV變異體的效能較低。藉由相同細胞類型中獲得之第2輪文庫資料成功地預測變異體效能中觀測之趨勢(圖19、20、21)。另外，此等資料展示雙重pol II hSyn1及pol III hU6條形碼量測方法之成功應用。在例如Neuro2A的均質細胞株中，hSyn1與hU6量測值之間的一致性高。在原代小鼠皮質神經元及hiPSC源性神經元中，神經元亞型之異質性較大，使得兩個量測值之差異較大。然而，總體上，兩個量測值仍相關。實例 5 ：針對非神經元細胞轉導活體外評估 CNS 向性變異體
針對非神經元細胞類型轉導活體外評估相同子組之CNS向性AAV變異體及對照(圖32)。在此實驗中，針對衍生自人類誘導多能幹細胞之iCell人類星形膠質細胞及衍生自人類誘導多能幹細胞之iCell人類內皮細胞之轉導評估帶條形碼的AAV變異體。上文實例4中所述之相同AAV帶條形碼的集合體測試物品及方法與以下規格一起使用。對於hiPSC衍生之星形膠質細胞中之評估，每個細胞3×105 、1×105 、3×104 、1×104 、3×103 及1×103 個載體基因組複本用於感染。對於hiPSC衍生之內皮細胞中之評估，每個細胞3×105 、1×105 及3×104 個載體基因組複本用於感染。星形膠質細胞及內皮細胞均在感染後72小時收集。提取總RNA且使用靶向hU6轉錄物之基因特異性引子逆轉錄AAV轉錄物，未探測到hSyn1轉錄物，因為hSyn1啟動子在非神經元細胞類型中具有極小活性。下一代定序接著應用於定量衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比。此等百分比係藉由用於感染之集合體中各AAV變異體之頻率標準化。在hiPSC衍生之星形膠質細胞中，結果展示效能分佈，其中基於AAV2之若干AAV變異體展現高效能。一般而言，基於AAV1及AAV9之AAV變異體的效能較低。在hiPSC衍生之內皮細胞中，結果展示效能分佈，其中基於AAV1及AAV2之若干AAV變異體展現高效能。一般而言，基於AAV3B及AAV9之AAV變異體的效能較低。實例 6 ： 小鼠及大鼠中 CNS 向性 AAV 變異體之活體內評估
進一步針對C57BL/6J小鼠及史泊格-多利大鼠(Sprague-Dawley rat)之中樞神經系統之轉導活體內評估相同子組之CNS向性AAV變異體(圖33及34)。評估嚙齒動物中之轉導，以完成跨越通常用於治療劑開發之物種的徹底AAV效能評估。對於C57BL/6J小鼠中之評估，藉由單側腦室內注射至左側腦室中來投與10微升體積之1E11個載體基因組(n=3隻雄性及n=3隻雌性)。對於史泊格-多利大鼠中之評估，藉由單側腦室內注射至左側腦室中來投與20微升體積之2E11個載體基因組(n=3隻雄性及n=3隻雌性)。在投與測試物品之後32天處死動物且解剖CNS組織。對於在經注射半球對側之腦區完成分析，以避免同與注射道相關之轉導混淆。自CNS組織提取總RNA，且使用分別靶向hSyn1及hU6轉錄物之基因特異性引子逆轉錄AAV轉錄物。下一代定序接著應用於定量衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比。此等百分比係藉由投與之集合體中各AAV變異體之頻率標準化。
在C57BL/6J小鼠中，表現於神經元細胞中之轉錄物的hSyn1條形碼量測展示效能分佈，其中相對於AAV9基準，本文所揭示之許多基於肽插入至AAV1及AAV2中之AAV變異體展現高效能。如所預期，PHP.B對照血清型在C57BL/6J小鼠中具有高效能。一般而言，基於AAV9及AAV3B之AAV變異體的效能較低。在C57BL/6J小鼠中，表現於所有細胞類型中之轉錄物之hU6條形碼量測展示效能分佈，其中相對於AAV9基準，本文所揭示之許多基於肽插入至AAV2及尤其AAV1中之AAV變異體展現高效能。一般而言，基於AAV9及AAV3B之AAV變異體的效能較低。Fig. 33.
在史泊格-多利大鼠中，表現於神經元細胞中之轉錄物的hSyn1條形碼量測展示效能分佈，其中相對於AAV9基準，本文所揭示之許多基於肽插入至AAV1及AAV2中之AAV變異體展現高效能。如所預期，相比於在C57BL/6J小鼠中，PHP.B對照血清型在史泊格-多利大鼠中之效能劣化。一般而言，基於AAV9及AAV3B之AAV變異體的效能較低。在史泊格-多利大鼠中，表現於所有細胞類型中之轉錄物之hU6條形碼量測展示效能分佈，其中相對於AAV9基準，本文所揭示之許多基於肽插入至AAV1及AAV2中之AAV變異體展現高效能。一般而言，基於AAV9及AAV3B之AAV變異體的效能較低。圖34。實例 7 ： 非人類靈長類動物中 CNS 向性 AAV 變異體之活體內評估
吾人接下來進一步針對非人類靈長類動物(食蟹獼猴)之中樞神經系統之轉導活體內評估相同子組之CNS向性AAV變異體。在上文所述之各種評估中，評估食蟹獼猴中之轉導對於臨床轉譯至人類特別重要，因為非人類靈長類動物最佳例示人類CNS之遺傳學及生理學。將AAV變異體之集合體以每隻動物5.2×1013 個載體基因組(vg)之劑量鞘內投與至一隻雄性及一隻雌性食蟹獼猴。對於鞘內投與，螺紋導管用於在頸位及胸位更接近大腦地沈積測試物品。在投與測試物品之後57天處死動物。大腦以3 mm冠狀切片厚度進行切片。各切片沿中矢面切成對半。自大腦左半球切片獲得衝壓樣品(3 mm)，用於分析AAV基因組DNA。將右半球置於RNAlater中且冷凍大約24小時以保持RNA完整性。在儲存之後，對各個腦區取樣，收集3 mm衝出物。將脊髓分成頸段、胸段及腰段以用於分析。分別自CNS組織提取基因組DNA及總RNA，且後續分析分別被稱為DNA分析及RNA分析。對於DNA分析，分別藉由PCR擴增獨特條形碼hSyn1及hU6中之每一者。下一代定序應用於定量衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比。應注意，對於DNA分析，不存在藉由啟動子提供之細胞限制，因此，預期hSyn1及hU6條形碼以相等的可能性擴增。對於RNA分析，使用分別靶向hSyn1 (神經元)及hU6 (所有細胞類型)轉錄物之基因特異性引子逆轉錄AAV轉錄物。下一代定序接著應用於定量衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比。對於DNA及RNA分析，此等百分比均藉由投與之集合體中各AAV變異體之頻率標準化。
在食蟹獼猴中，基於表現於神經元細胞中之轉錄物之hSyn1條形碼量測的RNA分析結果(圖35)展示效能分佈，其中相對於AAV9基準，本文所揭示之許多基於肽插入至AAV3B、AAV2及AAV1中之AAV變異體展現高效能。一般而言，基於AAV9之AAV變異體的效能較低。在食蟹獼猴中，表現於所有細胞類型中之轉錄物之hU6條形碼量測展示效能分佈，其中相對於AAV9基準，本文所揭示之許多基於肽插入至AAV3B、AAV2及AAV1中之AAV變異體展現高效能。一般而言，基於AAV9之AAV變異體的效能較低。本文所揭示之血清型相比於AAV9基準之倍數增加繪製於圖37及38中。
在食蟹獼猴中，基於CNS組織中之AAV載體基因組之hSyn1及hU6條形碼量測的DNA分析結果(圖36)展示效能分佈，其中相對於野生型AAV9基準，跨越所有血清型之許多AAV變異體，包括基於AAV9之工程化變異體展現極高效能。本文所揭示之血清型相比於AAV9基準之倍數增加繪製於圖39及40中。
儘管RNA分析指示何等AAV變異體在神經元及所有CNS細胞中提供最高生產轉殖基因表現量，但值得注意的是DNA分析表明存在極高度富集於腦組織中之額外AAV。
跨越所有細胞培養及活體內評估之血清型效能概述繪製於圖41及圖42中。結果展示跨物種之轉導差異，且突出顯示在非人類靈長類動物中進行血清型篩選及評估之值。
本文中提及之所有專利、專利申請案及公開案均特此以全文引用的方式併入。
儘管已出於清晰理解的目的而藉助於說明及舉例提供揭示內容之一些細節，但熟習此項技術者將顯而易見的是可在不脫離本發明之精神或範疇之情況下實踐各種更改及修改。因此，前述描述及實例不應視為限制性的。
本發明之特定實施例闡述於以下編號段落中：
1.  一種鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法，其包含： (i)使細胞、細胞株或組織與AAV變異體之文庫接觸，其中該文庫之各成員包含： a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸； (ii)使該文庫中之AAV變異體轉導細胞、細胞株或組織； (iii)自細胞、細胞株或組織回收AAV變異體；及 (iv)鑑別具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
2.  一種鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法，其包含： (i)使細胞、細胞株或組織與AAV變異體之文庫接觸，其中該文庫之各成員包含： a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者： b)側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸； (ii)使該文庫中之AAV變異體轉導細胞、細胞株或組織； (iii)自細胞、細胞株或組織回收AAV變異體；及 (iv)鑑別具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
3. 如實施例1之方法，其中該文庫之各成員包含側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變。
4. 如實施例2之方法，其中該文庫之各成員包含側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變。
5. 如實施例1至4中任一項之方法，其中該文庫之各成員包含編碼定位信號之核酸。
6. 如實施例1至5中任一項之方法，其中該文庫之各成員含有包含條形碼之核酸。
7. 如實施例1至6中任一項之方法，其中該文庫之各成員包含編碼報導蛋白之核酸。
8. 如實施例1至7中任一項之方法，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於獨立核酸分子中。
9. 如實施例1至7中任一項之方法，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於一個核酸分子中。
10. 如實施例9之方法，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。
11. 如實施例10之方法，其中該文庫之各成員包含：5'ITR序列、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸、編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
12. 如實施例1至11中任一項之方法，其中該AAV變異體之文庫包含衍生自兩種或更多種AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。
13. 如實施例1至12中任一項之方法，其中該AAV變異體之文庫之AAV血清型選自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
14. 如實施例1至13中任一項之方法，其中編碼報導蛋白之核酸及編碼AAV變異衣殼之核酸各自獨立地以可操作方式連接於啟動子。
15. 如實施例1至14中任一項之方法，其中所需特徵為增強之細胞或組織向性。
16. 一種鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法，其包含： (i)將複數個編碼肽之核酸插入至編碼AAV衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環之核酸群體中，以產生編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸之文庫； (ii)將該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至以下中之一或多者： (a)包含條形碼之核酸， (b)編碼報導蛋白之核酸，及 (c)編碼定位信號之核酸； (iii)藉由以反式提供腺病毒輔助及AAV rep功能而在生產細胞中製造AAV變異體之文庫； (iv)純化該AAV變異體之文庫； (v)使細胞、細胞株或組織與該AAV變異體之文庫接觸； (vi)自目標細胞、細胞株或組織回收AAV變異體；及 (vii)鑑別具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
17. 如實施例16之方法，其中該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至包含條形碼之核酸。
18. 如實施例1至17中任一項之方法，其中該文庫之各成員含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。
19. 如實施例18之方法，其中包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸不同。
20. 如實施例18或19之方法，其中包含第一條形碼之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
21. 如實施例18或19之方法，其中包含第一條形碼之第一核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
22. 如實施例18或19之方法，其中包含第二條形碼之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
23. 如實施例18或19之方法，其中包含第二條形碼之第二核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
24. 如實施例18至23中任一項之方法，其中包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。
25. 如實施例24之方法，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子。
26. 如實施例24之方法，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子。
27. 如實施例24之方法，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子為RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子為RNA Pol III啟動子。
28. 如實施例25至27中任一項之方法，其中各RNA Pol II啟動子獨立地選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
29. 如實施例26至27中任一項之方法，其中各RNA Pol III啟動子獨立地選自由以下組成之群：U6啟動子、H1啟動子及7SK啟動子。
30. 如實施例16至29中任一項之方法，其中該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至編碼報導蛋白之核酸。
31. 如實施例16至30中任一項之方法，其中該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至編碼定位信號之核酸。
32. 如實施例16至31中任一項之方法，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸進一步包含側接肽插入位點之核酸序列中之一或多個沉默突變。
33. 如實施例16至32中任一項之方法，其中步驟(iv)進一步包含組合基於兩種或更多種AAV血清型之變異AAV之文庫以產生單一集合體。
34. 如實施例16至33中任一項之方法，其中編碼AAV衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環之核酸序列群體包含衍生自兩種或更多種AAV血清型之序列。
35. 如實施例16至34中任一項之方法，其中AAV血清型選自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
36. 如實施例16至35中任一項之方法，其中輔助功能包含E2A、E4、VA、E1A及E1B中之一或多者。
37. 如實施例16至36中任一項之方法，其中AAV rep功能包含rep78、rep 68、rep 52及rep40基因。
38. 如實施例37之方法，其中rep78及/或rep68基因之起始密碼子自ACG修飾為ATG。
39. 如實施例16至38中任一項之方法，其中該等生產細胞為HEK293細胞。
40. 如實施例16至39中任一項之方法，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸及/或編碼定位信號之核酸以任何次序彼此連接。
41. 如實施例16至40中任一項之方法，其中該文庫之各成員包含：5'ITR序列、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸、編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
42. 如實施例16至41中任一項之方法，其中編碼報導蛋白之核酸及編碼AAV變異衣殼之核酸各自獨立地以可操作方式連接於啟動子。
43. 如實施例16至42中任一項之方法，其中所需特徵為增強之細胞或組織向性。
44. 如實施例1至43中任一項之方法，其中該肽之長度為4-15個胺基酸。
45. 如實施例1至44中任一項之方法，其中該肽之長度為6-15個胺基酸。
46. 如實施例45之方法，其中該肽之長度為7、10或15個胺基酸。
47. 如實施例46之方法，其中該肽之長度為7個胺基酸。
48. 如實施例1至47中任一項之方法，其中該肽插入至選自由以下組成之群的區域中：衣殼蛋白之VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII及VR-IX區域。
49. 如實施例48之方法，其中該肽插入至衣殼蛋白之VR-I中。
50. 如實施例48之方法，其中該肽插入至衣殼蛋白之VR-IV中。
51. 如實施例48之方法，其中該肽插入至衣殼蛋白之VR-VIII中。
52. 如實施例1至49中任一項之方法，其中該肽插入至衣殼蛋白VP1、VP2或VP3中。
53. 如實施例1至50中任一項之方法，其中該肽插入衣殼蛋白之胺基酸殘基450與600之間的位置處。
54. 如實施例1至51中任一項之方法，其中 (i)該AAV血清型為AAV1且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置590處， (ii)該AAV血清型為AAV6且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置454或590處， (iii)該AAV血清型為AAV2且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置588處， (iv)該AAV血清型為AAV3B且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置589處， (v)該AAV血清型為AAV5且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置578處， (vi)該AAV血清型為AAV8且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置591處，或 (vii)該AAV血清型為AAV9且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置266、455或589處， 其中該位置對應於AAV血清型中VP1之編號。
55. 如實施例1至54中任一項之方法，其中該報導蛋白為螢光蛋白。
56. 如實施例55之方法，其中該報導蛋白係選自由以下組成之群：EGFP、mCherry、mClover3、mRuby3、mApple、iRFP、tdTomato、mVenus、YFP、RFP、螢火蟲螢光素酶及奈米螢光素酶。
57. 如實施例1至56中任一項之方法，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸以可操作方式連接於p40啟動子。
58. 如實施例1至57中任一項之方法，其中編碼報導蛋白之核酸以可操作方式連接於細胞類型及/或組織特異性啟動子。
59. 如實施例58之方法，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
60. 如實施例59之方法，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為hSyn1啟動子。
61. 如實施例60之方法，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為TTR啟動子。
62. 如實施例1至61中任一項之方法，其中該報導蛋白與定位信號融合。
63. 如實施例62之方法，其中該定位信號在N端、在C端或在N端及C端與報導蛋白融合。
64. 如實施例1至63中任一項之方法，其中該定位信號為核定位信號(NLS)、核膜結合域或組蛋白結合域。
65. 如實施例64之方法，其中該NLS為SV40 NLS。
66. 如實施例64之方法，其中該核膜結合域為KASH域。
67. 如實施例64之方法，其中該組蛋白結合域為H2B。
68. 如實施例1至67中任一項之方法，其中該包含條形碼之核酸之長度為5-18個核苷酸。
69. 如實施例1至68中任一項之方法，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
70. 如實施例1至68中任一項之方法，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
71. 如實施例1至68中任一項之方法，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
72. 如實施例1至68中任一項之方法，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
73. 如實施例1至72中任一項之方法，其中具有所需特徵之AAV衣殼變異體係經由相關的一或多個條形碼之定序來鑑別。
74. 如實施例1至73中任一項之方法，其中具有所需特徵之AAV衣殼變異體係藉由AAV基因組之純化及定序來鑑別。
75. 如實施例1至74中任一項之方法，其中該細胞、細胞株或組織選自由以下組成之群：CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴及口腔黏膜。
76. 如實施例1至74中任一項之方法，其中該細胞係選自：神經元、膠細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞、室管膜細胞、肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞、肝內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。
77. 一種AAV變異體之文庫，其中該文庫之各成員包含： a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸。
78. 一種AAV變異體之文庫，其中該文庫之各成員包含： a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸。
79. 如實施例77之文庫，其中該文庫之各成員包含側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變。
80. 如實施例78之文庫，其中該文庫之各成員包含側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變。
81. 如實施例77至80中任一項之文庫，其中該文庫之各成員包含編碼定位信號之核酸。
82. 如實施例77至81中任一項之文庫，其中該文庫之各成員含有包含條形碼之核酸。
83. 如實施例77至82中任一項之文庫，其中該文庫之各成員含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。
84. 如實施例83之文庫，其中包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸不同。
85. 如實施例84之文庫，其中包含第一條形碼序列之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
86. 如實施例84之文庫，其中包含第一條形碼序列之第一核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
87. 如實施例84之文庫，其中包含第二條形碼序列之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
88. 如實施例84之文庫，其中包含第二條形碼序列之第二核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
89. 如實施例8382至88中任一項之文庫，其中包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。
90. 如實施例89之文庫，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子。
91. 如實施例89之文庫，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子。
92. 如實施例89之文庫，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子以可操作方式連接於RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子為RNA Pol III啟動子。
93. 如實施例90至91中任一項之文庫，其中RNA Pol II啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
94. 如實施例91至93中任一項之文庫，其中RNA Pol III啟動子係選自由以下組成之群：U6啟動子、H1啟動子及7SK啟動子。
95. 如實施例78至94中任一項之文庫，其中該文庫之各成員包含編碼報導蛋白之核酸。
96. 如實施例77至95中任一項之文庫，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於獨立核酸分子中。
97. 如實施例77至95中任一項之文庫，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於一個核酸分子中。
98. 如實施例97之文庫，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。
99. 如實施例97之文庫，其中該文庫之各成員包含：5'ITR序列、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸、編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
100. 如實施例77至99中任一項之文庫，其中AAV變異體衍生自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
101. 如實施例100之文庫，其中該AAV變異體之文庫包含衍生自兩種或更多種AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。
102. 如實施例77至101中任一項之文庫，其中該肽之長度為4-15個胺基酸。
103. 如實施例102之文庫，其中該肽之長度為6-15個胺基酸。
104. 如實施例103之文庫，其中該肽之長度為7、10或15個胺基酸。
105. 如實施例104之文庫，其中該肽之長度為7個胺基酸。
106. 如實施例77至105中任一項之文庫，其中該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
107. 如實施例106之文庫，其中該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
108.  如實施例77至106中任一項之文庫，其中該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
109. 如實施例108之文庫，其中該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
110. 如實施例77至109中任一項之文庫，其中該肽插入至選自由以下組成之群的區域中：衣殼蛋白之VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII及VR-IX區域。
111. 如實施例110之文庫，其中該肽插入至衣殼蛋白之VR-I中。
112. 如實施例110之文庫，其中該肽插入至衣殼蛋白之VR-IV中。
113. 如實施例110之文庫，其中該肽插入至衣殼蛋白之VR-VIII中。
114. 如實施例77至113中任一項之文庫，其中該肽插入至衣殼蛋白VP1、VP2或VP3中。
115. 如實施例77至114中任一項之文庫，其中該肽插入衣殼蛋白之胺基酸殘基450與600之間的位置處。
116. 如實施例77至115中任一項之文庫，其中 (i)該AAV血清型為AAV1且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置590處， (ii)該AAV血清型為AAV6且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置454或590處， (iii)該AAV血清型為AAV2且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置588處， (iv)該AAV血清型為AAV3B且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置589處， (v)該AAV血清型為AAV5且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置578處， (vi)該AAV血清型為AAV8且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置591處，或 (vii)該AAV血清型為AAV9且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置266、455或589處， 其中該位置對應於AAV血清型中VP1之編號。
117. 如實施例77至116中任一項之文庫，其中該報導蛋白為螢光蛋白。
118. 如實施例117之文庫，其中該報導蛋白係選自由以下組成之群：EGFP、mCherry、mClover3、mRuby3、mApple、iRFP、tdTomato、mVenus、YFP、RFP、螢火蟲螢光素酶及奈米螢光素酶。
119. 如實施例77至118中任一項之文庫，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸以可操作方式連接於p40啟動子。
120. 如實施例77至119中任一項之文庫，其中編碼報導蛋白之核酸以可操作方式連接於細胞類型及/或組織特異性啟動子。
121. 如實施例120之文庫，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
122. 如實施例121之文庫，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為hSyn1啟動子。
123. 如實施例121之文庫，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為TTR啟動子。
124. 如實施例77至123中任一項之文庫，其中該報導蛋白與定位信號融合。
125. 如實施例124之文庫，其中該定位信號在N端、在C端或在N端及C端與報導蛋白融合。
126. 如實施例77至125中任一項之文庫，其中該定位信號為核定位信號(NLS)、核膜結合域或組蛋白結合域。
127. 如實施例126之文庫，其中該NLS為SV40 NLS。
128. 如實施例126之文庫，其中該核膜結合域為KASH域。
129. 如實施例126之文庫，其中該組蛋白結合域為H2B。
130. 如實施例77至129中任一項之文庫，其中包含條形碼之核酸之長度為5-18個核苷酸。
131. 如實施例77至130中任一項之文庫，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
132. 如實施例77至130中任一項之文庫，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
133. 如實施例77至132中任一項之文庫，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
134. 如實施例77至132中任一項之文庫，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
135.  一種AAV變異體，其包含： a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸。
136.  一種AAV變異體，其包含： a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸。
137. 如實施例135之變異體，其中該變異體包含側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變。
138. 如實施例136之變異體，其中該變異體包含側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變。
139. 如實施例135至136中任一項之變異體，其中該變異體包含編碼定位信號之核酸。
140. 如實施例135至139中任一項之變異體，其中該變異體含有包含條形碼之核酸。
141. 如實施例138至139中任一項之變異體，其中該變異體含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。
142. 如實施例141之變異體，其中包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸不同。
143. 如實施例142之變異體，其中包含第一條形碼序列之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
144. 如實施例142之變異體，其中包含第一條形碼序列之第一核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
145. 如實施例142之變異體，其中包含第二條形碼序列之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
146. 如實施例142之變異體，其中包含第二條形碼序列之第二核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
147. 如實施例142至146中任一項之變異體，其中包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。
148. 如實施例147之變異體，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子。
149. 如實施例147之變異體，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子。
150. 如實施例147之變異體，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子以可操作方式連接於RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子為RNA Pol III啟動子。
151. 如實施例148至150中任一項之變異體，其中RNA Pol II啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
152. 如實施例149至151中任一項之變異體，其中RNA Pol III啟動子係選自由以下組成之群：U6啟動子、H1啟動子及7SK啟動子。
153. 如實施例135至152中任一項之變異體，其中該變異體包含編碼報導蛋白之核酸。
154. 如實施例135至153中任一項之變異體，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於獨立核酸分子中。
155. 如實施例135至154中任一項之變異體，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸位於一個核酸分子中。
156. 如實施例155之變異體，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及編碼定位信號之核酸、包含條形碼之核酸及/或編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。
157. 如實施例156之變異體，其中該變異體包含：5'ITR序列、包含條形碼之核酸、編碼報導蛋白之核酸、編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
158. 如實施例135至157中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
159. 如實施例135至158中任一項之變異體，其中該肽之長度為4-15個胺基酸。
160. 如實施例159之變異體，其中該肽之長度為6-15個胺基酸。
161. 如實施例160之變異體，其中該肽之長度為7、10或15個胺基酸。
162. 如實施例161之變異體，其中該肽之長度為7個胺基酸。
163. 如實施例135至162中任一項之變異體，其中該插入肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
164. 如實施例163之變異體，其中該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
165. 如實施例135至162中任一項之變異體，其中該插入肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
166. 如實施例165之變異體，其中該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
167. 如實施例135至166中任一項之變異體，其中該肽插入至選自由以下組成之群的區域中：衣殼蛋白之VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII及VR-IX區域。
168. 如實施例167之變異體，其中該肽插入至衣殼蛋白之VR-I中。
169. 如實施例167之變異體，其中該肽插入至衣殼蛋白之VR-IV中。
170. 如實施例168之變異體，其中該肽插入至衣殼蛋白之VR-VIII中。
171. 如實施例135至170中任一項之變異體，其中該肽插入至衣殼蛋白VP1、VP2或VP3中。
172. 如實施例135至171中任一項之變異體，其中該肽插入衣殼蛋白之胺基酸殘基450與600之間的位置處。
173. 如實施例135至172中任一項之變異體，其中 (i)該AAV血清型為AAV1且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置590處， (ii)該AAV血清型為AAV6且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置454或590處， (iii)該AAV血清型為AAV2且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置588處， (iv)該AAV血清型為AAV3B且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置589處， (v)該AAV血清型為AAV5且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置578處， (vi)該AAV血清型為AAV8且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置591處，或 (vii)該AAV血清型為AAV9且該肽插入衣殼蛋白之胺基酸位置266、455或589處， 其中該位置對應於AAV血清型中VP1之編號。
174. 如實施例135至173中任一項之變異體，其中該報導蛋白為螢光蛋白。
175. 如實施例174之變異體，其中該報導蛋白係選自由以下組成之群：EGFP、mCherry、mClover3、mRuby3、mApple、iRFP、tdTomato、mVenus、YFP、RFP、螢火蟲螢光素酶及奈米螢光素酶。
176. 如實施例135至175中任一項之變異體，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸以可操作方式連接於p40啟動子。
177. 如實施例138至176中任一項之變異體，其中編碼報導蛋白之核酸以可操作方式連接於細胞類型及/或組織特異性啟動子。
178. 如實施例177之變異體，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
179. 如實施例178之變異體，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為hSyn1啟動子。
180. 如實施例178之變異體，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為TTR啟動子。
181. 如實施例135至180中任一項之變異體，其中該報導蛋白與定位信號融合。
182. 如實施例181之變異體，其中該定位信號在N端、在C端或在N端及C端與報導蛋白融合。
183. 如實施例135至182中任一項之變異體，其中該定位信號為核定位信號(NLS)、核膜結合域或組蛋白結合域。
184. 如實施例183之變異體，其中該NLS為SV40 NLS。
185. 如實施例183之變異體，其中該核膜結合域為KASH域。
186. 如實施例183之變異體，其中該組蛋白結合域為H2B。
187. 如實施例135至186中任一項之變異體，其中包含條形碼之核酸之長度為5-18個核苷酸。
188. 如實施例135至187中任一項之變異體，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
189. 如實施例188之變異體，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
190. 如實施例135至187中任一項之變異體，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
191. 如實施例190之變異體，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
192. 如實施例135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV1。
193 如實施例192之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 68至SEQ ID NO: 75中之任一者組成之群的胺基酸序列。
194. 如實施例192之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3組成之群的胺基酸序列。
195. 如實施例192之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 71。
196. 如實施例135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV2。
197. 如實施例196之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 90至SEQ ID NO: 110中之任一者組成之群的胺基酸序列。
198.  如實施例196之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由以下組成之群的序列中之任一者：SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 91及SEQ ID NO: 102。
199. 如實施例196之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 4-7中之任一者組成之群的胺基酸序列。
200. 如實施例135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV3B。
201. 如實施例200之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由以下組成之群的序列中之任一者：SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 76及SEQ ID NO: 83。
202. 如實施例200之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 8至SEQ ID NO: 11中之任一者組成之群的胺基酸序列。
203. 如實施例135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV5。
204. 如實施例203之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 28至SEQ ID NO: 32中之任一者組成之群的胺基酸序列。
205. 如實施例135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV6。
206. 如實施例205之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 19至SEQ ID NO: 27中之任一者組成之群的胺基酸序列。
207. 如實施例135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV9。
208. 如實施例207之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 18中之任一者組成之群的胺基酸序列。
209. 如實施例207之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 86至SEQ ID NO: 89中之任一者組成之群的胺基酸序列。
210. 如實施例207之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含序列SEQ ID NO: 89。
211.  一種核酸分子，其包含： a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)編碼變異衣殼蛋白之核酸序列，該變異衣殼蛋白在其高變環及/或外露表面環中側接肽插入位點之核苷酸序列中包含一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸序列； d)包含條形碼之核酸序列；及 e)編碼報導蛋白之核酸序列。
212. 如實施例211之核酸分子，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列在側接a)之AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中包含一或多個沉默突變。
213. 如實施例212之核酸分子，其中該核酸分子包含編碼定位信號之核酸。
214. 如實施例212之核酸分子，其中該核酸分子含有包含條形碼之核酸。
215. 如實施例211至214之核酸分子，其中該核酸分子含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。
216. 如實施例215之核酸分子，其中該包含第一條形碼之第一核酸及該包含第二條形碼之第二核酸不同。
217. 如實施例216之核酸分子，其中包含第一條形碼序列之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
218. 如實施例217之核酸分子，其中包含第一條形碼序列之第一核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
219. 如實施例216之核酸分子，其中包含第二條形碼序列之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
220. 如實施例217之核酸分子，其中包含第二條形碼序列之第二核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
221. 如實施例215至220中任一項之核酸分子，其中包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。
222. 如實施例221之核酸分子，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子。
223. 如實施例221之核酸分子，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子及以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子。
224. 如實施例221之核酸分子，其中以可操作方式連接於包含第一條形碼之第一核酸的啟動子以可操作方式連接於RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於包含第二條形碼之第二核酸的啟動子為RNA Pol III啟動子。
225. 如實施例222至224中任一項之核酸分子，其中RNA Pol II啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
226. 如實施例223至224中任一項之核酸分子，其中RNA Pol III啟動子係選自由以下組成之群：U6啟動子、H1啟動子及7SK啟動子。
227. 如實施例211至226中任一項之核酸分子，其中該核酸分子包含編碼報導蛋白之核酸。
228. 如實施例211至227中任一項之核酸分子，其中AAV變異體衍生自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
229. 如實施例211至228中任一項之核酸分子，其中該插入肽之長度為4-15個胺基酸。
230. 如實施例229之核酸分子，其中該插入肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
231.  如實施例229之核酸分子，其中該插入肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
232. 如實施例211至231中任一項之核酸分子，其中編碼報導蛋白之核酸以可操作方式連接於細胞類型及/或組織特異性啟動子。
233. 如實施例232之核酸分子，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為hSyn1啟動子。
234. 如實施例211至233中任一項之核酸分子，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
235. 如實施例211至233中任一項之核酸分子，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
236. 一種如實施例135至210中任一項之AAV變異體之用途，其用於將轉殖基因遞送至目標細胞或組織。
237. 一種AAV載體，其包含編碼肽之核酸分子，該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
238. 如實施例237之AAV載體，其中該核酸編碼包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的肽。
239. 如實施例237或238之AAV載體，其中該核酸編碼具有SEQ ID NO: 1-32中之任一者之序列的肽。
240. 一種AAV載體，其包含編碼肽之核酸分子，該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
241. 如實施例240之AAV載體，其中該核酸編碼包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的肽。
242. 如實施例240或241之AAV載體，其中該核酸編碼具有SEQ ID NO: 68-110中之任一者之序列的肽。
243. 如實施例240之AAV載體，其中該核酸編碼包含以下中之任一者中所闡述之胺基酸序列的肽：SEQ ID NO: 71、76-80、83、89、91、94-96、101-103及106。
244. 如實施例237至243中任一項之AAV載體，其中該肽為衣殼蛋白之一部分。
245. 如實施例244之AAV載體，其中該衣殼蛋白為VP1、VP2或VP3。
246. 如實施例237至245中任一項之AVV載體，其中該肽插入衣殼蛋白之胺基酸殘基450與600之間的位置處。
247. 如實施例246之AAV載體，其中該肽插入於 (i) AAV1衣殼蛋白之胺基酸位置590， (ii) AAV6衣殼蛋白之胺基酸位置454或590， (iii) AAV2衣殼蛋白之胺基酸位置588， (iv) AAV3B衣殼蛋白之胺基酸位置589， (v) AAV5衣殼蛋白之胺基酸位置578， (vi) AAV8衣殼蛋白之胺基酸位置591，或 (vi) AAV9衣殼蛋白之胺基酸位置266、455或589， 其中該位置對應於AAV血清型中VP1之編號。
248. 一種醫藥組合物，其包含如實施例237至247中任一項之AAV載體及醫藥學上可接受之載劑。
249. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
250. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
251. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 71、76-80、83、89、91、94-96、101-103及106中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
252. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 71、76-80、83及94-96中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
253. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 89、91、101-103及106中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
254. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 68至SEQ ID NO: 75中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
255. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
256. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 71中所闡述之胺基酸序列。
257. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 90至SEQ ID NO: 110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
258.  一種肽，其包含SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 91及SEQ ID NO: 102中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
259. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 4-7中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
260. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 76及SEQ ID NO: 83中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
261. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 8至SEQ ID NO: 11中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
262. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 28至SEQ ID NO: 32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
263. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 19至SEQ ID NO: 27中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
264. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 18中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
265. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 86至SEQ ID NO: 89中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
266. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 89中所闡述之胺基酸序列。
267. 如實施例249至266中任一項之肽，其中該肽為AAV載體之一部分。
268. 如實施例267之肽，其中該肽為AAV載體之衣殼蛋白之一部分。
269. 一種核酸分子，其編碼如實施例249至268中任一項之肽。
270. 一種衣殼蛋白，其包含肽，該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
271. 一種衣殼蛋白，其包含肽，該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
272. 如實施例270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
273.  如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
274.  如實施例270之衣殼蛋白，其包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
275.  如實施例271之衣殼蛋白，其包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
276. 如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 71、76-80、83、89、91、94-96、101-103及106中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
277. 如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 71、76-80、83及94-96中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
278. 如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 89、91、101-103及106中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
279. 如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 68至SEQ ID NO: 75中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
280. 如實施例270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
281. 如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 71中所闡述之胺基酸序列。
282. 如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 90至SEQ ID NO: 110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
283.  如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 91及SEQ ID NO: 102中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
284. 如實施例270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 4-7中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
285. 如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 76及SEQ ID NO: 83中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
286. 如實施例270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 8至SEQ ID NO: 11中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
287. 如實施例270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 28至SEQ ID NO: 32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
288. 如實施例270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 19至SEQ ID NO: 27中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
289. 如實施例270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 18中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
290. 如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 86至SEQ ID NO: 89中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
291. 如實施例271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 89中所闡述之胺基酸序列。
292. 一種核酸分子，其編碼如實施例269至291中任一項之衣殼蛋白。
293. 一種將核酸遞送至個體之目標細胞或組織之方法，其包含：投與包含如實施例237至247中任一項之AAV載體的組合物。
294. 如實施例293之方法，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
295. 如實施例293之方法，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
296. 如實施例293至295中任一項之方法，其中該目標細胞、細胞株或組織選自由以下組成之群：CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴及口腔黏膜。
297. 如實施例293至295中任一項之方法，其中目標細胞選自由以下組成之群：神經元、膠細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞、室管膜細胞、肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞、肝內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。
298.  如實施例296之方法，其中目標細胞或組織來自肝臟。
299. 如實施例296之方法，其中目標細胞或組織來自CNS。
300. 一種醫藥組合物，其包含如實施例135至211中任一項之變異體及醫藥學上可接受之載劑。
無
本專利或申請案檔案含有至少一張彩製圖。
圖 1 描繪與衣殼文庫組裝相關之資訊。圖A為AAV衣殼蛋白之圖示，其中箭頭指示肽所插入之外露環。組1B為肽所插入之AAV血清型主鏈之圖式。在肽插入位點周圍的區域(顯示為與插入肽區域，「肽」鄰近的灰色框)中進行沉默突變，以使得能夠使用相同的通用下一代定序(NGS)引子來擴增多樣化區域及在面對面直接比較中定量變異體效能。描繪單一插入區域(VR-VIII)作為代表性實例，但相同策略對以多樣化為目標之其他衣殼區域普遍適用。
圖 2 說明用於產生具有高多樣性之衣殼文庫之方法的實例。圖A展示用於建立衣殼編碼基因之片段，其中左右兩個片段藉由兩個PCR擴增產物及預消化質體主鏈之Gibson組裝接合。圖B為用於藉由Gibson組裝接合兩個片段之引子對(反向：SEQ ID NO: 204及正向：SEQ ID NO: 205)之放大圖，且亦描繪RF Fwd引子中包括之多樣化序列，其中X之長度可為12至45個核苷酸。
圖 3A 及圖 3B 為各種文庫構築體之圖式，該等構築體含有與表現卡匣呈順式之變異衣殼文庫，兩者均側接有用於病毒基因組之衣殼化的病毒ITR。圖A為構築體，其中變異衣殼基因「Cap」由p40啟動子調節，且轉錄物經聚腺苷酸化信號序列(「polyA」)封端。構築體亦包含由CMV啟動子調節之EGFP報導基因，其中EGFP在其N端上連接至SV40核定位序列(「SV40 NLS」)。構築體亦包含牛生長激素polyA信號序列BGH及5'及3' ITR序列。圖B與圖A類似，除了其具有mCherry報導子。圖C展示變異衣殼基因之相同設計，且進一步包含由CMV啟動子調節之EGFP報導基因，其中EGFP基因與KASH核膜結合域(「KASH」)融合。圖D展示與組C類似之構築體，除了使用mCherry報導子。圖E展示構築體，其具有相同變異衣殼表現構築體，但在其3'端上具有驅動與組蛋白2B DNA結合域(「H2B」)融合之EGFP報導子之表現的突觸蛋白啟動子(「hSyn1」)。構築體亦包含SV40聚腺苷酸化信號序列。圖F及G與圖E類似，除了圖F使用mClover3報導子且圖G使用mRuby3報導子。
圖 4A 及圖 4B 說明用於將各變異衣殼序列與隨機產生或指定之條形碼以生物資訊學方式連接之方法1的步驟。在步驟1中，合成一小段DNA，其包含隨機產生或指定之條形碼及隨機產生或指定之衣殼變異區域，以及用於Gibson組裝之兩個區域。步驟2包含擴增多樣化區域之衣殼序列3'。步驟3為Gibson組裝反應，其中5'ITR及SV40聚腺苷酸化序列與條形碼在5'端上融合，且第二Gibson組裝區域與衣殼基因之3'端及用於衣殼基因之polyA信號及3'ITR融合。步驟4包含跨越條形碼及變異衣殼序列進行ILLUMINA® 定序。步驟5包含用BsaI限制酶進行消化。步驟6為PCR擴增步驟，其中製備了H2B、EGFP、hSyn1及p40啟動子，及衣殼基因之5'端。或者，包含H2B、EGFP、hSyn1、p40啟動子及衣殼基因之5'端的片段可預組裝於供體質體中，用BsaI消化，且經凝膠純化。步驟7為最終golden gate選殖步驟以產生最終構築體。
圖 4C 及圖 4D 說明用於將各變異衣殼序列與隨機產生之條形碼以生物資訊學方式連接之方法1的替代方式。在步驟1中，合成兩個DNA片段。片段A包含Gibson組裝區域#1、BsaI位點、可變衣殼區域及與用作PCR引子之衣殼基因同源之區域。片段B包含Gibson組裝區域#2、隨機條形碼、BsaI位點及Gibson組裝區域#1。隨後，進行PCR程序，其中使用步驟1中合成之片段A作為PCR引子來擴增衣殼基因之3'序列。隨後，藉由Gibson組裝產生中間AAV構築體，其中構築體以5'至3'次序包含5' ITR、SV40 poly A信號、條形碼、兩個限制性核酸內切酶位點、變異衣殼序列、衣殼蛋白之3'區域、用於衣殼表現構築體之polyA序列及3' ITR (步驟3)。步驟4包含跨越條形碼及變異衣殼序列進行ILLUMINA® 定序。步驟5包含用BsaI限制酶進行消化。步驟6為PCR擴增步驟，其中製備了H2B、EGFP、hSyn1及p40啟動子，及衣殼基因之5'端。或者，包含H2B、EGFP、hSyn1、p40啟動子及衣殼基因之5'端的片段可預組裝於供體質體中，用BsaI消化，且經凝膠純化。步驟7為最終golden gate選殖步驟以產生最終構築體。
圖 5 說明用於將各突變衣殼序列與隨機產生之條形碼以生物資訊學方式連接之方法2的步驟。首先，兩組ILLUMINA®定序引子用於分別以高保真度對隨機條形碼及突變衣殼序列進行定序。隨後，進行OXFORD NANOPORE® 定序以對整個構築體進行定序。奈米孔定序之精確性比不上ILLUMINA®定序，但可用於經由生物資訊學分析將兩個ILLUMINA®序列連接至一個分子。
圖 6 為在經AAV變異體文庫轉導後自原代小鼠皮質神經元分離之AAV變異體的圖。Y軸指示與轉導之前的所投與文庫中之變異體頻率相比，在自經轉導細胞選擇及回收之後的變異體頻率之log2倍數變化。資料表明AAV血清型傾向於叢集，其中與基於插入至其他AAV血清型中之變異體相比，基於AAV1之變異體為原代小鼠神經元中最富集的。
圖 7A 及圖 7B 為AAV1變異體(圖7A)或AAV2變異體(圖7B)之圖。在圖7A中，衣殼序列中不具有任何插入肽之野生型AAV1經標記。資料表明相比於野生型AAV1，許多插入肽序列引起變異體富集。在圖7B中，衣殼序列中不具有任何插入肽之野生型AAV2經標記。資料表明相比於野生型AAV2，許多插入肽序列在細胞核中引起變異體富集。
圖 8 描繪展示經富集AAV變異體之兩個圖，該等變異體藉由自目標細胞分離之RNA的反轉錄及條形碼之擴增(左側圖)，或藉由自經處理細胞分離細胞核及定序編碼插入至衣殼基因中之肽的插入核苷酸(右側圖)進行分析。資料表明藉由兩種分析方法獲得極類似結果。左圖及右圖按出現之次序(各圖中頂部至底部)分別各公開SEQ ID NO: 199-203。
圖 9 展示經不同報導基因構築體轉導之HEK293細胞的顯微照片。圖A展示經單獨包含EGFP報導子之AAV變異體轉導的HEK293細胞，而圖B展示當HEK293細胞經包含與EGFP基因融合之SV40核定位序列(NLS)的構築體轉導，在細胞核中引起報導子積聚時之結果。圖C展示經包含KASH連接之EGFP序列之AAV構築體轉導的HEK293細胞之結果，且圖D展示經包含mCherry報導子之AAV構築體轉導的HEK293細胞。圖E展示當AAV構築體包含與SV40 NLS融合之mCherry時的結果，且圖F展示當mCherry與KASH融合時的結果。
圖 10A 及圖 10B 為來自小鼠腦組織之免疫組織化學顯微照片，其描繪在注射後，包含EGFP-H2B融合物之AAV變異體文庫之核定位神經元報導子表現(皮質、海馬區、丘腦)(圖A及B)。圖C展示小鼠腦組織，描繪了在注射後，包含mClover3-H2B融合物之AAV變異體文庫之核定位神經元報導子表現(皮質、海馬區丘腦)。圖D及E展示小鼠腦組織，描繪了在注射後，包含EGFP-KASH融合物之AAV變異體文庫的核膜定位神經元報導子表現(皮質、海馬區、丘腦)。圖F展示小鼠腦組織，描繪了在注射後，包含mRuby3-H2B融合物之AAV變異體文庫之核定位神經元報導子表現(皮質、海馬區丘腦)。圖F中之影像為固定腦切片中之天然螢光。
圖 11 描繪自小鼠之神經元組織分離之細胞核的FACS分析，該等小鼠用包含EGFP-H2B報導子之AAV變異體治療。在單獨注射調配物緩衝液(調配物)之小鼠中，檢查之腦組織不展現任何EGFP螢光(圖中描繪皮質組織)。相比之下，對於自用AAV變異體治療之小鼠分離的細胞核，可在胸部脊髓(總事件之7.68%)、丘腦(總事件之16.53%)及皮質(總事件之6.54%)中偵測到報導子信號傳導。
圖 12 描繪自小鼠分離之細胞核的FACS分析，該等小鼠用包含mClover3報導子構築體或EGFP-KASH報導子之AAV變異體治療。在兩種類型之AAV變異體的情況下，對於mClover3在丘腦中(總事件之14.72%)且對於EGFP-KASH在皮質中(4.88%)均可見報導子信號。
圖 13 描繪自小鼠分離之細胞核的FACS分析，該等小鼠用包含mRuby3報導子構築體之AAV變異體治療，其中如所示，在皮質中偵測到報導子信號(總事件之7.62%)。
圖 14 描繪當報導基因由hSyn1啟動子驅動(神經元特異性)時，自非CNS組織分離之細胞核的FACS分析。圖A展示與調配物緩衝液相比，來自用包含EGFP-H2B構築體之AAV變異體治療之小鼠之肝組織的信號比較，而圖B展示心臟組織中之相同比較。未觀測到來自hSyn1啟動子之脫靶表現。
圖 15A 、圖 15B 及圖 15C 描繪一系列圖，其支持當包含由肝臟特異性TTR啟動子驅動之EGFP-H2B構築體的AAV變異體文庫以不同劑量(3×103 (圖B)；1×104 (圖C)；3×104 (圖D)；1×105 (圖E)；3×105 (圖F)及1×106 (圖G)，相比於模擬(圖A))活體外引入至HepG2細胞中時，EGFP報導子信號之明顯劑量反應。
圖 16 描繪在向動物注射AAV變異體文庫後，自肝組織分離之NHP (非人類靈長類動物)細胞核中偵測之報導子信號(圖A)。圖B展示肝組織之免疫組織化學分析，且表明在雄性及雌性NHP之肝臟中均偵測到核定位報導子信號(細胞核褐色染色)。
圖 17A 及圖 17B 根據進行肽插入之親本血清型展示前2500個倍數富集之AAV變異體之分佈。資料係獲自分選及定序。在活體外自HepG2 (圖A)及原代人類肝細胞(圖B)相比於在活體內自小鼠(圖C)及NHP肝組織(圖D)分離之EGFP陽性細胞核。如圖中可見，當以不同選擇壓力刺激時成功的AAV變異體之親本血清型存在顯著差異。
圖 18 展示高度富集AAV變異體之取樣及自第二輪NHP肝組織篩選鑑別之插入肽序列(「肽」，SEQ ID NO 1至32)。如可見，變異體係基於插入至AAV1、AAV2、AAV3B、AAV9、AAV6及AAV5血清型中，其中肽序列係插入至各指定血清型中之以下胺基酸位置中：AAV1 (590)、AAV2 (588)、AAV3B (589)、AAV5 (578)、AAV6 (454)、AAV8 (591)、AAV9 (589)。資料展示經由第二輪篩選之個別變異體富集，如藉由分析以下各者所量測：自肝組織分離之AAV文庫衍生之帶條形碼的mRNA轉錄物(「第2輪mRNA」)、基於EGFP-H2B報導子信號使用FACS分離的自細胞核定序之病毒基因組DNA (「第2輪細胞核」)、在第2輪自總肝臟基因組DNA定序之病毒基因組DNA (「第2輪總gDNA」)及在第1輪自總肝臟基因組DNA定序之病毒基因組DNA(「第1輪總gDNA」)。亦展示當由瞬時轉染至HEK293細胞中產生時，AAV變異體之相對產率。藉由圓之大小來指示相比於注射之前文庫中之百分比，個別變異體在自組織分離時之富集程度。舉例而言，與起始文庫相比，具有插入肽序列QGALAQV (SEQ ID NO: 8)之AAV3B血清型變異體在自NHP組織分離時，mRNA條形碼頻率之log2倍數富集為6.1。圓之顏色暗度亦與右下方所示之標度有關，其展示針對特定變異體跨越多個動物及組織衝壓之效能相對變化性。
圖 19 為在感染Neuro2A細胞之後回收之AAV文庫變異體的氣泡圖。log2倍數變化表示與所投與文庫中之變異體頻率相比，在感染及回收表現於經轉導Neuro2A細胞中的轉錄物之後，變異體頻率之變化。野生型血清型之效能經指示，且變異體1-43 (SEQ ID NO: 68-110)之效能列於圖29A-D中。
圖 20 為在感染原代小鼠皮質神經元之後回收之AAV文庫變異體的氣泡圖。log2倍數變化表示與所投與文庫中之變異體頻率相比，在感染及回收表現於經轉導神經元中的轉錄物之後，變異體頻率之變化。野生型血清型之效能經指示，且變異體1-43 (SEQ ID NO: 68-110)之效能列於圖29A-D中。
圖 21 為在感染衍生自人類誘導多能幹細胞之iCell人類神經元之後回收之AAV文庫變異體的氣泡圖。log2倍數變化表示與所投與文庫中之變異體頻率相比，在感染及回收表現於經轉導神經元中的轉錄物之後，變異體頻率之變化。野生型血清型之效能經指示，且變異體1-43 (SEQ ID NO: 68-110)之效能列於圖29A-D中。
圖 22 為在腦室內投與AAV變異體文庫之後自C57BL/6J小鼠CNS組織回收之AAV文庫變異體的氣泡圖。分析中包括之組織區域為紋狀體、海馬區、小腦、丘腦、下丘腦、中腦、腦幹、運動皮質、軀體感覺皮質、其餘皮質、頸部脊髓、胸部脊髓及腰部脊髓。log2倍數變化表示與所投與文庫中之變異體頻率相比，在感染及回收表現於經轉導神經元中的轉錄物之後，變異體頻率之變化。野生型血清型之效能經指示，且變異體1-43 (SEQ ID NO: 68-110)之效能列於圖29A-D中。
圖 23 為在鞘內投與AAV變異體文庫之後自非人類靈長類動物CNS組織回收之AAV文庫變異體的氣泡圖。此分析中包括之組織區域為海馬區、內嗅皮質、顳葉皮質、額葉皮質及頂葉皮層。log2倍數變化表示與所投與文庫中之變異體頻率相比，在感染及回收來自組織之病毒基因組DNA之後，變異體頻率之變化。野生型血清型之效能經指示，且變異體1-43 (SEQ ID NO: 68-110)之效能列於圖29A-D中。
圖 24 為在鞘內投與AAV變異體文庫之後自非人類靈長類動物CNS組織回收之AAV文庫變異體的氣泡圖。此分析中包括之組織區域為腦橋、髓質、小腦及運動皮質。log2倍數變化表示與所投與文庫中之變異體頻率相比，在感染及回收來自組織之病毒基因組DNA之後，變異體頻率之變化。野生型血清型之效能經指示，且變異體1-43 (SEQ ID NO: 68-110)之效能列於圖29A-D中。
圖 25 為在鞘內投與AAV變異體文庫之後自非人類靈長類動物脊髓回收之AAV文庫變異體的氣泡圖。log2倍數變化表示與所投與文庫中之變異體頻率相比，在感染及回收來自組織之病毒基因組DNA之後，變異體頻率之變化。野生型血清型之效能經指示，且變異體1-43 (SEQ ID NO: 68-110)之效能列於圖29A-D中。
圖 26 為在鞘內投與AAV變異體文庫之後自非人類靈長類動物CNS組織回收之AAV文庫變異體的氣泡圖。此分析中包括之組織區域為海馬區、內嗅皮質、顳葉皮質、額葉皮質及頂葉皮層。log2倍數變化表示與所投與文庫中之變異體頻率相比，在感染及回收表現於經轉導神經元中的轉錄物之後，變異體頻率之變化。野生型血清型之效能經指示，且變異體1-43 (SEQ ID NO: 68-110)之效能列於圖29A-D中。
圖 27 為在鞘內投與AAV變異體文庫之後自非人類靈長類動物CNS組織回收之AAV文庫變異體的氣泡圖。此分析中包括之組織區域為腦橋、髓質、小腦、黑質及運動皮質。log2倍數變化表示與所投與文庫中之變異體頻率相比，在感染及回收表現於經轉導神經元中的轉錄物之後，變異體頻率之變化。野生型血清型之效能經指示，且變異體1-43 (SEQ ID NO: 68-110)之效能列於圖29中。
圖 28 為在鞘內投與AAV變異體文庫之後自非人類靈長類動物脊髓回收之AAV文庫變異體的氣泡圖。log2倍數變化表示與所投與文庫中之變異體頻率相比，在感染及回收表現於經轉導神經元中的轉錄物之後，變異體頻率之變化。野生型血清型之效能經指示，且變異體1-43 (SEQ ID NO: 68-110)之效能列於圖29中。
圖 29A 、圖 29B 、 圖 29C 及圖 29D 展示高度富集AAV變異體及自第二輪NHP CNS組織篩選鑑別之插入肽序列(「肽」，SEQ ID NO 68-110)。變異體係基於插入至AAV1、AAV2、AAV3B及AAV9血清型中，其中肽序列係插入至各指定血清型中之以下胺基酸位置中：AAV1 (590)、AAV2 (588)、AAV3B (589)、AAV9 (589)。各變異體左側之數字(1至43 (SEQ ID NO: 68-110))對應於用於在圖19至28中繪製之數目。資料展示個別變異體經由第二輪篩選在多個細胞株或物種中之富集，如藉由自細胞或CNS組織分離之AAV文庫帶條形碼的mRNA轉錄物或載體基因組DNA之定量所量測。藉由圓之大小來指示相比於注射之前文庫中之百分比，各個別變異體在自細胞或組織分離時之富集程度。圓之顏色暗度亦與圖29D右下方所示之標度有關，其展示針對特定變異體跨越多個複本、動物及/或組織衝壓之效能相對變化性。
圖 30 為用於帶條形碼的AAV變異體之彙集評估之載體基因組卡匣的示意圖。卡匣含有RNA聚合酶II啟動子，其定量帶條形碼的轉錄物於目標細胞群體，例如神經元或肝細胞中之表現。另外，存在RNA聚合酶III啟動子(例如hU6)，其驅動所有細胞類型中之廣泛表現。此等啟動子之組合使得能夠對個別目標細胞類型及塊體組織兩者中之AAV變異體轉導排序。
圖 31 展示圖29A-D中之AAV變異體(變異體2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、16、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、49)子組之彙集評估的結果。對照血清型包括野生型AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO。在Neuro2A細胞(ATCC CCL-131)、原代小鼠皮質神經元(Gibco)及衍生自人類誘導多能幹細胞之iCell人類神經元中活體外評估帶條形碼的AAV變異體。圖30中所述之AAV表現卡匣用於彙集評估，且來自pol II神經元特異性hSyn1啟動子及pol III hU6遍存啟動子之獨特條形碼定量經標記。熱度圖中之值表示衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比，且捨入為百分比之最接近十分位。此等結果係藉由用於感染之集合體中各AAV變異體之頻率標準化。各AAV變異體之親本血清型根據隨附圖例著色。
圖 32 展示帶條形碼的AAV變異體(變異體2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、16、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、49)及對照血清型野生型AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO於iCell人類星形膠質細胞及衍生自人類誘導多能幹細胞之內皮細胞中之活體外評估。圖30中所述之載體基因組表現卡匣用於彙集評估，針對pol III hU6遍存啟動子呈現資料，未進行hSyn1條形碼量測，因為啟動子在非神經元細胞類型中具有極小活性。熱度圖中之值表示衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比，且捨入為百分比之最接近十分位。此等結果係藉由用於感染之集合體中各AAV變異體之頻率標準化。各AAV變異體之親本血清型根據隨附圖例著色。
圖 33 展示在向C57BL/6J小鼠單側腦室內投與之後，帶條形碼的AAV變異體(變異體2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、16、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、49)及對照血清型野生型AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO之活體內評估。資料係根據以下CNS區域彙總：腦幹(腦幹、中腦)、小腦、皮質(運動皮質、感覺皮質、其餘皮質)、深部腦區(海馬區、下丘腦、紋狀體、丘腦)及脊髓(頸部、胸部及腰部)。圖30中所述之AAV表現卡匣用於彙集評估，且來自pol II神經元特異性hSyn1啟動子及pol III hU6遍存啟動子之獨特條形碼定量經標記。熱度圖中之值表示衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比，且捨入為百分比之最接近十分位。此等結果係藉由投與之集合體中各AAV變異體之頻率標準化。各AAV變異體之親本血清型根據隨附圖例著色。
圖 34 展示在向史泊格-多利大鼠單側腦室內投與之後，帶條形碼的AAV變異體(變異體2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、16、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、49)及對照血清型野生型AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO之活體內評估。資料係根據以下CNS區域彙總：腦幹(腦幹、中腦)、小腦、皮質(運動皮質、感覺皮質、其餘皮質)、深部腦區(海馬區、下丘腦、紋狀體、丘腦)及脊髓(頸部、胸部及腰部)。圖30中所述之AAV表現卡匣用於彙集評估，且來自pol II神經元特異性hSyn1啟動子及pol III hU6遍存啟動子之獨特條形碼定量經標記。熱度圖中之值表示衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比，且捨入為百分比之最接近十分位。此等結果係藉由投與之集合體中各AAV變異體之頻率標準化。各AAV變異體之親本血清型根據隨附圖例著色。
圖 35 展示在向非人類靈長類動物(食蟹獼猴)鞘內投與之後，帶條形碼的AAV變異體(變異體2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、16、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、49)及對照血清型野生型AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO之活體內評估。所示之資料來自對分離自NHP組織之總RNA的分析。資料係根據以下CNS區域彙總：腦幹(髓質、中腦、腦橋、黑質)、小腦(小腦、小腦蚓部)、皮質(內嗅皮質、額葉皮質、額眶回、梭狀回、眶外側回、眶內側回、運動皮質、海馬回、頂葉皮質、頂葉視覺皮質、扣帶後回、感覺皮質、軀體感覺皮質、顳葉皮質、視覺皮質)、深部腦區(杏仁核、尾核、海馬區、下丘腦、殼核、丘腦)及脊髓(頸部、胸部及腰部)。圖30中所述之AAV表現卡匣用於彙集評估，且來自pol II神經元特異性hSyn1啟動子及pol III hU6遍存啟動子之獨特條形碼定量經標記。熱度圖中之值表示衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比，且捨入為百分比之最接近十分位。此等結果係藉由投與之集合體中各AAV變異體之頻率標準化。各AAV變異體之親本血清型根據隨附圖例著色。
圖 36 展示在向非人類靈長類動物(食蟹獼猴)鞘內投與之後，帶條形碼的AAV變異體及對照血清型野生型AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO之活體內評估。所示之資料來自對分離自NHP組織之基因組DNA的分析。資料係根據以下CNS區域彙總：腦幹(髓質、腦橋、黑質)、小腦、皮質(內嗅皮質、額葉皮質、運動皮質、頂葉皮質、軀體感覺皮質、顳葉皮質)、深部腦區(尾核、海馬區、下丘腦、殼核、丘腦)及脊髓(頸部、胸部及腰部)。圖30中所述之AAV表現卡匣用於彙集評估，且來自pol II神經元特異性hSyn1啟動子及pol III hU6遍存啟動子之獨特條形碼定量經標記。熱度圖中之值表示衍生自各AAV變異體之NGS讀段的百分比，且捨入為百分比之最接近十分位。此等結果係藉由投與之集合體中各AAV變異體之頻率標準化。各AAV變異體之親本血清型根據隨附圖例著色。
圖 37 展示在向非人類靈長類動物(食蟹獼猴)鞘內投與之後，帶條形碼的AAV變異體及對照血清型野生型AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO之活體內評估。所示之資料來自對分離自NHP組織之總RNA的分析。資料係根據以下CNS區域彙總：腦幹(髓質、中腦、腦橋、黑質)、小腦(小腦、小腦蚓部)及皮質(內嗅皮質、額葉皮質、額眶回、梭狀回、眶外側回、眶內側回、運動皮質、海馬回、頂葉皮質、頂葉視覺皮質、扣帶後回、感覺皮質、軀體感覺皮質、顳葉皮質、視覺皮質)。繪製之結果展示相比於野生型AAV9，各血清型之讀段之標準化百分比的倍數增加。
圖 38 展示在向非人類靈長類動物(食蟹獼猴)鞘內投與之後，帶條形碼的AAV變異體及對照血清型野生型AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO之活體內評估。所示之資料來自對分離自NHP組織之總RNA的分析。資料係根據以下CNS區域彙總：深部腦區(杏仁核、尾核、海馬區、下丘腦、殼核、丘腦)及脊髓(頸部、胸部及腰部)。繪製之結果展示相比於野生型AAV9，各血清型之讀段之標準化百分比的倍數增加。
圖 39 展示在向非人類靈長類動物(食蟹獼猴)鞘內投與之後，帶條形碼的AAV變異體及對照血清型野生型AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO之活體內評估。所示之資料來自對分離自NHP組織之基因組DNA的分析。資料係根據以下CNS區域彙總：腦幹(髓質、腦橋、黑質)、小腦及皮質(內嗅皮質、額葉皮質、運動皮質、頂葉皮質、軀體感覺皮質、顳葉皮質)。繪製之結果展示相比於野生型AAV9，各血清型之讀段之標準化百分比的倍數增加。
圖 40 展示在向非人類靈長類動物(食蟹獼猴)鞘內投與之後，帶條形碼的AAV變異體及對照血清型野生型AAV9、PHP.B及AAV2_HSPGKO之活體內評估。所示之資料來自對分離自NHP組織之基因組DNA的分析。資料係根據以下CNS區域彙總：深部腦區(尾核、海馬區、下丘腦、殼核、丘腦)及脊髓(頸部、胸部及腰部)。繪製之結果展示相比於野生型AAV9，各血清型之讀段之標準化百分比的倍數增加。
圖 41 展示跨越不同物種之血清型效能的概述。針對hSyn1條形碼RNA分析呈現資料且根據非人類靈長類動物CNS中之效能對血清型排序。
圖 42 展示跨越不同物種之血清型效能的概述。針對hU6條形碼RNA分析呈現資料且根據非人類靈長類動物CNS中之效能對血清型排序。
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Claims (300)

  1. 一種鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法，其包含： (i)使細胞、細胞株或組織與AAV變異體之文庫接觸，其中該文庫之各成員包含： a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)側接a)之該AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸； (ii)使該文庫中之該等AAV變異體轉導該細胞、細胞株或組織； (iii)自該細胞、細胞株或組織回收該AAV變異體；及 (iv)鑑別該具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
  2. 一種鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法，其包含： (i)使細胞、細胞株或組織與AAV變異體之文庫接觸，其中該文庫之各成員包含： a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及以下中之一或多者： b)側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之該AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸； (ii)使該文庫中之該等AAV變異體轉導該細胞、細胞株或組織； (iii)自該細胞、細胞株或組織回收該AAV變異體；及 (iv)鑑別該具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
  3. 如請求項1之方法，其中該文庫之各成員包含側接a)之該AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變。
  4. 如請求項2之方法，其中該文庫之各成員包含側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之該AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該文庫之各成員包含編碼定位信號之核酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該文庫之各成員含有包含條形碼之核酸。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該文庫之各成員包含編碼報導蛋白之核酸。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及該編碼定位信號之核酸、該包含條形碼之核酸及/或該編碼報導蛋白之核酸位於獨立核酸分子中。
  9. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、該編碼定位信號之核酸、該包含條形碼之核酸及/或該編碼報導蛋白之核酸位於一個核酸分子中。
  10. 如請求項9之方法，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及該編碼定位信號之核酸、該包含條形碼之核酸及/或該編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。
  11. 如請求項10之方法，其中該文庫之各成員包含：5'ITR序列、該包含條形碼之核酸、該編碼報導蛋白之核酸、該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該AAV變異體之文庫包含衍生自兩種或更多種AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該AAV變異體之文庫之該AAV血清型選自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該編碼報導蛋白之核酸及該編碼AAV變異衣殼之核酸各自獨立地以可操作方式連接於啟動子。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中該所需特徵為增強之細胞或組織向性。
  16. 一種鑑別相比於天然AAV血清型具有所需特徵之AAV衣殼變異體的方法，其包含： (i)將複數個編碼肽之核酸插入至編碼AAV衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環之核酸群體中，以產生編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸之文庫； (ii)將該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至以下中之一或多者： (a)包含條形碼之核酸， (b)編碼報導蛋白之核酸，及 (c)編碼定位信號之核酸； (iii)藉由以反式提供腺病毒輔助及AAV rep功能而在生產細胞中製造AAV變異體之文庫； (iv)純化該AAV變異體之文庫； (v)使細胞、細胞株或組織與該AAV變異體之文庫接觸； (vi)自目標細胞、細胞株或組織回收該等AAV變異體；及 (vii)鑑別該具有所需特徵之AAV衣殼變異體。
  17. 如請求項16之方法，其中該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至包含條形碼之核酸。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該文庫之各成員含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。
  19. 如請求項18之方法，其中該包含第一條形碼之第一核酸及該包含第二條形碼之第二核酸不同。
  20. 如請求項18或19之方法，其中該包含第一條形碼之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
  21. 如請求項18或19之方法，其中該包含第一條形碼之第一核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
  22. 如請求項18或19之方法，其中該包含第二條形碼之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
  23. 如請求項18或19之方法，其中該包含第二條形碼之第二核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
  24. 如請求項18至23中任一項之方法，其中該包含第一條形碼之第一核酸及該包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。
  25. 如請求項24之方法，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子及以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子。
  26. 如請求項24之方法，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子及以可操作方式連接於該包含第二條形碼之核酸的該啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子。
  27. 如請求項24之方法，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子為RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子為RNA Pol III啟動子。
  28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中各RNA Pol II啟動子獨立地選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
  29. 如請求項26至27中任一項之方法，其中各RNA Pol III啟動子獨立地選自由以下組成之群：U6啟動子、H1啟動子及7SK啟動子。
  30. 如請求項16至29中任一項之方法，其中該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至編碼報導蛋白之核酸。
  31. 如請求項16至30中任一項之方法，其中該文庫中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸連接至編碼定位信號之核酸。
  32. 如請求項16至31中任一項之方法，其中編碼AAV變異衣殼蛋白之各核酸進一步包含側接肽插入位點之核酸序列中之一或多個沉默突變。
  33. 如請求項16至32中任一項之方法，其中步驟(iv)進一步包含組合基於兩種或更多種AAV血清型之變異AAV之文庫以產生單一集合體。
  34. 如請求項16至33中任一項之方法，其中編碼AAV衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環之核酸序列群體包含衍生自兩種或更多種AAV血清型之序列。
  35. 如請求項16至34中任一項之方法，其中該AAV血清型選自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
  36. 如請求項16至35中任一項之方法，其中輔助功能包含E2A、E4、VA、E1A及E1B中之一或多者。
  37. 如請求項16至36中任一項之方法，其中AAV rep功能包含rep78、rep 68、rep 52及rep40基因。
  38. 如請求項37之方法，其中該rep78及/或rep68基因之起始密碼子自ACG修飾為ATG。
  39. 如請求項16至38中任一項之方法，其中該等生產細胞為HEK293細胞。
  40. 如請求項16至39中任一項之方法，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、該包含條形碼之核酸、該編碼報導蛋白之核酸及/或編碼定位信號之核酸以任何次序彼此連接。
  41. 如請求項16至40中任一項之方法，其中該文庫之各成員包含：5'ITR序列、該包含條形碼之核酸、該編碼報導蛋白之核酸、該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
  42. 如請求項16至41中任一項之方法，其中該編碼報導蛋白之核酸及該編碼AAV變異衣殼之核酸各自獨立地以可操作方式連接於啟動子。
  43. 如請求項16至42中任一項之方法，其中該所需特徵為增強之細胞或組織向性。
  44. 如請求項1至43中任一項之方法，其中該肽之長度為4-15個胺基酸。
  45. 如請求項1至44中任一項之方法，其中該肽之長度為6-15個胺基酸。
  46. 如請求項45之方法，其中該肽之長度為7、10或15個胺基酸。
  47. 如請求項46之方法，其中該肽之長度為7個胺基酸。
  48. 如請求項1至47中任一項之方法，其中該肽插入至選自由以下組成之群的區域中：該衣殼蛋白之VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII及VR-IX區域。
  49. 如請求項48之方法，其中該肽插入至該衣殼蛋白之VR-I中。
  50. 如請求項48之方法，其中該肽插入至該衣殼蛋白之VR-IV中。
  51. 如請求項48之方法，其中該肽插入至該衣殼蛋白之VR-VIII中。
  52. 如請求項1至49中任一項之方法，其中該肽插入至衣殼蛋白VP1、VP2或VP3中。
  53. 如請求項1至50中任一項之方法，其中該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸殘基450與600之間的位置處。
  54. 如請求項1至51中任一項之方法，其中 (i)該AAV血清型為AAV1且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置590處， (ii)該AAV血清型為AAV6且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置454或590處， (iii)該AAV血清型為AAV2且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置588處， (iv)該AAV血清型為AAV3B且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置589處， (v)該AAV血清型為AAV5且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置578處， (vi)該AAV血清型為AAV8且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置591處，或 (vii)該AAV血清型為AAV9且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置266、455或589處， 其中該位置對應於該AAV血清型中VP1之編號。
  55. 如請求項1至54中任一項之方法，其中該報導蛋白為螢光蛋白。
  56. 如請求項55之方法，其中該報導蛋白係選自由以下組成之群：EGFP、mCherry、mClover3、mRuby3、mApple、iRFP、tdTomato、mVenus、YFP、RFP、螢火蟲螢光素酶及奈米螢光素酶。
  57. 如請求項1至56中任一項之方法，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸以可操作方式連接於p40啟動子。
  58. 如請求項1至57中任一項之方法，其中該編碼報導蛋白之核酸以可操作方式連接於細胞類型及/或組織特異性啟動子。
  59. 如請求項58之方法，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
  60. 如請求項59之方法，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為hSyn1啟動子。
  61. 如請求項60之方法，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為TTR啟動子。
  62. 如請求項1至61中任一項之方法，其中該報導蛋白與該定位信號融合。
  63. 如請求項62之方法，其中該定位信號在N端、在C端或在N端及C端與該報導蛋白融合。
  64. 如請求項1至63中任一項之方法，其中該定位信號為核定位信號(NLS)、核膜結合域或組蛋白結合域。
  65. 如請求項64之方法，其中該NLS為SV40 NLS。
  66. 如請求項64之方法，其中該核膜結合域為KASH域。
  67. 如請求項64之方法，其中該組蛋白結合域為H2B。
  68. 如請求項1至67中任一項之方法，其中該包含條形碼之核酸之長度為5-18個核苷酸。
  69. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
  70. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
  71. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
  72. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
  73. 如請求項1至72中任一項之方法，其中該具有所需特徵之AAV衣殼變異體係經由相關的一或多個條形碼之定序來鑑別。
  74. 如請求項1至73中任一項之方法，其中該具有所需特徵之AAV衣殼變異體係藉由AAV基因組之純化及定序來鑑別。
  75. 如請求項1至74中任一項之方法，其中該細胞、細胞株或組織選自由以下組成之群：CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴及口腔黏膜。
  76. 如請求項1至74中任一項之方法，其中該細胞係選自：神經元、膠細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞、室管膜細胞、肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞、肝內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。
  77. 一種AAV變異體之文庫，其中該文庫之各成員包含： a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)側接a)之該AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸。
  78. 一種AAV變異體之文庫，其中該文庫之各成員包含： a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之該AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸。
  79. 如請求項77之文庫，其中該文庫之各成員包含側接a)之該AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變。
  80. 如請求項78之文庫，其中該文庫之各成員包含側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之該AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變。
  81. 如請求項77至80中任一項之文庫，其中該文庫之各成員包含編碼定位信號之核酸。
  82. 如請求項77至81中任一項之文庫，其中該文庫之各成員含有包含條形碼之核酸。
  83. 如請求項77至82中任一項之文庫，其中該文庫之各成員含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。
  84. 如請求項83之文庫，其中該包含第一條形碼之第一核酸及該包含第二條形碼之第二核酸不同。
  85. 如請求項84之核酸分子，其中該包含第一條形碼序列之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
  86. 如請求項84之核酸分子，其中該包含第一條形碼序列之第一核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
  87. 如請求項84之文庫，其中該包含第二條形碼序列之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
  88. 如請求項84之文庫，其中該包含第二條形碼序列之第二核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
  89. 如請求項8382至88中任一項之文庫，其中該包含第一條形碼之第一核酸及該包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。
  90. 如請求項89之文庫，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子及以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子。
  91. 如請求項89之文庫，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子及以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子。
  92. 如請求項89之文庫，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子以可操作方式連接於RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子為RNA Pol III啟動子。
  93. 如請求項90至91中任一項之文庫，其中該RNA Pol II啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
  94. 如請求項91至93中任一項之文庫，其中該RNA Pol III啟動子係選自由以下組成之群：U6啟動子、H1啟動子及7SK啟動子。
  95. 如請求項78至94中任一項之文庫，其中該文庫之各成員包含編碼報導蛋白之核酸。
  96. 如請求項77至95中任一項之文庫，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及該編碼定位信號之核酸、該包含條形碼之核酸及/或該編碼報導蛋白之核酸位於獨立核酸分子中。
  97. 如請求項77至95中任一項之文庫，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、該編碼定位信號之核酸、該包含條形碼之核酸及/或該編碼報導蛋白之核酸位於一個核酸分子中。
  98. 如請求項97之文庫，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及該編碼定位信號之核酸、該包含條形碼之核酸及/或該編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。
  99. 如請求項97之文庫，其中該文庫之各成員包含：5'ITR序列、該包含條形碼之核酸、該編碼報導蛋白之核酸、該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
  100. 如請求項77至99中任一項之文庫，其中該等AAV變異體衍生自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
  101. 如請求項100之文庫，其中該AAV變異體之文庫包含衍生自兩種或更多種AAV血清型之AAV變異衣殼蛋白。
  102. 如請求項77至101中任一項之文庫，其中該肽之長度為4-15個胺基酸。
  103. 如請求項102之文庫，其中該肽之長度為6-15個胺基酸。
  104. 如請求項103之文庫，其中該肽之長度為7、10或15個胺基酸。
  105. 如請求項104之文庫，其中該肽之長度為7個胺基酸。
  106. 如請求項77至105中任一項之文庫，其中該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
  107. 如請求項106之文庫，其中該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  108. 如請求項77至106中任一項之文庫，其中該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
  109. 如請求項108之文庫，其中該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  110. 如請求項77至109中任一項之文庫，其中該肽插入至選自由以下組成之群的區域中：該衣殼蛋白之VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII及VR-IX區域。
  111. 如請求項110之文庫，其中該肽插入至該衣殼蛋白之VR-I中。
  112. 如請求項110之文庫，其中該肽插入至該衣殼蛋白之VR-IV中。
  113. 如請求項110之文庫，其中該肽插入至該衣殼蛋白之VR-VIII中。
  114. 如請求項77至113中任一項之文庫，其中該肽插入至衣殼蛋白VP1、VP2或VP3中。
  115. 如請求項77至114中任一項之文庫，其中該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸殘基450與600之間的位置處。
  116. 如請求項77至115中任一項之文庫，其中 (i)該AAV血清型為AAV1且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置590處， (ii)該AAV血清型為AAV6且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置454或590處， (iii)該AAV血清型為AAV2且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置588處， (iv)該AAV血清型為AAV3B且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置589處， (v)該AAV血清型為AAV5且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置578處， (vi)該AAV血清型為AAV8且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置591處，或 (vii)該AAV血清型為AAV9且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置266、455或589處， 其中該位置對應於該AAV血清型中VP1之編號。
  117. 如請求項77至116中任一項之文庫，其中該報導蛋白為螢光蛋白。
  118. 如請求項117之文庫，其中該報導蛋白係選自由以下組成之群：EGFP、mCherry、mClover3、mRuby3、mApple、iRFP、tdTomato、mVenus、YFP、RFP、螢火蟲螢光素酶及奈米螢光素酶。
  119. 如請求項77至118中任一項之文庫，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸以可操作方式連接於p40啟動子。
  120. 如請求項77至119中任一項之文庫，其中該編碼報導蛋白之核酸以可操作方式連接於細胞類型及/或組織特異性啟動子。
  121. 如請求項120之文庫，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
  122. 如請求項121之文庫，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為hSyn1啟動子。
  123. 如請求項121之文庫，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為TTR啟動子。
  124. 如請求項77至123中任一項之文庫，其中該報導蛋白與定位信號融合。
  125. 如請求項124之文庫，其中該定位信號在N端、在C端或在N端及C端與該報導蛋白融合。
  126. 如請求項77至125中任一項之文庫，其中該定位信號為核定位信號(NLS)、核膜結合域或組蛋白結合域。
  127. 如請求項126之文庫，其中該NLS為SV40 NLS。
  128. 如請求項126之文庫，其中該核膜結合域為KASH域。
  129. 如請求項126之文庫，其中該組蛋白結合域為H2B。
  130. 如請求項77至129中任一項之文庫，其中該包含條形碼之核酸之長度為5-18個核苷酸。
  131. 如請求項77至130中任一項之文庫，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
  132. 如請求項77至130中任一項之文庫，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
  133. 如請求項77至132中任一項之文庫，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
  134. 如請求項77至132中任一項之文庫，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
  135. 一種AAV變異體，其包含： a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)側接a)之該AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸。
  136. 一種AAV變異體，其包含： a) AAV變異衣殼蛋白，其包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之該AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸； d)包含條形碼之核酸；及 e)編碼報導蛋白之核酸。
  137. 如請求項135之變異體，其中該變異體包含側接a)之該AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中之一或多個沉默突變。
  138. 如請求項136之變異體，其中該變異體包含側接肽插入位點的核酸序列中編碼a)之該AAV變異衣殼蛋白之核酸中之一或多個沉默突變。
  139. 如請求項135至136中任一項之變異體，其中該變異體包含編碼定位信號之核酸。
  140. 如請求項135-139中任一項之變異體，其中該變異體含有包含條形碼之核酸。
  141. 如請求項138至139中任一項之變異體，其中該變異體含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。
  142. 如請求項141之變異體，其中該包含第一條形碼之第一核酸及該包含第二條形碼之第二核酸不同。
  143. 如請求項142之變異體，其中該包含第一條形碼序列之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
  144. 如請求項142之變異體，其中該包含第一條形序碼列之第一核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
  145. 如請求項142之變異體，其中該包含第一條形碼序列之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
  146. 如請求項142之變異體，其中該包含第一條形碼序列之第一核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
  147. 如請求項142至146中任一項之變異體，其中該包含第一條形碼之第一核酸及該包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。
  148. 如請求項147之變異體，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子及以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子。
  149. 如請求項147之變異體，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子及以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子。
  150. 如請求項147之變異體，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子以可操作方式連接於RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子為RNA Pol III啟動子。
  151. 如請求項148至150中任一項之變異體，其中該RNA Pol II啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
  152. 如請求項149至151中任一項之變異體，其中該RNA Pol III啟動子係選自由以下組成之群：U6啟動子、H1啟動子及7SK啟動子。
  153. 如請求項135至152中任一項之變異體，其中該變異體包含編碼報導蛋白之核酸。
  154. 如請求項135至153中任一項之變異體，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及該編碼定位信號之核酸、該包含條形碼之核酸及/或該編碼報導蛋白之核酸位於獨立核酸分子中。
  155. 如請求項135至154中任一項之變異體，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸、該編碼定位信號之核酸、該包含條形碼之核酸及/或該編碼報導蛋白之核酸位於一個核酸分子中。
  156. 如請求項155之變異體，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸，及該編碼定位信號之核酸、該包含條形碼之核酸及/或該編碼報導蛋白之核酸以任何次序彼此連接。
  157. 如請求項156之變異體，其中該變異體包含：5'ITR序列、該包含條形碼之核酸、該編碼報導蛋白之核酸、該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸及3'ITR序列(以該次序)。
  158. 如請求項135至157中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
  159. 如請求項135至158中任一項之變異體，其中該肽之長度為4-15個胺基酸。
  160. 如請求項159之變異體，其中該肽之長度為6-15個胺基酸。
  161. 如請求項160之變異體，其中該肽之長度為7、10或15個胺基酸。
  162. 如請求項161之變異體，其中該肽之長度為7個胺基酸。
  163. 如請求項135至162中任一項之變異體，其中該插入肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
  164. 如請求項163之變異體，其中該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  165. 如請求項135至162中任一項之變異體，其中該插入肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
  166. 如請求項165之變異體，其中該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  167. 如請求項135至166中任一項之變異體，其中該肽插入至選自由以下組成之群的區域中：該衣殼蛋白之VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII及VR-IX區域。
  168. 如請求項167之變異體，其中該肽插入至該衣殼蛋白之VR-I中。
  169. 如請求項167之變異體，其中該肽插入至該衣殼蛋白之VR-IV中。
  170. 如請求項168之變異體，其中該肽插入至該衣殼蛋白之VR-VIII中。
  171. 如請求項135至170中任一項之變異體，其中該肽插入至該衣殼蛋白VP1、VP2或VP3中。
  172. 如請求項135至171中任一項之變異體，其中該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸殘基450與600之間的位置處。
  173. 如請求項135至172中任一項之變異體，其中 (i)該AAV血清型為AAV1且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置590處， (ii)該AAV血清型為AAV6且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置454或590處， (iii)該AAV血清型為AAV2且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置588處， (iv)該AAV血清型為AAV3B且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置589處， (v)該AAV血清型為AAV5且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置578處， (vi)該AAV血清型為AAV8且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置591處，或 (vii)該AAV血清型為AAV9且該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸位置266、455或589處， 其中該位置對應於該AAV血清型中VP1之編號。
  174. 如請求項135至173中任一項之變異體，其中該報導蛋白為螢光蛋白。
  175. 如請求項174之變異體，其中該報導蛋白係選自由以下組成之群：EGFP、mCherry、mClover3、mRuby3、mApple、iRFP、tdTomato、mVenus、YFP、RFP、螢火蟲螢光素酶及奈米螢光素酶。
  176. 如請求項135至175中任一項之變異體，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸以可操作方式連接於p40啟動子。
  177. 如請求項138至176中任一項之變異體，其中該編碼報導蛋白之核酸以可操作方式連接於細胞類型及/或組織特異性啟動子。
  178. 如請求項177之變異體，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
  179. 如請求項178之變異體，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為hSyn1啟動子。
  180. 如請求項178之變異體，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為TTR啟動子。
  181. 如請求項135至180中任一項之變異體，其中該報導蛋白與該定位信號融合。
  182. 如請求項181之變異體，其中該定位信號在N端、在C端或在N端及C端與該報導蛋白融合。
  183. 如請求項135至182中任一項之變異體，其中該定位信號為核定位信號(NLS)、核膜結合域或組蛋白結合域。
  184. 如請求項183之變異體，其中該NLS為SV40 NLS。
  185. 如請求項183之變異體，其中該核膜結合域為KASH域。
  186. 如請求項183之變異體，其中該組蛋白結合域為H2B。
  187. 如請求項135至186中任一項之變異體，其中該包含條形碼之核酸之長度為5-18個核苷酸。
  188. 如請求項135至187中任一項之變異體，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
  189. 如請求項188之變異體，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
  190. 如請求項135至187中任一項之變異體，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
  191. 如請求項190之變異體，其中該包含條形碼之核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
  192. 如請求項135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV1。
  193. 如請求項192之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 68至SEQ ID NO: 75中之任一者組成之群的胺基酸序列。
  194. 如請求項192之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3組成之群的胺基酸序列。
  195. 如請求項192之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 71。
  196. 如請求項135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV2。
  197. 如請求項196之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 90至SEQ ID NO: 110中之任一者組成之群的胺基酸序列。
  198. 如請求項196之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由以下組成之群的序列中之任一者：SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 91及SEQ ID NO: 102。
  199. 如請求項196之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 4-7中之任一者組成之群的胺基酸序列。
  200. 如請求項135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV3B。
  201. 如請求項200之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由以下組成之群的序列中之任一者：SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 76及SEQ ID NO: 83。
  202. 如請求項200之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 8至SEQ ID NO: 11中之任一者組成之群的胺基酸序列。
  203. 如請求項135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV5。
  204. 如請求項203之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 28至SEQ ID NO: 32中之任一者組成之群的胺基酸序列。
  205. 如請求項135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV6。
  206. 如請求項205之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 19至SEQ ID NO: 27中之任一者組成之群的胺基酸序列。
  207. 如請求項135至191中任一項之變異體，其中該AAV變異體衍生自AAV9。
  208. 如請求項207之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 18中之任一者組成之群的胺基酸序列。
  209. 如請求項207之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含選自由SEQ ID NO: 86至SEQ ID NO: 89中之任一者組成之群的胺基酸序列。
  210. 如請求項207之變異體，其中該變異體包含肽，該肽包含序列SEQ ID NO: 89。
  211. 一種核酸分子，其包含： a)編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列，該AAV變異衣殼蛋白包含插入至該變異衣殼蛋白之高變環及/或外露表面環中的肽；及 以下中之一或多者： b)編碼變異衣殼蛋白之核酸序列，該變異衣殼蛋白在其高變環及/或外露表面環中側接肽插入位點之核苷酸序列中包含一或多個沉默突變； c)編碼定位信號之核酸序列； d)包含條形碼之核酸序列；及 e)編碼報導蛋白之核酸序列。
  212. 如請求項211之核酸分子，其中該編碼AAV變異衣殼蛋白之核酸序列在側接a)之該AAV變異衣殼蛋白中之肽插入位點的核酸序列中包含一或多個沉默突變。
  213. 如請求項212之核酸分子，其中該核酸分子包含編碼定位信號之核酸。
  214. 如請求項212之核酸分子，其中該核酸分子含有包含條形碼之核酸。
  215. 如請求項211至214之核酸分子，其中該核酸分子含有包含第一條形碼之第一核酸及包含第二條形碼之第二核酸。
  216. 如請求項215之核酸分子，其中該包含第一條形碼之第一核酸及該包含第二條形碼之第二核酸不同。
  217. 如請求項216之核酸分子，其中該包含第一條形碼序列之第一核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
  218. 如請求項217之核酸分子，其中該包含第一條形碼序列之第一核酸選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者。
  219. 如請求項216之核酸分子，其中該包含第二條形碼序列之第二核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
  220. 如請求項217之核酸分子，其中該包含第二條形碼序列之第二核酸選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者。
  221. 如請求項215至220中任一項之核酸分子，其中該包含第一條形碼之第一核酸及該包含第二條形碼之第二核酸中之每一者獨立地以可操作方式連接於啟動子。
  222. 如請求項221之核酸分子，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子及以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子各自獨立地為RNA Pol II啟動子。
  223. 如請求項221之核酸分子，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子及以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子各自獨立地為RNA Pol III啟動子。
  224. 如請求項221之核酸分子，其中以可操作方式連接於該包含第一條形碼之第一核酸的該啟動子以可操作方式連接於RNA Pol II啟動子，且以可操作方式連接於該包含第二條形碼之第二核酸的該啟動子為RNA Pol III啟動子。
  225. 如請求項222至224中任一項之核酸分子，其中該RNA Pol II啟動子係選自由以下組成之群：人類突觸蛋白啟動子(hSyn1)、甲狀腺素轉運蛋白啟動子(TTR)、細胞角蛋白18、細胞角蛋白19、unc-45肌球蛋白伴隨蛋白B (unc45b)啟動子、心肌肌鈣蛋白T (cTnT)啟動子、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓鞘鹼性蛋白(MBP)啟動子及甲基CpG-結合蛋白2 (Mecp2)啟動子。
  226. 如請求項223至224中任一項之核酸分子，其中該RNA Pol III啟動子係選自由以下組成之群：U6啟動子、H1啟動子及7SK啟動子。
  227. 如請求項211至226中任一項之核酸分子，其中該核酸分子包含編碼報導蛋白之核酸。
  228. 如請求項211至227中任一項之核酸分子，其中該等AAV變異體衍生自以下中之一或多者：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAVrh10、AAVrh39及AAVrh74。
  229. 如請求項211至228中任一項之核酸分子，其中該插入肽之長度為4-15個胺基酸。
  230. 如請求項229之核酸分子，其中該插入肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
  231. 如請求項229之核酸分子，其中該插入肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
  232. 如請求項211至231中任一項之核酸分子，其中該編碼報導蛋白之核酸以可操作方式連接於細胞類型及/或組織特異性啟動子。
  233. 如請求項232之核酸分子，其中該細胞類型及/或組織特異性啟動子為hSyn1啟動子。
  234. 如請求項211至233中任一項之核酸分子，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 111-154中之任一者的序列。
  235. 如請求項211至233中任一項之核酸分子，其中該包含條形碼之核酸包含選自序列SEQ ID NO: 155-198中之任一者的序列。
  236. 一種如請求項135至210中任一項之AAV變異體之用途，其用於將轉殖基因遞送至目標細胞或組織。
  237. 一種AAV載體，其包含編碼肽之核酸分子，該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
  238. 如請求項237之AAV載體，其中該核酸編碼包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的肽。
  239. 如請求項237或238之AAV載體，其中該核酸編碼具有SEQ ID NO: 1-32中之任一者之序列的肽。
  240. 一種AAV載體，其包含編碼肽之核酸分子，該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
  241. 如請求項240之AAV載體，其中該核酸編碼包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的肽。
  242. 如請求項240或241之AAV載體，其中該核酸編碼具有SEQ ID NO: 68-110中之任一者之序列的肽。
  243. 如請求項240之AAV載體，其中該核酸編碼包含以下中之任一者中所闡述之胺基酸序列的肽：SEQ ID NO: 71、76-80、83、89、91、94-96、101-103及106。
  244. 如請求項237至243中任一項之AAV載體，其中該肽為衣殼蛋白之一部分。
  245. 如請求項244之AAV載體，其中該衣殼蛋白為VP1、VP2或VP3。
  246. 如請求項237至245中任一項之AVV載體，其中該肽插入該衣殼蛋白之胺基酸殘基450與600之間的位置處。
  247. 如請求項246之AAV載體，其中該肽插入於 (i) AAV1衣殼蛋白之胺基酸位置590， (ii) AAV6衣殼蛋白之胺基酸位置454或590， (iii) AAV2衣殼蛋白之胺基酸位置588， (iv) AAV3B衣殼蛋白之胺基酸位置589， (v) AAV5衣殼蛋白之胺基酸位置578， (vi) AAV8衣殼蛋白之胺基酸位置591，或 (vi) AAV9衣殼蛋白之胺基酸位置266、455或589， 其中該位置對應於該AAV血清型中VP1之編號。
  248. 一種醫藥組合物，其包含如請求項237至247中任一項之AAV載體及醫藥學上可接受之載劑。
  249. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  250. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  251. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 71、76-80、83、89、91、94-96、101-103及106中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  252. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 71、76-80、83及94-96中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  253. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 89、91、101-103及106中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  254. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 68至SEQ ID NO: 75中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  255. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  256. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 71中所闡述之胺基酸序列。
  257. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 90至SEQ ID NO: 110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  258. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 91及SEQ ID NO: 102中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  259. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 4-7中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  260. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 76及SEQ ID NO: 83中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  261. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 8至SEQ ID NO: 11中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  262. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 28至SEQ ID NO: 32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  263. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 19至SEQ ID NO: 27中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  264. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 18中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  265. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 86至SEQ ID NO: 89中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  266. 一種肽，其包含SEQ ID NO: 89中所闡述之胺基酸序列。
  267. 如請求項249至266中任一項之肽，其中該肽為AAV載體之一部分。
  268. 如請求項267之肽，其中該肽為該AAV載體之衣殼蛋白之一部分。
  269. 一種核酸分子，其編碼如請求項249至268中任一項之肽。
  270. 一種衣殼蛋白，其包含肽，該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
  271. 一種衣殼蛋白，其包含肽，該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列的至少4個連續胺基酸。
  272. 如請求項270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  273. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  274. 如請求項270之衣殼蛋白，其包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  275. 如請求項271之衣殼蛋白，其包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  276. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 71、76-80、83、89、91、94-96、101-103及106中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  277. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 71、76-80、83及94-96中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  278. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 89、91、101-103及106中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  279. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 68至SEQ ID NO: 75中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  280. 如請求項270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  281. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 71中所闡述之胺基酸序列。
  282. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 90至SEQ ID NO: 110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  283. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 91及SEQ ID NO: 102中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  284. 如請求項270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 4-7中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  285. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 76及SEQ ID NO: 83中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  286. 如請求項270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 8至SEQ ID NO: 11中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  287. 如請求項270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 28至SEQ ID NO: 32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  288. 如請求項270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 19至SEQ ID NO: 27中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  289. 如請求項270之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 12至SEQ ID NO: 18中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  290. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 86至SEQ ID NO: 89中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  291. 如請求項271之衣殼蛋白，其中該肽包含SEQ ID NO: 89中所闡述之胺基酸序列。
  292. 一種核酸分子，其編碼如請求項269至291中任一項之衣殼蛋白。
  293. 一種將核酸遞送至個體之目標細胞或組織之方法，其包含：投與包含如請求項237至247中任一項之AAV載體的組合物。
  294. 如請求項293之方法，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 1-32中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  295. 如請求項293之方法，其中該衣殼蛋白包含SEQ ID NO: 68-110中之任一者中所闡述之胺基酸序列。
  296. 如請求項293至295中任一項之方法，其中該目標細胞、細胞株或組織選自由以下組成之群：CNS、心臟、肺臟、氣管、食道、肌肉、骨骼、軟骨、胃、胰臟、腸、肝臟、膀胱、腎臟、尿管、尿道、子宮、輸卵管、卵巢、睾丸、前列腺、眼部、血液、淋巴及口腔黏膜。
  297. 如請求項293至295中任一項之方法，其中該目標細胞選自由以下組成之群：神經元、膠細胞、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、微神經膠質細胞、神經鞘細胞、室管膜細胞、肝細胞、星狀貯脂細胞、庫弗細胞、肝內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、T細胞、B細胞、造血幹細胞及胚胎幹細胞。
  298. 如請求項296之方法，其中該目標細胞或組織來自肝臟。
  299. 如請求項296之方法，其中該目標細胞或組織來自CNS。
  300. 一種醫藥組合物，其包含如請求項135至211中任一項之變異體及醫藥學上可接受之載劑。
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