KR20230079139A - 항-aav 항체의 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 대상체에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하기 위한 스크리닝 검정 및 확증 검정을 포함하는 전체 항체 검정에 관한 것이며, 이것은 사전처리 및 사후처리 전체 항체 수준에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 대상체를 rAAV(예를 들어, rAAV6) 벡터를 포함하는 유전자 요법으로 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제63/086,165호(출원일: 2020년 10월 1일)로부터의 우선권을 주장하며; 상기 기초출원의 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
배경기술
재조합 아데노-연관 바이러스(recombinant adeno-associated virus: rAAV)는 유전자 요법의 투여를 위해서 가장 일반적으로 사용되는 벡터 중 일부이다. rAAV 벡터를 사용하면 많은 이점이 있지만, 대상체에서 소량의 항-AAV도 그 효능을 크게 감소시킬 수 있다. AAV는 자연 발생 바이러스이기 때문에, 항 AAV 항체에 대한 집단에 0이 아닌 기준선이 존재하여 전체 항체 도구에서 가변성을 유발하고 치료 전 스크리닝 및 치료 후 모니터링을 위한 정확한 컷 포인트(cut point)를 평가하는 데 어려움이 있다.
바이러스 유전자 전달에 사용되는 AAV의 여러 혈청형이 존재하며, 인간 샘플 및 비인간 샘플 둘 다에서 발견된다. 이들 혈청형은 이의 캡시드의 아미노산 서열이 다양하다(Zincarelli et al., Mol Ther., 2008; vol. 16(6):1073-80). 따라서, 하나의 AAV 혈청형에 노출된 대상체는 그 AAV 혈청형에 대한 항체를 발달시킬 수 있다. 이러한 항-AAV 항체는 다른 혈청형의 AAV에 결합하거나 결합하지 않을 수 있다. 따라서, 항-AAV 항체 수준의 면역원성 분석은 기존 면역이 없는 환자를 등록하여 적절한 치료 효능을 보장하고, 치료-유도 항체 반응을 검출하여 안전성을 평가하는 데 중요하다.
항-AAV 항체는 중화 항체 또는 비중화 항체일 수 있다. 중화 항체 및 비중화 항체 둘 다는 AAV-기반 유전자 요법의 효능 및 안전성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 중화 항체는 흡수를 저해하고, 엔도솜 및 핵 수송(trafficking)의 조절에 영향을 미치고, 캡시드 처리에 영향을 미치고, 유전자 방출을 억제할 수 있다. 비중화 항체는 안전성에 부정적인 영향을 미칠 뿐만 아니라 AAV 벡터의 제거에 역할을 할 수 있다. 따라서 중화 항체 및 비중화 항체 둘 다의 존재를 검출하는 시험을 하는 것이 중요하다. 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 벡터에 대한 중화 항체 검정이 당업계에 공지되어 있지만, 중화 항체 및 비중화 항체 둘 다를 검출하기 위한 검정에 대한 필요성이 당업계에 남아있고, 즉, 전체 항체 검정에 대한 필요성이 남아있다.
본 개시내용은 대상체에서의 중화 및 비중화 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체의 검출에 관한 것이다. 본 개시내용은 더 높은 감도 및 감소된 위양성률로 환자 샘플에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 보다 정확하게 검출하기 위한, 스크리닝 검정(screening assay) 및 확증 검정(confirmatory assay)을 포함하는 최적화된 전체 항체 검정을 제공한다. 본 개시내용은 또한 rAAV(예를 들어, rAAV6) 바이러스 벡터를 사용한 치료 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 제1 양태는 스크리닝 검정을 사용하여 대상체에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 시험 대상체로부터 얻은 시험 샘플을 제공하는 단계; (b) 시험 샘플을 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, AAV 캡시드는 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (c) 시험 샘플-접촉된 고정된 AAV 캡시드를 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 시험 2차 항체는 시험 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; 및 (d) 시험 검출 가능한 표지를 검출하는 단계를 포함하되; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 컷 포인트 인자 이상인 경우 시험 대상체는 항-AAV 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 컷 포인트 인자 미만인 경우 시험 대상체는 항-AAV 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해서 결정된다: (1) 복수의 참조 대상체로부터 얻은 참조 샘플을 제공하는 단계로서, 참조 대상체 각각은 중화 항-AAV 항체 검정에 대해서 음성(즉, 사전스크리닝된 음성)이었던, 단계; (2) 각각의 참조 샘플을 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, AAV 캡시드는 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (3) 각각의 참조 샘플-접촉된 고정된 AAV 캡시드를 참조 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 참조 2차 항체는 참조 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; (4) 각각의 참조 샘플에 대한 참조 검출 가능한 표지를 검출하는 단계; (5) 이상치(outlier) 참조 샘플을 제거하는 단계; 및 (6) 이상치-제거 참조 샘플을 사용하여 컷 포인트 인자를 결정하는 단계. 일부 실시형태에서, 이상치 참조 샘플은 기준 [Q1-1.5*(Q3-Q1),Q3+1.5*(Q3-Q1)]을 사용하여 제거된다. 일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자는 95% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법(parametric method)에 기초한다. 일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자는 95% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법(robust parametric method)에 기초한다. 일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자는 비매개변수 방법(non-parametric method)에 기초한다.
일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이고, AAV 캡시드는 AAV6 캡시드이다.
일부 실시형태에서, 시험 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 참조 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 고정된 AAV 캡시드를 단계 (b) 후에 그리고 단계 (c) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플-접촉된 고정된 AAV 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (d) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지 및 참조 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생(fluorogenic) 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포(spore) 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 시험 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 샘플을 대상체로부터 얻기 전에 시험 대상체에게 투여되었다.
일부 실시형태에서, 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 샘플을 제공하는 단계; (b) 샘플을 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (c) 샘플-접촉된 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 2차 항체는 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; 및 (d) 표지를 검출하는 단계를 포함하되; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 1.5 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 1.5 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.6 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.6 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.7 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.7 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.73 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.73 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.75 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.75 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (b) 후에 그리고 단계 (c) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플-접촉된 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (d) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 비색 표지이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제이다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 배양 플레이트의 웰이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-인간 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, AAV(예를 들어, AAV6) 벡터는 샘플을 대상체로부터 얻기 전에 대상체에게 투여되었다.
일부 실시형태에서, 음성 대조군은 사전스크리닝된 음성 샘플이다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군은 중화 항체 검정에서 음성이었다.
본 개시내용의 제2 양태는 확증 검정을 사용하여 대상체에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 방법은, (a) 시험 대상체로부터 얻은 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플을 제공하는 단계; (b) 제2 시험 샘플을 시험 가용성 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계; (c) 제1 시험 샘플을 제1 시험 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제1 시험 고정된 AAV 캡시드는 제1 시험 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (d) 제2 시험 샘플과 시험 가용성 AAV 캡시드의 혼합물을 제2 시험 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제2 시험 고정된 AAV 캡시드는 제2 시험 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (e) 제1 시험 샘플-접촉된 제1 시험 고정된 AAV 캡시드를 제1 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제1 시험 2차 항체는 제1 시험 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; (f) 혼합물-접촉된 제2 시험 고정된 AAV 캡시드를 제2 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제2 시험 2차 항체는 제2 시험 검출 가능한 표지를 포함하고, 제2 시험 2차 항체는 제1 시험 2차 항체와 동일하고 제1 시험 검출 가능한 표지는 제2 시험 검출 가능한 표지와 동일한, 단계; 및 (g) 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지를 검출하는 단계를 포함하며; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 컷 포인트 백분율 이상만큼 감소되는 경우 대상체는 항-AAV 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 컷 포인트 미만만큼 감소되는 경우 대상체는 항-AAV 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 컷 포인트는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해서 결정된다: (1) 복수의 참조 대상체로부터 얻은 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플을 제공하는 단계로서, 참조 대상체 각각은 중화 항-AAV 항체 검정에 대해서 음성이었던, 단계; (2) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제2 참조 샘플을 참조 가용성 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계; (3) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제1 참조 샘플을 제1 참조 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제1 참조 고정된 AAV 캡시드는 제1 참조 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (4) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제2 참조 샘플과 참조 가용성 AAV 캡시드의 혼합물을 제2 참조 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제2 참조 고정된 AAV 캡시드는 제2 참조 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (5) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제1 참조 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV 캡시드를 제1 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제1 2차 항체는 제1 참조 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; (6) 각각의 참조 대상체에 대해서, 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV 캡시드를 제2 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제2 2차 항체는 제2 참조 검출 가능한 표지를 포함하고, 제2 2차 항체는 제1 2차 항체와 동일하고, 제1 참조 검출 가능한 표지는 제2 참조 검출 가능한 표지와 동일한, 단계; (7) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지를 검출하는 단계; (8) 이상치 참조 샘플을 제거하는 단계; 및 (9) 이상치-제거 참조 샘플을 사용하여 컷 포인트 백분율을 결정하는 단계.
일부 실시형태에서, 이상치 참조 샘플은 기준 [Q1-1.5*(Q3-Q1),Q3+1.5*(Q3-Q1)]을 사용하여 제거된다. 일부 실시형태에서, 컷 포인트 백분율은 99% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법에 기초한다. 일부 실시형태에서, 컷 포인트 백분율은 99% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법에 기초한다. 일부 실시형태에서, 컷 포인트 백분율은 비매개변수 방법에 기초한다.
일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이고, 가용성 AAV 캡시드는 가용성 AAV6 캡시드이며, 제1 고정된 AAV 캡시드는 제1 고정된 AAV6 캡시드이고, 제2 고정된 AAV 캡시드는 제2 고정된 AAV6 캡시드이다.
일부 실시형태에서, 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플은 각각 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 제1 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (e) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 제2 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (d) 후에 그리고 단계 (f) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (e) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (f) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 샘플을 샘플로부터 얻기 전에 대상체에게 투여되었다.
일부 실시형태에서, 가용성 AAV 캡시드는 7.5E10 내지 15E10cp/㎖의 농도이다.
일부 실시형태에서, 방법은, (a) 대상체로부터 얻은 제1 샘플 및 제2 샘플을 제공하는 단계; (b) 제2 샘플을 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계; (c) 제1 샘플을 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 제1 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (d) 제2 샘플과 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드의 혼합물을 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 제2 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (e) 제1 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 제1 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제1 2차 항체는 제1 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; (f) 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 제2 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제2 2차 항체는 제2 검출 가능한 표지를 포함하고, 제2 2차 항체는 제1 2차 항체와 동일하고, 제2 검출 가능한 표지는 제2 검출 가능한 표지와 동일한, 단계; 및 (g) 제1 표지 및 제2 표지를 검출하는 단계를 포함하며; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 20% 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 20% 미만만큼 감소되는 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 22% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 22% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.1% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.1% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.5% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.5% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 각각 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (e) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (d) 후에 그리고 단계 (f) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (e) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (f) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% tween을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 비색 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 호스래디쉬 퍼옥시다제이다.
일부 실시형태에서, 제1 고체 지지체 및 제2 고체 지지체는 각각 독립적으로 배양 플레이트의 웰이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-인간 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, AAV(예를 들어, AAV6) 벡터는 제1 샘플 및 제2 샘플을 대상체로부터 획득하기 전에 대상체에게 투여되었다.
일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 7.5E10 내지 1.5E11cp/㎖의 농도이다.
본 개시내용의 제3 양태는 유전자 요법을 필요로 하는 대상체(예를 들어, 시험 대상체)의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체(예를 들어, 시험 대상체)를 제공하는 단계 및 대상체가 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 경우에만 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV, 예를 들어, rAAV6) 벡터를 대상체(예를 들어, 시험 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 시험 대상체)에서 임의의 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체는 본 명세서에 개시된 검정 방법 중 임의의 것에 의해서 검출된다.
일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 시험 대상체)는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 시험 대상체)는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 시험 대상체)는 인간이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-인간 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 시험 대상체)는 AAV(예를 들어, AAV6) 벡터가 이전에 투여된 적이 없다.
일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 시험 대상체)는 유전 장애를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 시험 대상체)는 신경 장애를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 장애는 혈우병 A형 및 B형, 파브리병(Fabry disease), 낫형 세포병(sickle cell disease), 베타 지중해빈혈, 점액다당류증 타입 I 및 II, 페닐케톤뇨증, 글리코겐 축적병 타입 1a, GLUT1 결핍 증후군 및 HIV/AIDS로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 장애는 파브리병이다.
도 1A 내지 도 1C는 예시적인 AAV 항체 검출 검정의 그래픽 묘사를 제공한 도면. 패널 A는 루시퍼라제 리포터 유전자를 포함하는 AAV 벡터를 사용하는 예시적인 AAV 중화 활성 검정의 그래픽 묘사를 제공한다. 패널 B는 고정된 AAV 캡시드를 사용한 예시적인 AAV 스크리닝 검정의 그래픽 묘사를 제공한다. 패널 C는 고정된 AAV 캡시드 및 가용성 AAV 캡시드 둘 다를 사용한 예시적인 AAV 확증 검정의 그래픽 묘사를 제공한다.
도 2는 AAV6 중화 활성 검정에 대해 음성으로 사전스크리닝된 샘플을 사용한 AAV6 스크리닝 검정의 결과를 제공한 도면. 혈청 샘플(n=38)을 광학 밀도(OD)에 의해서 그래프화하였다. 정규화된 반응을 계산하는 데 사용된 음성 대조군을 이러한 샘플의 하위집단으로부터 풀링시켰다. 컷 포인트 결정을 위한 공여자 샘플을 선택하기 위해 다른 개체에 대해 동일한 사전스크리닝 방법을 수행하였다.
도 3A 및 도 3B는 컷 포인트를 결정하는 방법의 개략도를 제공한 도면. 패널 A는 이상치 제거에 사용되는 박스 플롯 다이어그램을 제공한다. 사분위수(Q) 1 및 Q3을 사용하여 제공된 계산을 사용하여 이상치를 계산하였다. 패널 B는 전체 항체 검정(스크리닝 검정(위양성율(FPR) 5%)) 및 확증 검정(FPR 1%)에서 항-약물 항체(ADA)에 대한 컷 포인트를 결정하기 위해 사용하기 위한 정규화된 반응의 그래프를 제공한다. 컷 포인트를 결정하기 위한 매개변수 계산은 하기와 같았다: 평균+1.645×SD (5% FPR) 또는 평균+2.33×SD (1%FPR). SD: 표준 편차.
도 4A 및 도 4B는 사전스크리닝이 없는 100개의 혈청 샘플에 대한 박스 플롯 다이어그램을 제공한 도면. 패널 A는 컷 포인트 인자를 1, 2 또는 3라운드의 이상치 제거에 제공한다. 3라운드의 이상치 제거 후, 최종 컷 포인트 인자 계산에 70개의 샘플을 플로팅하였는데, 이것은 스크리닝 검정을 위한 최종 컷 포인트 인자 2.61을 결정하였다. 이상치 제거 전략은 컷 포인트 인자 계산에 영향을 미쳤다. 패널 B는 확증 검정에서 100개의 무작위 혈청 샘플 데이터의 박스 플롯 다이어그램을 제공한다. 이상치는 확인되지 않았다. 스크리닝 검정에서 확인된 이상치를 제거한 후, 컷 포인트 백분율은 43.1% 저해로 결정되었다.
도 5A 및 도 5B는 중화 활성 검정에 의해 사전스크리닝된 혈청 샘플로부터의 데이터 분포 및 박스 플롯을 제공한 도면. 패널 A는 중화 활성 검정을 사용하여 사전스크리닝되고 항-AAV6 중화 항체에 대해 음성인 것으로 결정된 211개의 혈청 샘플("사전스크리닝된 음성 혈청")을 사용한 스크리닝 검정의 박스 플롯 계산 및 로그-변환된 정규화된 반응 플롯을 제공한다. 스크리닝 검정에 대한 컷 포인트 인자는 1.73으로 계산되었다. 패널 B는 211개의 사전스크리닝된 음성 혈청 샘플을 사용한 확증 검정의 플롯 및 박스 플롯을 제공한다. 확증 검정에 대한 컷 포인트 백분율은 24.5% 저해로 계산되었다.
도 6A 및 도 6B는 양성 대조군 스크리닝의 결과를 제공한 도면. 패널 A는 광학 밀도(OD)로 그래프로 표시된 63명의 무작위 인간 대상체로부터의 혈청 샘플을 사용한 스크리닝 검정 결과를 제공한다. 화살표는 가장 높은 신호를 갖는 5개 샘플을 식별한다. 패널 B는 가장 높은 양성 신호를 갖는 5개 샘플의 적정을 사용한 스크리닝 검정을 제공한다. 화살표로 식별된 가장 낮은 농도(즉, 가장 높은 희석)에서 가장 높은 OD를 갖는 샘플인 PC-2를 선택하여 양성 대조군을 생성시켰다.
도 7A 및 도 7B는 전체 항체 검정에 대한 감도 결정을 제공한 도면. 패널 A는 각각 단백질 A/G 및 AAV6-커플링 자성 비드를 사용하여 혈청 샘플 PC-2로부터 단리된 IgG 항체(상단 패널) 또는 항-AAV6 특이적 항체로의 적정을 사용하여 스크리닝 검정에 대한 감도 결정을 제공한다. 모든 IgG 항체를 사용한 검정 감도는 15.4㎍/㎖로 결정되었으며, 항-AAV6 특이적 항체를 사용한 검정 감도는 0.241㎍/㎖로 결정되었다. 패널 B는 각각 단백질 A/G 및 AAV6-커플링 자성 비드를 사용하여 혈청 샘플 PC-2로부터 단리된 IgG 항체(상단 패널) 또는 항-AAV6 특이적 항체로의 적정을 사용하여 확증 검정에 대한 감도 결정을 제공한다. 모든 IgG 항체를 사용한 검정 감도는 5.85㎍/㎖로 결정되었으며, 항-AAV6 특이적 항체를 사용한 검정 감도는 0.0734㎍/㎖로 결정되었다.
도 8A 내지 도 8C는 스크리닝 검정 대 중화 항체 검정의 플롯을 제공한 도면. 패널 A는 100명의 무작위 건강한 대상체의 패널에서 항-AAV6 항체의 검출을 위한 무작위 혈청 샘플(CPF = 2.6)로부터 유래된 컷 포인트 인자를 사용하는 전체 항체(TAb) 스크리닝 검정과 중화 항체(NAb) 검정(CPF = 0.3) 간의 비교를 제공한다. 타원형은 TAb 스크리닝 검정에서 위음성을 나타낸다. 패널 B는 100명의 무작위 건강한 대상체의 패널에서 항-AAV6 항체의 검출을 위한 사전스크리닝된 음성 샘플(CPF = 1.75)로부터 유래된 컷 포인트 인자를 사용하는 전체 항체(TAb) 스크리닝 검정과 중화 항체(NAb) 검정(CPF = 0.3) 간의 비교를 제공한다. 위음성 결과는 식별되지 않았다. 패널 C는 100명의 무작위 건강한 대상체의 패널에서 항-AAV6 항체의 검출을 위한 사전스크리닝된 음성 샘플(CPP = 24.5% 저해)로부터 유래된 컷 포인트 백분율 사용하는 확증 검정(Tab% 저해)과 중화 항체(NAb) 검정(CPF = 0.3; 즉, 30%) 간의 비교를 제공한다. 위음성 결과는 식별되지 않았다.
도 9A 및 도 9B는 스크리닝 검정 및 확증 검정의 선택성을 도시한다. 패널 A는 스크리닝 검정의 선택성을 식별한다. 10개의 사전스크리닝된 음성 샘플에 20㎍/㎖ 및 40㎍/㎖의 총 IgG 양성 대조군을 스파이킹하였다. 스크리닝 검정은 사전스크리닝된 음성 샘플에서 항-AAV6 항체를 검출하지 못했지만 스파이킹된 모든 샘플에서 항-AAV6 항체를 검출하였다. NR=정규화된 반응. 패널 B는 확증 검정의 선택성을 식별한다. 10개의 사전스크리닝된 음성 샘플에 20㎍/㎖ 및 40㎍/㎖의 총 IgG 양성 대조군을 스파이킹하였다. 확증 검정은 모든 스파이킹된 샘플에서 항-AAV6 항체를 검출하였다.
도 2는 AAV6 중화 활성 검정에 대해 음성으로 사전스크리닝된 샘플을 사용한 AAV6 스크리닝 검정의 결과를 제공한 도면. 혈청 샘플(n=38)을 광학 밀도(OD)에 의해서 그래프화하였다. 정규화된 반응을 계산하는 데 사용된 음성 대조군을 이러한 샘플의 하위집단으로부터 풀링시켰다. 컷 포인트 결정을 위한 공여자 샘플을 선택하기 위해 다른 개체에 대해 동일한 사전스크리닝 방법을 수행하였다.
도 3A 및 도 3B는 컷 포인트를 결정하는 방법의 개략도를 제공한 도면. 패널 A는 이상치 제거에 사용되는 박스 플롯 다이어그램을 제공한다. 사분위수(Q) 1 및 Q3을 사용하여 제공된 계산을 사용하여 이상치를 계산하였다. 패널 B는 전체 항체 검정(스크리닝 검정(위양성율(FPR) 5%)) 및 확증 검정(FPR 1%)에서 항-약물 항체(ADA)에 대한 컷 포인트를 결정하기 위해 사용하기 위한 정규화된 반응의 그래프를 제공한다. 컷 포인트를 결정하기 위한 매개변수 계산은 하기와 같았다: 평균+1.645×SD (5% FPR) 또는 평균+2.33×SD (1%FPR). SD: 표준 편차.
도 4A 및 도 4B는 사전스크리닝이 없는 100개의 혈청 샘플에 대한 박스 플롯 다이어그램을 제공한 도면. 패널 A는 컷 포인트 인자를 1, 2 또는 3라운드의 이상치 제거에 제공한다. 3라운드의 이상치 제거 후, 최종 컷 포인트 인자 계산에 70개의 샘플을 플로팅하였는데, 이것은 스크리닝 검정을 위한 최종 컷 포인트 인자 2.61을 결정하였다. 이상치 제거 전략은 컷 포인트 인자 계산에 영향을 미쳤다. 패널 B는 확증 검정에서 100개의 무작위 혈청 샘플 데이터의 박스 플롯 다이어그램을 제공한다. 이상치는 확인되지 않았다. 스크리닝 검정에서 확인된 이상치를 제거한 후, 컷 포인트 백분율은 43.1% 저해로 결정되었다.
도 5A 및 도 5B는 중화 활성 검정에 의해 사전스크리닝된 혈청 샘플로부터의 데이터 분포 및 박스 플롯을 제공한 도면. 패널 A는 중화 활성 검정을 사용하여 사전스크리닝되고 항-AAV6 중화 항체에 대해 음성인 것으로 결정된 211개의 혈청 샘플("사전스크리닝된 음성 혈청")을 사용한 스크리닝 검정의 박스 플롯 계산 및 로그-변환된 정규화된 반응 플롯을 제공한다. 스크리닝 검정에 대한 컷 포인트 인자는 1.73으로 계산되었다. 패널 B는 211개의 사전스크리닝된 음성 혈청 샘플을 사용한 확증 검정의 플롯 및 박스 플롯을 제공한다. 확증 검정에 대한 컷 포인트 백분율은 24.5% 저해로 계산되었다.
도 6A 및 도 6B는 양성 대조군 스크리닝의 결과를 제공한 도면. 패널 A는 광학 밀도(OD)로 그래프로 표시된 63명의 무작위 인간 대상체로부터의 혈청 샘플을 사용한 스크리닝 검정 결과를 제공한다. 화살표는 가장 높은 신호를 갖는 5개 샘플을 식별한다. 패널 B는 가장 높은 양성 신호를 갖는 5개 샘플의 적정을 사용한 스크리닝 검정을 제공한다. 화살표로 식별된 가장 낮은 농도(즉, 가장 높은 희석)에서 가장 높은 OD를 갖는 샘플인 PC-2를 선택하여 양성 대조군을 생성시켰다.
도 7A 및 도 7B는 전체 항체 검정에 대한 감도 결정을 제공한 도면. 패널 A는 각각 단백질 A/G 및 AAV6-커플링 자성 비드를 사용하여 혈청 샘플 PC-2로부터 단리된 IgG 항체(상단 패널) 또는 항-AAV6 특이적 항체로의 적정을 사용하여 스크리닝 검정에 대한 감도 결정을 제공한다. 모든 IgG 항체를 사용한 검정 감도는 15.4㎍/㎖로 결정되었으며, 항-AAV6 특이적 항체를 사용한 검정 감도는 0.241㎍/㎖로 결정되었다. 패널 B는 각각 단백질 A/G 및 AAV6-커플링 자성 비드를 사용하여 혈청 샘플 PC-2로부터 단리된 IgG 항체(상단 패널) 또는 항-AAV6 특이적 항체로의 적정을 사용하여 확증 검정에 대한 감도 결정을 제공한다. 모든 IgG 항체를 사용한 검정 감도는 5.85㎍/㎖로 결정되었으며, 항-AAV6 특이적 항체를 사용한 검정 감도는 0.0734㎍/㎖로 결정되었다.
도 8A 내지 도 8C는 스크리닝 검정 대 중화 항체 검정의 플롯을 제공한 도면. 패널 A는 100명의 무작위 건강한 대상체의 패널에서 항-AAV6 항체의 검출을 위한 무작위 혈청 샘플(CPF = 2.6)로부터 유래된 컷 포인트 인자를 사용하는 전체 항체(TAb) 스크리닝 검정과 중화 항체(NAb) 검정(CPF = 0.3) 간의 비교를 제공한다. 타원형은 TAb 스크리닝 검정에서 위음성을 나타낸다. 패널 B는 100명의 무작위 건강한 대상체의 패널에서 항-AAV6 항체의 검출을 위한 사전스크리닝된 음성 샘플(CPF = 1.75)로부터 유래된 컷 포인트 인자를 사용하는 전체 항체(TAb) 스크리닝 검정과 중화 항체(NAb) 검정(CPF = 0.3) 간의 비교를 제공한다. 위음성 결과는 식별되지 않았다. 패널 C는 100명의 무작위 건강한 대상체의 패널에서 항-AAV6 항체의 검출을 위한 사전스크리닝된 음성 샘플(CPP = 24.5% 저해)로부터 유래된 컷 포인트 백분율 사용하는 확증 검정(Tab% 저해)과 중화 항체(NAb) 검정(CPF = 0.3; 즉, 30%) 간의 비교를 제공한다. 위음성 결과는 식별되지 않았다.
도 9A 및 도 9B는 스크리닝 검정 및 확증 검정의 선택성을 도시한다. 패널 A는 스크리닝 검정의 선택성을 식별한다. 10개의 사전스크리닝된 음성 샘플에 20㎍/㎖ 및 40㎍/㎖의 총 IgG 양성 대조군을 스파이킹하였다. 스크리닝 검정은 사전스크리닝된 음성 샘플에서 항-AAV6 항체를 검출하지 못했지만 스파이킹된 모든 샘플에서 항-AAV6 항체를 검출하였다. NR=정규화된 반응. 패널 B는 확증 검정의 선택성을 식별한다. 10개의 사전스크리닝된 음성 샘플에 20㎍/㎖ 및 40㎍/㎖의 총 IgG 양성 대조군을 스파이킹하였다. 확증 검정은 모든 스파이킹된 샘플에서 항-AAV6 항체를 검출하였다.
1. 일반적인 기술
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 약리학, 세포 및 조직 배양, 분석 화학, 생화학, 합성 유기 화학, 의약 및 제약 화학, 분자 생물학, 세포 및 암 생물학, 신경생물학, 신경화학, 바이러스학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 이러한 분야에서 수행되는 실험실 절차 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것이다. 화학 합성 및 화학 분석에 대해서는 표준 기술이 사용된다. 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
본 개시내용의 실시는 달리 나타내지 않는 한 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 다음과 같은 문헌에 완전히 설명되어 있다: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999).
효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조사의 사양에 따라 수행된다.
본 명세서 및 실시예 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하는 의미이지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하는 것은 아니라는 것을 이해할 것이다. 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이들로 제한되지 않는"을 의미하는 데 사용된다. "포함하는" 및 "포함하지만 이들로 제한되지 않는"은 같은 의미로 사용된다.
본 명세서에서 "포함하는"이라는 언어로 실시형태가 기재된 경우에는, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"이라는 용어로 기재된 다른 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
용어 "예컨대 또는 "예를 들어" 뒤에 오는 모든 예(들)는 포괄적이거나 제한을 의미하지 않는다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다.
단수 표현은 단수 표현의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해서 본 명세서에 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 개시내용의 조성물에서 또는 본 개시내용의 방법에서 사용되는 성분의 양, 매개변수, 계산 또는 측정을 수식하는 용어 "약" 및 "대략"은 본 개시내용의 조성물 또는 방법의 화학적 또는 물리적 속성에 실질적인 영향을 미치지 않으면서 예를 들어, 실제 세계에서 단리된 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용되는 전형적인 측정 및 액체 취급 절차를 통해; 이러한 절차의 부주의한 오류를 통해; 조성물을 제조하거나 방법을 수행하기 위해 사용된 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이를 통해; 그리고 다른 이유를 통해 일어날 수 있는 수치 양의 변동을 지칭한다. 이러한 변동은 한 자릿수 내, 전형적으로 주어진 값 또는 범위의 10% 이내, 더 전형적으로는 여전히 주어진 값 또는 범위의 5% 이내일 수 있다. 본 명세서에서 값 또는 매개변수 "약"에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수 자체에 관한 실시형태를 포함(및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"에 대한 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수치를 포함한다.
본 개시내용의 넓은 범주를 설명하는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 언급된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 임의의 수치는 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로 인해 필수적으로 발생하는 특정 오류를 본질적으로 포함한다. 또한, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 그 안에 포함된 임의의 및 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "1 내지 10"의 명시된 범위는 최소값 1과 최대값 10(이들 값 포함) 사이의 임의의 및 모든 하위 범위; 즉, 최소값 1 또는 그 초과, 예를 들어, 1 내지 6.1로 시작하고 최대값 10 또는 그 미만, 예를 들어, 5.5 내지 10으로 끝나는 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본 발명의 양태 또는 실시형태가 마쿠쉬 군 또는 대안의 다른 그룹핑 관점에서 기재되는 경우, 본 개시내용은 전체로서 열거된 전체 군뿐만 아니라 군의 각각의 구성원을 개별적으로 그리고 주요 군의 모든 가능한 하위군을 포함할 뿐만 아니라 군 구성원 중 하나 이상이 없는 주요 군을 포함한다. 본 개시내용은 또한 본 발명의 실시형태에서 임의의 군 구성원 중 하나 이상의 명시적 배제를 고려한다.
예시적인 방법 및 물질이 본 명세서에 기재되어 있지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있다. 물질, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한을 의도하는 것이 아니다.
2. 정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 과학 및 기술 용어는 본 개시내용이 포함하는 선행 기술의 일반적인 지식을 가진 당업자가 일반적으로 이해한다. 일반적으로, 이들 용어는 분자 생물학, 면역학, 세포 배양 및 분석 생화학과 관련된 기술과 관련하여 사용될 것이며 당업계에 널리 공지되어 있고 일반적으로 사용된다. 따라서 제공된 사양 및 정의는 임의의 용어 충돌을 줄이기 위해 수행된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "확증 검정"은 경쟁 검정을 지칭한다. 예를 들어, 도 1C를 참조한다. 예를 들어, 환자로부터 얻은 샘플은 샘플이 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드(또는 이의 일부)와 접촉하기 전에 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드(또는 이의 일부)와 함께 인큐베이션될 수 있다. 가용성 분자는 샘플 중의 임의의 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체에 결합하기 위해 고정된 분자와 경쟁한다. 이러한 경쟁은 검정에서 포획된 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체의 수를 감소시키고, 따라서 포획된 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 통해, 고정된 분자에 결합된 2차 항체의 수를 감소시키고 2차 항체로부터의 전체 신호를 감소시킨다. 이러한 신호 감소는 본 명세서에서 "저해 백분율"로 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "컷 포인트 인자" 및 "CPF"는 샘플에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체의 검출을 위한 전체 항체 스크리닝 검정 또는 스크리닝 검정에서 역치 신호를 지칭한다. 역치 신호 이상의 신호는 항체가 검출되었음을 나타낸다. 역치 신호 미만의 신호는 항체가 검출되지 않았음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 신호는 정규화된 값, 예를 들어, 음성 대조군으로 정규화된다. 이러한 실시형태에서, 특정 검정에 대해 "컷 포인트" 신호가 계산될 수 있다. 예를 들어, 광학 밀도(OD)를 측정하는 검정에서, "컷 포인트 OD"는 CPF와 음성 대조군으로부터의 평균 OD 신호를 곱하여 결정될 수 있다. CPF는 매개변수 방법, 강력한 매개변수 방법 또는 비매개변수 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CPF는 매개변수 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, CPF는 강력한 매개변수 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, CPF는 비매개변수 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, CPF는 각각 중화 항-AAV 항체 검정에 대해 음성인 집단 참조 대상체로부터 얻은 샘플로부터 결정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "컷 포인트 백분율" 및 "CPP"는 샘플에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체의 검출을 위한 확증 검정에서 역치 저해 백분율을 지칭한다. 역치 신호 이상의 저해 백분율은 항체가 검출되었음을 나타낸다. 역치 신호 미만의 저해 백분율은 항체가 검출되지 않았음을 나타낸다. CPP는 매개변수 방법, 강력한 매개변수 방법 또는 비매개변수 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, CPP는 매개변수 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, CPP는 강력한 매개변수 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, CPP는 비매개변수 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, CPP는 각각 중화 항-AAV 항체 검정에 대해 음성인 집단 참조 대상체로부터 얻은 샘플로부터 결정된다.
용어 "검출 항체" 및 "2차 항체"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체에 결합하고 샘플에서 해당 항체의 검출을 허용하는 항체를 지칭한다. 따라서, 검출 항체는 전형적으로 호스래디쉬 퍼옥시다제와 같은 검출 가능한 표지에 접합된다. 일부 실시형태에서, 검출 항체는 항-IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 검출 항체는 샘플이 얻어지는 대상체의 종으로부터의 항체에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 항-인간 IgG 항체는 인간 대상체로부터 얻은 샘플에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체에 결합하기 위한 검출 항체로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "비매개변수 방법"은 CPF 또는 CPP를 결정하는 방법을 지칭한다. 비매개변수 방법은 Shapiro-Wilk P<0.05 및 왜도(skewness)>1 또는 <-1인 집단에 대해서 사용된다. 비매개변수 방법에 기반한 스크리닝 검정에 대한 CPF는 95번째 백분위수이고 비매개변수 방법에 기반한 확증 검정에 대한 CPP는 99번째 백분위수이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "정규화된 반응" 및 "NR"은 검정에서 사용되는 표준으로부터의 신호에 대한 샘플로부터의 신호의 비율을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표준은 음성 대조군이다. 예를 들어, 각각의 샘플로부터의 신호는 검정에 의해 정의되는 바와 같이, 음성 대조군으로부터의 평균 신호로 나눠질 수 있다. 일부 실시형태에서, 스크리닝 검정에 대한 정규화된 반응은 다음과 같이 계산된다:
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "광학 밀도" 및 "OD"는 농도 측정을 지칭하며, 샘플이 광을 흡수하거나 반사하는 정도에 의해 정의된다. 따라서, 샘플의 광학 밀도(OD)는 표준 곡선과 비교되어 주어진 성분의 농도를 결정할 수 있다. 표준 곡선은 예를 들어, 양성 대조군의 연속 희석을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지(예를 들어, 비색 표지, 예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제)로부터의 신호는 광학 밀도에 의해 측정된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "매개변수 방법"은 CPF 또는 CPP를 결정하는 방법을 지칭한다. 매개변수 방법은 Shapiro-Wilk P>0.05인 집단에 대해서 사용된다. 일부 실시형태에서, CPF 또는 CPP는 95% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법에 기반하고 평균 + (1.645×SD)와 동일하다. 일부 실시형태에서, CPF 또는 CPP는 99% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법에 기반하고 평균 + (2.33×SD)와 동일하다. SD: 표준 편차.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "저해 백분율"은 확증 검정에서 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 포함하는 샘플에서의 신호의 감소를 지칭한다. 저해 백분율은 다음 수학식으로 계산될 수 있다:
반응은 정규화되거나 원시일 수 있다. 일부 실시형태에서, 저해 백분율은 십진수로 표현될 수 있다. 예를 들어, 30% 저해는 0.3 저해라고도 지칭될 수 있다. 십진수로 표시되는 경우, 백분율 기호(%)는 생략된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "강력한 매개변수 방법"은 CPF 또는 CPP를 결정하는 방법을 지칭한다. 강력한 매개변수 방법은 Shapiro-Wilk P<0.05 및 -1<왜도<1인 집단에 대해서 사용된다. 일부 실시형태에서, CPF 또는 CPP는 95% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법에 기반하고 중간값 + (1.645×(1.483×MAD))와 동일하다. MAD: 평균 절대 편차. 일부 실시형태에서, CPF 또는 CPP는 99% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법에 기반하고 중간값 + (2.33×SD)와 동일하다. SD: 표준 편차.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "샘플"은 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하는 데 사용될 수 있는 대상체로부터 얻은 임의의 조직 또는 유체를 지칭한다. 대상체로부터 얻은 샘플은 시험 전에 변형될 수 있으며 여전히 본 명세서에서 "샘플"로 간주될 것이다. 예를 들어, 혈액의 바이알은 대상체로부터 얻은 경우, 혈액의 혈청 부분을 혈액의 다른 성분으로부터 단리시킬 수 있다. 본 개시내용에서, 이러한 단리된 혈청은 환자로부터 얻은 샘플로 간주된다. 유사하게, 환자로부터 단일 샘플을 얻은 다음, 둘 이상의 샘플로 나눌 수 있다. 각각의 샘플은 여전히 대상체로부터 얻은 것으로 간주된다. 예를 들어, 확증 검정에서, 단일 혈청 샘플을 대상체로부터 얻을 수 있고, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드와 접촉하지 않는 제1 샘플과, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드와 접촉하는 제2 샘플로 나눌 수 있다. 제1 샘플 및 제2 샘플은 둘 다 대상체로부터 얻은 샘플로 간주된다.
용어 "스크리닝 검정" 및 "전체 항체 스크리닝 검정"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체의 존재를 검출하기 위한 항체 시험을 지칭한다. 예를 들어, 도 1B를 참조한다. 스크리닝 검정은 전형적으로 샘플에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포획하기 위해 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드(또는 이의 부분)를 사용한다. 그 다음 포획된 항체는 검출 가능한 표지에 접합된 2차 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 검정은 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 2차 항체를 사용하는 ELISA일 수 있다. 스크리닝 검정은 컷 포인트 인자에 따라 전형적으로 해석된다.
용어 "대상체", "환자" 및 "개체"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체 검출을 위해 샘플로부터 채취된 인간 또는 비인간 동물을 지칭하며, 음성 대조군 및/또는 양성 대조군 세대로서 사용한다. 일부 실시형태에서, 개체는 유전자 요법을 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 AAV(예를 들어, AAV6) 벡터로의 치료를 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 AAV(예를 들어, AAV6) 벡터로 치료를 받았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 AAV(예를 들어, AAV6) 벡터로 치료를 받지 않았다. 이러한 용어는 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이) 및 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 개, 돼지 등)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "전체 항체 검정"은 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6)가 중화 항체인지 비중화 항체인지의 여부와 상관없이 샘플에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체의 존재를 검출하기 위해 사용되는 시험을 지칭한다. 본 명세서에 개시된 스크리닝 검정 및 확증 검정은 전체 항체 검정이다.
3. 스크리닝 검정을 사용한 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체의 검출
본 개시내용의 제1 양태는 스크리닝 검정을 사용하여 대상체에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 시험 대상체로부터 얻은 시험 샘플을 제공하는 단계; (b) 시험 샘플을 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, AAV 캡시드는 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (c) 시험 샘플-접촉된 고정된 AAV 캡시드를 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 시험 2차 항체는 시험 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; 및 (d) 시험 검출 가능한 표지를 검출하는 단계를 포함하되; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 컷 포인트 인자 이상인 경우 시험 대상체는 항-AAV 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 컷 포인트 인자 미만인 경우 시험 대상체는 항-AAV 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해서 결정된다: (1) 복수의 참조 대상체로부터 얻은 참조 샘플을 제공하는 단계로서, 참조 대상체 각각은 중화 항-AAV 항체 검정에 대해서 음성(즉, 사전스크리닝된 음성)이었던, 단계; (2) 각각의 참조 샘플을 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, AAV 캡시드는 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (3) 각각의 참조 샘플-접촉된 고정된 AAV 캡시드를 참조 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 참조 2차 항체는 참조 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; (4) 각각의 참조 샘플에 대한 참조 검출 가능한 표지를 검출하는 단계; (5) 이상치 참조 샘플을 제거하는 단계; 및 (6) 이상치-제거 참조 샘플을 사용하여 컷 포인트 인자를 결정하는 단계. 일부 실시형태에서, 이상치 참조 샘플은 기준 [Q1-1.5*(Q3-Q1),Q3+1.5*(Q3-Q1)]을 사용하여 제거된다. 일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자를 결정하기 위해서 사전스크리닝된 음성 대상체를 사용하는 것은 컷 포인트 인자를 결정하기 위해서 무작위 대상체를 사용하는 것과 비교할 때 이상치 제거 라운드가 적어도 1회 더 적어진다. 일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자는 95% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법에 기반한다(즉, 평균 + (1.645×SD)와 동일함). 일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자는 99% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법에 기반한다(즉, 평균 + (2.33×SD)와 동일함). 일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자는 95% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법에 기반한다(즉, 중간값 + (1.645 x (1.483×MAD))와 동일함). 일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자는 99% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법에 기반한다(즉, 중간값 + (2.33×SD)와 동일함). 일부 실시형태에서, 컷 포인트 인자는 비매개변수 방법에 기초한다(즉, 95번째 백분위).
일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이고, AAV 캡시드는 AAV6 캡시드이다.
일부 실시형태에서, 시험 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 참조 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 시험 고정된 AAV 캡시드를 단계 (b) 후에 그리고 단계 (c) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플-접촉된 고정된 시험 AAV 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (d) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함할 수 있다. Tween 20은 폴리솔베이트 20으로서도 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 세척은 3회 반복된다. 일부 실시형태에서, 세척은 플레이트 세척기를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 세척은 실온에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 방법은 참조 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (2) 후에 그리고 단계 (3) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플-접촉된 참조 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (3) 후에 그리고 단계 (4) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함할 수 있다. Tween 20은 폴리솔베이트 20으로서도 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 세척은 3회 반복된다. 일부 실시형태에서, 세척은 플레이트 세척기를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 세척은 실온에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지 및 참조 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 형광발생 표지이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 염료이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 비색 표지이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 방사성 표지이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 화학발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 자성 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 금속 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 하전된 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 이온성 용액이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 아포이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 효소 표지이다.
일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 형광발생 표지이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 염료이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 비색 표지이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 방사성 표지이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 화학발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 자성 입자이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 금속 입자이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 하전된 입자이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 이온성 용액이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 아포이다. 일부 실시형태에서, 참조 검출 가능한 표지는 효소 표지이다.
일부 실시형태에서, 시험 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 원숭이이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 실험실 동물이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 돼지이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 래트이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 고양이이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 개이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 기니피그이다. 일부 실시형태에서, AAV(예를 들어, AAV6) 벡터는 샘플을 시험 대상체로부터 얻기 전에 대상체에게 투여되었다.
일부 실시형태에서, 참조 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 원숭이이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 실험실 동물이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 돼지이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 래트이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 고양이이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 개이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 기니피그이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체 및 참조 대상체는 동일한 종이다.
당업자는 시험 2차 항체가 시험 대상체에 의해서 생산된 항체에 특이적으로 결합되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-인간 항체이다. 유사하게, 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-원숭이 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-돼지 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-래트 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-마우스 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-고양이 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-개 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-기니피그 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 IgM, IgG, IgA, IgD 또는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-IgM 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-IgE 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-IgA 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체는 항-인간 IgG이다.
당업자는 참조 2차 항체가 참조 대상체에 의해서 생산된 항체에 특이적으로 결합되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-인간 항체이다. 유사하게, 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-원숭이 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-돼지 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-래트 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-마우스 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-고양이 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-개 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-기니피그 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 IgM, IgG, IgA, IgD 또는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-IgM 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-IgE 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-IgA 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 참조 2차 항체는 항-인간 IgG이다. 일부 실시형태에서, 시험 2차 항체 ?? 참조 2차 항체는 동일하다.
일부 실시형태에서, 시험 고체 지지체는 배양 플레이트의 웰이다. 일부 실시형태에서, 참조 고체 지지체는 배양 플레이트의 웰이다.
일부 실시형태에서, 시험 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시험 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 참조 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
임의의 항-AAV 항체는 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것에 의해서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV1 항체, 항-AAV2 항체, 항-AAV3B 항체, 항-AAV3 항체, 항-AAV4 항체, 항-AAV5 항체, 항-AAV6 항체, 항-AAV7 항체, 항-AAV8 항체, 항-AAV9 항체, 항-AAV10 항체, 항-AAV11 항체, 항-AAVrh10 항체, 항-AAVrh39 항체, 및 항-AAVrh74 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이다. 일부 실시형태에서, 시험 AAV 캡시드는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3B 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAVrh39 캡시드 및 AAVrh74 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 시험 AAV 캡시드는 AAV6 캡시드이다. 당업자는 시험 AAV 캡시드가 검출될 항-AAV 항체에 상응해야 한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 참조 AAV 캡시드는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3B 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAVrh39 캡시드 및 AAVrh74 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 참조 AAV 캡시드는 AAV6 캡시드이다. 일부 실시형태에서, 시험 AAV 캡시드는 참조 AAV 캡시드와 동일하다.
일부 실시형태에서, 방법은 (a) 대상체로부터 얻은 샘플을 제공하는 단계; (b) 샘플을 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (c) 샘플-접촉된 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 2차 항체는 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; 및 (d) 표지를 검출하는 단계를 포함하되; 표지가 약 1.5 이상의 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출되는 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 표지가 약 1.5 미만의 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출되는 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 약 1.6 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 약 1.6 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 약 1.7 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 약 1.7 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 약 1.73 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 약 1.73 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 약 1.75 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 약 1.75 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.5 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.5 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.6 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.6 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.7 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.7 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.73 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.73 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.75 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.75 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 혈장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 타액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 뇌척수액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 안구액을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (b) 후에 그리고 단계 (c) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플-접촉된 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (d) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함할 수 있다. Tween 20은 폴리솔베이트 20으로서도 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 세척은 3회 반복된다. 일부 실시형태에서, 세척은 플레이트 세척기를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 세척은 실온에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 형광발생 표지이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 염료이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 비색 표지이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 방사성 표지이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 화학발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 자성 입자이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 금속 입자이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 하전된 입자이다. 일부 실시형태에서, 시험 검출 가능한 표지는 이온성 용액이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 아포이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 효소 표지이다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 본 명세서에 열거된 검출 가능한 표지 중 임의의 것의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 배양 플레이트의 웰이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 원숭이이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 실험실 동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 돼지이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 래트이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 고양이이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 개이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 기니피그이다. 일부 실시형태에서, AAV(예를 들어, AAV6) 벡터는 샘플을 대상체로부터 얻기 전에 대상체에게 투여되었다.
당업자는 2차 항체가 대상체에 의해서 생산된 항체에 특이적으로 결합되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-인간 항체이다. 유사하게, 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-원숭이 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-돼지 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-래트 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-마우스 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-고양이 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-개 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-기니피그 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 IgM, IgG, IgA, IgD 또는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-IgM 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-IgE 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-IgA 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 2차 항체는 항-인간 IgG이다.
일부 실시형태에서, 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
임의의 항-AAV 항체는 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV1 항체, 항-AAV2 항체, 항-AAV3B 항체, 항-AAV3 항체, 항-AAV4 항체, 항-AAV5 항체, 항-AAV6 항체, 항-AAV7 항체, 항-AAV8 항체, 항-AAV9 항체, 항-AAV10 항체, 항-AAV11 항체, 항-AAVrh10 항체, 항-AAVrh39 항체, 및 항-AAVrh74 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3B 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAVrh39 캡시드 및 AAVrh74 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드는 AAV6 캡시드이다. 당업자는 AAV 캡시드가 검출될 항-AAV 항체에 상응해야 한다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것의 음성 대조군은 사전스크리닝된 음성 샘플이다. 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 음성 대조군은 중화 항체 검정에서 음성이었다. 예를 들어, 도 1A를 참조한다.
본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것의 일부 실시형태에서, 스크리닝 검정은 ELISA이다. 일부 실시형태에서, ELISA는 하기 단계를 포함한다:
1. ELISA 플레이트를 100㎕/웰의 희석된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드(1.5E10cp/㎖)로 4℃에서 밤새 코팅함.
2. 플레이트를 Tween 20을 함유하는 300㎕의 인산염 완충 식염수로 3회 세척함.
3. 200㎕의 샘플 완충액을 모든 웰에 첨가하고, 실온에서 2 내지 3시간 동안 인큐베이션시킴.
4. 플레이트를 Tween 20을 함유하는 300㎕의 인산염 완충 식염수로 3회 세척함.
5. 100㎕의 샘플을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킴.
6. 플레이트를 Tween 20을 함유하는 300㎕의 인산염 완충 식염수로 6회 세척함.
7. 100㎕의 호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-인간 IgG(잭슨사(Jackson), 0.8mg/㎖ 1:40k 희석)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킴.
8. 플레이트를 Tween 20을 함유하는 300㎕의 인산염 완충 식염수로 3회 세척함.
9. 100㎕의 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킴.
10. 100㎕의 정지 용액을 첨가하고, 450/650nm에서 플레이트를 판독함.
일부 실시형태에서, 샘플 완충액은 0.05% Tween 20을 함유한 인산염 완충 식염수 중의 0.5% 소 혈청 알부민이다.
4. 확증 검정을 사용한 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체의 검출
본 개시내용의 제2 양태는 확증 검정을 사용하여 대상체에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 방법은, (a) 시험 대상체로부터 얻은 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플을 제공하는 단계; (b) 제2 시험 샘플을 시험 가용성 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계; (c) 제1 시험 샘플을 제1 시험 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제1 시험 고정된 AAV 캡시드는 제1 시험 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (d) 제2 시험 샘플과 시험 가용성 AAV 캡시드의 혼합물을 제2 시험 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제2 시험 고정된 AAV 캡시드는 제2 시험 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (e) 제1 시험 샘플-접촉된 제1 시험 고정된 AAV 캡시드를 제1 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제1 시험 2차 항체는 제1 시험 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; (f) 혼합물-접촉된 제2 시험 고정된 AAV 캡시드를 제2 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제2 시험 2차 항체는 제2 시험 검출 가능한 표지를 포함하고, 제2 시험 2차 항체는 제1 시험 2차 항체와 동일하고 제1 시험 검출 가능한 표지는 제2 시험 검출 가능한 표지와 동일한, 단계; 및 (g) 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지를 검출하는 단계를 포함하며; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 컷 포인트 백분율 이상만큼 감소되는 경우 대상체는 항-AAV 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 컷 포인트 미만만큼 감소되는 경우 대상체는 항-AAV 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 컷 포인트 백분율은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해서 결정된다: (1) 복수의 참조 대상체로부터 얻은 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플을 제공하는 단계로서, 참조 대상체 각각은 중화 항-AAV 항체 검정에 대해서 음성이었던, 단계; (2) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제2 참조 샘플을 참조 가용성 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계; (3) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제1 참조 샘플을 제1 참조 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제1 참조 고정된 AAV 캡시드는 제1 참조 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (4) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제2 참조 샘플과 참조 가용성 AAV 캡시드의 혼합물을 제2 참조 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제2 참조 고정된 AAV 캡시드는 제2 참조 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (5) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제1 참조 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV 캡시드를 제1 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제1 2차 항체는 제1 참조 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; (6) 각각의 참조 대상체에 대해서, 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV 캡시드를 제2 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제2 2차 항체는 제2 참조 검출 가능한 표지를 포함하고, 제2 2차 항체는 제1 2차 항체와 동일하고, 제1 참조 검출 가능한 표지는 제2 참조 검출 가능한 표지와 동일한, 단계; (7) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지를 검출하는 단계; (8) 이상치 참조 샘플을 제거하는 단계; 및 (9) 이상치-제거 참조 샘플을 사용하여 컷 포인트 백분율을 결정하는 단계.
일부 실시형태에서, 이상치 참조 샘플은 기준 [Q1-1.5*(Q3-Q1),Q3+1.5*(Q3-Q1)]을 사용하여 제거된다. 일부 실시형태에서, 컷 포인트 백분율을 결정하기 위해서 사전스크리닝된 음성 대상체를 사용하는 것은 컷 포인트 백분율을 결정하기 위해서 무작위 대상체를 사용하는 것과 비교할 때 이상치 제거 라운드가 적어도 1회 더 적어진다. 일부 실시형태에서, 컷 포인트 백분율은 95% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법에 기반한다(즉, 평균 + (1.645×SD)와 동일함). 일부 실시형태에서, 컷 포인트 백분율은 99% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법에 기반한다(즉, 평균 + (2.33×SD)와 동일함). 일부 실시형태에서, 컷 포인트 백분율은 95% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법에 기반한다(즉, 중간값 + (1.645×(1.483×MAD))와 동일함). 일부 실시형태에서, 컷 포인트 백분율은 99% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법에 기반한다(즉, 중간값 + (2.33×SD)와 동일함). 일부 실시형태에서, 컷 포인트 백분율은 비매개변수 방법에 기초한다(즉, 99번째 백분위).
일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이고, 시험 가용성 AAV 캡시드는 가용성 AAV6 캡시드이며, 제1 시험 고정된 AAV 캡시드는 제1 시험 고정된 AAV6 캡시드이고, 제2 시험 고정된 AAV 캡시드는 제2 고정된 AAV6 캡시드이다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이고, 참조 가용성 AAV 캡시드는 가용성 참조 AAV6 캡시드이며, 제1 참조 고정된 AAV 캡시드는 제1 참조 고정된 AAV6 캡시드이고, 제2 참조 고정된 AAV 캡시드는 제2 참조 고정된 AAV6 캡시드이다.
일부 실시형태에서, 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플은 각각 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플은 각각 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플은 각각 혈장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플은 각각 타액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플은 각각 뇌척수액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플은 각각 안구액을 포함한다.
일부 실시형태에서, 각각의 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플은 각각 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플은 각각 혈장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플은 각각 타액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플은 각각 뇌척수액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플은 각각 안구액을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 제1 시험 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (e) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 제2 시험 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (d) 후에 그리고 단계 (f) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플-접촉된 제1 시험 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (e) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 혼합물-접촉된 제2 시험 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (f) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함할 수 있다. Tween 20은 폴리솔베이트 20으로서도 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 세척은 3회 반복된다. 일부 실시형태에서, 세척은 플레이트 세척기를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 세척은 실온에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 방법은 제1 참조 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (3) 후에 그리고 단계 (5) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 제2 참조 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (4) 후에 그리고 단계 (6) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플-접촉된 제1 참조 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (5) 후에 그리고 단계 (7) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 혼합물-접촉된 제2 참조 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (6) 후에 그리고 단계 (8) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함할 수 있다. Tween 20은 폴리솔베이트 20으로서도 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 세척은 3회 반복된다. 일부 실시형태에서, 세척은 플레이트 세척기를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 세척은 실온에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 형광발생 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 염료이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 비색 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 방사성 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 화학발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 자성 입자이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 금속 입자이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 하전된 입자이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 이온성 용액이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 아포이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 효소 표지이다.
일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 형광 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 형광발생 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 염료이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 비색 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 방사성 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 화학발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 자성 입자이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 금속 입자이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 하전된 입자이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 이온성 용액이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 아포이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 효소 표지이다.
일부 실시형태에서, 시험 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 원숭이이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 실험실 동물이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 돼지이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 래트이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 고양이이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 개이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체는 기니피그이다. 일부 실시형태에서, AAV(예를 들어, AAV6) 벡터는 샘플을 시험 대상체로부터 얻기 전에 대상체에게 투여되었다.
일부 실시형태에서, 참조 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 원숭이이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 실험실 동물이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 돼지이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 래트이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 고양이이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 개이다. 일부 실시형태에서, 참조 대상체는 기니피그이다. 일부 실시형태에서, 시험 대상체 및 참조 대상체는 동일한 종이다.
당업자는 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체가 시험 대상체에 의해서 생산된 항체에 특이적으로 결합되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-인간 항체이다. 유사하게, 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-원숭이 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-돼지 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-래트 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-마우스 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-고양이 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-개 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-기니피그 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 IgM, IgG, IgA, IgD 또는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-IgM 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-IgE 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-IgA 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 항-인간 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서 제1 시험 2차 항체와 제2 시험 2차 항체는 동일하다.
당업자는 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체가 참조 대상체에 의해서 생산된 항체에 특이적으로 결합되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-인간 항체이다. 유사하게, 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-원숭이 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-돼지 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-래트 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-마우스 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-마우스 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-개 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-기니피그 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 IgM, IgG, IgA, IgD 또는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-IgM 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-IgE 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-IgA 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체는 항-인간 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서 제1 참조 2차 항체와 제2 참조 2차 항체는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 2차 항체 및 제2 시험 2차 항체는 제1 참조 2차 항체 및 제2 참조 2차 항체와 동일하다.
일부 실시형태에서, 제1 시험 고체 지지체는 배양 플레이트의 웰이다. 일부 실시형태에서, 제2 시험 고체 지지체는 배양 플레이트의 웰이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 고체 지지체는 배양 플레이트의 웰이다. 일부 실시형태에서, 제2 참조 고체 지지체는 배양 플레이트의 웰이다.
일부 실시형태에서, 제1 시험 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 시험 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 제2 참조 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 참조 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
임의의 항-AAV 항체는 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 것에 의해서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV1 항체, 항-AAV2 항체, 항-AAV3B 항체, 항-AAV3 항체, 항-AAV4 항체, 항-AAV5 항체, 항-AAV6 항체, 항-AAV7 항체, 항-AAV8 항체, 항-AAV9 항체, 항-AAV10 항체, 항-AAV11 항체, 항-AAVrh10 항체, 항-AAVrh39 항체, 및 항-AAVrh74 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 AAV 캡시드는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3B 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAVrh39 캡시드 및 AAVrh74 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 AAV 캡시드는 AAV6 캡시드이다. 당업자는 제1 시험 AAV 캡시드가 검출될 항-AAV 항체에 상응해야 한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 제2 시험 AAV 캡시드는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3B 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAVrh39 캡시드 및 AAVrh74 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제2 시험 AAV 캡시드는 AAV6 캡시드이다. 당업자는 제2 시험 AAV 캡시드가 검출될 항-AAV 항체에 상응해야 한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 AAV 캡시드는 제2 시험 AAV 캡시드와 동일하다.
일부 실시형태에서, 제1 참조 AAV 캡시드는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3B 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAVrh39 캡시드 및 AAVrh74 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 AAV 캡시드는 AAV6 캡시드이다. 일부 실시형태에서, 제2 참조 AAV 캡시드는 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3B 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAVrh39 캡시드 및 AAVrh74 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제2 참조 AAV 캡시드는 AAV6 캡시드이다. 일부 실시형태에서, 제1 참조 AAV 캡시드는 제2 참조 AAV 캡시드와 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 시험 AAV 캡시드 및 제2 시험 AAV 캡시드는 제1 참조 AAV 캡시드 및 제2 참조 AAV 캡시드와 동일하다.
일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 7.5E10 내지 1.5E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 7.5E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 8E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 9E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.0E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.1E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.2E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.3E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.4E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.5E11cp/㎖의 농도이다.
일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 7.5E10 내지 1.5E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 7.5E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 8E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 9E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.0E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.1E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.2E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.3E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.4E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 시험 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.5E11cp/㎖의 농도이다.
일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 7.5E10 내지 1.5E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 7.5E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 8E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 9E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.0E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.1E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.2E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.3E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.4E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.5E11cp/㎖의 농도이다.
일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 7.5E10 내지 1.5E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 7.5E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 8E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 9E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.0E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.1E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.2E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.3E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.4E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 참조 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.5E11cp/㎖의 농도이다.
일부 실시형태에서, 방법은, (a) 대상체로부터 얻은 제1 샘플 및 제2 샘플을 제공하는 단계; (b) 제2 샘플을 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계; (c) 제1 샘플을 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 제1 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (d) 제2 샘플과 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드의 혼합물을 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 제2 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계; (e) 제1 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 제1 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제1 2차 항체는 제1 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; (f) 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 제2 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제2 2차 항체는 제2 검출 가능한 표지를 포함하고, 제2 2차 항체는 제1 2차 항체와 동일하고, 제2 검출 가능한 표지는 제2 검출 가능한 표지와 동일한, 단계; 및 (g) 제1 표지 및 제2 표지를 검출하는 단계를 포함하며; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 20% 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 20% 미만만큼 감소되는 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 약 22% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 약 22% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 약 24% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 약 24% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 약 24.1% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 약 24.1% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 약 24.5% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 약 24.5% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 22% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 22% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.1% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.1% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.5% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.5% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 각각 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함한다. 제1 샘플은 제2 샘플과 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 각각 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 각각 혈장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 각각 타액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 각각 뇌척수액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 각각 안구액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 공통 샘플로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 방법은 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (e) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (d) 후에 그리고 단계 (f) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (e) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 단계 (f) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세척은 3회 반복된다. 일부 실시형태에서, 세척은 플레이트 세척기를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 세척은 실온에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지는 제2 검출 가능한 표지와 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 호스래디쉬 퍼옥시다제이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 형광 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 형광발생 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 염료이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 비색 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 방사성 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 화학발광 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 자성 입자이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 금속 입자이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 하전된 입자이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 이온성 용액이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 아포이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 효소 표지이다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 본 명세서에 열거된 검출 가능한 표지 중 임의의 것의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 고체 지지체 및 제2 고체 지지체는 각각 배양 플레이트의 웰이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 원숭이이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 실험실 동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 돼지이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 래트이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 고양이이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 개이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 기니피그이다. 일부 실시형태에서, AAV(예를 들어, AAV6) 벡터는 제1 샘플 및 제2 샘플을 대상체로부터 획득하기 전에 대상체에게 투여되었다.
당업자는 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체가 대상체에 의해서 생산된 항체에 특이적으로 결합되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 IgM, IgG, IgA, IgD 또는 IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-IgG 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-IgM 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-IgE 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-IgA 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-IgD 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-인간 IgG 항체이다. 유사하게, 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-원숭이 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-돼지 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-래트 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-마우스 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-고양이 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-개 항체이다. 일부 실시형태에서, 제1 2차 항체 및 제2 2차 항체는 각각 항-기니피그 항체이다.
일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 7.5E10 내지 1.5E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 7.5E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 8E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 9E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.0E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.1E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.2E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.3E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.4E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 약 1.5E11cp/㎖의 농도이다.
일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 7.5E10 내지 1.5E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 7.5E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 8E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 9E10cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.0E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.1E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.2E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.3E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.4E11cp/㎖의 농도이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 1.5E11cp/㎖의 농도이다.
일부 실시형태에서, 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 고정된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 확증 검정은 ELISA이다. 일부 실시형태에서, 챌린지 ELISA는 하기 단계를 포함한다:
1. ELISA 플레이트를 100㎕/웰의 희석된 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드(1.5e10cp/㎖)로 4℃에서 밤새 코팅함.
2. 플레이트를 Tween 20을 함유하는 300㎕의 인산염 완충 식염수로 3회 세척함.
3. 200㎕의 샘플 완충액을 모든 웰에 첨가하고, 실온에서 2 내지 3시간 동안 인큐베이션시킴.
4. 플레이트를 Tween 20을 함유하는 300㎕의 인산염 완충 식염수로 3회 세척함.
5. 7.5e10cp/㎖의 가용성 AAV(예를 들어, AAV6) 캡시드를 대상체로부터 얻은 2개의 샘플 중 하나에 첨가함.
6. 100㎕의 샘플을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킴.
7. 플레이트를 Tween 20을 함유하는 300㎕의 인산염 완충 식염수로 6회 세척함.
8. 100㎕의 호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-인간 IgG(잭슨사, 0.8mg/㎖ 1:40k 희석)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킴.
9. 플레이트를 Tween 20을 함유하는 300㎕의 인산염 완충 식염수로 3회 세척함.
10. 100㎕의 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킴.
11. 100㎕의 정지 용액을 첨가하고, 450/650nm에서 플레이트를 판독함.
일부 실시형태에서, 샘플 완충액은 0.05% Tween 20을 함유한 인산염 완충 식염수 중의 0.5% 소 혈청 알부민이다.
임의의 항-AAV 항체는 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV1 항체, 항-AAV2 항체, 항-AAV3B 항체, 항-AAV3 항체, 항-AAV4 항체, 항-AAV5 항체, 항-AAV6 항체, 항-AAV7 항체, 항-AAV8 항체, 항-AAV9 항체, 항-AAV10 항체, 항-AAV11 항체, 항-AAVrh10 항체, 항-AAVrh39 항체, 및 항-AAVrh74 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV 캡시드, 제1 고정된 AAV 캡시드 및 제2 고정된 AAV 캡시드는 각각 AAV1 캡시드, AAV2 캡시드, AAV3B 캡시드, AAV3 캡시드, AAV4 캡시드, AAV5 캡시드, AAV6 캡시드, AAV7 캡시드, AAV8 캡시드, AAV9 캡시드, AAV10 캡시드, AAV11 캡시드, AAVrh10 캡시드, AAVrh39 캡시드 및 AAVrh74 캡시드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 가용성 AAV 캡시드, 제1 고정된 AAV 캡시드 및 제2 고정된 AAV 캡시드는 각각 AAV6 캡시드이다. 당업자는 가용성 AAV 캡시드, 제1 고정된 AAV 캡시드 및 제2 고정된 AAV 캡시드가 동일해야 하고, 검출될 항-AAV 항체에 상응해야 한다는 것을 인식할 것이다.
5. 치료 방법
본 개시내용의 제3 양태는 유전자 요법을 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체를 제공하는 단계 및 대상체가 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 경우에만 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV, 예를 들어, rAAV6) 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체가 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 경우에만 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV, 예를 들어, rAAV6) 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 rAAV 벡터는 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 rAAV1 벡터, rAAV2 벡터, rAAV3B 벡터, rAAV3 벡터, rAAV4 벡터, rAAV5 벡터, rAAV6 벡터, rAAV7 벡터, rAAV8 벡터, rAAV9 벡터, rAAV10 벡터, rAAV11 벡터, rAAVrh10 벡터, rAAVrh39 벡터, 및 rAAVrh74 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 rAAV6 벡터이다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV1 항체, 항-AAV2 항체, 항-AAV3B 항체, 항-AAV3 항체, 항-AAV4 항체, 항-AAV5 항체, 항-AAV6 항체, 항-AAV7 항체, 항-AAV8 항체, 항-AAV9 항체, 항-AAV10 항체, 항-AAV11 항체, 항-AAVrh10 항체, 항-AAVrh39 항체, 및 항-AAVrh74 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이다. 당업자는 대상체가 투여될 rAAV 벡터에 상응하는 항-AAV 항체에 대해서 음성이어야 한다는 것을 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 대상체에서 임의의 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체는 본 명세서에 개시된 전체 항체 검정(예를 들어, 스크리닝 검정 또는 확증 검정)을 사용하여 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하는 방법 중 임의의 것을 사용하여 검출된다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 임의의 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체는 본 명세서에 개시된 스크리닝 검정을 사용하여 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하는 방법 중 임의의 것을 사용하여 검출된다. 이러한 실시형태에서, rAAV(예를 들어, rAAV6) 벡터는 스크리닝 검정의 대상체에게만 투여되고, 대상체에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하지 못한다(예를 들어, 스크리닝의 정규화된 반응은 컷 포인트 인자 미만이다).
일부 실시형태에서, 대상체에서 임의의 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체는 본 명세서에 개시된 확증 검정을 사용하여 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하는 방법 중 임의의 것을 사용하여 검출된다. 이러한 실시형태에서, rAAV(예를 들어, rAAV6) 벡터는 확증 검정의 대상체에게만 투여되고, 대상체에서 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하지 못한다(즉, 확증 검정에서의 저해 백분율은 컷 포인트 백분율 미만이다).
일부 실시형태에서, 대상체는 유전 장애를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 신경 장애를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 rAAV(예를 들어, rAAV6) 벡터가 투여된다. 일부 실시형태에서, 유전 장애는 리소솜 축적병이다. 일부 실시형태에서, 장애는 혈우병 A형 및 B형, 파브리병, 낫형 세포병, 베타 지중해빈혈, 점액다당류증 타입 I 및 II, 페닐케톤뇨증, 글리코겐 축적병 타입 1a, GLUT1 결핍 증후군 및 HIV/AIDS로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 혈우병 A형을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 혈우병 B형을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 낫형 세포병을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 베타 지중해빈혈을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 점액다당류증 타입 I을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 점액다당류증 타입 II를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 페닐케톤뇨증을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 글리코겐 축적병 타입 1a를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 GLUT1 결핍 증후군을 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 HIV/AIDS를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 파브리병을 앓고 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 원숭이이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 실험실 동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 돼지이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 래트이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 고양이이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 개이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 기니피그이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 이전에 AAV(예를 들어, AAV6) 벡터를 제공받은 적이 없다.
6. 넘버링된 실시형태
본 개시내용의 특정 실시형태는 하기 넘버링된 단락에 제시되어 있다:
A1. 시험 대상체에서 항-아데노-연관 바이러스(항-AAV) 항체를 검출하는 방법으로서,
(a) 시험 대상체로부터 얻은 시험 샘플을 제공하는 단계;
(b) 시험 샘플을 시험 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, AAV 캡시드는 시험 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(c) 시험 샘플-접촉된 고정된 시험 AAV 캡시드를 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 시험 2차 항체는 시험 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; 및
(d) 시험 검출 가능한 표지를 검출하는 단계
를 포함하되; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 컷 포인트 인자 이상인 경우 시험 대상체는 항-AAV 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 컷 포인트 인자 미만인 경우 시험 대상체는 항-AAV 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
A2. 실시형태 A1에 있어서, 컷 포인트 인자는 하기를 포함하는 방법에 의해서 결정되는, 방법:
(1) 복수의 참조 대상체로부터 얻은 참조 샘플을 제공하는 단계로서, 참조 대상체 각각은 중화 항-AAV 항체 검정에 대해서 음성이었던, 단계;
(2) 각각의 참조 샘플을 참조 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 참조 AAV 캡시드는 참조 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(3) 각각의 참조 샘플-접촉된 고정된 참조 AAV 캡시드를 참조 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 참조 2차 항체는 참조 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계;
(4) 각각의 참조 샘플에 대한 참조 검출 가능한 표지를 검출하는 단계;
(5) 이상치 참조 샘플을 제거하는 단계; 및
(6) 이상치-제거 참조 샘플을 사용하여 컷 포인트 인자를 결정하는 단계.
A3. 실시형태 A2에 있어서, 이상치 참조 샘플은 기준 [Q1-1.5*(Q3-Q1),Q3+1.5*(Q3-Q1)]을 사용하여 제거되는, 방법.
A4. 실시형태 A2 또는 A3에 있어서, 컷 포인트 인자는 95% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법에 기초하는, 방법.
A5. 실시형태 A2 또는 A3에 있어서, 컷 포인트 인자는 95% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법에 기초하는, 방법.
A6. 실시형태 A2 또는 A3에 있어서, 컷 포인트 인자는 비매개변수 방법에 기초하는, 방법.
A7. 실시형태 A1 내지 A6 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이고, AAV 캡시드는 AAV6 캡시드인, 방법.
A8. 실시형태 A1 내지 A7 중 어느 하나에 있어서, 시험 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
A9. 실시형태 A1 내지 A8 중 어느 하나에 있어서, 각각의 참조 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
A10. 실시형태 A1 내지 A9 중 어느 하나에 있어서, 방법은 고정된 AAV 캡시드를 단계 (b) 후에 그리고 단계 (c) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
A11. 실시형태 A1 내지 A10 중 어느 하나에 있어서, 방법은 샘플-접촉된 고정된 AAV 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (d) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
A12. 실시형태 A1 내지 A11 중 어느 하나에 있어서, 시험 검출 가능한 표지 및 참조 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
A13. 실시형태 A1 내지 A12 중 어느 하나에 있어서, 시험 대상체는 인간인, 방법.
A14. 실시형태 A1 내지 A13 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 샘플을 시험 대상체로부터 얻기 전에 시험 대상체에게 투여된, 방법.
A15. 시험 대상체에서 항-아데노-연관 바이러스(항-AAV) 항체를 검출하는 방법으로서,
(a) 시험 대상체로부터 얻은 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플을 제공하는 단계;
(b) 제2 시험 샘플을 시험 가용성 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계;
(c) 제1 시험 샘플을 제1 시험 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제1 시험 고정된 AAV 캡시드는 제1 시험 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(d) 제2 시험 샘플과 가용성 시험 AAV 캡시드의 혼합물을 제2 시험 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제2 시험 고정된 AAV 캡시드는 제2 시험 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(e) 제1 시험 샘플-접촉된 제1 시험 고정된 AAV 캡시드를 제1 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제1 시험 2차 항체는 제1 시험 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계;
(f) 혼합물-접촉된 제2 시험 고정된 AAV 캡시드를 제2 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제2 시험 2차 항체는 제2 시험 검출 가능한 표지를 포함하고, 제2 시험 2차 항체는 제1 2차 항체와 동일하고 제1 시험 검출 가능한 표지는 제2 시험 검출 가능한 표지와 동일한, 단계; 및
(g) 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지를 검출하는 단계
를 포함하며; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 컷 포인트 백분율 이상만큼 감소되는 경우 대상체는 항-AAV 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 컷 포인트 미만만큼 감소되는 경우 대상체는 항-AAV 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
A16. 실시형태 A15에 있어서, 컷 포인트는 하기를 포함하는 방법에 의해서 결정되는, 방법:
(1) 복수의 참조 대상체로부터 얻은 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플을 제공하는 단계로서, 참조 대상체 각각은 중화 항-AAV 항체 검정에 대해서 음성이었던, 단계;
(2) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제2 참조 샘플을 참조 가용성 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계;
(3) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제1 참조 샘플을 제1 참조 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제1 참조 고정된 AAV 캡시드는 제1 참조 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(4) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제2 참조 샘플과 참조 가용성 AAV 캡시드의 혼합물을 제2 참조 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제2 참조 고정된 AAV 캡시드는 제2 참조 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(5) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제1 참조 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV 캡시드를 제1 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제1 2차 항체는 제1 참조 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계;
(6) 각각의 참조 대상체에 대해서, 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV 캡시드를 제2 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제2 2차 항체는 제2 참조 검출 가능한 표지를 포함하고, 제2 2차 항체는 제1 2차 항체와 동일하고, 제1 참조 검출 가능한 표지는 제2 참조 검출 가능한 표지와 동일한, 단계;
(7) 각각의 참조 대상체에 대해서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지를 검출하는 단계;
(8) 이상치 참조 샘플을 제거하는 단계; 및
(9) 이상치-제거 참조 샘플을 사용하여 컷 포인트 백분율을 결정하는 단계.
A17. 실시형태 A16에 있어서, 이상치 참조 샘플은 기준 [Q1-1.5*(Q3-Q1),Q3+1.5*(Q3-Q1)]을 사용하여 제거되는, 방법.
A18. 실시형태 A16 또는 A17에 있어서, 컷 포인트 백분율은 99% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법에 기초하는, 방법.
A19. 실시형태 A16 또는 A17에 있어서, 컷 포인트 백분율은 99% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법에 기초하는, 방법.
A20. 실시형태 A16 또는 A17에 있어서, 컷 포인트 백분율은 비매개변수 방법에 기초하는, 방법.
A21. 실시형태 A15 내지 A20 중 어느 하나에 있어서, 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이고, 가용성 AAV 캡시드는 가용성 AAV6 캡시드이며, 제1 고정된 AAV 캡시드는 제1 고정된 AAV6 캡시드이고, 제2 고정된 AAV 캡시드는 제2 고정된 AAV6 캡시드인, 방법.
A22. 실시형태 A15 내지 A21 중 어느 하나에 있어서, 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플은 각각 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
A23. 실시형태 A15 내지 A22 중 어느 하나에 있어서, 각각의 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
A24. 실시형태 A15 내지 A23 중 어느 하나에 있어서, 방법은 제1 시험 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (e) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
A25. 실시형태 A15 내지 A24 중 어느 하나에 있어서, 방법은 제2 시험 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (d) 후에 그리고 단계 (f) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
A26. 실시형태 A15 내지 A25 중 어느 하나에 있어서, 방법은 샘플-접촉된 제1 시험 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (e) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
A27. 실시형태 A15 내지 A26 중 어느 하나에 있어서, 방법은 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (f) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
A28. 실시형태 A15 내지 A27 중 어느 하나에 있어서, 제1 시험 검출 가능한 표지 및 제2 시험 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
A29. 실시형태 A15 내지 A28 중 어느 하나에 있어서, 제1 참조 검출 가능한 표지 및 제2 참조 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
A30. 실시형태 A15 내지 A29 중 어느 하나에 있어서, 시험 대상체는 인간인, 방법.
A31. 실시형태 A15 내지 A30 중 어느 하나에 있어서, AAV 벡터는 샘플을 시험 대상체로부터 얻기 전에 시험 대상체에게 투여된, 방법.
A32. 실시형태 A15 내지 A31 중 어느 하나에 있어서, 시험 가용성 AAV 캡시드는 7.5E10 내지 15E10cp/㎖의 농도인, 방법.
A33. 유전자 요법을 필요로 하는 시험 대상체를 치료하는 방법으로서, 시험 대상체가 항-AAV 항체를 포함하지 않는 경우에만 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 시험 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
시험 대상체에서 임의의 항-AAV 항체는 실시형태 A1 내지 A32 중 어느 하나에 따른 방법에 의해서 검출되는, 방법.
A34. 실시형태 A33에 있어서, 시험 대상체는 유전 장애를 앓고 있는, 방법.
A35. 실시형태 A33에 있어서, 시험 대상체는 신경 장애를 앓고 있는, 방법.
A36. 실시형태 A34 또는 A35에서, 장애는 혈우병 A형 및 B형, 파브리병, 낫형 세포병, 베타 지중해빈혈, 점액다당류증 타입 I 및 II, 페닐케톤뇨증, 글리코겐 축적병 타입 1a, GLUT1 결핍 증후군 및 HIV/AIDS로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
A37. 실시형태 A36에 있어서, 장애는 파브리병인, 방법.
A38. 실시형태 A33 내지 A37 중 어느 하나에 있어서, 시험 대상체는 AAV6 벡터가 이전에 투여된 적이 없는, 방법.
B1. 대상체에서 항-아데노-연관 바이러스(항-AAV; 예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하는 방법으로서,
(a) 대상체로부터 얻은 샘플을 제공하는 단계;
(b) 샘플을 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드는 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(c) 샘플-접촉된 고정된 AAV(예를 들어, 항-AAV6) 캡시드를 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 2차 항체는 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; 및
(d) 표지를 검출하는 단계
를 포함하되; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 1.5 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 1.5 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B2. 실시형태 B1에 있어서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.6 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.6 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B3. 실시형태 B1에 있어서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.7 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.7 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B4. 실시형태 B1에 있어서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.73 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.73 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B5. 실시형태 B1에 있어서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.75 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.75 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B6. 실시형태 B1 내지 B5 중 어느 하나에 있어서, 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
B7. 실시형태 B1 내지 B6 중 어느 하나에 있어서, 방법은 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (b) 후에 그리고 단계 (c) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B8. 실시형태 B7에 있어서, 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함하는, 방법.
B9. 실시형태 B1 내지 B8 중 어느 하나에 있어서, 방법은 샘플-접촉된 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (d) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B10. 실시형태 B9에 있어서, 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함하는, 방법.
B11. 실시형태 B1 내지 B10 중 어느 하나에 있어서, 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
B12. B11에 있어서, 검출 가능한 표지는 비색 표지인, 방법.
B13. B12에 있어서, 검출 가능한 표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제인, 방법.
B14. 실시형태 B1 내지 B13 중 어느 하나에 있어서, 고체 지지체는 배양 플레이트의 웰인, 방법.
B15. 실시형태 B1 내지 B14 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 포유동물인, 방법.
B16. 실시형태 B15에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
B17. 실시형태 B16에 있어서, 2차 항체는 항-인간 IgG 항체인, 방법.
B18. 실시형태 B1 내지 B17 중 어느 하나에 있어서, AAV(예를 들어, rAAV6) 벡터는 샘플을 대상체로부터 얻기 전에 대상체에게 투여된, 방법.
B19. 실시형태 B1 내지 B18 중 어느 하나에 있어서, 음성 대조군은 사전스크리닝된 음성 샘플인, 방법.
B20. 실시형태 B19에 있어서, 음성 대조군은 중화 항체 검정에서 사전스크리닝된, 방법.
B21. 대상체에서 항-아데노-연관 바이러스(항-AAV; 예를 들어, 항-AAV6) 항체를 검출하는 방법으로서,
(a) 대상체로부터 얻은 제1 샘플 및 제2 샘플을 제공하는 단계;
(b) 제2 샘플을 가용성 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계;
(c) 제1 샘플을 제1 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제1 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드는 제1 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(d) 제2 샘플과 가용성 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드의 혼합물을 제2 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제2 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드는 제2 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(e) 제1 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 제1 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제1 2차 항체는 제1 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계;
(f) 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 제2 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제2 2차 항체는 제2 검출 가능한 표지를 포함하고, 제2 2차 항체는 제1 2차 항체와 동일하고, 제2 검출 가능한 표지는 제2 검출 가능한 표지와 동일한, 단계; 및
(g) 제1 표지 및 제2 표지를 검출하는 단계
를 포함하며; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 20% 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 20% 미만만큼 감소되는 경우 대상체는 항-AAV 항체(예를 들어, 항-AAV6)를 포함하지 않는 것인, 방법.
B22. 실시형태 B21에 있어서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 22% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 22% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B23. 실시형태 B21에 있어서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B24. 실시형태 B21에 있어서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.1% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.1% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B25. 실시형태 B21에 있어서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.5% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.5% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B26. 실시형태 B21 내지 B25 중 어느 하나에 있어서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 각각 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
B27. 실시형태 B21 내지 B26 중 어느 하나에 있어서, 방법은 제1 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (e) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B28. 실시형태 B21 내지 B27 중 어느 하나에 있어서, 방법은 제2 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (d) 후에 그리고 단계 (f) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B29. 실시형태 B27 또는 B28에 있어서, 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함하는, 방법.
B30. 실시형태 B21 내지 B29 중 어느 하나에 있어서, 방법은 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (e) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B31. 실시형태 B21 내지 B30 중 어느 하나에 있어서, 방법은 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (f) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B32. 실시형태 B30 또는 B31에 있어서, 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함하는, 방법.
B33. 실시형태 B21 내지 B32 중 어느 하나에 있어서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지 각각은 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
B34. 실시형태 B33에 있어서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 비색 표지인, 방법.
B35. 실시형태 B34에 있어서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 호스래디쉬 퍼옥시다제인, 방법.
B36. 실시형태 B21 내지 B35 중 어느 하나에 있어서, 제1 고체 지지체 및 제2 고체 지지체는 각각 배양 플레이트의 웰인, 방법.
B37. 실시형태 B21 내지 B36 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 포유동물인, 방법.
B38. 실시형태 B37에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
B39. 실시형태 B38에 있어서, 2차 항체는 항-인간 IgG 항체인, 방법.
B40. 실시형태 B21 내지 B39 중 어느 하나에 있어서, AAV(예를 들어, rAAV6) 벡터는 샘플을 샘플로부터 얻기 전에 대상체에게 투여된, 방법.
B41. 실시형태 B21 내지 B40 중 어느 하나에 있어서, 가용성 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드는 7.5E10 내지 15E10cp/㎖의 농도인, 방법.
B42. 유전자 요법을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체가 항-AAV(예를 들어, 항-rAAV6) 항체를 포함하지 않는 경우에만 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV, 예를 들어, rAAV6) 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
대상체에서 임의의 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해서 검출되고, 이 방법은,
(a) 대상체로부터 얻은 샘플을 제공하는 단계;
(b) 샘플을 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드는 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(c) 샘플-접촉된 고정된 AAV(예를 들어, 항-AAV6) 캡시드를 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 2차 항체는 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; 및
d) 표지를 검출하는 단계
를 포함하되; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 1.5 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 표지가 1.5 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B43. 실시형태 B42에 있어서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.6 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.6 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B44. 실시형태 B42에 있어서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.7 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.7 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B45. 실시형태 B42에 있어서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.73 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.73 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B46. 실시형태 B42에 있어서, 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응이 1.75 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응 1.75 미만인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B47. 실시형태 B42 내지 B46 중 어느 하나에 있어서, 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
B48. 실시형태 B42 내지 B47 중 어느 하나에 있어서, 방법은 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (b) 후에 그리고 단계 (c) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B49. 실시형태 B48에 있어서, 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함하는, 방법.
B50. 실시형태 B42 내지 B49 중 어느 하나에 있어서, 방법은 샘플-접촉된 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (d) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B51. 실시형태 B50에 있어서, 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함하는, 방법.
B52. 실시형태 B42 내지 B51 중 어느 하나에 있어서, 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
B53. B52에 있어서, 검출 가능한 표지는 비색 표지인, 방법.
B54. B53에 있어서, 검출 가능한 표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제인, 방법.
B55. 실시형태 B42 내지 B54 중 어느 하나에 있어서, 고체 지지체는 배양 플레이트의 웰인, 방법.
B56. 실시형태 B42 내지 B55 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 포유동물인, 방법.
B57. 실시형태 B56에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
B58. 실시형태 B57에 있어서, 2차 항체는 항-인간 IgG 항체인, 방법.
B59. 실시형태 B42 내지 B58 중 어느 하나에 있어서, 음성 대조군은 사전스크리닝된 음성 샘플인, 방법.
B60. 유전자 요법을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체가 항-AAV(예를 들어, 항-rAAV6) 항체를 포함하지 않는 경우에만 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV, 예를 들어, rAAV6) 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
대상체에서 임의의 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해서 검출되고, 상기 방법은,
(a) 대상체로부터 얻은 제1 샘플 및 제2 샘플을 제공하는 단계;
(b) 제2 샘플을 가용성 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계;
(c) 제1 샘플을 제1 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제1 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드는 제1 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(d) 제2 샘플과 가용성 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드의 혼합물을 제2 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 제2 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드는 제2 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(e) 제1 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 제1 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제1 2차 항체는 제1 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계;
(f) 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 제2 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 제2 2차 항체는 제2 검출 가능한 표지를 포함하고, 제2 2차 항체는 제1 2차 항체와 동일하고, 제2 검출 가능한 표지는 제2 검출 가능한 표지와 동일한, 단계; 및
(g) 제1 표지 및 제2 표지를 검출하는 단계
를 포함하며; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 20% 이상인 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 20% 미만만큼 감소되는 경우 대상체는 항-AAV 항체(예를 들어, 항-AAV6)를 포함하지 않는 것인, 방법.
B61. 실시형태 B60에 있어서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 22% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 22% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B62. 실시형태 B60에 있어서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B63. 실시형태 B60에 있어서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.1% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.1% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B64. 실시형태 B60에 있어서, 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.5% 이상만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하고; 검출된 제2 표지의 양이 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 24.5% 미만만큼 감소된 경우 대상체는 항-AAV(예를 들어, 항-AAV6) 항체를 포함하지 않는 것인, 방법.
B65. 실시형태 B60 내지 B64 중 어느 하나에 있어서, 제1 샘플 및 제2 샘플은 각각 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
B66. 실시형태 B60 내지 B65 중 어느 하나에 있어서, 방법은 제1 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (e) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B67. 실시형태 B60 내지 B66 중 어느 하나에 있어서, 방법은 제2 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (d) 후에 그리고 단계 (f) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B68. 실시형태 B66 또는 B67에 있어서, 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함하는, 방법.
B69. 실시형태 B60 내지 B68 중 어느 하나에 있어서, 방법은 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (e) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B70. 실시형태 B60 내지 B69 중 어느 하나에 있어서, 방법은 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드를 단계 (f) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
B71. 실시형태 B69 또는 B70에 있어서, 세척 완충액은 1× 인산염 완충 식염수, 0.05% Tween 20을 포함하는, 방법.
B72. 실시형태 B60 내지 B71 중 어느 하나에 있어서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지 각각은 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
B73. 실시형태 B72에 있어서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 비색 표지인, 방법.
B74. 실시형태 B73에 있어서, 제1 검출 가능한 표지 및 제2 검출 가능한 표지는 각각 호스래디쉬 퍼옥시다제인, 방법.
B75. 실시형태 B60 내지 B74 중 어느 하나에 있어서, 제1 고체 지지체 및 제2 고체 지지체는 각각 배양 플레이트의 웰인, 방법.
B76. 실시형태 B60 내지 B75 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 포유동물인, 방법.
B77. 실시형태 B76에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
B78. 실시형태 B77에 있어서, 2차 항체는 항-인간 IgG 항체인, 방법.
B79. 실시형태 B60 내지 B78 중 어느 하나에 있어서, 가용성 AAV(예를 들어, rAAV6) 캡시드는 7.5E10 내지1.5E11cp/㎖의 농도인, 방법.
B80. 실시형태 B42 내지 B79 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 유전 장애를 앓고 있는, 방법.
B81. 실시형태 B42 내지 B79 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 신경 장애를 앓고 있는, 방법.
B82. 실시형태 B80 또는 B81에서, 장애는 혈우병 A형 및 B형, 파브리병, 낫형 세포병, 베타 지중해빈혈, 점액다당류증 타입 I 및 II, 페닐케톤뇨증, 글리코겐 축적병 타입 1a, GLUT1 결핍 증후군 및 HIV/AIDS로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
B83. 실시형태 B82에 있어서, 장애는 파브리병인, 방법.
B84. 실시형태 B42 내지 B83에 있어서, 대상체는 AAV(예를 들어, rAAV6) 벡터가 이전에 투여된 적이 없는, 방법.
실시예
실시예 1
중화 항체 검정
검정의 감도와 선택성을 추가로 증가시키기 위해서, AAV6 중화 항체(NAb) 활성 검정을 사용하여 음성 대조군(NC) 샘플을 선택하였다. 예를 들어, 도 1A를 참조한다. 간략하면, 샘플 혈청의 연속 희석물을 AAV6-기반 리포터 벡터와 함께 인큐베이션시켜 루시퍼라제 유전자를 운반하여 혈청 중의 임의의 중화 항체가 리포터 벡터에 결합하도록 하였다. 1시간 후, 샘플을 96웰 플레이트로 옮기고 _HT1080_세포와 함께 인큐베이션시켰다. 22시간 후, 모든 웰을 마이크로플레이트 판독기에서 판독하여 루시퍼라제 발현을 결정하였다. 음성 대조군에 정규화시킨 후 각각의 혈청 희석액에 대한 중화 백분율을 계산하였다. 각각의 샘플을 이중으로 실행하고, 각각의 플레이트는 양성 대조군(혈청은 없지만 AAV6-루시퍼라제 벡터가 있는 웰), 음성 대조군(세포 배양 배지만 있는 웰) 및 음성 대조군 샘플 혈청을 포함하였다.
스크리닝 검정에서 저농도(OD=약 0.1)를 갖는 혈청 샘플을 음성 대조군(NC) 샘플로 선택하였다(도 2).
실시예 2
인간 혈청을 위한 항-AAV6 항체에 대한 스크리닝 검정
본 명세서에 기재된 절차를 사용하여 인간 혈청에서 항-AAV6 총 항체의 존재를 평가하였다. High Binding Easy Wash Microtiter ELISA 플레이트(코닝사(Corning), 카탈로그 번호: 3369)를 1× Dulbecco 인산염 완충 식염수(DPBS)에 희석된 AAV6 캡시드(1.5e10cp/㎖; 상가모사(Sangamo), REC-000841-130178) 100㎕/웰로 코팅하고, 밀봉하고, 2 내지 8℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트를 실온에서 최소 15분 동안 인큐베이션시킨 후 플레이트 밀봉기를 제거하고, 플레이트를 300㎕/웰 세척 완충액(1×PBS 0.05% Tween 20)으로 3회 세척하였다. 과량의 액체를 제거한 후, 검정 희석액(세척 완충액 중의 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)) 200㎕/웰을 첨가하여 플레이트를 차단하고 플레이트를 플레이트 밀봉기로 덮고 10분 동안 부드럽게 교반하면서 실온에서 2 내지 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트 밀봉기를 제거한 후 플레이트를 300㎕/웰 세척 완충액으로 3회 세척하고 과량의 액체를 제거하였다.
플레이트를 최소 2시간 동안 차단시킨 후, 음성 대조군(풀링된 혈청, 상가모사, 1650-28)을 포함한 대조군 100㎕/웰, 양성 역가 대조군의 연속 희석액(음성 대조군 혈청 중의 양성 공급원 항체 500㎍/㎖, 상가모사 1732-5) 및 혈청 시험 샘플을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 덮고, 2시간 ± 10분 동안 부드럽게 교반하면서 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트 밀봉기를 제거한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 300㎕/웰로 6회 세척하고 과량의 액체를 제거하였다. 항-AAV6 항체를 검출하기 위해, 항-인간 IgG 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된 검출 항체(1:40,000) 100㎕/웰을 첨가하였다. 그 다음 플레이트를 플레이트 밀봉기로 덮고, 교반하면서 실온에서 1시간±5분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충액 300㎕/웰로 6회 세척하고 과량의 액체를 제거하였다. HRP의 존재는 3, 3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 두 부분 키트(KPL, 키트 #50-76-00, A:5120-0049, B: 5120-0038)를 사용하여 검출하였는데, 여기서 동일 부의 용액 A(TMB 퍼옥시다제 기질) 및 용액 B(퍼옥시다제 용액 B)를 합하고 합한 용액 100㎕/웰을 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 교반하면서 플레이트를 15분±2분 동안 발색하게 하고, 100㎕/웰의 정지 용액(1M H3PO4; 수모딕스사(Surmodics), 카탈로그 번호 SLTP-1000-01)을 첨가하여 발색 반응을 종료하였다. SpectraMax I3X 플레이트 판독기(몰레큘러 디바이시스사(Molecular Devices))를 사용하여 플레이트를 450nm 및 650nm 파장에서 판독하였다.
모든 샘플을 하기와 같이 NC에 정규화하였다:
실시예 3
확증 검정
대상체 샘플에서 항-AAV6 항체의 특이성을 확인하기 위해, 확증 분석을 수행하였다. 간략하면, 가용성 AAV6 캡시드(7.5e10cp/㎖ 또는 1.5e11cp/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 혈청 샘플을 시험한 것을 제외하고는, 실시예 2에 기재된 바와 같이 ELISA 검정을 수행하였다. 저해 백분율은 다음과 같이 계산하였다:
실시예 4
무작위 샘플을 사용한 컷 포인트 결정
항-AAV6 항체에 대한 건강한 공여자에서의 높은 혈청유병률은 양성 사례와 음성 사례 사이의 명확한 구분을 허용하지 않는다. 추가로, 이러한 샘플로부터의 스크리닝 검정 데이터는 정상적으로 분포되지 않으며 컷 포인트 인자(CPF)에 영향을 줄 수 있는 여러 라운드의 이상치 제거가 필요하다. 실시예 2의 ELISA 스크리닝 검정 및 실시예 3의 확증 검정은 102개의 무작위 건강한 샘플을 사용하여 수행하였다. 중화 항체 검정(CP는 이전에 0.3(즉, 30% 활성도)인 것으로 결정됨; 0.3 이하의 NR을 갖는 샘플은 양성이고, 0.3 초과의 NR을 갖는 샘플은 음성임)을 사용하여 스크리닝하는 경우, 58개 샘플은 음성이었고, 44개의 샘플은 양성이었다. ELISA 스크리닝 검정으로부터의 정규화된 반응을 JMP v13(에스에이에스 인스티튜트사(SAS Institute))을 사용하여 박스 및 위스커 플롯으로 그래프로 표시하여 분위수(Q) 1 및 3(도 3A)을 기반으로 이상치를 결정하였다. 다음 기준을 사용하여 이상치를 제거하였다:
상기에 기재된 바와 같은 스크리닝 검정을 위해 박스플롯을 사용한 3라운드의 이상치 제거 후, 70개의 샘플을 최종 컷 포인트 계산에 사용하였다. 로그 변환 후, ELISA 스크리닝 검정에 대한 5% 위양성률(FPR) 및 확증 검정에 대한 1% FPR을 사용한 컷 포인트 인자(CPF)에 대한 매개변수 계산은 다음과 같다(도 3B참조):
무작위 샘플의 경우, CPF는 ELISA 스크리닝 검정(도 4A)의 경우 2.6으로 결정되었고 CPP는 확증 검정(도 4B)의 경우에는 43.1% 저해로 결정되었다. 컷 포인트 이상의 값을 갖는 샘플은 양수이고 컷 포인트 미만의 값을 갖는 샘플은 음수였다.
실시예 5
사전스크리닝된 음성 샘플을 사용한 컷 포인트 결정
NAb 검정(CP=0.3)을 사용하여 샘플을 사전스크리닝하여 음성 샘플을 식별하였다. 실시예 2의 ELISA 스크리닝 검정 및 실시예 3의 확증 검정은 104개의 사전스크리닝된 음성 샘플을 사용하여 수행하였다. JMP v13을 사용하여 이상치를 제거하고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 로그 변환을 수행하였는데, 여기서 스크리닝 검정을 위해서는 박스플롯을 사용하여 1라운드의 이상치 제거를 수행하였고, 확증 검정을 위해서는 1회를 수행하였고; 따라서 최종 CP 계산에는 99개의 샘플이 사용되었다. 3라운드의 이상치 제거를 활용하여 32개의 이상치 제거를 초래한 실시예 4의 무작위 샘플과 비교할 때, 사전스크리닝된 샘플의 사용은 더 우수한 데이터 세트가 생성되었는데, 이것은 1라운드의 이상치 제거만을 사용하여 5개의 이상치를 제거하였다. 실제로, 실시예 4의 무작위 샘플로부터 3라운드의 이상치를 제거한 후에도, 분포가 정상적이지 않았다. 예를 들어, 도 4A를 참조한다. 대조적으로, 사전스크리닝된 샘플을 사용한 1라운드의 이상치 제거는 정규 분포를 제공하였다. 사전스크리닝된 음성 샘플을 사용하여 CPF 및 CPP를 실시예 4에 제시된 바와 같이 계산하였다. 스크리닝 검정(5% FPR)에서 사전스크리닝된 음성 샘플에 대한 CPF는 1.75였고, 확증 검정(1% FPR)에서 사전스크리닝된 음성 샘플에 대한 CPP은 24.1%였다(도 5).
실시예 2의 ELISA 스크리닝 검정 및 실시예 3의 확증 검정을 추가 211개의 사전스크리닝된 음성 샘플을 사용하여 반복하였다. 반복 실험에서, 스크리닝 검정(5% FPR)에서 사전스크리닝된 음성 샘플에 대한 CPF는 1.73이었고, 확증 검정(1% FPR)에서 사전스크리닝된 음성 샘플에 대한 CPP은 24.5%였다.
실시예 6
검정 감도의 결정
정제된 양성 대조군 항-AAV6 항체를 생성시키기 위해, 실시예 1의 중화 항체 검정을 사용하여 항-AAV6 항체에 대해 양성인 것으로 사전스크리닝된 63개의 개별 혈청 샘플을 실시예 2에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 항-AAV6 항체에 대해 스크리닝하였다(도 5A 및 도 5B 참조). 이들 63개 중에서, 광학 밀도(OD)가 가장 높은 5개를 선택하고, 양성 대조군(PC)-1-5로 표시하고 적정하였다(도 6A). 적정 곡선의 모든 농도에 걸쳐서 가장 높은 신호를 갖는 샘플인 PC-2(도 6B)를 단백질 A/G 스핀 키트(써모피셔사(Thermofisher), 89950)를 사용한 전체 IgG를 정제를 위해서 그리고 AAV6-자기 비드(PierceTM NHS-활성화 자기 비드; 써모피셔사, 88827)를 사용하여 AAV6 특이적 항체의 친화성 정제를 위해서 선택하였다. 검정 감도를 평가하기 위해서, 전체 IgG 항체 대조군 및 친화성 정제된 항-AAV6 항체의 연속 희석물을 실시예 2의 ELISA 스크리닝 검정 및 실시예 3의 확증 검정을 사용하여 평가하였다(도 7A). 친화성 정제된 항-AAV6 항체는 총 IgG 항체 대조군과 비교할 때 감도를 64배를 초과하게 개선시켰다(도 7B). 예를 들어, 실시예 2의 ELISA 스크리닝 검정에서 CPF에서의 항체 농도는 전체 IgG 항체 대조군의 경우 15.4㎍/㎖였지만, 친화성 정제된 항-AAV6 대조군의 경우에는 단지 0.24㎍/㎖였다. 유사하게, 실시예 3의 확증 검정에서 CPP에서의 항체 농도는 전체 IgG 항체 대조군의 경우 5.85㎍/㎖였지만, 친화성 정제된 항-AAV6 대조군의 경우에는 단지 0.073㎍/㎖였다.
실시예 7
검정 특이성의 확인
최적화된 CPF의 효능을 결정하기 위해서, 실시예 1의 중화 항체 검정(CP=0.3) 및 실시예 2의 ELISA 스크리닝 검정을 사용하여 100개의 샘플을 평가하였다. 중화 항체 검정으로부터의 결과(CPF=0.3, 즉, 30%의 정규화된 RLU)를, 무작위 건강한 샘플로부터 결정된 CPF를 사용한 ELISA 스크리닝 검정으로부터의 결과(CPF=2.6), 사전스크리닝된 음성 샘플을 사용하여 결정된 CPF를 사용한 ELISA 스크리닝 검정으로부터의 결과(CPF=1.73)와 비교하였다(도 8A 내지 도 8C 참조). CPF=2.6(무작위 건강한 대상체)을 사용하여 평가하는 경우, ELISA 스크리닝 검정은 8개의 위음성을 초래하였다(도 8A, 좌측 하단 사분면). CPF=1.75(사전스크리닝된 음성 대상체)를 사용하여, ELISA 스크리닝 검정 결과는 중화 항체 검정 결과와 보다 양호한 상관 관계가 있었고, 위음성 결과는 제거되었다(도 8B, 좌측 하단 사분면). 유사하게, CPP=24.1% 저해(사전스크리닝된 음성 대상체)를 사용하여, 확증 검정 결과는 위음성 결과 없이 중화 항체 검정 결과와 거의 완벽하게 상관 관계가 있었다(도 8C).
추가로, 실시예 6에서 정제된 양성 대조군 항체의 존재 하에서 그리고 부재 하에서 실시예 1의 중화 항체 검정에 대해 사전스크리닝된 샘플을 사용하여 실시예 2의 ELISA 스크리닝 검정 및 실시예 3의 확증 검정을 수행하였다. 구체적으로, 20㎍/㎖ 또는 40㎍/㎖의 양성 대조군 항체를 10개의 음성 개별 혈청 샘플에 첨가하였다(도 9A 및 도 9B 참조). CPF=1.73을 사용하는 ELISA 스크리닝 검정의 경우, 양성 대조군 항체가 없는 모든 샘플은 음성이었고, 양성 대조군 항체가 스파이킹된 모든 샘플은 양성이었다(도 9A). 유사하게, CP=24.1% 저해를 사용하는 확증 검정의 경우, 양성 대조군이 없는 모든 샘플은 음성이었고, 양성 대조군이 스파이킹된 모든 샘플은 양성이었다(도 9B). 이러한 결과는 각각 항-AAV6 항체의 검출에 대한 CPF 및 CPP의 특이성을 확인해 준다.
상기에 제시된 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법의 실시형태를 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제공되며, 개시내용의 범주를 제한하려는 의도가 아니다. 당업자에게 자명한 본 개시내용을 수행하기 위한 전술한 방식의 변형은 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가 수준을 나타낸다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌이 그 전체가 개별적으로 참조에 의해 포함된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 포함된다.
모든 제목 및 섹션 명칭은 명확성 및 참조 목적으로만 사용되며 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 당업자는 본 명세서에 기재된 본 개시내용의 사상 및 범주에 따라 적절하게 상이한 표제 및 섹션으로부터의 다양한 양태를 합하는 유용성을 인식할 것이다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 본 개시내용의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 본 발명의 많은 변형 및 변경이 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 실시형태 및 실시예는 단지 예로서 제공된다.
Claims (38)
- 시험 대상체에서 항-아데노-연관 바이러스(anti-adeno-associated virus)(항-AAV) 항체를 검출하는 방법으로서,
(a) 상기 시험 대상체로부터 얻은 시험 샘플을 제공하는 단계;
(b) 상기 시험 샘플을 시험 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 상기 AAV 캡시드는 시험 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(c) 상기 시험 샘플-접촉된 고정된 시험 AAV 캡시드를 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 시험 2차 항체는 시험 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계; 및
(d) 상기 시험 검출 가능한 표지를 검출하는 단계
를 포함하되; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 상기 표지가 컷 포인트 인자(cut point factor) 이상인 경우 상기 시험 대상체는 항-AAV 항체를 포함하고; 음성 대조군에 대해서 정규화된 반응으로 검출된 상기 표지가 상기 컷 포인트 인자 미만인 경우 상기 시험 대상체는 항-AAV 항체를 포함하지 않는 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 컷 포인트 인자는,
(1) 복수의 참조 대상체로부터 얻은 참조 샘플을 제공하는 단계로서, 상기 참조 대상체 각각은 중화 항-AAV 항체 검정에 대해서 음성이었던, 단계;
(2) 각각의 참조 샘플을 참조 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 상기 참조 AAV 캡시드는 참조 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(3) 각각의 참조 샘플-접촉된 고정된 참조 AAV 캡시드를 참조 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 참조 2차 항체는 참조 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계;
(4) 각각의 참조 샘플에 대한 상기 참조 검출 가능한 표지를 검출하는 단계;
(5) 이상치(outlier) 참조 샘플을 제거하는 단계; 및
(6) 상기 이상치-제거 참조 샘플을 사용하여 상기 컷 포인트 인자를 결정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해서 결정되는, 방법. - 제2항에 있어서, 상기 이상치 참조 샘플은 기준 [Q1-1.5*(Q3-Q1),Q3+1.5*(Q3-Q1)]을 사용하여 제거되는, 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 컷 포인트 인자는 95% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법(parametric method)에 기초하는, 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 컷 포인트 인자는 95% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법(robust parametric method)에 기초하는, 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 컷 포인트 인자는 비매개변수 방법(non-parametric method)에 기초하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이고, 상기 AAV 캡시드는 AAV6 캡시드인, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 참조 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 고정된 AAV 캡시드를 단계 (b) 후에 그리고 단계 (c) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 샘플-접촉된 고정된 AAV 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (d) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 검출 가능한 표지 및 상기 참조 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생(fluorogenic) 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포(spore) 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 대상체는 인간인, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터는 상기 샘플을 상기 시험 대상체로부터 얻기 전에 상기 시험 대상체에게 투여된, 방법.
- 시험 대상체에서 항-아데노-연관 바이러스(항-AAV) 항체를 검출하는 방법으로서,
(a) 상기 시험 대상체로부터 얻은 제1 시험 샘플 및 제2 시험 샘플을 제공하는 단계;
(b) 상기 제2 시험 샘플을 시험 가용성 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계;
(c) 상기 제1 시험 샘플을 제1 시험 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 시험 고정된 AAV 캡시드는 제1 시험 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(d) 상기 제2 시험 샘플과 상기 가용성 시험 AAV 캡시드의 혼합물을 제2 시험 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 시험 고정된 AAV 캡시드는 제2 시험 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(e) 상기 제1 시험 샘플-접촉된 제1 시험 고정된 AAV 캡시드를 제1 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 시험 2차 항체는 제1 시험 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계;
(f) 상기 혼합물-접촉된 제2 시험 고정된 AAV 캡시드를 제2 시험 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 시험 2차 항체는 제2 시험 검출 가능한 표지를 포함하고, 상기 제2 시험 2차 항체는 상기 제1 2차 항체와 동일하고 상기 제1 시험 검출 가능한 표지는 상기 제2 시험 검출 가능한 표지와 동일한, 단계; 및
(g) 상기 제1 시험 검출 가능한 표지 및 상기 제2 시험 검출 가능한 표지를 검출하는 단계
를 포함하되; 상기 검출된 제2 표지의 양이 상기 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 컷 포인트 백분율 이상만큼 감소되는 경우 상기 대상체는 항-AAV 항체를 포함하고; 상기 검출된 제2 표지의 양이 상기 검출된 제1 표지의 양과 비교할 때 상기 컷 포인트 미만만큼 감소되는 경우 상기 대상체는 항-AAV 항체를 포함하지 않는 것인, 방법. - 제15항에 있어서, 상기 컷 포인트는,
(1) 복수의 참조 대상체로부터 얻은 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플을 제공하는 단계로서, 상기 참조 대상체 각각은 중화 항-AAV 항체 검정에 대해서 음성이었던, 단계;
(2) 각각의 참조 대상체에 대해서, 상기 제2 참조 샘플을 참조 가용성 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계;
(3) 각각의 참조 대상체에 대해서, 상기 제1 참조 샘플을 제1 참조 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 참조 고정된 AAV 캡시드는 제1 참조 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(4) 각각의 참조 대상체에 대해서, 상기 제2 참조 샘플과 상기 참조 가용성 AAV 캡시드의 혼합물을 제2 참조 고정된 AAV 캡시드와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 참조 고정된 AAV 캡시드는 제2 참조 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 단계;
(5) 각각의 참조 대상체에 대해서, 상기 제1 참조 샘플-접촉된 제1 고정된 AAV 캡시드를 제1 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 2차 항체는 제1 참조 검출 가능한 표지를 포함하는, 단계;
(6) 각각의 참조 대상체에 대해서, 상기 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV 캡시드를 제2 2차 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 2차 항체는 제2 참조 검출 가능한 표지를 포함하고, 상기 제2 2차 항체는 상기 제1 2차 항체와 동일하고, 상기 제1 참조 검출 가능한 표지는 상기 제2 참조 검출 가능한 표지와 동일한, 단계;
(7) 각각의 참조 대상체에 대해서, 상기 제1 참조 검출 가능한 표지 및 상기 제2 참조 검출 가능한 표지를 검출하는 단계;
(8) 이상치 참조 샘플을 제거하는 단계; 및
(9) 상기 이상치-제거 참조 샘플을 사용하여 상기 컷 포인트 백분율을 결정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해서 결정되는, 방법. - 제16항에 있어서, 상기 이상치 참조 샘플은 기준 [Q1-1.5*(Q3-Q1),Q3+1.5*(Q3-Q1)]을 사용하여 제거되는, 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 컷 포인트 백분율은 99% 신뢰 구간을 갖는 매개변수 방법에 기초하는, 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 컷 포인트 백분율은 99% 신뢰 구간을 갖는 강력한 매개변수 방법에 기초하는, 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 컷 포인트 백분율은 비매개변수 방법에 기초하는, 방법.
- 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-AAV 항체는 항-AAV6 항체이고, 상기 가용성 AAV 캡시드는 가용성 AAV6 캡시드이며, 상기 제1 고정된 AAV 캡시드는 제1 고정된 AAV6 캡시드이고, 상기 제2 고정된 AAV 캡시드는 제2 고정된 AAV6 캡시드인, 방법.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 시험 샘플 및 상기 제2 시험 샘플은 각각 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 제1 참조 샘플 및 제2 참조 샘플은 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 안구액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체를 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 제1 시험 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (c) 후에 그리고 단계 (e) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 제2 시험 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (d) 후에 그리고 단계 (f) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플-접촉된 제1 시험 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (e) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 혼합물-접촉된 제2 고정된 AAV6 캡시드를 단계 (f) 후에 그리고 단계 (g) 전에 세척 완충액과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 시험 검출 가능한 표지 및 상기 제2 시험 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 참조 검출 가능한 표지 및 상기 제2 참조 검출 가능한 표지는 형광 표지, 형광발생 표지, 염료, 비색 표지, 방사성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 자성 입자, 금속 입자, 하전된 입자, 이온성 용액, 아포 및 효소 표지 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제15항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 대상체는 인간인, 방법.
- 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터는 상기 샘플을 상기 시험 대상체로부터 얻기 전에 상기 시험 대상체에게 투여된, 방법.
- 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 가용성 AAV 캡시드는 7.5E10 내지 15E10cp/㎖의 농도인, 방법.
- 유전자 요법을 필요로 하는 시험 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 시험 대상체가 항-아데노-연관 바이러스(항-AAV) 항체를 포함하지 않는 경우에만 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 상기 시험 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
상기 시험 대상체에서 임의의 항-AAV 항체는 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 검출되는, 방법. - 제33항에 있어서, 상기 시험 대상체는 유전 장애를 앓고 있는, 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 시험 대상체는 신경 장애를 앓고 있는, 방법.
- 제34항 또는 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장애는 혈우병 A형 및 B형, 파브리병(Fabry disease), 낫형 세포병(sickle cell disease), 베타 지중해빈혈(beta thalassemia), 점액다당류증(mucopolysaccharidosis) 타입 I 및 II, 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 글리코겐 축적병(glycogen storage disease) 타입 1a, GLUT1 결핍 증후군 및 HIV/AIDS로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 장애는 파브리병인, 방법.
- 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 대상체는 AAV6 벡터가 이전에 투여된 적이 없는, 방법.
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