CN110423776B - 表达重组凝血因子fix的载体及其构建方法和应用 - Google Patents

表达重组凝血因子fix的载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域,尤其涉及一种表达重组凝血因子FIX的载体及其构建方法和应用。针对病毒的不安全性，腺相关病毒的包装复杂性的问题提供一种不整合入宿主基因组且能在细胞内复制的安全的用于血友病基因治疗的细胞及其构建方法和应用。所述质粒载体，包括编码EBV核蛋白EBNA‑1的EBV基因以及EBV的oriP复制起点和凝血因子hFIX编码序列等。本发明重组载体是首次提出将凝血因子导入细胞以治疗血友病的基因治疗产品，并为该载体进一步经由中为安全治疗血友病B打下基础。

Description

表达重组凝血因子FIX的载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域,尤其涉及一种表达重组凝血因子FIX的载体及其构建方法和应用，所述载体可用于治疗血友病B。
背景技术
血友病B是一种由凝血因子FIX缺乏或功能障碍引起的遗传性出血性疾病，该病因为X染色体隐性遗传的凝血因子FIX基因缺陷所致。血友病临床特点为自发性关节、肌肉出血，伤口流血难以自愈。长期反复发病会导致关节变形，严重影响患者的生活质量。现有技术主要采用预防性的凝血因子替代疗法进行治疗，定期输注纯化的FIX因子可以使血友病B患者的出血严重程度和发生频率明显降低，但是患者仍然存在致命性出血和慢性关节损伤的风险。此外，纯化FIX价格昂贵，而且需要定期反复输注，绝大多数患者不可能实施终生预防性治疗。
目前，已有多种血友病作为基因治疗的靶标进行了研究。1996年复旦大学选用反转录病毒作为载体系统治疗血友病B，在经历细胞和动物实验研究后，采用基因修饰自体皮肤成纤维细胞为靶细胞，自体移植获得了成功。这是我国第一个成功的基因治疗临床实验，也是到目前为止有限的几个基因治疗成功的方案之一。4例病人1年的有效缓解期后，随访17年没有发现肿瘤和免疫异常与治疗相关的副作用或毒性，免疫检查也没发现改变，血浆中没有检测到反转录病毒，凝血因子IX的抑制物试验呈阴性，安全性良好。虽然外源的人凝血因子IX cDNA虽然能够在血友病B患者体内安全转移和表达，使得人FIX浓度和活性达到正常水平的5％左右,血友病症状得以减轻,但是尚不能完全消除血友病B的症状。
然而病毒载体走向临床仍然面临许多问题，目前血友病基因治疗的靶器官是肝脏，但是依靠输血改善出血状况的患者感染乙肝和HIV的几率增加，因此许多患有肝脏问题的患者无法接受治疗；特别是人群中约有40％的人感染过AAV不同血清型病毒，感染过AAV病毒的人群会诱发病毒的免疫反应或使病毒载体失效；这都限制了病毒载体在基因疗法当中的应用。因此，仍非常需要寻找高效、低毒的、安全的非病毒类的基因载体，让无法接受病毒疗法的患者受益。
发明内容
鉴于此，有必要针对病毒的不安全性、包装复杂性等问题提供一种不整合入宿主基因组且能在细胞内复制的安全的用于血友病B基因治疗的质粒载体及其用途。本发明提供了一种将携带正常基因的载体转染到有基因突变的脐带间充质干细胞进而通过恢复凝血因子的相关功能蛋白来达到恢复的基因治疗方式。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明解决的第一个技术问题是提供一种表达重组凝血因子FIX的载体，包括有编码EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因以及EBV的oriP复制起点和凝血因子hFIX编码序列(SEQID NO.1)。编码EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因以及EBV的oriP复制起点的意义在于用于质粒在表达细胞中的自主复制。
进一步的，所述表达重组凝血因子FIX的载体还包括人HSA基因的分泌信号肽编码序列。
进一步的，所在表达框的构成包括：从5’到3’方向依次为CMV启动子、人HSA基因的分泌信号肽编码序列、编码人凝血因子FIX的基因序列、SV40加尾信号。本发明采用HSA信号肽替换了凝血因子FIX基因信号肽和已公开三个氨基酸突变的凝血因子FIX-TripleL，FIX-TripleL比野生型凝血因子FIX蛋白活性更高，同时采用了强启动子使得凝血因子FIX蛋白得以高效率的持续、稳定的表达，从而起到治疗、缓解血友病出血症状的效果。本发明的实验中发现，在凝血因子的信号肽替换为HSA信号肽可以使凝血因子的分泌量增加一倍以上。
本发明的重组载体应用于制备促凝血药物和止血药物中。
本发明解决的第二个技术问题是提供含有上述重组载体的宿主细胞。
进一步的，所述含有表达重组凝血因子FIX的载体的宿主细胞的构建方法，包括步骤：
1)构建表达重组凝血因子FIX的载体；
2)制备人脐带间充质干细胞；
3)将步骤1)中的表达重组凝血因子FIX的载体导入步骤2)制备的人脐带间充质干细胞。
进一步的，本发明的重组载体或含有所述重组载体的宿主细胞应用于制备治疗血友病B的药物。
本发明有益效果：
本发明重组载体是首次提出将凝血因子导入细胞以治疗血友病的基因治疗产品，并为该载体进一步经由中为安全治疗血友病B打下基础。
本发明采用截短的凝血因子将分子量较大的FIX基因装载入上述的质粒载体中，且同时采用了强启动子使得凝血因子FⅧ蛋白得以高效率的持续、稳定的表达，从而起到治疗、缓解血友病出血症状的效果。
附图说明
图1载体的质粒模式图。
图2可独立表达凝血因子的载体pCEP4-HSA-FIX-TripleL的测序结果图。
图3转染后ELISA检测FIX分泌量的变化。
图4转染后ELISA法检测FIX分泌量的变化。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例1、载体的构建和分离纯化
包装入重组FIX的质粒命名为pCEP4-HSA-FIX-TripleL的构建方式如图1所示，该表达载体的复制子具有人疱疫病毒复制子(replication origin,OriP),和EBNA-1表达盒,人类FIX基因的cDNA(SEQ ID N0:1)被克隆到CMV启动子的下游，此外质粒中还包括CMV增强子和CMV启动子，两者都可以增强转入基因FIX的长期表达。人的凝血因子基因由公司合成，FIX cDNA前端是HSA的分泌信号肽编码序列(SEQ ID N0:2)。
重组蛋白的分泌效率因信号肽的不同而有很大差异，为了提高凝血因子的分泌效率，本发明将凝血因子FIX的信号肽替换为人血白蛋白(human serum albumin，HSA)的信号肽。
EBNA-I基因编码的核抗原将表达载体质粒以游离染色体的形式存在，在细胞中实现外源基因的非整合且长期表达。
可独立表达凝血因子的载体的构建：
首先，以HSA-FIX-TripleL(苏州泓迅生物科技股份有限公司合成)为模板，将HSA-FIX-TripleL序列克隆到载体pCEP4中(Adgene)。HSA-FIX-TripleL载体用引物(序列F和R)扩增出含有HSA-FIX-TripleL的片段，将回收后的PCR产物及pCEP4载体分别用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切，图1标识出XhoⅠ和BamHⅠ的酶切位点。分别胶回收后用Takara T4连接酶进行连接反应，连接反应按试剂盒要求进行。取连接产物5ul，转化以氯化钙方法制备的大肠杆菌(DH5α)感受态，将感受态细菌涂布于含有卡那霉素的固体LB平板上。12小时后挑取单菌落并送测序公司测序鉴定。测序结果(见图2)证实载体构建成功，如前所述，此载体命名为载体pCEP4-HSA-FIX-TripleL。
引物序列如下：
F:CCGCTCGAGGCCACCATGAAGTGGGTGACCTTCATC；
R:CGCGGATCCGGTACCGTCGACTTAGGTCAGCTTGGTCTTCTCC。
质粒载体pCEP4-HSA-FIX-TripleL的特征图谱如图1所示，各元件的起止位点如图1所示。质粒的全长序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例2、构建所需的脐带间充质干细胞
由下述步骤制备并获得本发明构建所需的人脐带间充质干细胞：
取培养第3-5代人脐带间充质干细胞的25cm2培养瓶；
用酒精棉球擦拭培养瓶盖口四周，然后旋开瓶盖；
吸弃培养瓶中原有培养基，每瓶用5ml的PBS缓冲液清洗两次，吸弃洗液；
每瓶中加入0.5ml胰酶-EDTA，放入37℃孵箱中5分钟；
在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保人脐带间充质干细胞完全消化下来；
每瓶中加入2ml完全培养基终止消化，反复吹打，制得细胞悬液；
将细胞悬液移入离心管中，以300g的离心速度离心5min，离心结束，吸弃上清，获得准备用于电转染的人脐带间充质干细胞。
实施例3、载体pCEP4-HSA-FIX-TripleL导入细胞和表达
将实施例2获得的细胞，用电转液重悬，重复离心洗涤一次；细胞悬液计数，重悬为密度1.0～1.2×106/ml个细胞；取0.4ml电转杯，每杯加细胞悬液100μl，加实施例1得到的基因载体pCEP4-HSA-FIX-TripleL质粒DNA 10μg；用电转染仪为Multiporator(德国eppendorf)电转仪，选择真核细胞模式，电压350V，电击60μs，电击1次。将电转后的细胞转入25cm2培养瓶中，加入5ml完全培养基，37℃培养。
实施例4、OriP和EBNA-1元件对凝血因子FIX表达持续时间的延长作用
带有Ori P和EBNA-1元件的pCEP4-HSA-FIX-TripleL载体和没有Ori P和EBNA-1元件的pcDNA3.1-HSA-FIX-TripleL载体电转染人脐带间充质干细胞(UC-MSC)48小时后，加入100μg/ml潮霉素筛选，药物筛选6天后，大部分不表达外源基因的UC-MSC被杀死。将能够在含有100μg/ml的潮霉素培养基的筛选条件下存活的UC-MSC消化至25cm2培养瓶上，以30％的汇合率接种。一直观察凝血因子的表达，其表达产物通过ELISA证实。如图3显示pcDNA3.1-HSA-FIX-TripleL转染的细胞，上清中凝血因子FIX-TripleL表达量随着时间的延长降低，但在潮霉素筛选压力下pCEP4-HSA-FIX-TripleL转染的细胞，上清中凝血因子FIX-TripleL可持续表达一个月以上。
实施例5、HSA信号肽对凝血因子FIX分泌量的增强作用
替换为HAS信号肽的凝血因子FIX载体和没有替换信号肽的FIX载体电转染细胞两天后，其表达产物通过ELISA证实。
收集的细胞培养基上清液，以Abcam公司的Human Factor IX ELISA Kit(Catalog:ab188393)分析上清液中的凝血因子含量，精确按照试剂盒说明书操作，以试剂盒中提供的重组human凝血因子做标准曲线。
测定结果如图4所示。
电转pCEP4-HSA-FIX-TripleL质粒8天后，UC-MSC培养基上清中，凝血因子蛋白浓度约为814±73ng/106个细胞/24h。
电转对照野生型信号肽的载体pCEP4-FIX-TripleL的UC-MSC培养基上清中，凝血因子蛋白浓度约为228±82ng/106个细胞/24h。这个数额为测试试剂和仪器读数本底误差范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
                         序列表
<110>  广州辉园苑医药科技有限公司
<120>  表达重组凝血因子FIX的载体及其构建方法和应用
<160>  3
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  1356
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
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cagctggggc gaggagtgcg ccatgaaggg caagtacggc atctacacca aggtgagccg      1980
ctacgtgaac tggatcaagg agaagaccaa gctgacctaa gtcgacggta ccggatccag      2040
acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat      2100
gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata      2160
aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg      2220
aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat ggctgattat gatccggctg      2280
cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt      2340
cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcaggcgt cagcgggtgt      2400
tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaggtc gactctagag gatcgatgcc ccgccccgga      2460
cgaactaaac ctgactacga catctctgcc ccttcttcgc ggggcagtgc atgtaatccc      2520
ttcagttggt tggtacaact tgccaactgg gccctgttcc acatgtgaca cgggggggga      2580
ccaaacacaa aggggttctc tgactgtagt tgacatcctt ataaatggat gtgcacattt      2640
gccaacactg agtggctttc atcctggagc agactttgca gtctgtggac tgcaacacaa      2700
cattgccttt atgtgtaact cttggctgaa gctcttacac caatgctggg ggacatgtac      2760
ctcccagggg cccaggaaga ctacgggagg ctacaccaac gtcaatcaga ggggcctgtg      2820
tagctaccga taagcggacc ctcaagaggg cattagcaat agtgtttata aggccccctt      2880
gttaacccta aacgggtagc atatgcttcc cgggtagtag tatatactat ccagactaac      2940
cctaattcaa tagcatatgt tacccaacgg gaagcatatg ctatcgaatt agggttagta      3000
aaagggtcct aaggaacagc gatatctccc accccatgag ctgtcacggt tttatttaca      3060
tggggtcagg attccacgag ggtagtgaac cattttagtc acaagggcag tggctgaaga      3120
tcaaggagcg ggcagtgaac tctcctgaat cttcgcctgc ttcttcattc tccttcgttt      3180
agctaataga ataactgctg agttgtgaac agtaaggtgt atgtgaggtg ctcgaaaaca      3240
aggtttcagg tgacgccccc agaataaaat ttggacgggg ggttcagtgg tggcattgtg      3300
ctatgacacc aatataaccc tcacaaaccc cttgggcaat aaatactagt gtaggaatga      3360
aacattctga atatctttaa caatagaaat ccatggggtg gggacaagcc gtaaagactg      3420
gatgtccatc tcacacgaat ttatggctat gggcaacaca taatcctagt gcaatatgat      3480
actggggtta ttaagatgtg tcccaggcag ggaccaagac aggtgaacca tgttgttaca      3540
ctctatttgt aacaagggga aagagagtgg acgccgacag cagcggactc cactggttgt      3600
ctctaacacc cccgaaaatt aaacggggct ccacgccaat ggggcccata aacaaagaca      3660
agtggccact cttttttttg aaattgtgga gtgggggcac gcgtcagccc ccacacgccg      3720
ccctgcggtt ttggactgta aaataagggt gtaataactt ggctgattgt aaccccgcta      3780
accactgcgg tcaaaccact tgcccacaaa accactaatg gcaccccggg gaatacctgc      3840
ataagtaggt gggcgggcca agataggggc gcgattgctg cgatctggag gacaaattac      3900
acacacttgc gcctgagcgc caagcacagg gttgttggtc ctcatattca cgaggtcgct      3960
gagagcacgg tgggctaatg ttgccatggg tagcatatac tacccaaata tctggatagc      4020
atatgctatc ctaatctata tctgggtagc ataggctatc ctaatctata tctgggtagc      4080
atatgctatc ctaatctata tctgggtagt atatgctatc ctaatttata tctgggtagc      4140
ataggctatc ctaatctata tctgggtagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagt      4200
atatgctatc ctaatctgta tccgggtagc atatgctatc ctaatagaga ttagggtagt      4260
atatgctatc ctaatttata tctgggtagc atatactacc caaatatctg gatagcatat      4320
gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagcatag      4380
gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagtatat      4440
gctatcctaa tttatatctg ggtagcatag gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat      4500
gctatcctaa tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa tctgtatccg ggtagcatat      4560
gctatcctca tgcatataca gtcagcatat gatacccagt agtagagtgg gagtgctatc      4620
ctttgcatat gccgccacct cccaaggggg cgtgaatttt cgctgcttgt ccttttcctg      4680
ctggttgctc ccattcttag gtgaatttaa ggaggccagg ctaaagccgt cgcatgtctg      4740
attgctcacc aggtaaatgt cgctaatgtt ttccaacgcg agaaggtgtt gagcgcggag      4800
ctgagtgacg tgacaacatg ggtatgccca attgccccat gttgggagga cgaaaatggt      4860
gacaagacag atggccagaa atacaccaac agcacgcatg atgtctactg gggatttatt      4920
ctttagtgcg ggggaataca cggcttttaa tacgattgag ggcgtctcct aacaagttac      4980
atcactcctg cccttcctca ccctcatctc catcacctcc ttcatctccg tcatctccgt      5040
catcaccctc cgcggcagcc ccttccacca taggtggaaa ccagggaggc aaatctactc      5100
catcgtcaaa gctgcacaca gtcaccctga tattgcaggt aggagcgggc tttgtcataa      5160
caaggtcctt aatcgcatcc ttcaaaacct cagcaaatat atgagtttgt aaaaagacca      5220
tgaaataaca gacaatggac tcccttagcg ggccaggttg tgggccgggt ccaggggcca      5280
ttccaaaggg gagacgactc aatggtgtaa gacgacattg tggaatagca agggcagttc      5340
ctcgccttag gttgtaaagg gaggtcttac tacctccata tacgaacaca ccggcgaccc      5400
aagttccttc gtcggtagtc ctttctacgt gactcctagc caggagagct cttaaacctt      5460
ctgcaatgtt ctcaaatttc gggttggaac ctccttgacc acgatgcttt ccaaaccacc      5520
ctcctttttt gcgcctgcct ccatcaccct gaccccgggg tccagtgctt gggccttctc      5580
ctgggtcatc tgcggggccc tgctctatcg ctcccggggg cacgtcaggc tcaccatctg      5640
ggccaccttc ttggtggtat tcaaaataat cggcttcccc tacagggtgg aaaaatggcc      5700
ttctacctgg agggggcctg cgcggtggag acccggatga tgatgactga ctactgggac      5760
tcctgggcct cttttctcca cgtccacgac ctctccccct ggctctttca cgacttcccc      5820
ccctggctct ttcacgtcct ctaccccggc ggcctccact acctcctcga ccccggcctc      5880
cactacctcc tcgaccccgg cctccactgc ctcctcgacc ccggcctcca cctcctgctc      5940
ctgcccctcc tgctcctgcc cctcctcctg ctcctgcccc tcctgcccct cctgctcctg      6000
cccctcctgc ccctcctgct cctgcccctc ctgcccctcc tgctcctgcc cctcctgccc      6060
ctcctcctgc tcctgcccct cctgcccctc ctcctgctcc tgcccctcct gcccctcctg      6120
ctcctgcccc tcctgcccct cctgctcctg cccctcctgc ccctcctgct cctgcccctc      6180
ctgctcctgc ccctcctgct cctgcccctc ctgctcctgc ccctcctgcc cctcctgccc      6240
ctcctcctgc tcctgcccct cctgctcctg cccctcctgc ccctcctgcc cctcctgctc      6300
ctgcccctcc tcctgctcct gcccctcctg cccctcctgc ccctcctcct gctcctgccc      6360
ctcctgcccc tcctcctgct cctgcccctc ctcctgctcc tgcccctcct gcccctcctg      6420
cccctcctcc tgctcctgcc cctcctgccc ctcctcctgc tcctgcccct cctcctgctc      6480
ctgcccctcc tgcccctcct gcccctcctc ctgctcctgc ccctcctcct gctcctgccc      6540
ctcctgcccc tcctgcccct cctgcccctc ctcctgctcc tgcccctcct cctgctcctg      6600
cccctcctgc tcctgcccct cccgctcctg ctcctgctcc tgttccaccg tgggtccctt      6660
tgcagccaat gcaacttgga cgtttttggg gtctccggac accatctcta tgtcttggcc      6720
ctgatcctga gccgcccggg gctcctggtc ttccgcctcc tcgtcctcgt cctcttcccc      6780
gtcctcgtcc atggttatca ccccctcttc tttgaggtcc actgccgccg gagccttctg      6840
gtccagatgt gtctcccttc tctcctaggc catttccagg tcctgtacct ggcccctcgt      6900
cagacatgat tcacactaaa agagatcaat agacatcttt attagacgac gctcagtgaa      6960
tacagggagt gcagactcct gccccctcca acagcccccc caccctcatc cccttcatgg      7020
tcgctgtcag acagatccag gtctgaaaat tccccatcct ccgaaccatc ctcgtcctca      7080
tcaccaatta ctcgcagccc ggaaaactcc cgctgaacat cctcaagatt tgcgtcctga      7140
gcctcaagcc aggcctcaaa ttcctcgtcc ccctttttgc tggacggtag ggatggggat      7200
tctcgggacc cctcctcttc ctcttcaagg tcaccagaca gagatgctac tggggcaacg      7260
gaagaaaagc tgggtgcggc ctgtgaggat cagcttatcg atgataagct gtcaaacatg      7320
agaattcttg aagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga      7380
taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta      7440
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat      7500
aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc      7560
ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga      7620
aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca      7680
acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt      7740
ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg      7800
gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc      7860
atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata      7920
acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt      7980
tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag      8040
ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgcagc aatggcaaca acgttgcgca      8100
aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg      8160
aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg      8220
ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag      8280
atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg      8340
aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag      8400
accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga      8460
tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt      8520
tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc      8580
tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc      8640
cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac      8700
caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac      8760
cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt      8820
cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct      8880
gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat      8940
acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt      9000
atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg      9060
cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt      9120
gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt      9180
tcctggcctt ttgctggcct tgaagctgtc cctgatggtc gtcatctacc tgcctggaca      9240
gcatggcctg caacgcgggc atcccgatgc cgccggaagc gagaagaatc ataatgggga      9300
aggccatcca gcctcgcgtc gcgaacgcca gcaagacgta gcccagcgcg tcggccccga      9360
gatgcgccgc gtgcggctgc tggagatggc ggacgcgatg gatatgttct gccaagggtt      9420
ggtttgcgca ttcacagttc tccgcaagaa ttgattggct ccaattcttg gagtggtgaa      9480
tccgttagcg aggtgccgcc ctgcttcatc cccgtggccc gttgctcgcg tttgctggcg      9540
gtgtccccgg aagaaatata tttgcatgtc tttagttcta tgatgacaca aaccccgccc      9600
agcgtcttgt cattggcgaa ttcgaacacg cagatgcagt cggggcggcg cggtccgagg      9660
tccacttcgc atattaaggt gacgcgtgtg gcctcgaaca ccgagcgacc ctgcagcgac      9720
ccgcttaaca gcgtcaacag cgtgccgcag atcccggggg gcaatgagat atgaaaaagc      9780
ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg      9840
acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc      9900
gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt      9960
atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggaattca     10020
gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg caagacctgc     10080
ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat gcgatcgctg     10140
cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat     10200
acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa     10260
ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt     10320
gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg     10380
tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg     10440
attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc     10500
agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg cggctccggg     10560
cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg     10620
atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg     10680
tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag     10740
tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc ggatcgggag atgggggagg     10800
ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc gcgctatgac ggcaataaaa     10860
agacagaata aaacgcacgg gtgttgggtc gtttgttcat aaacgcgggg ttcggtccca     10920
gggctggcac tctgtcgata ccccaccgag accccattgg ggccaatacg cccgcgtttc     10980
ttccttttcc ccaccccacc ccccaagttc gggtgaaggc ccagggctcg cagccaacgt     11040
cggggcggca ggccctgcca tagccactgg ccccgtgggt tagggacggg gtcccccatg     11100
gggaatggtt tatggttcgt gggggttatt attttgggcg ttgcgtgggg tcaggtccac     11160
gactggactg agcagacaga cccatggttt ttggatggcc tgggcatgga ccgcatgtac     11220
tggcgcgaca cgaacaccgg gcgtctgtgg ctgccaaaca cccccgaccc ccaaaaacca     11280
ccgcgcggat ttctggcgtg ccaagctagt cgaccaattc tcatgtttga cagcttatca     11340
tcgcagatcc gggcaacgtt gttgccattg ctgcaggcgc agaactggta ggtatggaag     11400
atctatacat tgaatcaata ttggcaatta gccatattag tcattggtta tatagcataa     11460
atcaatattg gctattggcc attgcatacg ttgtatctat atcataatat gtacatttat     11520
attggctcat gtccaatatg accgccat                                  11548

Claims (5)

1.一种表达重组凝血因子FIX的载体，其特征在于，包括有编码EBV核蛋白EBNA-1的EBV基因、EBV的oriP复制起点、如SEQ ID NO：1所示的凝血因子hFIX编码序列和如SEQ ID N0：2所示的人HSA基因的分泌信号肽编码序列；所述载体的表达框构成包括：从5’到3’方向依次为CMV启动子、人HSA基因的分泌信号肽编码序列、编码人凝血因子FIX的基因序列、SV40加尾信号；所述载体的序列如SEQ ID NO:3所示。
2.权利要求1所述的表达重组凝血因子FIX的载体在制备促凝血药物中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的表达重组凝血因子FIX的载体的重组宿主细胞。
4.含有权利要求1所述的表达重组凝血因子FIX的载体的宿主细胞的构建方法，其特征在于，包括步骤：
1)构建表达重组凝血因子FIX的载体；
2)制备宿主细胞；
3)将步骤1)中的表达重组凝血因子FIX的载体导入步骤2)制备的宿主细胞，得到重组宿主细胞。
5.权利要求3所述的重组宿主细胞，或权利要求4所述的方法构建的重组宿主细胞在制备治疗血友病B的药物中的应用。
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