KR102070763B1

KR102070763B1 - 도파민 신경세포 특이적 발현 제어 시스템

Info

Publication number: KR102070763B1
Application number: KR1020180097376A
Authority: KR
Inventors: 이연종; 함상우; 김효정
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2020-01-29

Abstract

본 발명은 THP 및 tTA을 포함하는 벡터와 TetO 및 표적 유전자를 포함하는 벡터를 이용한 도파민 세포 특이적 표적 유전자의 발현 제어 기술인 도파민 신경세포 특이적 발현 제어 시스템에 관한 것으로, 본 발명에 따른 AAV-THP-tTA 벡터는 질병 유전자의 발현을 급성으로 도파민 세포 특이적으로 유도할 수 있어, 도파민 세포 특이적인 질병 병변 유도가 가능하며, 이러한 세포 특이성을 통해 약물 스크리닝이나 병변의 분자 기작 연구에 유용하고, 도파민 세포 특이적 표적 단백질 발현 제어 시스템의 TetO에 의해 표적 유전자의 발현이 도파민 세포 특이적으로 제어될 수 있어, 도파민 특이적 질병에서의 다양한 유전자의 기능, 병리적인 역할 및 분자 기작을 연구하는데에 활용될 수 있다.

Description

도파민 신경세포 특이적 발현 제어 시스템{DOPAMINERGIC NEURON SPECIFIC EXPRESSION CONTROL SYSTEM}

본 발명은 도파민 신경세포 특이적 발현 제어 시스템에 관한 것으로, 타이로신 하이드록실레이즈 프로모터 (THP) 및 tetracycline 조절 전사인자 (tTA)을 포함하는 벡터와 테트라사이클린 조절 오페레이터 (TetO) 및 표적 유전자를 포함하는 벡터를 이용한 도파민 세포 특이적 표적 유전자의 발현 제어 기술에 관한 것이다.

특정 신경퇴행 질병 및 장애들은 도파민성 신경의 퇴행을 수반할 수 있다. 이들은 다발성뇌신경계위축(multiple system atrophy), 선조체흑질퇴행증(striatonigral degeneration), 올리브교소뇌위축(olivopontocerebellar atrophy), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 파킨슨 특징을 가지는 운동신경세포병(motor neuron disease), 루이체 치매(Lewy body dementia), 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy), 피질-기저 신경절 퇴행증(cortical-basal ganglionic degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), 파킨슨증을 가지는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 윌슨병(Wilson disease), 할러포르텐-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 체디악-하가쉬병(ChediakHagashi disease), SCA-3 척수소뇌 운동실조(SCA-3 spinocerebellar ataxia), X-연관 근육긴장이상-파킨슨증(Xlinked dystonia-parkinsonism; DYT3), 헌팅턴병(웨스트팔 변이){Huntington's disease(Westphal variant)}, 프리온병(prion disease), 혈관 파킨슨증(vascular parkinsonism), 뇌성마비(cerebral palsy), 반복 두부외상(repeated head trauma), 뇌염후 파킨슨증(postencephalitic parkinsonism) 및 신경매독(neurosyphilis)을 포함한다.

대표적인 도파민성 신경 퇴행성 운동 장애 질환인, 파킨슨병(Parkinson's disease)은 1817년 James Parkinson에 의해 최초로 보고된 질병으로서, 중뇌의 흑색질(substantial nigra; SN)에서 도파민성(dopaminergic) 신경세포의 선택적 손실 및 선조체(striatum)의 도파민 결핍으로 인해 운동능력을 상실하는 대표적인 퇴행성 뇌질환의 일종이다. 파킨슨병은 65세 이상 인구의 1%, 85세 이상 인구에서는 5%정도가 발병하는 것으로 보고되고 있다. 특징적인 임상적 증상으로는 떨림 (restingtremor), 서행(bradykinesia), 강직(rigidit) 및 자세 불안정(postural instability)을 수반하고, 루이체(Lewybody)로 알려진 신경세포간 단백응집체(intraneuronal proteinous inclusion)의 존재가 대표적인 병리학적 특성이다 (Olanow et al., Annu Rev Neurosci 22,123-44). 대부분의 파킨슨병인 산발형(sporadic form)의 경우 그 원인은 특발성(idiopathic)으로 거의 알려져 있지 않지만 환경적 요인(environmental factor)들과 아직 완전히 규명되지 않은 유전적 감수성(genetic susceptibility)간의 복잡한 상호작용이 중요한 원인으로 추정되고 있다(Langston et al., Ann Neurol 44(3 Suppl 1): S45-52). 파킨슨병은 유전적 인자에 의해서도 발병되어지는데(familial Parkinson's disease), 지금까지 파킨슨병과 관련된 유전자로는 Polymeropoulos등에 의해서 α-synuclein(Science 276 (1997) 2045-2047), C. Paisan-Ruiz등에 의해서 LRRK2(Neuron 44 (2004) 595-600), Kitada등에 의해서 AR-JP를 나타내는 일본 가계의 유전적 결함에 대한 positional cloning(Nature ,392 (1998) 605-608)에 의해서 처음 보고되었다. 또한 Valente등에 의해서 PINK1(Nat. Genet. 38 (2006) 1184-1191), Bonifati등에 의해서 DJ-1(Science 299 (2003) 256-259), 그리고 Ramirez등에 의해서 ATP13A2(Nat. Genet. 38 (2006) 1184-1191)이 보고되어 있다.

인간의 뇌는 다양한 종류의 신경세포들의 특이적이고 복잡한 시냅스 연결을 통해 여러 종류의 뇌기능 수행이 가능하므로, 특정 신경 세포군만을 선택적으로 조절할 수 있는 시스템의 확보는 해당 신경세포군 및 신경회로에 의해 조절되는 뇌기능을 이해하고 분석하는데 중요한 의의를 지닌다. 따라서, 도파민 신경세포의 기능 조절 및 파킨슨 질병 모델의 선택적 개발을 위해서는 도파민 세포 특이적으로 질병 유전자를 발현시킬 수 있는 시스템이 필요한 실정이다.

한편, 아데노-관련 바이러스(AAV)는 아데노바이러스의 제제에 존재하는 부수체(satellite) 바이러스이며, AAV 분리물 (사람, 원숭이, 조류)은 어떠한 뚜렷한 질환도 야기시키지 않고 암이나 기타 해로운 작용과 병인학적으로 관련이 없다. 몇몇 연구에서는, AAV가 기타 바이러스, 예를 들면, 아데노바 이러스 및 소의 유두종 바이러스의 종양발생 균주에 의해 매개된 발암 현상에 대한 예방 효과와 관련이 있다고 보고하였다. 재조합 AAV(rAAV)는 시험관내 및 동물에서, 일반적으로 폐 또는 정상적인 AAV 감염 부위인 구강 점막에서 뿐만 아니라, 척수 뉴런, 간, 망막, 골수 세포, 뇌, 심장 근육, 및 근육에서 유전자 생성물을 발현시키기 위한 벡터로서 사용되어 왔다.

이에, 본 발명에서는 마우스의 중뇌에서 도파민 세포 특이적으로 표적 유전자를 발현 유도 및 조절에 이용될 수 있는 tTA 발현 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)를 개발하였다.

본 발명의 목적은 THP 및 tTA을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 벡터를 포함하는 세포주, 마우스 또는 바이러스를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 도파민 세포 특이적 표적 단백질 발현 제어 시스템을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 도파민 세포 특이적 표적 단백질 발현 제어 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 도파민 세포 특이적 Tet-OFF 모델 제작 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 Tet-OFF 파킨슨 동물 모델 제작 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 THP 및 tTA을 포함하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 세포주, 마우스 또는 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 도파민 세포 특이적 표적 단백질 발현 제어 시스템을 제공한다.

또한, 본 발명은 도파민 세포 특이적 표적 단백질 발현 제어 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 도파민 세포 특이적 Tet-OFF 모델 제작 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 Tet-OFF 파킨슨 동물 모델 제작 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 AAV-THP-tTA 벡터는 질병 유전자의 발현을 급성으로 도파민 세포 특이적으로 유도할 수 있어, 도파민 세포 특이적인 질병 병변 유도가 가능하며, 이러한 세포 특이성을 통해 약물 스크리닝이나 병변의 분자 기작 연구에 유용하고, 도파민 세포 특이적 표적 단백질 발현 제어 시스템의 TetO에 의해 표적 유전자의 발현이 도파민 세포 특이적으로 제어될 수 있어, 도파민 특이적 질병에서의 다양한 유전자의 기능, 병리적인 역할 및 분자 기작을 연구하는데에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 AAV-THP-tTA 플라스미드의 구조를 나타낸 도이다:
THP: 도파민 세포 특이적인 활성을 가진 2.5 kb 사이즈의 티로신수산화효소 프로모터(tyrosine hydroxylase promoter);
tTA: 테트라사이클린 조절 가능 전사 활성자(tetracycline regulatable transcription activator); 및
AAV ITR: 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 패키징을 위한 ITR(Inverted terminal repeat).
도 2는 본 발명의 AAV-THP-tTA 플라스미드의 도파민 세포 특이적인 tTA 발현을 in vitro로 검증한 도이다.
도 3은 AAV-THP-tTA 바이러스의 도파민 세포 특이적 발현을 in vivo에서 확인한 도이다:
A: AAV-THP-tTA 바이러스를 TetO-AIMP2 및 TetO-α-synuclein 마우스 라인의 중뇌에 입체 정위 주입하는 모식도; 및
B: AAV-THP-tTA 바이러스의 in vivo에서의 도파민 세포 특이적인 Tet-OFF 발현 조절 가능성을 검증하기 위한 실험 스케줄.
도 4는 도파민 세포 특이적인 Tet-OFF 표적 유전자 (α-synuclein; AIMP2)의 발현을 AAV-THP-tTA 바이러스를 주입한 마우스 라인에서의 중뇌 흑질 뇌조직 절편의 도파민 세포 (tyrosine hydroxylase, TH 염색)에 대해서 면역 형광 염색 이미지를 확인한 도이다:
A: TetO-α-synuclein 마우스; 및
B 및 C: TetO-AIMP2;α-synuclein double 마우스.
도 5는 도파민 세포 특이적인 Tet-OFF 표적 유전자 발현을 통한 파킨슨 병변을 유도하여 확인한 도이다:
A: 뇌조직 절편의 도파민 세포 면역 조직 염색 이미지; 및
B: 운동 능력 측정 실험 결과 (*P <0.05, ***P < 0.001.).
도 6은 본 발명의 tTA를 발현하는 벡터 및 Tet operator (TetO)에 의해 표적 유전자를 발현하는 Tet-OFF 발현 시스템을 도식화한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 티로신 수산화효소 프로모터(THP) 및 tTA(tetracycline regulatable transcription activator)을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

일 구현예에서, tTA 상위에 티로신 수산화효소 프로모터를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 수산화효소 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 포함하고 tTA는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 도파민 세포 특이적으로 발현되는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)용 플라스미드일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 세포주, 마우스 또는 바이러스에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 바이러스는 아데노-관련 바이러스(adenoassociated virus, AAV)일 수 있다.

본 발명에서는 도파민 세포 특이적인 Tet-OFF 시스템 구현을 위해 2.5 kb의 TH 프로모터에 의해 tTA를 발현하는 AAV 바이러스 (AAV-THP-tTA)를 구축하였다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터 및 테트라사이클린 오퍼레이터(tetracyclin operator, TetO) 하위에 표적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 벡터를 포함하는 도파민 세포 특이적 표적 단백질 발현 제어 시스템에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 벡터는 본 발명의 AAV-THP-tTA 벡터를 포함하는 아데노-관련 바이러스일 수 있다.

본 발명의 바이러스는 상기 기술된 것외의 다른 변형을 또한 포함할 수 있다. 어떠한 추가의 성분 또는 변형도 임의로 사용할 수 있지만 본 발명을 위해 의무적이지는 않다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터 또는 이를 포함하는 바이러스를 TetO 응답 모델(responder model) 세포 또는 인간을 제외한 동물에 형질전환 또는 주입하는 것을 포함하는 도파민 세포 특이적 표적 단백질 발현 제어 방법에 관한 것이다.

종래의 tTA 발현 rAAV 바이러스 시스템의 경우 CMV(Cytomegalovirus), α-시누클레인(synuclein), 또는 CBA(chicken beta actin) 프로모터들을 활용하기 때문에 강력한 tTA 발현을 유도할 수는 있지만, 도파민 세포 특이성이 없어, 도파민 세포 특이적인 유전자 발현 및 파킨슨 동물 모델 확립에 있어서 한계점이 있었다. 따라서, 기존의 세포 비특이적인 tTA 발현 바이러스 시스템을 극복하기 위해, 본 발명은 도파민 세포 특이적인 프로모터인 2.5 kb 사이즈의 TH(tyrosine hydroxylase) 프로모터를 이용하여 도파민 세포 특이적인 Tet-OFF 발현 유도 시스템을 구축하였다. 본 발명의 Tet-OFF 발현 시스템은 tTA를 발현하는 벡터와 Tet 오퍼레이터(operator) (TetO)에 의해 표적 유전자를 발현하는 두 벡터 시스템으로 이루어지며, tTA가 TetO에 결합하면 TetO가 활성화되어 하위의 표적 유전자의 발현을 유도한다 (도 6 참조). Tet-OFF 시스템은 테트라사이클린(tetracycline) 유도체인 독시사이클린(doxycycline)으로 tTA의 활성 억제가 가능하기 때문에 TetO 프로모터에 의한 표적 유전자의 발현을 약물학적으로 조절 가능하다. 또한, tTA를 바이러스를 통해 전달함으로써, TetO 프로모터에 연결된 질병 유전자 (표적 유전자)의 발현을 급성으로 유도하여 병변 발현을 촉진할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 바이러스를 TetO 응답 모델(responder model) 세포 또는 인간을 제외한 동물에 주입하는 것을 포함하는 도파민 세포 특이적 Tet-OFF 모델 제작 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 도파민 세포 특이적 Tet-OFF 모델은 도파민성 신경의 퇴행을 수반한 신경퇴행 질병 및 장애 모델일 수 있으며, 다발성뇌신경계위축(multiple system atrophy), 선조체흑질퇴행증(striatonigral degeneration), 올리브교소뇌위축(olivopontocerebellar atrophy), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 파킨슨 특징을 가지는 운동신경세포병(motor neuron disease), 루이체 치매(Lewy body dementia), 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy), 피질-기저 신경절 퇴행증(cortical-basal ganglionic degeneration), 전측두엽치매(frontotemporal dementia), 파킨슨증을 가지는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 윌슨병(Wilson disease), 할러포르텐-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 체디악-하가쉬병(ChediakHagashi disease), SCA-3 척수소뇌 운동실조(SCA-3 spinocerebellar ataxia), X-연관 근육긴장이상-파킨슨증(Xlinked dystonia-parkinsonism; DYT3), 헌팅턴병(웨스트팔 변이){Huntington's disease(Westphal variant)}, 프리온병(prion disease), 혈관 파킨슨증(vascular parkinsonism), 뇌성마비(cerebral palsy), 반복 두부외상(repeated head trauma), 뇌염후 파킨슨증(postencephalitic parkinsonism) 및 신경매독(neurosyphilis)을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 테트라사이클린 오퍼레이터 하위에 파킨슨 질환 관련 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 TetO 응답 동물 모델에 본 발명의 벡터를 포함하는 바이러스를 주입하는 것을 포함하는 Tet-OFF 파킨슨 동물 모델 제작 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, TetO 응답 동물 모델은 TetO-AIMP2 또는 TetO-α-synuclein 마우스일 수 있다.

본 발명의 AAV-THP-tTA 바이러스는 다양한 TetO responder 모델들에 주입 (또는 형질전환)되면 도파민 세포 특이적으로 TetO 하위에 연결된 표적 유전자의 발현을 유도하며, 독시사이클린(doxycycline)에 의해 표적 유전자 발현 조절이 가능하다. 즉 독성을 발현하는 질병 관련 표적 유전자를 도파민 세포 특이적으로 연구자가 원하는 시간 동안만 발현시켜서 병리적인 역할과 분자 기작을 연구하는데 최적의 환경을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 AAV-THP-tTA 바이러스를 주입에 의해 상대적으로 짧은 기간 (1~3달)만에 동물 모델에서 파킨슨 병변 유도가 가능하다. 또한, 본 발명의 rAAV 바이러스 (AAV-THP-tTA)는 이미 개발되어진 다양한 TetO 동물 모델 라인들에 접목함으로써 도파민 세포 특이적인 파킨슨 병변 유도를 가능하게 하고 이러한 세포 특이성을 통해 약물 스크리닝이나 병변의 분자 기작 연구에 유용하게 활용될 수 있다.

상기 TetO responder 모델들은 TetO 프로모터 하위에 원하는 유전자를 가진 마우스 라인, 세포주 등을 포함하여, 다양한 파킨슨 유전자 (LRRK2 WT and mutants, α-synuclein WT and mutants)에 대한 라인들이 이미 구축되어 있다. 현재 다양한 종류의 TetO 파킨슨 관련 질환 마우스가 개발되어 있으며, 종래에는 tTA를 발현 시키는 바이러스 시스템 및 tTA를 특정 프로모터에서 발현하는 driver 마우스 라인과의 교배를 통해 Tet-OFF 기반 파킨슨 질환 마우스 모델을 확립해 왔다.

본 발명의 시스템은 파킨슨 모델 뿐 아니라 기존에 개발된 TetO 라인들과의 접목을 통해 도파민 세포 특이적인 다양한 유전자의 기능을 연구하는데 활용될 수 있으며, 이 외에도 다양한 질병 관련 TetO 라인들 또는 개발될 새로운 TetO 라인들에 적용 가능하다.

일 실시예에서, 본 발명의 AAV-THP-tTA 벡터를 포함하는 바이러스는 TetO-AIMP2 및 TetO-α-synuclein 마우스에 입체 정위 주입을 통해 도파민 세포 특이적인 표적 유전자들 (AIMP2 또는 α-synuclein)의 발현을 유도함을 확인하였으며, 이에 따라 파킨슨 병변 (도파민 세포 사멸 및 운동 이상)이 효과적으로 유도되는 것을 확인하였다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. AAV-THP-tTA 플라스미드 제작

도 1과 같은 구조의 AAV-THP-tTA를 제작하기 위해, TH(tyrosine hydroxylase) 프로모터 (2.5 kb)를 포함하는 rAAV 바이러스용 플라스미드 기본 골격에 tTA 시퀀스를 붙여 넣는 클로닝을 수행하였다. 구체적으로, pAAV2.5-THP-GFP 벡터를 EcoRⅠ 및 SalⅠ으로 절단하고, pTet-Dual OFF 벡터는 BamHⅠ 및 EcoRⅠ으로 절단한 뒤, 각각 50ul를 6X loading dye 10ul와 혼합하여 0.8% 아가로즈 젤에 넣고 100V에서 40분동안 전기영동하였다. 그 후, gelDOC 기계를 이용하여 젤에서 DNA 밴드를 확인하여, pAAV2.5-THP-GFP 벡터를 절단한 시료에서는 약 6kb 크기의 벡터가 포함된 젤을, pTet-Dual OFF 벡터를 절단한 시료에서는 약 1kb 크기의 인서트가 포함된 젤을 잘라 수득하였다. 잘라낸 젤에 적정량의 NT1 buffer를 넣고 50℃에서 젤을 녹인 뒤, MN-NucleoSpin Gel and PCR Clean-up 제품으로 각각의 벡터와 인서트 DNA를 정제하였다. 정제한 DNA들의 접착성 말단(sticky end) 부분을 T4 중합효소를 이용하여 평활 말단(Blunt end)으로 각각 만든 후, 다시 DNA를 정제하였다. 벡터의 자가-라이게에션(self-ligation)을 방지하기 위해, pAAV2.5-THP-GFP 벡터를 EcoRⅠ 및 SalⅠ으로 절단하여 얻은 DNA 시료에 CIP(Calf Intestinal Phosphatase) 처리를 수행한 뒤 다시 DNA를 정제하였다. 그 후, 자른 벡터와 인서트를 0.8% 아가로즈 젤에서 전기영동하여 각각의 DNA 사이즈와 비율을 확인하였다. 절단한 인서트와 벡터를 3:1의 비율로 혼합한 뒤, 2X 라이게이션 버퍼 10ul, Quick 라이게이즈 3ul를 넣어 총 20ul가 되도록 하고 26℃에서 15분 동안 반응시켜 라이게이션 시켰다. 라이게이션 후, DH5α 컴피턴트 세포에 트랜스포메이션하여 엠피실린을 포함하는 아가 플레이트에 도말한 뒤, 인서트가 들어간 벡터를 발현하는 콜로니를 엠피실린 포함 LB 배지에서 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그 후, QIAZEN 미니-프렙 키트로 DNA를 추출한 뒤, 시퀀싱을 통해 인서트 DNA가 제대로 삽입되어 있는지 확인함으로써, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 AAV-THP-tTA의 제작을 확인하였다.

실시예 2. AAV-THP-tTA 플라스미드의 in vitro 검증

상기 실시예에서 제작한 플라스미드 (AAV-THP-tTA) 및 TetO-mCherry 리포터 플라스미드를 Opti-MEM과 함께 섞은 후 트랜스펙션 시약인 X-tremeGENE을 넣고 15분 내지 30분 동안 실온에서 인큐베이션한 뒤, 인간 신경모세포종 세포주인 SH-SY5Y 세포주 및 인간 배아 신장 세포주인 HEK-293T 세포주에 첨가하여 트랜스펙션하고 2일 후에 형광 현미경으로 mCherry 형광 발현을 확인하였다.

그 결과, tet 오퍼레이터 하위에 mCherry 발현이 조절되는 TetO-mCherry 플라스미드가 본 발명의 AAV-THP-tTA 플라스미드에 의해 발현되어 형광을 나타냈으며 (도 2), 특히, 도파민 세포 특이적인 TH 프로모터 때문에, mCherry 형광 신호가 도파민성 세포주인 SH-SY5Y 세포주에서 HEK-239T 세포주에 비해 더 강하게 나타났다.

실시예 3. AAV-THP-tTA 플라스미드의 in vivo 검증

3-1. 표적 유전자의 도파민 세포 특이적 in vivo 발현 유도

AAV-THP-tTA 바이러스가 목적한대로 도파민 세포 특이적으로 표적 유전자의 발현을 유도하는지 확인하기 위해서, TH 항체로 염색되는 도파민세포에 해당 표적 유전자인 α-synuclein 및 AIMP2가 발현되는지를 각각에 대한 항체를 활용하여 면역 형광 염색을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예에서 제작한 AAV-THP-tTA 플라스미드로부터 항원형 1 및 역가 1.3 X 10¹³ GC/ml의 고농도로 정제된 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)를 제작하였다. 그 후, 이 바이러스 1ul를 입체 정위 주입 실험을 통해 TetO-AIMP2, TetO-α-synuclein 또는 이 두가지를 모두 가진 이중 트랜스제닉 마우스 (2 또는 3개월령)의 중뇌 흑질 (Coordinate: Medial-Laterial, Anterior-Posterior, Dorsal-Ventral = 1.3, 3.2, 4.3mm) 위치에 주입하였다 (도 3A). 주입은 한 회 당 0.2ul 주입, 30초 휴지의 속도로 수행하였으며, 주입 3주 후에 면역 뇌조직 염색을 수행하였다 (도 3B). 뇌조직 염색을 위해, 바이러스의 주입 3 주 후에 마우스를 수면 마취시키고 마우스 수술 플랫폼에 고정 시켜 개심을 진행한 뒤, PBS 및 4% 파라 포름 알데히드 (w/v)로 관류 시켰다. 마우스 뇌를 추출하여 4% 파라 포름 알데히드 (w/v)로 후 고정시키고, 30% 수크로오스 (w/v)에서 동결 보존시켰다. 그 후, 면역염색 진행을 위하여 고정된 뇌를 40μm 두깨로 관상면 절단(coronal section)을 진행하고, 도파민 세포를 분석하기 위해 흑질(substantia nigra)을 포함한 절편을 1:1000으로 희석한 티로신수산화효소(tyrosine hydroxylase, TH) 항체와 인큐베이션하였다. 이후 시각화를 위해서 순차적으로 비오틴화된 고트 항-래빗(biotinylated goat anti-rabbit) IgG 및 HRP(streptavidin-conjugated horseradish peroxidase)로 인큐베이션하였다. 그 뒤, 3,3-다이아미노벤지딘(Diaminobenzidine)에 노출시켜 각 뇌 절편의 TH 염색 정도를 확인하고, Optical Fractionator probe of Stereo Investigator를 이용하여 실질적인 도파민 세포의 수를 계수하였다.

그 결과, TetO-α-synuclein 마우스 (도 4A) 또는 이중 트랜스제닉 마우스 (도 4B)에 AAV-THP-tTA 바이러스를 주입하자, α-synuclein의 발현이 TH 양성인 도파민 세포에 특이적으로 나타났다. 또한, 이중 트랜스제닉 마우스의 경우에는 α-synuclein과 함께 AIMP2 또한 TH로 염색되는 도파민세포에서 과발현이 유도된 것으로 나타났다 (도 4C). 즉 AAV-THP-tTA 바이러스는 in vivo 마우스 뇌에서 TetO 프로모터를 가진 응답(responder) 마우스에 적용될 경우 도파민 세포 특이적인 표적 유전자 발현이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

3-2. 급성 파킨슨 병변 유도

도파민 세포 특이적인 tTA 발현 유도에 의해 AAV-THP-tTA 바이러스가 파킨슨 동물 모델인 TetO-α-synuclein, TetO-AIMP2, 또는 TetO-α-synuclein;AIMP2 double 마우스 라인에서 질병 관련 병변 유도능을 나타내는지 확인하고자, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)를 입체 정위 주입 실험을 통해 TetO-AIMP2, TetO-α-synuclein 또는 이 두가지를 모두 가진 이중 트랜스제닉 마우스 (2 또는 3개월령)의 중뇌 흑질 (Coordinate: Medial-Laterial, Anterior-Posterior, Dorsal-Ventral = 1.3, 3.2, 4.3mm) 위치에 주입 3주 후, TH 항체를 이용한 뇌조직 절편의 도파민 세포 면역 조직 염색 및 도파민 신경회로의 기능 이상을 검증하기 위한 pole 테스트 (수직으로 세워진 막대기의 꼭대기에서 바닥까지 마우스가 내려오는데 걸리는 시간을 측정하는 행동 실험)를 수행하였다. 구체적으로, 도파민 세포 면역 조직 염색을 상기 3-1과 같이 수행하였으며, Pole 테스트는 바이러스를 주입한 마우스 (그룹 당 n=3)를 직경 10mm 및 높이 58cm의 붕대 거즈로 싸여 있는 금속 기둥인 Pole (운동 테스트 기둥)에서 20분 이상 순응하게 한 뒤, Pole의 꼭대기 놓고, 위쪽 끝에서 아래쪽 끝에 도달하는 데 걸린 총 시간을 기록하였다. 각 마우스를 6 회의 세션으로 평가하고 총 시간 및 평균을 기록하였다. 정량 실험 결과는 평균 ±표준오차로 표시되었으며, 그룹간의 유의성 비교는 ANOVA 테스트로 분석하였다.

그 결과, α-synuclein만의 발현 유도는 유의미한 도파민 세포 손실이 나타나지 않았으나, AAV-THP-tTA 바이러스 주입에 의한 AIMP2, 또는 AIMP2 및 α-synuclein의 동시 발현은 도파민 신경세포의 현저한 소실을 유도하였다 (도 5A). 또한, AIMP2 및 α-synuclein의 동시 발현이 AIMP2 단독 발현보다 Pole 테스트 시간이 증가하였다 (도 5B). 이를 통해, AAV-THP-tTA 바이러스 주입에 의한 AIMP2, 또는 AIMP2 및 α-synuclein의 동시 발현이 도파민 신경세포의 현저한 소실을 유도하고, 도파민 신경세포의 소실 정도와 비례하여 도파민 신경회로의 기능에 의해 조절되는 운동 능력이 감소되는 것을 알 수 있었다.

<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> DOPAMINERGIC NEURON SPECIFIC EXPRESSION CONTROL SYSTEM <130> PN1808-276 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2509 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH promoter <400> 1 tcttgggatt cttctcatca aaaagggcat gggacacagc taaagcgtcc agggctcctc 60 tgtgcccaca gatgccttag atcttggcac aatgtagtca gccagctccg tgtgtgtgtg 120 tgtgtgtttg catgtatctc acagacagtg cacaatggcc tggatgtgaa cagaggcaag 180 agtctgggcc agcagttgtc tcccaggagg gtccaaagac atcgtatttt caagtttagg 240 ccaggtgctc acttgggtga gctcagacac agacaaaggt ctggagagca cacattcccc 300 acccccaccc agctcctatg caagcacctc cagccgagac aagaaaacga attaaaaagc 360 aatatttgtg tcagcgtaag acatttgccg aaaggttaaa tccacactcg tggtgctgca 420 cagcagcccc ctgtgcagga tttgttaggc acagctccct cctaccccgt gccacctgag 480 caaatgccag gctgggtggg ctggaaccag cctgggcttg cctcaccctg gaatccccag 540 caccctccaa aggaggaccc tgggagtggg catagacgcc cttcaggtgt gggcaacagc 600 ccccagtcct caggatgaaa ggctaaggtg cagccagctc tgccttcacg gtgggaatgt 660 ctctatgtga gccctttctg ggctgtgaag aacgctctga gaagggtcct gggaccctgg 720 ataggccaga gctgtgctgg gcatgtagag acaggagtgg gctaaagcag caaaggcact 780 gaccaaggaa gagttcagag aggagcgtgg aatatgggga ggggttcata gtaagagaga 840 gcaggcagtg gagagtaaat agtcactgag ccggggttta tggggtttgt aggagcttac 900 tcagagaaag tagatgagag atgccatgcc agtctgagta tcacagagcc ccaggctctc 960 ctgggaacgg aactgtgagg gccagaaggt cagcaaggga ggttagggag agttcctttt 1020 gtactgactc agcatttatc ctgctcccag ggggcaatgg gggccagtga gggatgcaga 1080 gcaaggcagt gatgtggcag gcagttcctg ttgtgaaaga gctgggaagg gagcgggctg 1140 ggcctggtac gtacagcagg ccatttctga gggtccgagt gctgtctagg aggtgcagtg 1200 agacttcagt gatcagccag aacagaagct aagcggggtg gggactgcga gttcaggctt 1260 ctgggtcttg caaatatcca gaatgctaaa tcctcagaac cccagggtgg ccattttcag 1320 agtgggtttt gtcctttggg cacttgtgca gactccaata tccagaggga taaggatggt 1380 actcttcagt acccttagtg agaggacact tttctctgaa gggcttgaat gtgccgagcc 1440 attacctgaa ggaaggaaat gactccaggg acataggatg ggcccagcac aactcacctg 1500 ctacagagaa aggtcccctc cctggtctcc ttagagatcc tgtttccctg gctgaggaag 1560 ctagggtgga tctttgtgta agtgggtgtg gatgctaact ggaaaacaaa aggtcactta 1620 ctgttagacc tcggggtacc atggaagaga tgatcactga gtgtgccctt acatggggac 1680 cagctgagaa tggggctacc actagctcga gaccatgata cagggaataa gtgtgcattt 1740 gggggtaggg agtggctcag aatactctta accaaagcag aggtttgctc ccacaggaag 1800 gtgaggtcag aaggccttag ggagctgcca ggggctaggg ttggcaccat ctcccaggct 1860 gtgtctttaa ggagatgata atcagaggga tagaaccttg caaaagtggg ccagtcttgg 1920 gaatactata gaggaatagc cttctggaac attctgtgtc tcataggacc tgcctgggga 1980 tccagcccca gtgccagcac atataccgac tggggcagtg aatagatagt acactttgtt 2040 acatgggctg gggggaacat ggcccatgtc ctggagggga ctttatgaca gacatccaaa 2100 aatccagtga gagggcttct agatttgtct ccaaaggtta tagttctaac atgagccctt 2160 aggaaatcca gcatggttct ccctgtgtgc cctggtttgg ttagagagct ctagcggtct 2220 cctgtcccac agaataccag ccagcccctg ccctacgtcg tgcctcgggc tgagggtgat 2280 tcagaggcag gtgcctgtga cagtggatgc aattagatct aatgggacgg 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cctttgggca cttgtgcaga 1500 ctccaatatc cagagggata aggatggtac tcttcagtac ccttagtgag aggacacttt 1560 tctctgaagg gcttgaatgt gccgagccat tacctgaagg aaggaaatga ctccagggac 1620 ataggatggg cccagcacaa ctcacctgct acagagaaag gtcccctccc tggtctcctt 1680 agagatcctg tttccctggc tgaggaagct agggtggatc tttgtgtaag tgggtgtgga 1740 tgctaactgg aaaacaaaag gtcacttact gttagacctc ggggtaccat ggaagagatg 1800 atcactgagt gtgcccttac atggggacca gctgagaatg gggctaccac tagctcgaga 1860 ccatgataca gggaataagt gtgcatttgg gggtagggag tggctcagaa tactcttaac 1920 caaagcagag gtttgctccc acaggaaggt gaggtcagaa ggccttaggg agctgccagg 1980 ggctagggtt ggcaccatct cccaggctgt gtctttaagg agatgataat cagagggata 2040 gaaccttgca aaagtgggcc agtcttggga atactataga ggaatagcct tctggaacat 2100 tctgtgtctc ataggacctg cctggggatc cagccccagt gccagcacat ataccgactg 2160 gggcagtgaa tagatagtac actttgttac atgggctggg gggaacatgg cccatgtcct 2220 ggaggggact ttatgacaga catccaaaaa tccagtgaga gggcttctag atttgtctcc 2280 aaaggttata gttctaacat gagcccttag gaaatccagc 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aagagagaca cctaccaccg 3180 attctatgcc cccacttctg agacaagcaa ttgagctgtt cgaccatcag ggagccgaac 3240 ctgccttcct tttcggcctg aactaatcat atgtggcctg agaaacagct aaagtgcgaa 3300 agcggcgggc cggccgacgc ccttgacgat tttgacttag acatgctccc agccgatgcc 3360 cttgacgact ttgaccttga tatgctgcct gctgacgctc ttgacgattt ggaccttgac 3420 atgctcccgg gtaactagaa tttcgacctg cagaagcttg cctcgagcag cgctgctcga 3480 gagatctacg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt 3540 gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac 3600 taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt 3660 gggaagacaa cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca 3720 caatcttggc tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct 3780 cccgagttgt tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg 3840 tagagacggg gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc 3900 tacccacctt ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct 3960 gtccttctga ttttgtaggt aaccacgtgc ggaccgagcg 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ccgtcatcac cgaaacgcgc 4860 gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt 4920 ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 4980 tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 5040 ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 5100 ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 5160 tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 5220 gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 5280 gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 5340 acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 5400 tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 5460 caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 5520 gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 5580 cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 5640 tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 5700 agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 5760 tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc 5820 ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag 5880 acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 5940 ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 6000 gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 6060 gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 6120 ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 6180 gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 6240 ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 6300 cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 6360 cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 6420 ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 6480 tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 6540 cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 6600 ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 6660 aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 6720 ttgctggcct tttgctcaca tgt 6743

Claims

아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 티로신 수산화효소 프로모터(tyrosine hydroxylase promoter, THP) 및 테트라사이클린 조절가능 전사 활성자(tetracycline regulatable transcription activator, tTA)가 포함된 바이러스를 테트라사이클린 오퍼레이터(tetracyclin operator, TetO) 및 AIMP2 가 포함된 벡터로 형질전환된 인간을 제외한 동물에 입체 정위 주입하는 단계를 포함하는 Tet-OFF 파킨슨 질환 동물모델의 급성 병변 유도 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 테트라사이클린 조절가능 전사 활성자는 티로신 수산화효소 프로모터의 하위에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 티로신 수산화효소 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 테트라사이클린 조절가능 전사 활성자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 아데노-관련 바이러스, 티로신 수산화효소 프로모터 및 테트라사이클린 조절가능 전사 활성자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 바이러스는 도파민 세포에 특이적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서,
상기 테트라사이클린 오퍼레이터는 테트라사이클린 조절가능 전사 활성자가 발현된 경우 AIMP2를 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 형질전환된 인간을 제외한 동물은 테트라사이클린 오퍼레이터 및 α-synuclein 가 포함된 벡터로 더 형질전환된 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서,
상기 테트라사이클린 오퍼레이터는 테트라사이클린 조절가능 전사 활성자가 발현된 경우 α-synuclein를 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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