CN109295099A - Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途 - Google Patents

Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN109295099A
CN109295099A CN201811203718.5A CN201811203718A CN109295099A CN 109295099 A CN109295099 A CN 109295099A CN 201811203718 A CN201811203718 A CN 201811203718A CN 109295099 A CN109295099 A CN 109295099A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stub
sequence
over
recombinates
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811203718.5A
Other languages
English (en)
Inventor
陈意雄
蔡晓龙
邹杰
朱鹏飞
白易鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Han Heng Biotechnology (shanghai) Co Ltd
Original Assignee
Han Heng Biotechnology (shanghai) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Han Heng Biotechnology (shanghai) Co Ltd filed Critical Han Heng Biotechnology (shanghai) Co Ltd
Priority to CN201811203718.5A priority Critical patent/CN109295099A/zh
Publication of CN109295099A publication Critical patent/CN109295099A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/53—Ligases (6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02019—Ubiquitin-protein ligase (6.3.2.19), i.e. ubiquitin-conjugating enzyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种Stub 1重组过表达载体及其构建方法和用途，所PKD2重组过表达载体是将目的基因PKD2插入腺相关病毒载体获得，所述腺相关病毒载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：EF1启动子，MCS区，CMV启动子序列，EGFP基因序列。Stub 1重组过表达载体可以高效的表达Stub 1。经过发明人深入的研究，意外地发现，Stub 1重组过表达载体可以减轻心肌缺血再灌注损伤。在经历心肌缺血再灌注小鼠体内注射携带有该基因的腺相关病毒，能够有减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤，心肌梗塞面积明显降低，说明本发明的技术方案适用于心脏缺血再灌注的保护。

Description

Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途
技术领域
本发明涉及一种Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途，属于生物技术领域。
背景技术
Stub1分子是一类新型的辅助性伴侣蛋白，在蛋白质折叠、组装、转运和降解过程中起着重要的调节作用，属于泛素连接酶，Stub1具有E3泛素连接酶活性，能与Hsp70、Hsp90或者其他分子伴侣结合，促进底物的连接和链的延伸。Stub1具有调控阿尔兹海默病、帕金森、麦-考二氏综合征等神经退行性疾病相关的tau蛋白、α-突触核蛋白、MKKS突变体等降解的作用；同时Stub1还受辅助蛋白HspBP1及细胞激素Akt的调控。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，完整的生活周期需要辅助病毒(通常为腺相关病毒或疱疹病毒)参与。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。其中cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，适用于各种体内感染实验。由于AAV的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。
近十多年来缺血性心脏病的死亡率一直呈现上升趋势。心肌缺血会造成心脏受损，当心脏再灌注恢复血供的初期，会发生较缺血时更为严重的再灌注损伤。它们一起称为缺血再灌注损伤。有效减轻再灌注损伤对降低缺血性心脏病的死亡率和改善预后有着重要的意义。
本领域技术人员一直致力于开发能够有效减轻缺血再灌注损伤，从而保护心脏的技术。现有技术中的问题是缺少直接有效保护心脏抵抗缺血再灌注损伤并创伤性小的手段和方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种Stub 1过表达重组载体及其构建方法和用途，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以显著改善减轻心肌缺血再灌注损伤的腺相关病毒载体。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种PKD2重组过表达载体，所PKD2重组过表达载体是将目的基因PKD2插入腺相关病毒载体获得，所述腺相关病毒载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：
EF1启动子，MCS区，CMV启动子序列，EGFP基因序列。
腺相关病毒是一种单链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺相关病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。
Stub 1基因在NCBI中的登录号为10273。
本发明利用天然的腺相关病毒经过基因改造后获得一种转重组过表达载体。
所述的“操作性连接”或“可操作性连接”是指两个或者多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子的引导，从而，启动子区域可被“可操作性连接”到核酸序列上。
所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一些列功能性核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”序列是可以本发明中提供的，也包括他们的变体，只要这些元件上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或者删除一些碱基，或者随机或定点突变等来获得。
所述各个元件的上游及下游位置，还可包括限制性内切酶的酶切位点，这些位点有利于各个元件的有机连接。
进一步地，所述Stub 1重组过表达载体序列如SEQ ID NO.1：所示。具体如下：
tgctcacatgtcctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccgcacgcgcgctagcaggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccagatccaggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattccagatccggcgcgccagggctggaagctacctttgacatcatttcctctgcgaatgcatgtataatttctacagaacctattagaaaggatcacccagcctctgcttttgtacaactttcccttaaaaaactgccaattccactgctgtttggcccaatagtgagaactttttcctgctgcctcttggtgcttttgcctatggcccctattctgcctgctgaagacactcttgccagcatggacttaaacccctccagctctgacaatcctctttctcttttgttttacatgaagggtctggcagccaaagcaatcactcaaagttcaaaccttatcattttttgctttgttcctcttggccttggttttgtacatcagctttgaaaataccatcccagggttaatgctggggttaatttataactaagagtgctctagttttgcaatacaggacatgctataaaaatggaaagatgttgctttctgagagacagctttattgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcagtgcttctgacacaacagtctcgaacttaagctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattacagctcttaaggctagagtacttaatacgactcactataggctagcctcgaagaggatctatttccggtgaattcgccaccatgaagggcaaggaggagaaggagggcggcgcacggctgggcgctggcggcggaagccccgagaagagcccgagcgcgcaggagctcaaggagcagggcaatcgtctgttcgtgggccgaaagtacccggaggcggcggcctgctacggccgcgcgatcacccggaacccgctggtggccgtgtattacaccaaccgggccttgtgctacctgaagatgcagcagcacgagcaggccctggccgactgccggcgcgccctggagctggacgggcagtctgtgaaggcgcacttcttcctggggcagtgccagctggagatggagagctatgatgaggccatcgccaatctgcagcgagcttacagcctggccaaggagcagcggctgaacttcggggacgacatccccagcgctcttcgaatcgcgaagaagaagcgctggaacagcattgaggagcggcgcatccaccaggagagcgagctgcactcctacctctccaggctcattgccgcggagcgtgagagggagctggaagagtgccagcgaaaccacgagggtgatgaggacgacagccacgtccgggcccagcaggcctgcattgaggccaagcacgacaagtacatggcggacatggacgagcttttttctcaggtggatgagaagaggaagaagcgagacatccccgactacctgtgtggcaagatcagctttgagctgatgcgggagccgtgcatcacgcccagtggcatcacctacgaccgcaaggacatcgaggagcacctgcagcgtgtgggtcattttgaccccgtgacccggagccccctgacccaggaacagctcatccccaacttggctatgaaggaggttattgacgcattcatctctgagaatggctgggtggaggactacctcgaggcaacaaacttctcactactcaaacaagcaggtgacgtggaggagaatcccgggcctatggcccagtccaagcacggcctgaccaaggagatgaccatgaagtaccgcatggagggctgcgtggacggccacaagttcgtgatcaccggcgagggcatcggctaccccttcaagggcaagcaggccatcaacctgtgcgtggtggagggcggccccttgcccttcgccgaggacatcttgtccgccgccttcatgtacggcaaccgcgtgttcaccgagtacccccaggacatcgtcgactacttcaagaactcctgccccgccggctacacctgggaccgctccttcctgttcgaggacggcgccgtgtgcatctgcaacgccgacatcaccgtgagcgtggaggagaactgcatgtaccacgagtccaagttctacggcgtgaacttccccgccgacggccccgtgatgaagaagatgaccgacaactgggagccctcctgcgagaagatcatccccgtgcccaagcagggcatcttgaagggcgacgtgagcatgtacctgctgctgaaggacggtggccgcttgcgctgccagttcgacaccgtgtacaaggccaagtccgtgccccgcaagatgcccgactggcacttcatccagcacaagctgacccgcgaggaccgcagcgacgccaagaaccagaagtggcacctgaccgagcacgccatcgcctccggctccgccttgccctaaacgcgtctggaacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattaattgttaacagatctacgggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtccttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagacaacctgtagggcctgcggggtctattgggaaccaagctggagtgcagtggcacaatcttggctcactgcaatctccgcctcctgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagttgttgggattccaggcatgcatgaccaggctcagctaatttttgtttttttggtagagacggggtttcaccatattggccaggctggtctccaactcctaatctcaggtgatctacccaccttggcctcccaaattgctgggattacaggcgtgaaccactgctcccttccctgtccttctgattttgtaggtaaccacgtgcggaccgagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgt
进一步地，所述的5’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1：中第12～141位所示；
进一步地，所述的TBG启动子序列如SEQ ID NO.1：中第156～1173位所示；
进一步地，所述的基因Stub 1序列如SEQ ID NO.1：中第1204～2112位所示；
进一步地，所述的P2A序列如SEQ ID NO.1：中第2119～2175位所示；
进一步地，所述的ZsGreen基因序列如SEQ ID NO.1：中第2176～2871位所示；
进一步地，所述的3’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1：中第4016～4156位所示。
本发明的另外一个方面提供了上述Stub 1重组过表达载体用于制备减轻缺血再灌注损伤心脏的药物的用途。
本发明的另外一个方面提供了一种细胞，所述细胞内含有上述Stub 1重组过表达载体。
本发明的另外一个方面提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中包括如上所述的Stub1重组过表达载体和药学上可接受的载体，或者如上所述的细胞和药学上可接受的载体。
本发明的另外一个方面提供了上Stub 1重组过表达载体的构建方法，其特征在于所述构建方法至少包括以下步骤：
(1)构建腺相关病毒穿梭质粒；
(2)腺相关病毒包装。
进一步的，上述方法中采用正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反相引物的序列如SEQ IDNO.3所示。
SEQ ID NO.2atgaagggcaaggaggagaagga
SEQ ID NO.3gtagtcctccacccagccattct
如上所述，本发明的种Stub 1过表达腺相关病毒载体及其构建方法和用途，具有以下有益效果：
获得的腺相关病毒过表达载体能够高效的表达Stub 1，可以有效减轻缺血再灌注损伤心脏。
附图说明
图1显示为实施例1中使用的载体结构示意图。
图2显示为实施例1中步骤3制备的Stub 1片段凝胶图谱(Lane 1：DNA Marker，Lane 2：Stub 1PCR回收产物)。
图3显示为实施例1中步骤6获得的Stub 1单克隆鉴定PCR产物凝胶图。(其中，Lane1-5：Stub 1阳性单克隆鉴定，Lane6：DNAMarker。)
图4显示为实施例1中构建的重组载体结构图。
图5显示为实施例2中实验组和对照组心肌细胞活力恢复统计结果图。
图6显示为实施例2中实验组和对照组心梗面积降低统计结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
表1本实验相关仪器
实施例1腺相关病毒载体构建及转化
1、pHBAAV-TBG-MCS-P2A-ZsGreen载体(结构如图1)用EcoRI、XhoI酶切，酶切体系如下：
2、载体酶切完成后回收。
3、Stub 1片段PCR回收，正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反相引物的序列如SEQ IDNO.3所示。
PCR扩增m-Stub1序列，体系(50μl)为：
表2
PCR程序：表3
将获得后的目的片段利用凝胶电泳，其中PCR产物凝胶电泳如图2所示。
4、处理好的目的片段与载体连接反应体系(20μl)：
表4
以上连接液在16℃过夜
5、转化(感受态细胞:stbl3)。
抗性:Amp，37℃，培养过夜
6、转化后的Stub1平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序公司测序。
单克隆PCR鉴定结果：其中产物的凝胶电泳图如图3所示，结果获得Stub 1过表达载体测序结果如SEQ ID NO.1所示，结构如图4所示。
实施例2
高表达Stub1的腺相关病毒在细胞模型和在体小鼠模型中降低缺血再灌注损伤
1、实验材料
SD新生大鼠，C57BL/6小鼠(可购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)。
2、实验方法
2.1SD新生大鼠心肌细胞缺氧复氧模型
取24只培养的新生大鼠心肌细胞在缺氧复氧前24小时，将原培液替换成不含血清的含糖培液。24小时后缺氧复氧组的细胞用PBS洗一次后换成无糖培养基，然后放入工作站(氧气浓度小于0.1％)。6小时后取出，将培液换回含糖培液。完成整个Hyp/Reox操作。
2.2小鼠缺血再灌注造模
小鼠剑突上1cm处胸部左侧开胸，打开2-3肋间，小心放入扩胸器，充分暴露心脏。使用活结结扎冠状动脉左前降支，成功结扎血管后可见心脏变白。结扎30分钟后松开进行再灌注，可见心脏恢复粉嫩色。再灌注24小时后，收取心脏。
2.3尾静脉注射HBAAV-EF1-stub-CMV-EGFP和对照腺相关病毒
采用5号针头注射器，每只小鼠注射1x1011v.g的腺相关病毒，对照腺相关病毒为AAV-GFP(具有绿色荧光蛋白的腺相关病毒)。
3、实验结果
HBAAV-EF1-stub-CMV-EGFP腺相关病毒可以显著降低缺血再灌注后的损伤。
如图5中Normoxia是没有经过缺氧复氧的对照组，Hyp/Reox是缺氧复氧组。可以看到经过缺氧复氧后心肌细胞受损，细胞活力明显下降。与对照腺相关病毒组相比，过表达stub重组腺相关病毒的实验组中其心肌细胞活力恢复到75％，表现出明显的心肌保护作用。
如图6中，与对照腺相关病毒组相比，使用本发明的重组腺相关病毒的实验组，心梗面积降低了20％，显示了缺血再灌注后的心脏保护作用。
本实施例在缺血再灌注小鼠中比较了对照腺相关病毒组和HBAAV-EF1-stub-CMV-EGFP注射组小鼠(高表达stub基因的小鼠)的心梗面积指标。实验表明通过腺相关病毒高表达Stub1能够有效减轻心肌缺血再灌注损伤程度，说明本发明的技术可以保护心脏抵抗缺血再灌注损伤，具有潜在的缺血性心脏病治疗意义。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 汉恒生物科技（上海）有限公司
<120> Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgctcacatg tcctgcaggc agctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgcgctag caggttaatt tttaaaaagc 180
agtcaaaagt ccaagtggcc cttggcagca tttactctct ctgtttgctc tggttaataa 240
tctcaggagc acaaacattc cagatccagg ttaattttta aaaagcagtc aaaagtccaa 300
gtggcccttg gcagcattta ctctctctgt ttgctctggt taataatctc aggagcacaa 360
acattccaga tccggcgcgc cagggctgga agctaccttt gacatcattt cctctgcgaa 420
tgcatgtata atttctacag aacctattag aaaggatcac ccagcctctg cttttgtaca 480
actttccctt aaaaaactgc caattccact gctgtttggc ccaatagtga gaactttttc 540
ctgctgcctc ttggtgcttt tgcctatggc ccctattctg cctgctgaag acactcttgc 600
cagcatggac ttaaacccct ccagctctga caatcctctt tctcttttgt tttacatgaa 660
gggtctggca gccaaagcaa tcactcaaag ttcaaacctt atcatttttt gctttgttcc 720
tcttggcctt ggttttgtac atcagctttg aaaataccat cccagggtta atgctggggt 780
taatttataa ctaagagtgc tctagttttg caatacagga catgctataa aaatggaaag 840
atgttgcttt ctgagagaca gctttattgc ggtagtttat cacagttaaa ttgctaacgc 900
agtcagtgct tctgacacaa cagtctcgaa cttaagctgc agaagttggt cgtgaggcac 960
tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga aactgggctt 1020
gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta ctgacatcca 1080
ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat tacagctctt aaggctagag 1140
tacttaatac gactcactat aggctagcct cgaagaggat ctatttccgg tgaattcgcc 1200
accatgaagg gcaaggagga gaaggagggc ggcgcacggc tgggcgctgg cggcggaagc 1260
cccgagaaga gcccgagcgc gcaggagctc aaggagcagg gcaatcgtct gttcgtgggc 1320
cgaaagtacc cggaggcggc ggcctgctac ggccgcgcga tcacccggaa cccgctggtg 1380
gccgtgtatt acaccaaccg ggccttgtgc tacctgaaga tgcagcagca cgagcaggcc 1440
ctggccgact gccggcgcgc cctggagctg gacgggcagt ctgtgaaggc gcacttcttc 1500
ctggggcagt gccagctgga gatggagagc tatgatgagg ccatcgccaa tctgcagcga 1560
gcttacagcc tggccaagga gcagcggctg aacttcgggg acgacatccc cagcgctctt 1620
cgaatcgcga agaagaagcg ctggaacagc attgaggagc ggcgcatcca ccaggagagc 1680
gagctgcact cctacctctc caggctcatt gccgcggagc gtgagaggga gctggaagag 1740
tgccagcgaa accacgaggg tgatgaggac gacagccacg tccgggccca gcaggcctgc 1800
attgaggcca agcacgacaa gtacatggcg gacatggacg agcttttttc tcaggtggat 1860
gagaagagga agaagcgaga catccccgac tacctgtgtg gcaagatcag ctttgagctg 1920
atgcgggagc cgtgcatcac gcccagtggc atcacctacg accgcaagga catcgaggag 1980
cacctgcagc gtgtgggtca ttttgacccc gtgacccgga gccccctgac ccaggaacag 2040
ctcatcccca acttggctat gaaggaggtt attgacgcat tcatctctga gaatggctgg 2100
gtggaggact acctcgaggc aacaaacttc tcactactca aacaagcagg tgacgtggag 2160
gagaatcccg ggcctatggc ccagtccaag cacggcctga ccaaggagat gaccatgaag 2220
taccgcatgg agggctgcgt ggacggccac aagttcgtga tcaccggcga gggcatcggc 2280
taccccttca agggcaagca ggccatcaac ctgtgcgtgg tggagggcgg ccccttgccc 2340
ttcgccgagg acatcttgtc cgccgccttc atgtacggca accgcgtgtt caccgagtac 2400
ccccaggaca tcgtcgacta cttcaagaac tcctgccccg ccggctacac ctgggaccgc 2460
tccttcctgt tcgaggacgg cgccgtgtgc atctgcaacg ccgacatcac cgtgagcgtg 2520
gaggagaact gcatgtacca cgagtccaag ttctacggcg tgaacttccc cgccgacggc 2580
cccgtgatga agaagatgac cgacaactgg gagccctcct gcgagaagat catccccgtg 2640
cccaagcagg gcatcttgaa gggcgacgtg agcatgtacc tgctgctgaa ggacggtggc 2700
cgcttgcgct gccagttcga caccgtgtac aaggccaagt ccgtgccccg caagatgccc 2760
gactggcact tcatccagca caagctgacc cgcgaggacc gcagcgacgc caagaaccag 2820
aagtggcacc tgaccgagca cgccatcgcc tccggctccg ccttgcccta aacgcgtctg 2880
gaacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt 2940
tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc 3000
ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga 3060
gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc 3120
cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct 3180
ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg 3240
gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccatggct 3300
gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc 3360
cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg 3420
tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcctggaat 3480
taattgttaa cagatctacg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc 3540
cctggaagtt gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat 3600
tttgtctgac taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa 3660
ggggcaagtt gggaagacaa cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag 3720
tgcagtggca caatcttggc tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct 3780
gcctcagcct cccgagttgt tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt 3840
gtttttttgg tagagacggg gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc 3900
tcaggtgatc tacccacctt ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc 3960
tcccttccct gtccttctga ttttgtaggt aaccacgtgc ggaccgagcg gccgcaggaa 4020
cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg 4080
cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg 4140
cgcagctgcc tgcaggggcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 4200
tcacaccgca tacgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg 4260
cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc 4320
ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa 4380
atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac 4440
ttgatttggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt 4500
tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca 4560
accctatctc gggctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt 4620
taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta 4680
caattttatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 4740
gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 4800
acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 4860
cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 4920
taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 4980
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 5040
aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 5100
ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 5160
aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 5220
acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 5280
ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 5340
gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 5400
atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 5460
acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 5520
tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 5580
ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 5640
aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 5700
aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 5760
ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 5820
atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 5880
aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 5940
accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 6000
tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 6060
tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 6120
tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 6180
cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 6240
caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 6300
cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 6360
cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 6420
gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 6480
acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 6540
atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 6600
cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 6660
gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 6720
tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgt 6753
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaagggca aggaggagaa gga 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtagtcctcc acccagccat tct 23

Claims (7)

1.一种Stub 1重组过表达载体，其特征在于，所述Stub 1重组过表达载体是将目的基因Stub 1插入腺相关病毒载体获得，所述腺相关病毒载体至少包括如下可操作性连接的序列元件：5’末端反相重复序列，TBG启动子序列，MCS区，P2A序列，ZsGreen基因序列，3’末端反相重复序列。
2.根据权利要求1所述的Stub 1重组过表达载体，其特征在于：
所述Stub 1重组过表达载体序列如SEQ ID NO.1：所示，
所述5’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1：中第12～141位所示；
所述TBG启动子序列如SEQ ID NO.1：中第156～1173位所示；
所述基因Stub 1序列如SEQ ID NO.1：中第1204～2112位所示；
所述P2A序列序列如SEQ ID NO.1：中第2119～2175位所示；
所述ZsGreen基因序列如SEQ ID NO.1：中第2176～2871位所示；
所述3’末端反相重复序列如SEQ ID NO.1：中第4016～4156位所示。
3.如权利要求1或2任一项所述Stub 1重组过表达载体用于制备减轻缺血再灌注损伤心脏的药物的用途。
4.一种细胞，其特征在于，所述细胞内含有如权利要求1或2所述Stub 1重组过表达载体。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括如权利要求1或2所述的Stub 1重组过表达载体和药学上可接受的载体，或者如权利要求4所述的细胞和药学上可接受的载体。
6.如权利要求1或2所述的Stub 1重组过表达载体的构建方法，其特征在于所述构建方法至少包括以下步骤：
(1)构建腺相关病毒穿梭质粒；
(2)腺相关病毒包装。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中使用正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反相引物的序列如SEQ ID NO.3所示。
CN201811203718.5A 2018-10-16 2018-10-16 Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途 Pending CN109295099A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811203718.5A CN109295099A (zh) 2018-10-16 2018-10-16 Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811203718.5A CN109295099A (zh) 2018-10-16 2018-10-16 Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109295099A true CN109295099A (zh) 2019-02-01

Family

ID=65162872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811203718.5A Pending CN109295099A (zh) 2018-10-16 2018-10-16 Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109295099A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106916793A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种重组腺相关病毒的制备方法及重组杆状病毒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106916793A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种重组腺相关病毒的制备方法及重组杆状病毒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FELIPE CABRAL-MIRANDA ET AL.: "rAAV8-733-mediated gene transfer of CHIP/Stub-1 prevents hippocampal neuronal death in experimental brain ischemia", 《MOLECULAR THERAPY》 *
WENJUN XIONG ET AL.: "The carboxyl terminus of heat shock protein 70-interacting protein(CHIP) participates in high glucose-induced cardiac injury", 《FREE RADIAL BIOLOGY AND MEDICINE》 *
吕涛等: "辅助伴侣蛋白STUB1及其功能研究进展", 《中国药理学通报》 *
陈东等: "CHIP与心血管疾病关系的研究进展", 《中国老年学杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112695057B (zh) Sars-cov-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用
CN108977454A (zh) 一种大肠杆菌合成角鲨烯用质粒pTsqs及其制备和使用方法
JP2000139482A (ja) 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス
CN101410408A (zh) 用于浓缩多肽的方法
KR102070763B1 (ko) 도파민 신경세포 특이적 발현 제어 시스템
CN101985477A (zh) 用于评价hcv ns3/4a丝氨酸蛋白酶抑制剂的融合蛋白及其应用
CN112501101A (zh) 天然除草剂thaxtomins的高产菌株及其制备方法和用途
CN106497960A (zh) 一种用于大肠杆菌‑鸭疫里默氏杆菌的高效穿梭质粒
KR102510154B1 (ko) 비만유래 2형 당뇨 예방 및 치료를 위한 내장지방 대식세포 표적 비바이러스성 유전자／전달체 복합체
CN109295099A (zh) Stub1重组过表达载体及其构建方法和用途
KR101973007B1 (ko) 외래 단백질 발현 증가를 위한 재조합 전이 벡터
CN106520820A (zh) 一种利用短芽胞杆菌制备脑钠肽前体抗原表位的方法
KR102163667B1 (ko) 염증성 질환 예방 또는 치료용 유전자／전달체 복합체
CN101948866A (zh) 一种能用同源重组来克隆的枯草芽孢杆菌整合载体的构建及其应用
KR101998168B1 (ko) 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 유전자／전달체 복합체
KR20220111294A (ko) 키메라 옵신 gpcr 단백질
CN112980819A (zh) 视网膜色素变性动物模型的构建方法及其应用
CN107090474A (zh) 一种腹主动脉瘤疾病动物模型的制备方法
CN108866097A (zh) 一种表达细粒棘球蚴eg95蛋白的重组羊痘病毒
CN112759651B (zh) 一种包含嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用
TW202302858A (zh) 治療糖尿病之胰島素基因療法
KR20200037206A (ko) 과립상 각막 변성증에 대한 유전자 치료약
CN114214353B (zh) 一种发酵生产人重组精氨酸酶i的方法
CN114350721B (zh) 微生物酶法生产l-鸟氨酸的方法
CN110423776B (zh) 表达重组凝血因子fix的载体及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190201

RJ01 Rejection of invention patent application after publication